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Bioengineering

एकल या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर प्रतिक्रियाएँ के अध्ययन के लिए microfluidic उपकरणों डिजाइनिंग

Published: August 13, 2016 doi: 10.3791/54397
Automatic Translation
1, 2, 3, 1, 1, 3, 1
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Abstract

Microfluidic उपकरणों पीएच, तापमान, नमक एकाग्रता, और अन्य शारीरिक या रासायनिक उत्तेजनाओं की एक सटीक और चलाया सेलुलर सूक्ष्म वातावरण बनाने में सक्षम हैं। वे आमतौर पर परिवेश की तरह विवो में प्रदान करके इन विट्रो सेल के अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया गया है। विशेष रूप से, कैसे कोशिकाओं रासायनिक ढ़ाल, बिजली के क्षेत्रों, और कतरनी तनाव के लिए प्रतिक्रिया कई हितों तैयार की गई है के बाद से इन घटनाओं सेलुलर गुण और कार्यों को समझने में महत्वपूर्ण हैं। इन चिप्स microfluidic ग्लास substrates, सिलिकॉन वेफर्स, polydimethylsiloxane (PDMS) पॉलिमर, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, या polyethyleneterephthalate (पीईटी) substrates के बनाया जा सकता है। इन सामग्रियों में से PMMA substrates सस्ते होते हैं और आसानी से लेजर पृथक और लेखन का उपयोग कर कार्रवाई की जा सकती। हालांकि कुछ microfluidic उपकरणों के लिए डिज़ाइन किया गया है और गढ़े, कई पैदा रासायनिक और बिजली उत्तेजनाओं coexisting के लिए, उनमें से कोई भी विचार किया गया थापर्याप्त प्रयोगात्मक दोहराता है, स्क्रीनिंग प्रयोजनों के लिए विशेष रूप से कम करने में कुशल है। इस रिपोर्ट में, हम प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन और प्रवास में सेलुलर प्रतिक्रियाओं की जांच के लिए हमारे डिजाइन और दो PMMA आधारित microfluidic चिप्स के निर्माण का वर्णन है, एक या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत। पहली चिप के पांच रिश्तेदार सांद्रता उत्पन्न 0, 1/8, 1/2, 7/8, और संस्कृति के क्षेत्रों में 1, एक साथ एक कतरनी तनाव ढाल इन क्षेत्रों में से प्रत्येक के अंदर उत्पादन के साथ। दूसरी चिप ही रिश्तेदार सांद्रता उत्पन्न करता है, लेकिन पाँच अलग अलग बिजली के क्षेत्र में प्रत्येक संस्कृति के क्षेत्र के भीतर बनाया ताकत के साथ। इन उपकरणों को न केवल एक सटीक, सूक्ष्म चलाया पर्यावरण के साथ कोशिकाओं को प्रदान लेकिन यह भी बहुत प्रयोगात्मक throughput वृद्धि हुई है।

Introduction

इन विवो कोशिकाओं बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम), कार्बोहाइड्रेट, वसा, और अन्य कोशिकाओं सहित biomolecules की एक किस्म से घिरे हैं। वे इस तरह के और विभिन्न विकास कारकों की रासायनिक ढ़ाल के लिए ईसीएम के साथ बातचीत प्रतिक्रियाओं के रूप में सूक्ष्म पर्यावरण उत्तेजनाओं का जवाब देने से functionalize। परंपरागत रूप से, इन विट्रो सेल के अध्ययन सेल संस्कृति बर्तन में आयोजित की जाती हैं, जहां कोशिकाओं और अभिकर्मकों की खपत बड़ी है और कोशिकाओं को एक स्थिर में बढ़ने (गैर-घूम) पर्यावरण। हाल ही में, सूक्ष्म गढ़े fluidic घटकों के साथ एकीकृत उपकरणों के लिए एक अधिक चलाया रास्ते में सेल के अध्ययन के लिए एक वैकल्पिक मंच प्रदान किया है। इस तरह के उपकरणों रासायनिक और भौतिक उत्तेजनाओं की एक सटीक सूक्ष्म वातावरण बनाने के दौरान कोशिकाओं और अभिकर्मकों की खपत को कम करने में सक्षम हैं। (PDMS) पॉलिमर, polymethylmethacrylate (PMMA) substrates, या polyethylenetere ये microfluidic चिप्स ग्लास substrates, सिलिकॉन वेफर्स, polydimethylsiloxane का बनाया जा सकताphthalate (पीईटी) 1-3 substrates। PDMS आधारित उपकरणों, पारदर्शी biocompatible, और गैसों के लिए प्रवेश के योग्य हैं, उन्हें लंबे समय तक सेल संस्कृति और अध्ययन के लिए उपयुक्त बना रही है। PMMA और पीईटी substrates सस्ता और आसान लेजर पृथक और लेखन का उपयोग संसाधित किया जाना है।

Microfluidic उपकरणों के लिए एक स्थिर और चलाया सूक्ष्म वातावरण जहां कोशिकाओं विभिन्न रासायनिक और शारीरिक उत्तेजनाओं के अधीन हैं के साथ कोशिकाओं को प्रदान करना चाहिए। उदाहरण के लिए, चिप्स microfluidic कोशिकाओं की chemotaxis अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इसके बजाय पारंपरिक तरीकों को रोजगार कि Boyden कक्ष और केशिका 4,5 इन छोटी fluidic उपकरणों कोशिकाओं के व्यवहार के अध्ययन के लिए 1,6,7 सटीक रासायनिक ढ़ाल उत्पन्न कर सकते हैं। एक अन्य उदाहरण बिजली क्षेत्र (EFS), एक घटना नामित electrotaxis के तहत 'कोशिकाओं दिशात्मक प्रवास का अध्ययन करने के लिए है। कोशिकाओं के व्यवहार Electrotactic सूचित किया गया तंत्रिका उत्थान 8, 9 भ्रूण विकास से संबंधित हो,और चिकित्सा 10,11 घाव। और कई अध्ययनों, 14,15 लिम्फोसाइटों, कैंसर की कोशिकाओं 12,13 सहित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के electrotaxis जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया है ल्यूकेमिया कोशिकाओं 11, और 16 कोशिकाओं स्टेम। पारंपरिक, पेट्री डिश और कवर चश्मा EFS 17 पैदा करने के लिए electrotactic कक्षों के निर्माण के लिए उपयोग किया जाता है। इस तरह के सरल setups मध्यम वाष्पीकरण और imprecise EFS की समस्या पैदा, लेकिन वे संलग्न, अच्छी तरह से परिभाषित fluidic चैनलों 12,18,19 की microfluidic उपकरणों से दूर किया जा सकता है।

योजनाबद्ध तरीके से सटीक, चलाया हुआ रासायनिक और बिजली उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए, यह बहुत अच्छा microfluidic एक ही समय में कई उत्तेजनाओं के साथ कोशिकाओं को उपलब्ध कराने में सक्षम उपकरणों को विकसित करने का होगा। उदाहरण के लिए, ली एट अल। एकल बनाने या रासायनिक ढ़ाल और EFS 20 coexisting के लिए एक PDMS आधारित microfluidic युक्ति की सूचना दी। काओ एट अल। देवEFS 6 से फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की chemotaxis मिलाना के लिए एक समान microfluidic चिप भाग गई। इसके अलावा, throughput, Hou एट अल बढ़ाने के लिए। बनाया गया है और 8 अलग संयुक्त उत्तेजनाओं, किया जा रहा है (2 एफई ताकत एक्स 4 रासायनिक सांद्रता), 21 के साथ कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए एक PMMA आधारित मल्टीचैनल-दोहरे बिजली क्षेत्र चिप गढ़े। आगे बढ़ाने के लिए और पूरे कतरनी तनाव प्रोत्साहन जोड़ने के लिए, हम एक या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए दो PMMA आधारित microfluidic उपकरणों का विकास किया।

लो एट अल। 22,23 द्वारा रिपोर्ट, इन उपकरणों के पांच स्वतंत्र सेल संस्कृति निरंतर fluidic बहने के अधीन चैनल, विवो संचार प्रणाली की नकल उतार होते हैं। पहली चिप (रासायनिक-कतरनी तनाव चिप या सीएसएस चिप), 0 से पांच रिश्तेदार सांद्रता, 1/8, 1/2, 7/8, और 1 में संस्कृति क्षेत्रों में उत्पन्न कर रहे हैं, और एक कतरनी तनाव ढाल है उत्पादों होगापांच संस्कृति क्षेत्रों में से प्रत्येक के अंदर ced। दूसरी चिप (रासायनिक बिजली के क्षेत्र चिप या CEF चिप), इलेक्ट्रोड का एक ही सेट और 2 सिरिंज पंप का उपयोग करके, पांच एफई ताकत इन संस्कृति क्षेत्रों के भीतर पांच विभिन्न रासायनिक सांद्रता के अलावा उत्पन्न कर रहे हैं। संख्यात्मक गणना और सिमुलेशन बेहतर डिजाइन करने के लिए प्रदर्शन कर रहे हैं और इन चिप्स काम करते हैं, और फेफड़ों के कैंसर के इन उपकरणों के अंदर संवर्धित कोशिकाओं प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पादन के संबंध में अपनी प्रतिक्रिया के अवलोकन के लिए एकल या coexisting उत्तेजनाओं (आरओएस) के अधीन हैं, प्रवास दर, और प्रवास दिशा। इन चिप्स समय की बचत, उच्च throughput और विश्वसनीय उपकरणों की जांच कैसे कोशिकाओं विभिन्न सूक्ष्म पर्यावरण उत्तेजनाओं का जवाब के लिए होने का प्रदर्शन कर रहे हैं।

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Protocol

1. चिप डिजाइन और निर्माण

  1. ड्रा पैटर्न PMMA substrates और डबल साइड टेप वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग करने पर 24 ablated किया जाना है।
    1. रासायनिक सांद्रता और कतरनी तनाव के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, पांच संस्कृति के क्षेत्रों (चित्रा 1 ए और 1 बी) में से प्रत्येक में उसके अंत में एक अलग चौड़ाई के साथ एक "क्रिसमस का पेड़" पैटर्न आकर्षित।
    2. रासायनिक सांद्रता और बिजली क्षेत्र के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, नमक पुलों के लिए दो और fluidic चैनल (चित्रा 2A और 2 बी) के साथ एक "क्रिसमस का पेड़" पैटर्न आकर्षित।
  2. मुंशी एक PMMA शीट या सीओ 2 लेजर खुरचने का औजर में संबंधित फ़ाइल लोड करके एक डबल साइड टेप पर एक व्यक्ति के पैटर्न।
    1. लेजर खुरचने का औजर चालू करें, और कंप्यूटर के लिए अपने कनेक्शन की जाँच करें। पैटर्न खोलें वाणिज्यिक सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ablated किया जाना है।
    2. एक PMMA शीट या एक डबल पक्षीय टेप ओ रखेंखुरचने का औजर के मंच के एन शीर्ष। यदि आवश्यक हो तो अंशांकन बार दिखाई और वह-ने लेजर का उपयोग करते हुए सीओ 2 लेजर का ध्यान केंद्रित को समायोजित करें।
    3. PMMA शीट या टेप पर पृथक के लिए खुरचने का औजर में पैटर्न लोड।
    4. , नमूनों चादर या टेप उठाओ अवांछित टुकड़े को हटाने, और नाइट्रोजन उड़ाने के साथ सतह को साफ।
      नोट: PMMA शीट की मोटाई 1 मिमी है, और डबल पक्षीय टेप की है कि 0.07 मिमी या 0.22 मिमी है।

2. चिप विधानसभा

  1. सुपर गोंद के साथ शीर्ष पर पेंच धागे और छेद aligning से सर्वोच्च चिप की परत करने के लिए एक्रिलिक एडेप्टर (लंबाई x चौड़ाई x ऊँचाई = 10 मिमी x 10 मिमी x 5 मिमी, बीच में पेंच धागे के साथ) संलग्न अधिकांश परत। ये एडाप्टर मध्यम inlets / दुकानों और नमक पुल कनेक्टर्स के रूप में सेवा करते हैं।
  2. एक लामिना का प्रवाह हुड के अंदर microfluidic चिप इकट्ठा करो।
  3. रासायनिक कतरनी तनाव microfluidic चिप (सीएसएस चिप) इकट्ठा करो।
    1. एttach मानते डबल पक्षीय टेप के 2 टुकड़े का उपयोग कर मानते PMMA शीट के 3 चादरें। (चित्रा 1 ए और 1 बी)।
    2. चिप के नीचे करने के लिए 0.07 मिमी मोटी डबल पक्षीय टेप का एक और टुकड़ा जोड़ने और एक 10 सेमी व्यास पेट्री डिश के लिए चिप देते हैं।
    3. रात भर के लिए निर्वात चैम्बर में विधानसभा चिप डाल।
  4. = 0.22 मिमी (चित्रा 2A और 2 बी) रासायनिक बिजली के क्षेत्र चिप (CEF चिप) को इकट्ठा करने के लिए, मोटाई की एक डबल पक्षीय टेप करने के लिए PMMA शीट देते हैं।
    1. scribed PMMA शीट और टेप के इस एक ही टुकड़े का उपयोग कर एक 10 सेमी व्यास पेट्री डिश के लिए दो तरफा टेप संलग्न।
  5. हुड के अंदर इकट्ठे चिप छोड़ दें और इसे बेनकाब नसबंदी के लिए 30 मिनट के लिए यूवी करने के लिए।
  6. प्लास्टिक ट्यूब और उंगली से तंग नट के माध्यम से दो 3 मिलीलीटर सीरिंज को inlets कनेक्ट करें। एक प्लास्टिक ट्यूब और एक उंगली से तंग अखरोट के माध्यम से बर्बादी ट्यूब के आउटलेट से कनेक्ट करें।
    नोट: आटोक्लेवउपयोग करने से पहले 15 मिनट के लिए सभी ट्यूबों और 121 डिग्री सेल्सियस पर पागल।
  7. धीरे-धीरे प्रधानमंत्री पीबीएस के साथ fluidic चैनलों के लिए सिरिंज पर सवार दबाना। बुलबुले को दूर करने के लिए आगे और पीछे सीरिंज पुश।
  8. चिप्स 5% सीओ 2 के तहत 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर एक मशीन के अंदर डाल दिया।
    नोट: ये दो कदम चिप के भीतर चिप धोने और किसी भी शेष बुलबुले को दूर करने के उद्देश्य से कर रहे हैं।
  9. इनक्यूबेटर से बाहर चिप ले लो।
  10. CEF चिप में बिजली क्षेत्र पैदा करने के लिए अगर नमक पुलों तैयार करें।
    1. एक माइक्रोवेव का उपयोग कर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) बफर में 3% कम पिघलने बिंदु agarose भंग।
    2. समाधान चरणबद्ध नमक पुल चैनल में agarose इंजेक्षन और इससे पहले कि समाधान solidifies इलेक्ट्रोड डालें।
    3. चांदी / चांदी क्लोराइड इलेक्ट्रोड ट्यूबलर नट्स में रखें।
  11. सिरिंज पंप करने के लिए सीरिंज कनेक्ट करें, और लगातार संस्कृति के माध्यम से प्रवाह (Dulbecco संशोधित EagleR17 की मध्यम, DMEM) 20 μl के प्रवाह की दर पर 10 मिनट के लिए fluidic चैनल में / मिनट पीबीएस बदलने के लिए।

3. सेल तैयार करना और प्रायोगिक सेटअप

नोट: पूर्व गर्म 1x पीबीएस, संस्कृति मध्यम (DMEM प्लस एफबीएस), और trypsin उपयोग से पहले एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में।

  1. प्लेट 2 एक्स 10 5 फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को CL1-5 DMEM प्लस 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ आपूर्ति की एक 10 सेमी पेट्री डिश में 25,26। 90% संगम तक 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के तहत एक मशीन के अंदर कोशिकाओं को सेते हैं।
  2. मध्यम Aspirate और पूर्व गर्म 1x पीबीएस के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें। कोशिकाओं को 0.05% trypsin बफर के 2 मिलीलीटर जोड़ें और कोशिकाओं को अलग करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 से 3 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
  3. एक 15 मिलीलीटर बाँझ centrifugation ट्यूब कोशिकाओं स्थानांतरण और ट्यूब में संस्कृति के माध्यम से 6 मिलीलीटर जोड़ें। धीरे मिश्रण के लिए ट्यूब पलटना और एक hemocytomete में सेल संख्या की गणना के लिए सेल युक्त मध्यम के 5 μl बाहर लेआर।
  4. पर 300 x ट्यूब अपकेंद्रित्र 5 मिनट के लिए जी। संस्कृति के माध्यम से 1 मिलीलीटर में 10 6 कोशिकाओं को निलंबित और एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में सेल युक्त मध्यम जगह है।
  5. दुकान से microfluidic चिप में सेल युक्त मध्यम दिखे और सुनिश्चित करें कि समाधान पांच संस्कृति क्षेत्रों के माध्यम से सभी वितरित करते हैं। 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के तहत एक मशीन के अंदर चिप सेते हैं।

4. प्रायोगिक सेटअप

  1. इनक्यूबेटर से बाहर चिप ले लो और एक पारदर्शी इंडियम टिन ऑक्साइड (आईटीओ) गिलास हीटर के शीर्ष पर जगह है।
    नोट: आईटीओ कांच एक थर्मल युग्मक से प्रतिक्रिया के माध्यम से 37 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर बनाए रखने के लिए एक आनुपातिक-अभिन्न-व्युत्पन्न (पीआईडी) नियंत्रक से जुड़ा है आईटीओ हीटर और चिप के बीच कसकर clamped।
  2. सेल प्रवास या की एक निश्चित XY मंच पर नज़र रखने के लिए एक औंधा माइक्रोस्कोप की एक मोटर चालित XY मंच के शीर्ष पर चिप हीटर विधानसभा रखोआरओएस के उत्पादन को मापने के लिए एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप।
  3. विभिन्न रासायनिक सांद्रता उत्पन्न करने के लिए, (मध्यम संस्कृति में भंग) रिश्तेदार सांद्रता 0 और 1 का रासायनिक समाधान के 5 मिलीलीटर के साथ दो सीरिंज को भरने और उन्हें वांछित प्रवाह दरों पर चिप में पंप: सीएसएस चिप में 0.3 मिलीलीटर की एक प्रवाह दर पर / 1 घंटे के लिए मिनट; CEF चिप, पहले 20 मिनट के लिए 20 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर और एक अन्य 120 मिनट (कुल समय = 2 घंटा) के लिए 20 μl / घंटा की एक प्रवाह की दर में।
  4. CEF चिप में, सेल प्रवास, कार्यक्रम माइक्रोस्कोप की XY मंच तस्वीरें लेने को दोहराने के लिए ट्रैकिंग, एक डिजिटल एकल लेंस पलटा के माध्यम से (DSLR) कैमरा, (FOVs) व्यू के कुछ क्षेत्र की संस्कृति के क्षेत्रों 2 के लिए हर 15 मिनट के भीतर के लिए मानव संसाधन।
  5. आरओएस के उत्पादन को मापने के लिए, प्रतिदीप्ति आधारित सूचक 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate (2'-7'-DCFDA) का उपयोग करें।
    1. आणविक जीव विज्ञान ग्रेड di में 10 मिमी पर 2'-7'-DCFDA का स्टॉक तैयारमिथाइल sulfoxide (DMSO)। केवल सीरम (DMEM में 5 माइक्रोन) के बिना DMEM में DCFDA पतला। संभावित deacetylase पृष्ठभूमि संकेतों को बढ़ाने और कोशिकाओं में संकेतों को कम कर सकता है।
    2. सीएसएस चिप में या CEF चिप में एफई प्रोत्साहन के 2 घंटे के बाद कतरनी तनाव प्रोत्साहन के 1 घंटे के बाद, 20 μl / मिनट की एक प्रवाह की दर के लिए कम से चिप में 2'-7'-DCFDA (DMEM में 5 माइक्रोन) के पंप पहले 20 मिनट और एक और 20 मिनट के लिए 20 μl / घंटा की एक प्रवाह की दर। कपड़े धोने के लिए, 20 मिनट के लिए 20 μl / घंटा की एक प्रवाह दर पर चिप में DMEM पंप।
    3. फ्लोरोसेंट तीव्रता का विश्लेषण करने के लिए संस्कृति के क्षेत्रों के भीतर कुछ FOVs के एक आरोप युग्मित डिवाइस (सीसीडी) कैमरा के माध्यम से तस्वीरें ले लो,।

5. रासायनिक सांद्रता, कतरनी तनाव, और बिजली क्षेत्र की गणना

  1. दोनों सीएसएस चिप और CEF चिप में, पांच संस्कृति क्षेत्रों में रासायनिक सांद्रता की गणना। उदाहरण के लिए, concentr के एच 2 ओ 2 इंजेक्शन द्वाराations 0 और दो inlets से 200 माइक्रोन के, 0, 25, 100, 175, और 200 माइक्रोन के उत्पन्न कर रहे हैं सांद्रता।
    नोट: यह सोचते हैं कि सभी तरल पदार्थ विभाजित प्रवाह सुचारू रूप से और भी उतना ही कांटा चारों ओर से पांच संस्कृति क्षेत्रों में रिश्तेदार सांद्रता क्रमशः रहे हैं 0, 1/8, 1/2, 7/8, और 1,।
  2. सीएसएस चिप में, का उपयोग करते हुए संस्कृति क्षेत्रों में से प्रत्येक के भीतर कतरनी तनाव (τ) की गणना 1 समीकरण 27, जहां क्यू मात्रा प्रवाह की दर, η fluidic चिपचिपापन है, ज चैनल की ऊंचाई है, और w चैनल की चौड़ाई है।
    नोट:, प्रत्येक इनलेट (क्यू = 0.12 मिलीग्राम / प्रत्येक संस्कृति क्षेत्र में मिनट) में क्यू = 0.3 मिलीग्राम / मिनट की स्थापना करके η = 0.0008 पा · एस संस्कृति के माध्यम से, ज = 1 मिमी, और w = 1 ~ 4 मिमी, के लिए कतरनी तनाव .0048 Pa (4 मिमी चौड़े क्षेत्र) .0192 Pa (1 मिमी चौड़े क्षेत्र) से लेकर गणना की जाती है।
  3. मेंCEF चिप, ई = मैं / (σA eff) (ओम कानून) है, जहां मैं विद्युत प्रवाह fluidic चैनल पार बह रहा है का उपयोग करते हुए संस्कृति क्षेत्रों में से प्रत्येक के भीतर एफई शक्ति की गणना, σ संस्कृति के माध्यम से विद्युत चालकता है, और एक eff चैनल के प्रभावी पार के अनुभागीय क्षेत्र है।
    नोट: का प्रयोग σ = 1.38 Ω -1 एम -1 संस्कृति मध्यम और एक eff = 0.22 मिमी 2 (चौड़ाई = 1 मिमी और ऊंचाई = 0.22 मिमी) के लिए, एफई ताकत ई (एम वी / मिमी) = मैं (होने की गणना की जाती है ए) × 3.3 × 10 6।
    1. जैसा कि चित्र 2 डी में दिखाया गया है, चार (8 + 35 + 8) क्षेत्रों और एक (5 + 35 + 5) खंड के साथ के रूप में पांच सीजेरियन सर्किट समकक्ष सर्किट का इलाज।
      ध्यान दें: Kirchhoff के वोल्टेज कानून और ओम कानून के अनुसार इस समानांतर सर्किट का विश्लेषण करके, पांच संस्कृति भर में बहती धाराओं हैंके रूप में मैं मैं 5 नीचे से ऊपर के माध्यम से 1, चारों ओर 0.49 मैं (क्षेत्र 1) होने की गणना कर रहे हैं, 0.25 मैं (क्षेत्र) 2, 0.13 मैं (क्षेत्र) 3, 0.08 मैं (क्षेत्र 4), और 0.05 मैं (क्षेत्र 5), क्रमशः है, जहां मैं कुल प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) है। 0.157 मा, 254 की EFS, 130, 67, 41, और 26 एम वी / मिमी लागू किया डीसी के साथ पांच संस्कृति क्षेत्रों के भीतर उत्पन्न कर रहे हैं।
      नोट: microfluidic नेटवर्क का एक सरलीकृत बिजली के विश्लेषण के लिए, सभी fluidic खंडों प्रतिरोध उनकी लंबाई के लिए आनुपातिक साथ प्रतिरोधों के रूप में माना जाता है।

6. डेटा विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण ImageJ सॉफ्टवेयर का उपयोग किया जाता है।

  1. आरओएस के उत्पादन का विश्लेषण।
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर चलाते हैं। एक फ्लोरोसेंट छवि को लोड करने के लिए "फाइल" → खुला जाना विश्लेषण किया जा सके।
    2. im बदलने के लिए "छवि" → "प्रकार" → "16-बिट" जाओएक ग्रे स्केल करने के लिए उम्र।
    3. एक सेल लगा देना करने के लिए एक बहुभुज ड्रा। सेल का मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता को मापने के लिए "विश्लेषण" → "उपाय" जाओ।
    4. 6.1.3 दोहराएँ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के कम से कम 50 कोशिकाओं से तीव्रता जमा है, और मतलब की मानक त्रुटि (SEM) के साथ मतलब तीव्रता गणना करने के लिए।
    5. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए 6.1.1-6.1.4 दोहराएँ।
  2. सेल प्रवास का विश्लेषण।
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर चलाते हैं। एक छवि समय = 0 पर लिया लोड करने के लिए "फाइल" → खुला जाना विश्लेषण किया जा सके।
    2. एक सेल लगा देना करने के लिए एक बहुभुज ड्रा। (एक्स 1, y 1) के रूप में सेल के द्रव्यमान का केंद्र को मापने के लिए "विश्लेषण" → "उपाय" जाओ।
    3. दोहराएँ 6.2.1- 6.2.2 के रूप में एक छवि से एक ही सेल के द्रव्यमान का केंद्र (एक्स 2, वाई 2) को मापने के लिए समय में ले = टी।
    4. के पलायन की दर (माइक्रोन / घंटा में) की गणनाइस सेल के रूप में 2 समीकरण ।
    5. 6.2.1-6.2.4 दोहराएँ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के कम से कम 50 कोशिकाओं से पलायन दरों जमा है, और मतलब की मानक त्रुटि (SEM) के साथ मतलब पलायन दर की गणना करने के लिए।
    6. 6.2.2 और 6.2.3 से, कोज्या θ के रूप में इस सेल के प्रवास के directedness गणना या 3 समीकरण , जहां θ एप्लाइड एफई के वेक्टर के बीच कोण (सकारात्मक से नकारात्मक) और सेल (चित्रा 2 जी) के अंत की स्थिति के लिए शुरू से ही वेक्टर है।
    7. 6.2.6 दोहराएँ तीन स्वतंत्र प्रयोगों के कम से कम 50 कोशिकाओं से पलायन directedness जमा है, और मतलब की मानक त्रुटि (SEM) के साथ मतलब प्रवास directedness गणना करने के लिए।
    8. SEM के साथ मतलब पलायन की दर और प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए SEM के साथ मतलब प्रवास directedness की गणना।
      नोट: एक directedness+1 का संकेत देता है कि सभी कोशिकाओं कैथोड की ओर पलायन, और एक -1 मूल्य इंगित करता है कि सभी कोशिकाओं एनोड की ओर पलायन। बेतरतीब ढंग से आगे बढ़ कोशिकाओं का एक समूह की directedness 0 के करीब है।
  3. सेल संरेखण का विश्लेषण।
    1. ImageJ सॉफ्टवेयर चलाते हैं। एक छवि लोड करने के लिए "फाइल" → "ओपन" पर जायें विश्लेषण किया जा सके।
    2. एक अंडाकार रूप में सेल दावत और एक सेल की लंबी अक्ष इंगित करने के लिए एक रेखा खींचना। रेखा और क्षैतिज एफई दिशा के बीच β कोण को मापने के लिए "विश्लेषण" → "उपाय" जाओ।
    3. दोहराएँ 6.3.2 तीन स्वतंत्र प्रयोगों के कम से कम 50 कोशिकाओं से β इकट्ठा करने के लिए, और गणना मतलब कोज्या मतलब की मानक त्रुटि (SEM) के साथ β।
    4. प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत के लिए 6.3.1-6.3.3 दोहराएँ।
      नोट: +1 की β क्योंकि एक इंगित करता है कि सभी कोशिकाओं एप्लाइड एफई के समानांतर में संरेखित करें, और एक 0 मान इंगित करता है कि सभी कोशिकाओं perpendicularl संरेखितएप्लाइड एफई के लिए वाई।

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Representative Results

रासायनिक-कतरनी तनाव (सीएसएस) चिप

सीएसएस चिप तीन PMMA शीट, मोटाई 1 मिमी से प्रत्येक के दो डबल पक्षीय टेप के माध्यम से एक साथ जुड़ी है, मोटाई 0.07 मिमी (चित्रा 1 ए और 1 बी) में से प्रत्येक से बना है। "क्रिसमस का पेड़" संरचना 0 से पांच रिश्तेदार सांद्रता उत्पन्न 1/8, 1/2, 7/8, और पांच संस्कृति क्षेत्रों में 1। मात्रा प्रवाह की दर, fluidic चिपचिपाहट, और fluidic चैनल के आयाम से संबंधित एक परिमाण के साथ, एक त्रिकोण, एक कतरनी तनाव ढाल के रूप में संस्कृति के क्षेत्र डिजाइन करके, क्षेत्रों में से प्रत्येक के भीतर बनाई गई है। इस चिप तो संवर्धन फेफड़ों के कैंसर CL1-5 कोशिकाओं के लिए जुड़ा हुआ है, एक और 0.07 मिमी मोटी डबल पक्षीय टेप के माध्यम से, एक पेट्री डिश के लिए और आरओएस के उत्पादन विभिन्न रासायनिक सांद्रता और कतरनी तनाव के जवाब में मनाया गया। फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं में आरओएस के उत्पादन अत्यधिक लू से संबंधित हैएनजी कैंसर मेटास्टेसिस और विकास, और कुछ रसायनों और कतरनी तनाव आरओएस पीढ़ी 23 में शामिल होने का प्रदर्शन किया गया।

सबसे पहले, एच 2 ओ 2, एक रासायनिक उत्तेजना का प्रभाव, आरओएस के उत्पादन पर अध्ययन करने के लिए, कोशिकाओं निरंतर 0, 25, 100, 175, और 200 सुक्ष्ममापी पर 2 2 हे समाधान एच के बहने के साथ incubated रहे थे। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 सी, फ्लोरोसेंट तीव्रता एच 2 ओ 2 की एकाग्रता के रूप में वृद्धि की वृद्धि हुई है, यह दर्शाता है कि एच 2 ओ 2 आरओएस के उत्पादन को प्रोत्साहित किया। अगले, आरओएस के उत्पादन पर कतरनी तनाव के प्रभाव की जांच करने के लिए, कोशिकाओं .0048 पा के एक कतरनी तनाव ढाल करने के लिए 0.0192 से अवगत कराया गया Pa। चित्रा -1 डी से पता चलता है कि फ्लोरोसेंट तीव्रता कतरनी तनाव में वृद्धि के रूप में वृद्धि हुई (कतरनी तनाव उच्चतम थे और आगे और पीछे क्षेत्रों में सबसे कम क्रमशः), का सुझावआईएनजी प्रेरित है कि उच्च कतरनी तनाव अधिक आरओएस उत्पादन। इसके अलावा, इस सीएसएस चिप α-tocopherol के विभिन्न सांद्रता के जवाब में आरओएस के उत्पादन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, विटामिन ई की कोशिकाओं के एक फार्म के एक एंटीऑक्सीडेंट कतरनी तनाव प्लस 0 की α-tocopherol, 3.2, 12.5, 21.9 से प्रेरित थे , और 25 माइक्रोग्राम / एमएल। जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1E, α-tocopherol सांद्रता के लिए की तुलना में कम 21.9 माइक्रोग्राम / एमएल, फ्लोरोसेंट तीव्रता एकाग्रता में वृद्धि हुई है के रूप में कम, आरओएस के उत्पादन को कम करने में α-tocopherol के प्रभाव का संकेत है। हालांकि, के रूप में एकाग्रता 25 माइक्रोग्राम / एमएल की वृद्धि हुई, मतलब तीव्रता भी बढ़ गई है, सुझाव है कि α-tocopherol के इस उच्च एकाग्रता कम सांद्रता की तुलना में ज्यादा आरओएस को समाप्त नहीं किया।

रासायनिक-बिजली के क्षेत्र (CEF) चिप

CEF चिप एक 1 मिमी मोटी PMMA और एक 0.2 से बना हैयह (चित्रा 2A और 2 बी) की तर्ज पर fluidic चैनलों के साथ 2 मिमी डबल पक्षीय टेप। इसी तरह, "क्रिसमस का पेड़" संरचना 0 से पांच रिश्तेदार सांद्रता बनाता है, 1/8, 1/2, 7/8, और पांच संस्कृति क्षेत्रों में 1। इसके अलावा, इन पांच समानांतर क्षेत्रों में एक fluidic पथ एक बिजली के सर्किट के अनुरूप फार्म के लंबवत जुड़े हुए हैं। बिजली के एक संस्कृति के क्षेत्र के भीतर उत्पन्न क्षेत्र तरल पदार्थ, चैनल के पार के अनुभागीय क्षेत्र है, और प्रत्यक्ष वर्तमान (डीसी) क्षेत्र के माध्यम से पारित की चालकता से संबंधित है। Kirchhoff के वोल्टेज कानून और ओम कानून के अनुसार, पांच संस्कृति के क्षेत्रों में धाराओं 0.49 रहा, 0.25 मैं, 0.13 मैं, 0.08 मैं, और 0.05 रहा, क्रमशः रहे हैं, जहां मैं लागू किया डीसी (चित्रा -2) है। इस चिप फेफड़ों के कैंसर CL1-5 संवर्धन कोशिकाओं सेल प्रवास और productio निरीक्षण करने के लिए जुड़ा हुआ है, 0.22 मिमी मोटी डबल पक्षीय टेप के माध्यम से, एक पेट्री डिश के लिएविभिन्न रासायनिक सांद्रता और बिजली क्षेत्र के जवाब में आरओएस के एन।

सबसे पहले, इस चिप honokiol के विभिन्न सांद्रता, EFS के अलग ताकत है, और दोनों के संयुक्त उपचार के जवाब में आरओएस के उत्पादन का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Honokiol, एक छोटे अणु जीनस मैगनोलिया से अलग polyphenol, antiangiogenic, विरोधी भड़काऊ, और अर्बुदरोधी preclinical अध्ययनों से 28 में गुण पाया गया था। लगभग 67 एम वी / मिमी की तुलना में कम EFS के लिए ही किया गया था के रूप में चित्रा 2 डी में दिखाया गया है, आरओएस का उत्पादन किया है, लेकिन इस मूल्य से ऊपर EFS में वृद्धि के साथ वृद्धि हुई थी। चित्रा 2 ई पता चलता है कि बिजली क्षेत्र और honokiol के संयुक्त उपचार के तहत, आरओएस स्तर लगभग रुके एक ही है, यह दर्शाता है कि honokiol बहिर्जात आरओएस के उत्पादन हिचकते हैं (यानी।, आरओएस एफई प्रोत्साहन से संबंधित), विशेष रूप से उच्च EFS के तहत। एकल या coexisting रासायनिक तहत सेल प्रवास/ इलेक्ट्रिकल उत्तेजनाओं भी इस CEF चिप का उपयोग कर जांच की गई। जैसा कि चित्र 2 एफ में देखा, honokiol के अलावा बिना, प्रवास दर वृद्धि के रूप में एफई शक्ति में वृद्धि हुई। विभिन्न सांद्रता की honokiol जोड़ने के बाद, पलायन दर सामान्य रूप से कमी आई है, कि honokiol कम हो सेल प्रवास सुझाव संभवतः आरओएस के उत्पादन में बाधा के माध्यम से। पलायन directedness चित्रा 2 जी में दिखाया गया है। एफई की उपस्थिति में ही है, फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं एनोड (नकारात्मक मूल्यों के साथ) की ओर से प्रमुख दिशात्मक प्रवास दिखाया। विभिन्न सांद्रता की honokiol जोड़ने के बाद, वहाँ सभी एफई उत्तेजित क्षेत्रों के लिए पलायन directedness में कुछ कमी थी।

आकृति 1
चित्रा 1: रासायनिक-कतरनी तनाव (सीएसएस) चिप रसायनों के प्रभाव और कतरें फेफड़े कैंसर की कोशिकाओं पर तनाव का अध्ययन किया 2।3
(ए) PMMA substrates की तीन परतों को एक साथ दो दो तरफा टेप के माध्यम से सीएसएस चिप फार्म के लिए बाध्य कर रहे हैं। (बी) एकीकृत सीएसएस चिप। (सी) शीर्ष: फ्लोरोसेंट और 1-5 कोशिकाओं के बाद सीएल के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों एच 2 ओ 2 के विभिन्न सांद्रता के साथ इलाज किया जा रहा है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। नीचे: SEM के साथ मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता एच 2 ओ 2 के विभिन्न सांद्रता में साजिश रची। (डी) शीर्ष पर: विभिन्न कतरनी तनाव के तहत 1-5 कोशिकाओं सीएल के फ्लोरोसेंट छवियों। स्केल बार 50 माइक्रोन =। नीचे: SEM के साथ मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता अलग कतरनी तनाव में साजिश रची। (ई) शीर्ष: फ्लोरोसेंट और उज्ज्वल क्षेत्र 1-5 कोशिकाओं α-tocopherol के विभिन्न सांद्रता के साथ कतरनी तनाव के साथ प्रेरित किया जा रहा करने के बाद सीएल की छवियों। स्केल बार 50 माइक्रोन =। नीचे: SEM के साथ मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता α-tocopherol के विभिन्न सांद्रता में साजिश रची। यहां के डाटा डब्ल्यू प्रस्तुतमूल रूप में संदर्भ 23 में प्रकाशित हुआ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: रासायनिक-बिजली के क्षेत्र (CEF) चिप रसायनों के प्रभाव और बिजली क्षेत्र फेफड़ों के कैंसर कोशिकाओं 22 पर अध्ययन किया।
(ए) PMMA की एक परत CEF चिप के रूप में करने के लिए एक डबल पक्षीय टेप के माध्यम से एक संस्कृति पकवान पर बाध्य है। (बी) सीएसएस चिप के fluidic पैटर्न। (सी) microfluidic चिप के बराबर बिजली के सर्किट। (डी) वाम: फ्लोरोसेंट और उज्ज्वल क्षेत्र 1-5 कोशिकाओं के बाद सीएल की छवियों EFS के अलग अलग शक्तियों के साथ इलाज किया जा रहा है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। अधिकार: फ्लोरोसेंट मतलबSEM के साथ तीव्रता EFS के अलग अलग शक्तियों पर साजिश रची। (ई) वाम: फ्लोरोसेंट और 1-5 कोशिकाओं के बाद सीएल के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों संयुक्त honokiol और EFS के साथ इलाज किया जा रहा है। स्केल बार 50 माइक्रोन =। अधिकार: फ्लोरोसेंट मतलब तीव्रता SEM के साथ संयुक्त honokiol और EFS पर साजिश रची। (एफ) EFS केवल (नियंत्रण के रूप में चिह्नित) और संयुक्त honokiol और EFS के साथ इलाज किया जा रहा करने के बाद CL1-5 कोशिकाओं के प्रवास दर (honokiol के रूप में चिह्नित)। (G) प्रवास EFS केवल (नियंत्रण के रूप में चिह्नित) और संयुक्त honokiol और EFS के साथ इलाज किया जा रहा करने के बाद CL1-5 कोशिकाओं के directedness (honokiol के रूप में चिह्नित)। यहां प्रस्तुत डाटा मूल संदर्भ 22 में प्रकाशित हुआ था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

PMMA आधारित चिप्स लेजर पृथक और लेखन जो सस्ता और आसान तरीके हैं जब PDMS आधारित चिप्स जो अधिक जटिल नरम लिथोग्राफी की आवश्यकता की तुलना में उपयोग कर निर्मित कर रहे हैं। एक microfluidic चिप डिजाइनिंग के बाद, निर्माण और विधानसभा सिर्फ 5 मिनट के भीतर किया जा सकता है। वहाँ कुछ महत्वपूर्ण कदम है कि ध्यान प्रयोग प्रदर्शन में करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए रहे हैं। पहले "कोडांतरण" मुद्दा है। एडेप्टर सर्वोच्च चिप की परत करने के लिए ठीक से चिपका होना चाहिए। अगर बहुत ज्यादा लागू किया जाता है गोंद fluidic चैनलों में रिसाव हो सकता है, और यदि बहुत कम गोंद का इस्तेमाल किया जाता है तरल चिप से बाहर रिसाव हो सकता है। इसके अलावा, PMMA substrates और दो तरफा टेप कोडांतरण में, यह महत्वपूर्ण कसकर पूरे चिप प्रेस करने के लिए किसी भी तरल के रिसाव को रोकने के लिए दबाव लागू करने के लिए है। दूसरी "बुलबुला" मुद्दा है। बुलबुले को दूर करने के लिए, 1x पीबीएस लगातार 20 μl / मिनट की एक प्रवाह दर पर 1 या 2 मिनट के लिए fluidic चैनल में प्रवाहित किया जाता है और फिर चिप पी है37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर 5% सीओ 2 के तहत एक मशीन के अंदर सजी। वहाँ fluidic चैनलों के भीतर शेष बुलबुले हैं, तो प्रवाह गैर वर्दी हो जाएगा, nonhomogeneous रासायनिक एकाग्रता और एफई वितरण के कारण। तीसरे "सेल लोड हो रहा है" मुद्दा है। संस्कृति के क्षेत्रों में भरी हुई कोशिकाओं की संख्या में अच्छी तरह से नियंत्रित किया जाना चाहिए। सेल नंबर बहुत कम है, तो कई प्रयोगात्मक रन सांख्यिकीय प्रयोजन के लिए पर्याप्त डेटा एकत्र करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए। सेल नंबर बहुत अधिक है, यह व्यक्तिगत कोशिकाओं भेद और उनके पलायन अंदाजा लगाना मुश्किल होगा।

सीएसएस चिप में, एक "क्रिसमस का पेड़" एक त्रिकोणीय संस्कृति क्षेत्र के साथ संयुक्त संरचना पांच क्षेत्रों में विभिन्न रासायनिक सांद्रता उत्पन्न करता है, प्रत्येक एक कतरनी तनाव ढाल कर रही है। Fluidic कतरनी तनाव लगाव, आकृति विज्ञान, प्रवास, और कोशिकाओं की गतिविधि को प्रभावित करने के लिए जाने जाते थे। के रूप में कम के रूप में 0.25-0.6 पा सेल लगाव इंटरफेस सकता है की कतरनी तनाव, तनाव (0.5 -10 पा) की और यहां तक कि उच्च मूल्यों पक्षपाती कोशिकाओं को दूर करने के लिए 29 सूचित किया गया। लामिना कतरनी प्रवाह 30, और भी कम मूल्यों (0.1-1 पा) की दिशा में 0.8 से 1.5 पा प्रेरित सेल संरेखण लेकर तनाव सेलुलर आकृति विज्ञान और पारगम्यता 29 को प्रभावित करने के लिए जाने जाते थे। इसके अलावा, चिकनी मांसपेशियों 2-120 पा के तनावों कतरने के अधीन कोशिकाओं सेल नंबर 31 में गिरावट का अनुभव किया। लू एट अल। डिजाइन और कोशिका आसंजन 27 के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए microfluidic कतरनी उपकरणों के निर्माण की सूचना दी। fluidic चैनल के भीतर कतरनी तनाव चैनल के आयामों को बदलने के द्वारा संशोधित किया गया था। चिन एट अल। पोत 32 में रक्त के प्रवाह प्रोफ़ाइल नकल करने के लिए सूक्ष्म चैनल में संस्कृति के माध्यम के प्रवाह की दर को नियंत्रित करने के लिए एक रक्तसंचारप्रकरण लैब-ऑन-ए-चिप प्रणाली का वर्णन किया। fluidic चैनल के भीतर कतरनी तनाव माध्यम के प्रवाह की दर को बदलने के द्वारा संशोधित किया गया था। मेंएसई दो उपकरणों, भले ही किसी भी मूल्यों का एक कतरनी तनाव उत्पन्न किया जा सकता है, केवल एक ही मूल्य एक संस्कृति के क्षेत्र के भीतर उपलब्ध एक समय में किया गया था। तुलना करके, वर्तमान सीएसएस चिप, एक त्रिकोणीय क्षेत्र में एक कतरनी तनाव ढाल प्रदान करने के लिए एक स्क्रीनिंग प्रयोजन के लिए विशेष रूप से प्रयोगात्मक throughput बढ़ाने का फायदा है।

CEF चिप में, "क्रिसमस का पेड़" संरचना की संस्कृति क्षेत्रों लंबरूप एक fluidic पथ एक बिजली के सर्किट के अनुरूप फार्म से जुड़े हैं। एक प्रत्यक्ष वर्तमान आवेदन किया है, पांच एफई ताकत प्रत्येक एक विशिष्ट रासायनिक एकाग्रता का प्रवाह होने के साथ संस्कृति के क्षेत्रों के अंदर उत्पन्न कर रहे हैं। पारंपरिक, electrotactic प्रयोगों पेट्री डिश जहां imprecise EFS, मध्यम वाष्पीकरण, बड़े सेल / अभिकर्मक की खपत है, और वृद्धि जौल हीटिंग की समस्या उत्पन्न हो सकता है पर प्रदर्शन किया गया। संलग्न, लघु microfluidic उपकरणों कुशलता से इन खामियों को दूर। उदाहरण के लिए, अध्ययन करने के लिए electrotaxis ओएफ मानव रक्त स्मृति टी कोशिकाओं, लिन एट अल। एक प्लास्टिक microfluidic युक्ति दो समान, पक्ष द्वारा साइड सूक्ष्म चैनल, दो संशोधित पिपेट सुझावों के मध्यम जलाशयों के रूप में सेवा की है, और एफई आवेदन 15 के लिए दो प्लैटिनम इलेक्ट्रोड युक्त सूचना दी। Throughput बढ़ाने के लिए, PMMA आधारित electrotactic चिप्स एक ही उपकरण 12,33 में कई एफई ताकत प्रदान करने के लिए गढ़े गए थे। इसके अलावा, microfluidic चलाया रासायनिक और बिजली उत्तेजनाओं पैदा करने में सक्षम उपकरणों के साथ-साथ उच्च ब्याज की हैं। ली एट अल। एक PDMS आधारित microfluidic युक्ति कीमोटैक्टिक या टी 14 कोशिकाओं के electrotactic पलायन की जांच के लिए एक या coexisting रासायनिक ढ़ाल / EFS उत्पन्न करने के लिए गढ़े। काओ एट अल। EFS 12 का उपयोग करके फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं की chemotaxis मिलाना के लिए एक समान microfluidic युक्ति कार्यरत हैं। इन दोनों उपकरणों में, एक वाई-आकार संरचना एक ही एप्लाइड एफई में एक स्थिर एकाग्रता ढाल बनाने के लिए लागू किया गया था। Hou एट अल। फेफड़ों के कैंसर की कोशिकाओं को 21 पर रसायनों और EFS की समवर्ती प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मल्टीचैनल-दोहरे बिजली क्षेत्र चिप की सूचना दी। इस उपकरण के एक प्रयोग में इलेक्ट्रिकल / रासायनिक उत्तेजनाओं (2 विद्युत एक्स 4 रासायनिक) के 8 संयोजन प्रदान करने में सक्षम था। हालांकि throughput वृद्धि हुई है, इस चिप की क्षमता (1) केवल एक एफई शक्ति (प्लस एक शून्य एक नियंत्रण के रूप में), और (2) चार सिरिंज पंप चार स्वतंत्र चैनल में रसायन पंप के लिए आवश्यक हैं तक ही सीमित था। तुलना करके, वर्तमान CEF चिप इलेक्ट्रोड का एक ही सेट और 2 सिरिंज पंप के माध्यम से पांच रासायनिक सांद्रता के साथ एक साथ पांच एफई ताकत पैदा करने का लाभ दिया है।

हालांकि इन चिप्स गढ़े जा करने के लिए आसान कर रहे हैं, वे कुछ सीमाएं हैं। सबसे पहले, केवल पाँच "विशिष्ट" सांद्रता और पांच "विशिष्ट" एफई ताकत उत्पन्न किया जा सकता है। दूसरा, fluidic चैनल की चौड़ाई का ध्यान केंद्रित होने के कारण कम से कम 1 मिमी नहीं किया जा सकतासीओ 2 लेजर बीम। हालांकि, ठीक इनलेट और विद्युत प्रवाह fluidic चैनल के माध्यम से पारित करने में रासायनिक एकाग्रता को नियंत्रित करने से, किसी भी सांद्रता और एफई ताकत संस्कृति क्षेत्रों में प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, वर्तमान और सीएसएस CEF चिप्स चलाया एकल या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के साथ कोशिकाओं को प्रदान करने में सक्षम हैं। एक एकल सीएसएस चिप में, एक कतरनी तनाव ढाल के साथ संयोजन में पांच विभिन्न रासायनिक सांद्रता उत्पन्न किया जा सकता है। इसके अलावा, एक ही CEF चिप में, पांच एफई ताकत के साथ संयोजन में पांच विभिन्न रासायनिक सांद्रता बनाया जा सकता है। "क्रिसमस का पेड़" संरचना की शाखाओं में वृद्धि करके, इन चिप्स के throughput आगे बढ़ाया जा सकता है। इन चिप्स एक आसान, समय की बचत, विश्वसनीय, और रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर व्यवहार के अध्ययन के लिए उच्च throughput मंच होना प्रदर्शन कर रहे हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Gibco 11965-092 Cell culture medium
Trypsin Gibco 25300-054 detach cell from the dish
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 10082147 Cell culture medium
10 cm cell culture Petri dish Nunc 150350 Cell culture
Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629 Cell Counting Equipment
PMMA Customized Customized Microfluidic chip
Adaptor Customized Customized Microfluidic chip
0.07/0.22 mm double-sided tape  3M 8018/9088 Microfluidic chip
Low melting point agarose Sigma A9414 Salt bridge
2'-7'-dichlorodihydrofluoresce diacetate Sigma D6883 Intracellular ROS measurement
Indium tin oxide (ITO) glass Merck 300739 Heater
Proportional-integral-derivative controller  JETEC Electronics Co. TTM-J4-R-AB Temperature controller
Thermal coupler TECPEL TPK-02A Temperature controller
CO2 laser scriber Laser Tools & Technics Corp. ILS2 Microfluidic chip fabrication
Syringe pumps New Era NE-300 Pumping medium and chemicals into the chip
Power supply Major Science  MP-300V Supplying direct currents
Inverted microscope Olympus CKX41 Monitoring cell migration
Inverted fluorescent microscope Nikon TS-100 Monitoring cell migartion and fluorescencent signals
DSLR camera Canon 60D Recording bright-field images 
CCD camera Nikon DS-Qi1 Recording fluorescent images 
super glue 3M Scotch 7004 Attaching adaptors to PMMA substrates
AutoCAD Autodesk Inc. Designing microfluidic chips
DMSO Sigma D8418 Dissolving DCFDA
ImageJ National Institutes of Health Quantifying fluorescent intensities and cell migration

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References

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एकल या coexisting रासायनिक / इलेक्ट्रिकल / कतरनी तनाव उत्तेजनाओं के तहत सेलुलर प्रतिक्रियाएँ के अध्ययन के लिए microfluidic उपकरणों डिजाइनिंग
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