Summary
Ved hjælp patient-afledte tumorer i en subkutan præklinisk model er en glimrende måde at studere effekten af nye behandlingsformer, prædiktiv biomarkør opdagelse og lægemiddelresistente veje. Denne model, i udviklingsprocessen narkotika, er afgørende for at bestemme skæbnen for mange nye anti-cancer behandlinger forud for klinisk undersøgelse.
Introduction
Kolorektal cancer (CRC) er en væsentlig bidragyder til kræftdødsfald i USA. I 2015 var der en anslået 132,700 nye tilfælde af CRC med 49,700 dødsfald 1. Selvom prognosen hos patienter med lokaliseret sygdom er fremragende, patienter med fremskreden sygdom har dårlige resultater, hvilket gør dette til en vigtig prioritet i udviklingen af nye terapier. Trods standard for pleje kemoterapeutiske regimer og nyere biologiske, der er indsat mod denne sygdom, har der kun været en trinvis stigning i den samlede overlevelse. Følgelig er der en betydelig indsats for at forstå føreren involverede veje lette tumorvækst i denne sygdom. Den Cancer Genome Atlas Network har for nylig identificeret en lang række store veje, der er impliceret i CRC dysregulering og omfatter: WNT, phosphoinositid 3-kinase (PI3K), RAS, transformerende vækstfaktor-β (TGF β) og TP53 2. Sammen med undersøgelser, der beskriver othendes veje, der forstærker vækst i CRC har antændt udviklingen af nyere terapier for markant at øge overlevelsen i denne patientpopulation 3-5. Ved hjælp prækliniske modeller i onkologi lægemiddeludvikling har været afgørende i denne proces til at forudsige den kliniske aktivitet af disse nye forbindelser.
Forskellige prækliniske modeller er blevet anvendt i udvikling af nye lægemidler. I betragtning af at prækliniske transgene dyremodeller og udødeliggjort cellelinjer har fået medhold i at bestemme den kliniske aktivitet af nye onkologiske behandlinger, hovedsagelig på grund af deres manglende evne til at afspejle kompleksiteten af humane tumorer, er der etableret patient-afledt tumor xenograft (PDTX) modeller. Den største fordel ved denne model er, at tumor heterogenitet forbliver intakt og afspejler nøje de molekylære karakteristika og klonalitet af oprindelse patientens tumor 6-9. PDTX modeller giver en fremragende in vivopræklinisk platform til at studere nye agenter, lægemiddelresistens veje, kombinatoriske strategier og kræft stamcellebiologi 10.
En generel oversigt over PDTX er illustreret i figur 1. Den begynder i klinikken, samtykke patienter til at tillade nogle af deres overskydende tumorvæv, der skal anvendes til denne forskning. Dernæst ved kirurgi, er et stykke af tumoren indtjente af en patolog og sat i medier, der skal transporteres til forskning personale. Umiddelbart efter denne, er et snit af tumoren skåret i små stykker og transplanteres ind immunsvækkede mus subkutant. Når tumoren vokser, er det passeret i forskellige generationer af mus for at opretholde tumoren 10. Typisk efter F3 generation tumoren kan udvides til en behandling studie, hvor hidtil ukendte forbindelser og / eller kombinatoriske terapier evalueres. Ved hjælp Next Gen Seq (Exome Seq, RNA Seq og SNP-array) potentielle prædiktive biomarkører er opdageed at hjælpe med udvælgelsen af patienter, der kan drage fordel af en særlig behandling.
De overordnede mål med at bruge PDTX modeller er til: 1) evaluere effekten af nye behandlingsformer som enkeltstof eller i kombination, og 2) at identificere prædiktive biomarkører for følsomhed eller resistens forud for klinisk undersøgelse. I dette manuskript, giver vi den metode i initiering og vedligeholdelse af et CRC PDTX bank og give fordele og begrænsninger af denne model i udvikling lægemiddelforskning.
Figur 1. Oversigt over CRC PDTX Model protokol. En patient afledt tumor modtages fra kirurgi og straks injiceret i athymiske nøgne mus subkutant. Når tumoren vokser det udvidet til efterfølgende generationer og til sidst udvidet til behandling studier. Behandling RespoNSES vurderes og prædiktive biomarkører er identificeret, som kan hjælpe i patientudvælgelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: Patient-afledte kolorektal adenocarcinom tumor prøver blev indhentet fra samtykkende patienter på University of Colorado Hospital i overensstemmelse med en protokol godkendt af Colorado Multiple Institutional Review Board (08-0439). Alt dyr arbejde blev udført under dyr protokoller, der er godkendt af University of Colorado Denver Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC, Protokol # 51.412 (06) 1E og 96813 (04) 1E).
1. Modtagelse og Forberedelse Patient Blood
- Saml 1 - 2 ml blod i en blod / celleseparation rør indeholdende natriumcitrat (tube faser inkluderet er plasma, lymfocyt- og monocyt båndet, densitetsgradient væske, gel barriere, og erythrocytter og neutrofiler). Forsigtig Følg Blood patogen retningslinjer med blod eller væv.
Bemærk: PBMC'er og plasma kunne anvendes til fremtidige undersøgelser, der kan omfatte: sammenligne kimcellelinje genetisk variation med tumor-mutationer, isolere omløbTing tumorceller, evaluering celle fri DNA (cfDNA), der undersøger proteiner og microRNA'er osv. - Centrifugeres blodet / celleseparation rør ved 2.500 xg i 15 min uden bremse ved stuetemperatur.
- Saml perifere mononukleære blodceller (PBMC'er i lymfocyt og monocyt bånd af rør) og sat i et 1,5 ml mikrocentrifugerør (klar, autoklaverbar, DNase, RNase og pyrogen gratis), og fyld til toppen af røret med sterilt phosphatpufret saltvand (PBS).
- Centrifuger ved 2.300 xg i 3 minutter ved stuetemperatur til dannelse af en pellet af PBMC'er ved bunden af røret. Dernæst fjerner supernatanten forsigtigt. Der tilsættes 1 ml sterilt PBS for at vaske pelleten og centrifugeres ved 3.000 xg i 30 sek og derefter fjerne supernatanten.
- Brug en pipette til at indsamle plasma fra blod / celleseparation rør (i plasma fase af rør) i en 1,5 ml steril kryogene hætteglas (DNase og RNase fri, ingen menneskelig DNA, endotoksin gratis) og sætte plasma og pellet af PMBC s ind i en -80 ° C freezer til opbevaring.
2. Modtagelse og forberedelse Patient Tumor Sample
- Forbered enten RPMI eller DMEM-medium med 1: 100 (10%) af penicillin-streptomycin og ikke-essentielle aminosyrer, 1: 1000 (1%) Plasmocin, og 10% inaktiveret føtalt bovint serum (komplet medie) og tilsættes 20 - 25 ml til en steril samling cup for tumorprøve.
- Hent tumor prøve i en steril kop indeholdende komplette medier på is eller holde ved 4 ° C.
Bemærk: tumorprøven er et stykke af overskydende patient tumorvæv, som fjernes af en kirurg, behandles af en patolog, og anbringes i en steril samling kop med komplette medier. Forsigtig Følg Blood patogen retningslinjer med blod eller væv. Også ideelt at injicere fem mus, bør tumoren være ca. 1 cm³. - Bring tumorprøven til dyret facilitet til indsprøjtning i immunkompromitterede mus.
Bemærk: Det er bedst at behandle tumorprøven snarest muligt.- I en laminar flow hætte, placere tumorprøven i en steril plastik skære fad fra tumoren kop. Brug autoklaveret-lille saks og pincet til at skære i 10 - 12 ca. 3 x 3 x 3 mm stykker og anbringes i en autoklaveret 1,5 ml mikrocentrifugerør fyldt med 300 pi gelatinøs proteinblanding opløsning. Hold røret på is.
- Som en prioritet injicere tumor i mus, men hvis der er nogen svulst tilovers, indsamle flash frosne hætteglas (FF), formalin fast paraffin indstøbt (FFPE) kopper og en levedygtig hætteglas tumor.
- For FF, indsamle små stykker tumorvæv fra en steril kryogen hætteglas til yderligere analyse såsom protein, RNA eller DNA-isolering. Placer FF straks ind i en flydende nitrogen dewar og gemme langsigtet i en -80 ° C fryser.
- For FFPE, hvis der er nok tumor, sted 3 små stykker til en 10 ml 10% formalin kop og proces i paraffin indlejrede blokke, når tumor har været i formalin i mindst 24 timer.
Bemærk: 24 hr er baseretfra vores Histologi Core forslag 11. - Endelig placere den resterende tumor i en kryogen rør. Gøre levedygtige medier ved tilsætning af 10% dimethylsulfoxid (DMSO) for at fuldføre medier. Dernæst tilsættes 1 ml til en kryogen rør og gemme på is. Bemærk: Du må ikke holde på is i lange perioder.
- Skær alle rester tumor i små stykker, der ideelt set vil være nok for 10 tumorer der skal injiceres i 5 mus i fremtiden. Derefter placere den levedygtige tumor rør på is, indtil den kan placeres i en Isopropylalkohol kølecontaineren (langsomt fryser tumoren 1 ° C ad gangen) og tages i -80 ° C fryser for at sikre, at tumorerne ikke dør under frysning proces.
Bemærk: langtidsopbevaring tumorerne fjernes (efter 2 - 3 dage) og anbragt i en stor flydende nitrogen dewar. Bemærk venligst, at levedygtige rør ikke skal have lov til at tø, medmindre det bliver taget ud for at injicere i mus.
- Skær alle rester tumor i små stykker, der ideelt set vil være nok for 10 tumorer der skal injiceres i 5 mus i fremtiden. Derefter placere den levedygtige tumor rør på is, indtil den kan placeres i en Isopropylalkohol kølecontaineren (langsomt fryser tumoren 1 ° C ad gangen) og tages i -80 ° C fryser for at sikre, at tumorerne ikke dør under frysning proces.
3.Injektion af Patient Afledt tumorxenoplantater
- Bruge fem 6 - 8 uger gamle han- og / eller kvindelig athymiske nøgne mus (T-celle deficiente) For hver enkelt patient afledt tumor. Injicere i alt 10 tumorer (2 injektioner pr mus) subkutant (SQ).
Bemærk: Den oprindelige menneskelige tumor er udpeget som F0 og derefter en gang injiceret i mus den næste generation er F1. Også bruge autoklaverede pincet, saks, og trokarer for hver unik eksplantat. - Load stykker af tumor fra gelatinøse protein blanding løsning i autoklaveres 12 G trokarer og sikre, at tumoren er skubbet helt ind i trokaren.
- I en steril laminar flow hætte, placere 5 mus i en anæstesi boks, der er forbundet med en Isofluran anæstesiapparat (startet i den indledende hastighed på 5% isofluran, 3 - 4% oxygen, og 2 - 3% Isofluran til vedligeholdelse af anæstesi) og kulfilter (absorberer overskydende gas).
Bemærk: En erfaren tekniker skal kunne udføre hele proceduren pået bur af 5 mus i ca. 5 min i alt (ca. 30 sek pr mus). Derfor yderligere termisk støtte og øjne smøring ikke generelt bruges. For mindre erfarne individer eller under uddannelse, er det stærkt anbefales, at personer enten udføre proceduren på færre dyr på én gang og / eller bruge en opvarmning pad / øje smøring under procedure, hvis dyrene bliver bedøvet længere end 5 min. Procedure er baseret på IACUC standarder på vores universitet.
- I en steril laminar flow hætte, placere 5 mus i en anæstesi boks, der er forbundet med en Isofluran anæstesiapparat (startet i den indledende hastighed på 5% isofluran, 3 - 4% oxygen, og 2 - 3% Isofluran til vedligeholdelse af anæstesi) og kulfilter (absorberer overskydende gas).
- Klem en mus tå for at sikre musen ikke længere reagerer, og derefter tage musen ud af Isofluran kassen. Placer musen på en ren felt at injicere tumorer på den midterste dorsale halsområde og glidende trokaren ned subkutant indtil flanken region er nået med autoklaveres 12 g trokarer.
- Levere en tumor subkutant til hver side af musens flanke. Klem tumoren når trokaren trækkes ud, der sikrer, at tumoren bliver i den ønskede flanke region. Den gelatinous proteinblanding hærder med musen kropstemperatur og indkapsler tumoren i ca. 1 uge til hjælpe tumoren vokse og fastgøre den til SQ bindevæv. Læsionen foretaget af trokaren er ikke større end 4 mm, og der er ingen grund til at lukke huden med hæfteklammer.
Bemærk: Vores dyrlæger bestemt ingen lukning er nødvendig baseret på meget lille størrelse af læsionen, hurtig heling tid (midterste dorsale hals region reducerer nogen spænding hud eller grooming af læsion), ingen infektioner bemærket, og nøje overvågning af dyrene i denne periode .
- Levere en tumor subkutant til hver side af musens flanke. Klem tumoren når trokaren trækkes ud, der sikrer, at tumoren bliver i den ønskede flanke region. Den gelatinous proteinblanding hærder med musen kropstemperatur og indkapsler tumoren i ca. 1 uge til hjælpe tumoren vokse og fastgøre den til SQ bindevæv. Læsionen foretaget af trokaren er ikke større end 4 mm, og der er ingen grund til at lukke huden med hæfteklammer.
- Før musen er helt vågen injicere Meloxicam 2 mg / kg SQ (smertestillende medicin) væk fra stedet af tumor injektion. Dernæst placeres musen ind i buret og overvåge, indtil musen er vågen og bevæger sig.
Bemærk: Lad ikke komme dyr uden opsyn indtil helt vågen. Meloxicam dosering er baseret på IACUC standarder på vores universitet.- Dernæst gentages samme procedure med 4resterende mus og overvåge deres vejrtrækning.
Bemærk: Bemærk, dette er en meget hurtig procedure og mus vågner op meget hurtigt efter Meloxicam injektion, men juster Isofluran efter behov. Hver gang en mus er taget ud, skrue ned for Isofluran. Den Meloxicam vil vare 24 timer og læsioner fra trokarer vil fuldt ud at helbrede i 1 uge.
- Dernæst gentages samme procedure med 4resterende mus og overvåge deres vejrtrækning.
4. Vedligeholdelse af Patient Afledt Tumor xenograft Bank
- Overvåg vækst og sundhed af mus mindst en gang om ugen. Brug et regneark (eller et andet tracking system) til at spore tumor størrelser, tumor generation, dato for tumor injektion og sundhed af mus.
Bemærk: Hvis mus har tabt 15% af deres oprindelige kropsvægt, lav legemstilstanden scores (≥ 2), har tumor ulcerationer, tumorer nåede 2000 mm3 eller totale tumorer 3,000 mm3, eller er sygelig (krum, kulde, sløvhed, etc .) på nogen måde musene aflives via CO₂ eller bedøvet efterfulgt af cervikal dislokation som somecondary metode. Euthanize via anæstesi og cervikal dislokation hvis indsamling tumor, der ellers mus aflivet via CO₂ og cervikal dislokation. - Når en tumor er ca. 1.500-2.000 mm 3 anesthetize mus som beskrevet ovenfor og derefter udføre cervikal dislokation aflive.
- Kontroller, at musen har ingen hjerteslag. Udskære SQ tumor med autoklaveres saks og pincet.
BEMÆRK: Tillad tumorer at vokse i op til 1 år, og hvis der ikke tumor ses derefter aflive musene via CO 2, efterfulgt af cervikal dislokation som en sekundær metode. - Passage bedst voksende tumor ind i den næste generation (aka et nyt sæt af 5 mus). Brug instruktionerne ovenfor for at indsamle 10 - 12 tumorer for forbifarten og derefter indsamle sidesten tumor som også beskrevet ovenfor.
Bemærk: Indsamling talrige levedygtige rør er meget vigtigt i de tidlige generationer (F1 - F8); derfor indsamle flere levedygtige rør, FF rør, og en FFPE pr generation. - Hold de resterende mus indtil en ny generation af mus har tumorvækst på ca. 300 mm3. Når resterende mus har tumorer, der er store, fortsætte med at indsamle som beskrevet ovenfor.
- Kontroller, at musen har ingen hjerteslag. Udskære SQ tumor med autoklaveres saks og pincet.
- Fortsæt med at passage tumorer og indsamle på hvert trin, indtil F15. På dette tidspunkt, tage en levedygtig rør af den tidligst mulige ud af flydende nitrogen generation og lad tø på is og følg tumor-injektion ovenfor beskrevne procedurer.
Bemærk: Tumorer, der vokser fra levedygtige rør tage længere tid at vokse i mus i forhold til at passere fra generation til generation, så holder det i tankerne, når du planlægger. Hvis en bestemt PDTX model ikke længere er behov for til enhver passage, aflive og indsamle tumor, for at sikre talrige levedygtige rør opsamles til fremtidig brug.
5. Developmental Therapeutics med Patient Afledt tumorxenoplantater
Bemærk: De fleste tumorer på F3 generation har gode vækst- kinetik (vokse hurtigere og mere samarbejdensistent) derfor fortsætte til PDTX narkotika effektstudier.
- Når den ønskede tumor er meget stor (1.500 - 2.000 mm 3), følge procedurer ovenfor for at indsamle tumor at udvide til ønskede mængde af mus.
- Afhængigt af den hypotese, der testes bestemme antallet af tumorer, der er nødvendige pr behandlingsgruppe.
Bemærk: 1 ml gelatinøse protein blanding løsning kan tilnærmelsesvis fit 30 små tumor stykker (afhængig af tumor morfologi) til injektion i mus.
- Afhængigt af den hypotese, der testes bestemme antallet af tumorer, der er nødvendige pr behandlingsgruppe.
- Check-mus med tumorer ugentlige og når de fleste tumorer er synligt små (ca. mellem 50 - 300 mm³) måle tumorer med kalibre at bestemme tumorvolumen. Tumorvolumen = [width² (mindste mål) x længde (største måling)] x 0,52.
Bemærk: Den gelatinøse proteinblanding løsning omgiver de injicerede tumorstykker i en uge, derefter efter en uge tumorvækst vil være nøjagtige. - Brug tumorvolumener mellem 50 - 300 mm³ ogn gennemsnit venstre og højre tumorer. Derefter randomisere i behandlingsgrupper med 10 tumorer per gruppe og en gruppe gennemsnit inden for et par numre af hinanden. Dernæst sortere musene i grupper og begynde den ønskede behandling studiet.
- Dosis musene med narkotika (skema afhængig af narkotika) afvejes og foranstaltning (tumor) to gange om ugen. Ved afslutningen af studiet, aflive mus via anæstesi og cervikal dislokation og indsamle tumor til fremtidig farmakodynamiske analyse i laboratoriet.
Bemærk: Undersøgelsen varer 30 dage afhængig af køretøjets tumorstørrelse og sundhed mus.
6. Organisering af en PDTX bank
- Hold en veldokumenteret formular til at forhindre gentagelse af forskning og passende brug af dyr.
BEMÆRK: Dette er nøglen til en vellykket PDTX bank.- Bruge regneark til at holde styr på en tumor fra den humane patient i klinikken, til mus i PDTX bank, behandlinger, data, og hvad opsamles. Bemærk: Dette omfatter fryser, flydende nitrogen Dewars, Og FFPE lagring samt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ligheder af Fælles mutationer i CRC PDTX Modeller og TCGA
Vi undersøgte, om den procentdel af fælles mutationer (KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, BRAF, PIK3CA, APC, CTNNB1 og TP53) i CRC PDTX banken var repræsentant til mutationen frekvens ses i CRC patientpopulation. Som vist i figur 2A (TCGA) og B (CRC PDTX bank), hyppigheden af mutationer i disse gener var meget ens mellem TCGA (n = 276 patienter) og CRC PDTX bank (n = 59 CRC patienter). Den største forskel observeret var i APC-genet, hvorved en forskel på 23% blev set. Disse resultater antyder, at fælles mutationer observeret i CRC patientpopulation er godt repræsenteret i CRC PDTX model.
Evaluering af stabilitets- af behandling Responses mellem forskelligeGenerationer
I denne CRC PDTX model, vi satte sig for at afgøre, om behandlingseffekt var ens mellem forskellige generationer. Tumorer blev udvidet i atymiske nøgne mus (10 tumorer / gruppe) og effekt af standarden for plejemidler såsom cetuximab (0,4 mg / mus IP to gange om ugen) og irinotecan (15 mg / kg IP en gang om ugen) blev undersøgt i 4 unikke CRC PDTX modeller i to separate generationer. Som vist i figur 3A og B, CRC026 (F3) var mere resistent over for cetuximab behandling, mens CRC010 (F6) udviste behandling følsomhed. blev observeret lignende resultater, når disse CRC eksplantater blev behandlet i forskellige generationer; CRC026 (F9) var resistente og CRC010 (F7) var følsom over for cetuximab. For at fastlægge effekten af irinotecan i PDTX model, vi undersøgte behandlingseffekt på tumorvækst i 2 CRC PDTX modeller. Mens CRC098 (F8) var resistent over for irinotecan behandling, CRC036 (F5) udviste følsomhed (figur 3C og D). Som det blev observeret med cetuximab, behandling med irinotecan i forskellige generationer ikke ændre behandlingen respons i disse tumorer; CRC098 (F12) var resistent og CRC036 (F10) var følsom for irinotecan (figur 3C og D). Selvom væksten kinetik ubehandlede tumorer var til tider anderledes mellem generationerne, behandlings- reaktioner på irinotecan og cetuximab forblev den samme, hvilket indikerer stabilitet af denne model med at evaluere anti-behandlinger mod kræft.
Undersøgelse af Stroma Component i CRC PDTX Model
Dernæst var vi interesserede i at bestemme, om stroma komponent i denne CRC eksplantatet model bestod af mennesker og / eller mus afledte celler. Vi anvendte en tofarvet Cot-1 FISH-assayet, der bestod af musCot-1 DNA (grøn fluorofor) og human Cot-1 DNA (rød fluorofor) at bestemme mus og humane celler i 10 separate CRC eksplantaterne mellem F0 og F1 generationer 25. Som vist i figur 4A, i F1-generationen den menneskelige stroma erstattes af muse stroma, eftersom den humane tumor nu er omgivet af alle mus stroma. Disse resultater var tydelige i alle 10 CRC eksplantater, der blev udsat for Cot-1 FISH mellem F0 og F1 generationer. Foruden Cot-1 FISH, undersøgte vi proteinniveauer af muse og human HGF og VEGF ligander i F0 og F1 generationer under anvendelse muse og humane ELISA'er for disse ligander. Som vist i figur 4B og C, mens al menneskelig afledt HGF i F0 generation er erstattet med musen HGF i F1-generationen, VEGF-ligand bestod af både mennesker og mus i F1-generationen. Tilsammen viser disse forsøg antyder, at i CRC PDTX musemodel at musen stroma overhaler den menneskelige stroma i the F1-generationen og ligander udskilles kan variere med hensyn til at blive menneske og / eller mus afledt.
Figur 2. Sammenligning af Common Mutationer i CRC PDTX Bank og TCGA. Vi observerede meget lignende mutationsfrekvenser mellem TCGA (A) og CRC PDTX model (B) med hensyn til KRAS, nationale tilsynsmyndigheder, BRAF, PIK3CA, CTNNB1 og TP53 . klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Effekter af Cetuximab og irinotecan Behandling på tumorvækst. (A) CRC026 viste resistens over for cetuximab når stillingtagen til,ated i F3 og F9 generationer, og (B) CRC010 udstillet følsomhed over for cetuximab i F6 og F7 generationer. (C) CRC098 viste modstand mod irinotecan i F8 og F12 generationer, mens (D) CRC036 var følsom over for irinotecan i F5 og F10 generationer. Hvert datapunkt repræsenterer et gennemsnit af 10 tumorer pr behandlingsgruppe. Mus blev behandlet med cetuximab (100 pi IP 400 ug / mus) to gange om ugen og irinotecan (100 pi IP 20 mg / kg) blev doseret en gang om ugen. Data præsenteret som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Evaluering af Mouse og Tumor Cell Komponenter i F0 og F1 Generationer. (A) Dual-color FISK for den humane cot-1 DNA (rød) og mus cot-1 DNA (grøn) blev anvendt til at undersøge forskelle mellem tumorer i F0 og F1 generation. Menneskelig stroma (F0) erstattes af mus stroma (F1) i CRC098 og CR174 (skala = 20x). Nekrotiske celler blev identificeret ved nedsat eller manglende DAPI intercalation og rød fluorescens. Undersøgelse af muse og human HGF og VEGF-ligand-ekspression ved ELISA (muse og humane ELISA'er) mellem F0 og F1. (B) Humant HGF blev erstattet af mus i F1-generationen og (C) humane og muse VEGF var tydelige i F1-generationen (picogram / milliliter [pg / ml]). Data præsenteret som gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den PDTX lægemiddelforskning platform giver en forbedret model til manglerne i andre prækliniske modeller, der er upålidelige forudsige klinisk aktivitet af nye forbindelser. Vigtigt er det, tumorer i denne model er biologisk stabile, bevarer metastatisk potentiale, og udviser lignende stof lydhørhed fra generation til generation. I denne model er patientens afledte tumorer injiceres i athymiske nøgne mus, passeret, og efterfølgende anvendes i terapeutisk vurdering. Der er flere kritiske trin til en vellykket PDTX bank, der omfatter: 1) en sammenhængende klinisk team til at identificere / samtykke patienterne og til fjernelse og opregning af tumorvæv for PDTX modellen og 2) en stærk forskningsgruppe med fremragende laboratorium og dyr teknisk færdigheder til indsprøjtning tumorer, organisering og vedligeholdelse af PDTX bank og overvågning af sundheden hos mus. En væsentlig fordel i vores PDTX modeller er indsprøjtning tumorer med trokaren procedure. Den alternative fremgangsmåde til curg ø ring en tumor lomme og derefter suturering eller ved hjælp af hud klip er mere tidskrævende for personalet, kræver mere smerte medicin for mus, og overvågning af sutureres eller sår klippet område. Proceduren trokaren kræver mindre træning, er meget hurtig, musene er under anæstesi i kortere tid, og der er behov mindre smertestillende medicin. Derfor, i vores erfaring indsprøjtning tumorer med trokarer er den bedste metode versus alternative metoder. Disse faktorer vil i høj grad påvirke den samlede succes af PDTX banken og i lægemiddelforskning processen. Selv om denne in vivo model er betydeligt dyrere end at teste stoffer i kræft cellelinjekulturer, PDTX modeller tilbyder en mere klinisk relevant tilgang i test onkologi forbindelser.
I CRC PDTX bank, har vi modtaget 99 tumorprøver som blev injiceret i athymiske nøgne mus. Der var 68 ud af 99 (68,7% take rate) tumorer, der voksede i mus og blev passeret i flere generationer. derer flere grunde til, at nogle tumorer, som vi modtog ikke vokser i mus. For eksempel, nogle gange fik vi kun meget små stykker af væv, der kun tillod os at tilføre kun én mus faldende chancerne for at etablere en tumor. Et andet problem var, at til tider fik vi patient væv, der var normalt og ikke indeholdt tumorceller tydelige på H & E slide. Desuden kan nogle fattige væv kvalitet skyldes modtage allerede necrosed tumor, hvor der var en patientens respons på behandlingen. Derfor er det vigtigt at have en pålidelig kirurgisk og patologi hold når opregning tumoren. I betragtning af nogle af disse spørgsmål, har vi været i stand til at etablere en af de største CRC PDTX bredden af fuldt kommenterede tumorer med hensyn til mutationer, genekspression, og kliniske karakteristika, hvilket gør dette en værdifuld model til vurdering af nye behandlingsformer med det endelige mål at forbedre patientresultater.
Talrige biologiske og kombinatoriskbehandling er blevet undersøgt i denne model med det formål at fastlægge effekten, lægemiddel resistensmekanismer, samt behandlingseffekt på kræft stamcellepopulation. Vores gruppe har undersøgt effekten af en lang række nye biologiske pathway hæmmere ved hjælp af denne prækliniske model 12-18, som har givet værdifuld indsigt i videre klinisk udvikling af disse forbindelser. Mange af disse undersøgelser har identificeret prædiktive biomarkører 12-14,17,18 som kan støtte i patientudvælgelse i fremtidige kliniske forsøg. Desuden har andre undersøgelser bestemmes yderligere mekanismer behandling resistens ved hjælp af denne model, hvilket har ført til udviklingen af rationelle kombinationer 19-24. For eksempel Bardelli og kolleger 19 viste, at cetuximab behandling induceret MET forstærkning og at Met kan være en underliggende mekanisme for behandling modstand mod cetuximab i CRC. 19 I en separat undersøgelse, Bertotti et al. 20identificeret Her2 som et mål i CRC tumorer, der var resistente over for cetuximab. Endelig har vi og en anden gruppe vist, at behandling med en Notch pathway inhibitor i kombination med irinotecan reduceret CRC cancer stamcellepopulation og tumor tilbagefald efter behandlingens ophør 25,26. Tilsammen udgør disse undersøgelser viser den potentielle magt for at udnytte PDTX modeller i udviklingsprocessen stof, der i væsentlig grad kan påvirke den videre udvikling af nye forbindelser.
Trods de store fordele ved anvendelse patientens afledte tumorer ved bestemmelse af effektiviteten af nye forbindelser, der er flere begrænsninger i denne model. Som vist eksperimentelt i dette dokument, er den humane stroma fra tumoren oprindelse (F0) erstattet med musen stroma ved F1-generationen i CRC PDTX model. Afhængigt af den bestemte lægemiddelmål, kan dette være et problem, når muse ligander er i stand til at aktivere receptor (er) på humane tumorceller. For instance viser vi, at i F1-generationen, er HGF afledt af muse stroma og undersøgelser har fastslået, at muse HGF er ude af stand til funktionelt at aktivere den humane c-Met receptor 27,28. Som et resultat heraf kan c-Met-inhibitorer ikke udviser anti-tumorvækst virkninger i disse PDTX modeller. Faktisk er der blevet udviklet humaniserede HGF SCID-mus for at løse dette potentielle problem 28. En anden ulempe ved anvendelse af subkutane tumorer er den manglende evne til at studere behandlingspåvirkning af metastatiske potentiale tumorer. Ved hjælp ortotopisk modeller, selv om mere teknisk vanskeligt at etablere og billede tumorvækst, vil sandsynligvis give bedre indsigt i behandlingen effekter på metastaser. En endelig begrænsning af denne model er den manglende evne til at undersøge rollen af immunsystemet i potentiering tumorvækst og dens opgave med at lette resistens. Desuden med den fremragende aktivitet af immunoterapi nylig vist i klinikken, ved hjælp immunodeficient mus forhindrer undersøgelse af immune målrettede midler. Derfor er der udviklet humaniseret musemodeller til at løse disse begrænsninger, som kan give værdi i at forstå den grundlæggende rolle immun-tumor interaktioner samt give mulighed for undersøgelse af immunterapier i kombination med andre nye og godkendte forbindelser.
Afslutningsvis giver vi en metode på at udvikle og fastholde en CRC PDTX model, der er uvurderlig i at bestemme terapeutisk effekt, prædiktive biomarkører og lægemiddelresistens veje for nye anti-cancer. Selv om denne model har iboende udfordringer, anvendeligheden af denne model er, at den nøje rekapitulerer tumor heterogenitet af den oprindelige tumor, som indeholder en mere præcis og klinisk relevant undersøgelse af nye behandlingsformer førend klinisk evaluering. Fremtidig evaluering af den kliniske effekt i lægemiddeludvikling af denne prækliniske PDTX model vil i sidste ende bestemme kraften i dennemodel til at forudsige den kliniske aktivitet af behandlinger i cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI or DMEM | Corning | 10-040-CV | |
| Penicillin-Streptomycin | Corning | 30-002-CI | |
| Non-essential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| Fetal Bovine Serum | Corning | 35-010-CV | Thaw in -4 °C, then activate for 30 min at 60 °C water bath |
| CPT blood tube | BD vacutainer | 362761 | |
| Microcentrifuge tube | Surelock | A-7002 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Corning | 21-040-CV | |
| Cyrogenic vials | Cyroking | C0732901 | |
| Plastic tumor cutting dish | Trueline | TR4001 | |
| Scissors | Roboz | RS-5881 | |
| Forceps | Roboz | RS-5135 | |
| Matrigel (gelatinous protein mixture) | Corning | 354234 | Store at -20 or -80 °C, then thaw on ice, do not leave at RT |
| 10% Formalin cups | Protocol | 032-059 | |
| Liquid Nitrogen Dewar Storage | Thermolyne | CY50900 | |
| Portable liquid nitrogen dewar | Nalgene | 4150-2000 | |
| Dimethyl Sulfoxide | Fischer | 67-68-5 | |
| Freezing container: Mr Frosty | Nalgene | 5100-0001 | |
| Isopropyl Alcohol | Decon | 64-17-5 | |
| Trocars | Innovative Research of America | MP-182 | |
| Anesthesia machine | Patterson Veterinary | ||
| Anesthesia box | Patterson Veterinary | ||
| Isoflurane | Vet one | 1038005 | |
| F-Air Canister | Bickford Omnicon | 80120 | |
| Meloxicam | Vet one | 5182-90C | |
| Calipers | Fowler | 54-100-167 | |
| Weight scale | Ohaus | Scout Pro SP601 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics. 2015. CA Cancer J Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
- Comprehensive molecular characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 487 (7407), 330-337 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. Tumours with elevated levels of the Notch and Wnt pathways exhibit efficacy to PF-03084014, a gamma-secretase inhibitor, in a preclinical colorectal explant model. Br J Cancer. 109 (3), 667-675 (2013).
- Hubbard, J., Grothey, A. Antiangiogenesis agents in colorectal cancer. Curr Opin Oncol. 22 (4), 374-380 (2010).
- van Es, J. H., et al. Notch/gamma-secretase inhibition turns proliferative cells in intestinal crypts and adenomas into goblet cells. Nature. 435 (7044), 959-963 (2005).
- Cassidy, J. W., Caldas, C., Bruna, A. Maintaining Tumor Heterogeneity in Patient-Derived Tumor Xenografts. Cancer Res. 75 (15), 2963-2968 (2015).
- Jin, K., et al. Patient-derived human tumour tissue xenografts in immunodeficient mice: a systematic review. Clin Transl Oncol. 12 (7), 473-480 (2010).
- Julien, S., et al. Characterization of a large panel of patient-derived tumor xenografts representing the clinical heterogeneity of human colorectal cancer. Clin Cancer Res. 18 (19), 5314-5328 (2012).
- Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
- Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
- Carson, F. L. Histotechnology: A Self-Assessment Workbook. , American Society of Clinical Pathologists Press. Chicago, IL. (1996).
- Arcaroli, J. J., et al. Common PIK3CA mutants and a novel 3' UTR mutation are associated with increased sensitivity to saracatinib. Clin Cancer Res. 18 (9), 2704-2714 (2012).
- Arcaroli, J. J., et al. A NOTCH1 gene copy number gain is a prognostic indicator of worse survival and a predictive biomarker to a Notch1 targeting antibody in colorectal cancer. Int J Cancer. 138 (1), 195-205 (2016).
- Arcaroli, J. J., et al. Gene array and fluorescence in situ hybridization biomarkers of activity of saracatinib (AZD0530), a Src inhibitor, in a preclinical model of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 16 (16), 4165-4177 (2010).
- Lieu, C. H., et al. Antitumor activity of a potent MEK inhibitor, TAK-733, against colorectal cancer cell lines and patient derived xenografts. Oncotarget. 6 (33), 34561-34572 (2015).
- Pitts, T. M., et al. Association of the epithelial-to-mesenchymal transition phenotype with responsiveness to the p21-activated kinase inhibitor, PF-3758309, in colon cancer models. Front Pharmacol. 4, 35 (2013).
- Song, E. K., et al. Potent antitumor activity of cabozantinib, a c-MET and VEGFR2 inhibitor, in a colorectal cancer patient-derived tumor explant model. Int J Cancer. 136 (8), 1967-1975 (2015).
- Tentler, J. J., et al. Identification of predictive markers of response to the MEK1/2 inhibitor selumetinib (AZD6244) in K-ras-mutated colorectal cancer. Mol Cancer Ther. 9 (12), 3351-3362 (2010).
- Bardelli, A., et al. Amplification of the MET receptor drives resistance to anti-EGFR therapies in colorectal cancer. Cancer Discov. 3 (6), 658-673 (2013).
- Bertotti, A., et al. A molecularly annotated platform of patient-derived xenografts ("xenopatients") identifies HER2 as an effective therapeutic target in cetuximab-resistant colorectal cancer. Cancer Discov. 1 (6), 508-523 (2011).
- Davis, S. L., et al. Combined inhibition of MEK and Aurora A kinase in KRAS/PIK3CA double-mutant colorectal cancer models. Front Pharmacol. 6, 120 (2015).
- Morelli, M. P., et al. Preclinical activity of the rational combination of selumetinib (AZD6244) in combination with vorinostat in KRAS-mutant colorectal cancer models. Clin Cancer Res. 18 (4), 1051-1062 (2012).
- Pitts, T. M., et al. Dual pharmacological targeting of the MAP kinase and PI3K/mTOR pathway in preclinical models of colorectal cancer. PLoS One. 9 (11), e113037 (2014).
- Spreafico, A., et al. Rational combination of a MEK inhibitor, selumetinib, and the Wnt/calcium pathway modulator, cyclosporin A, in preclinical models of colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (15), 4149-4162 (2013).
- Arcaroli, J. J., et al. ALDH+ tumor-initiating cells exhibiting gain in NOTCH1 gene copy number have enhanced regrowth sensitivity to a gamma-secretase inhibitor and irinotecan in colorectal cancer. Mol Oncol. 6 (3), 370-381 (2012).
- Hoey, T., et al. DLL4 blockade inhibits tumor growth and reduces tumor-initiating cell frequency. Cell Stem Cell. 5 (2), 168-177 (2009).
- Ikebuchi, F., et al. Dissociation of c-Met phosphotyrosine sites in human cells in response to mouse hepatocyte growth factor but not human hepatocyte growth factor: the possible roles of different amino acids in different species. Cell Biochem Funct. 31 (4), 298-304 (2013).
- Zhang, Y. W., et al. Enhanced growth of human met-expressing xenografts in a new strain of immunocompromised mice transgenic for human hepatocyte growth factor/scatter factor. Oncogene. 24 (1), 101-106 (2005).
