Protocol
Alle forsøg udført på dyr blev godkendt af Udvalget for Laboratory Animal Care og brug af den selvstyrende National University of México (UNAM), under CICUAL-Protokol nummer: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologìa Mobilen, Universidad Nacional Autónoma de México").
1. Udarbejdelse af Embryo proteinekstrakt
- Indsamle 100 - 200 embryoner for hver betingelse at sammenligne (morphants vs. vildtype) på ønsket stadium, f.eks 72 timer efter befrugtning (HPF).
- Placer embryoner i petriskåle, der indeholder fisk vand (se tabel 1) og manuelt dechorionate embryoner hjælp fine spids pincet. Undgå at bruge pronase under dette trin (eller enhver anden protease hele protokollen), da det kan fordøje den målrettede receptor.
- Placer embryoner i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og vask embryoner twis med 1x phosphatpufferopløsning (PBS) (se tabel 1).
- Der tilsættes 500 pi deyolk puffer (se tabel 1).
- Slip fleste af æggeblomme ved forsigtigt at pipettere op og ned (30 - 40 gange) embryonerne i opløsningen. For 72 HPF og 48 HPF embryoner bruger blå og gule pipettespidser, hhv. Gule spidser kan være nødvendigt at skære en anelse for at undgå at ødelægge embryoner. Den vellykkede æggeblomme frigivelse kan kontrolleres ved at observere embryoner under mikroskop.
- Saml embryoner ved centrifugering ved 600 xg i 15 sek.
- Supernatanten kasseres omhyggeligt ved anvendelse af en pipette.
- Vask embryoer to gange med 500 pi vaskebuffer (se tabel 1) ved forsigtigt vortexing ved laveste hastighed.
- Saml embryoner ved centrifugering ved 600 xg i 15 sek.
- Begyndende fra her, fortsætter proceduren ved 4 ° C.
- Supernatanten kasseres omhyggeligt ved anvendelse af en pipette.
- Resuspender embryoner i 350 pi lysisbuffer (se tabel 1) og homogeniseres under anvendelse af en plast støder.
- Inkuber lyserede embryoner 30 min under omrøring på et reagensglas rocker ved 4 ° C.
- Centrifuger lyseret embryoner ved 11000 xg i 15 min for at fjerne uopløseligt debris.
- Overførsel klarede supernatant ved anvendelse af en pipette til et frisk rør.
- Bestem totalt protein ved Bradford-proteinassay 4, eller en anden egnet fremgangsmåde. Hvis der anvendes Bradford assay, udføre kalibreringskurven i nærværelse af ækvivalente koncentrationer af detergenterne præsenterer i lysisbufferen, da de forårsager en undervurdering af proteinet standard 4.
2. Påvisning af endogene receptor protein
- Affinity Mærkning og Immunopræcipitering (alle disse trin ved 4 ° C)
- Placer 400 - 500 pg af totalt embryo protein i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og fortyndes til 1 pg / pl med puffer 1 (se tabel 1).
Bemærk: For at opnå 500 ug totalt embryo protein, omkring 100-200 embryoner skal indledningsvis behandles. 72 HPF embryoner rutinemæssigt opnåelse ~ 5 ug totalt embryo protein, hvilket er tilstrækkeligt til betaglycan detektion. - Tilsæt så volumen af mærket TGF-β2 lager for at nå en slutkoncentration på 150 pM og inkuberes under omrøring på et reagensglas rocker 2 timer ved 4 ° C. TGF-β2 skal mærkes før AFLIP startes, med 125I ved hjælp af chloramin T som beskrevet af Cheifetz et al. 5.
ADVARSEL: Brug afskærmning for at minimere eksponeringen mens håndtering 125I mærket ligand. - Tilsæt så mængde ufortyndet antistof mod receptoren af interesse for at nå en 1: 100 fortynding og fortsætte inkubation i yderligere 2 timer ved 4 ° C (inkubation kan være O / N). Dette er den optimale fortynding af antiserum # 31, anvendt i denne undersøgelse og beskrevet andetsteds 3, men afhængigt af kvaliteten af entibody, kan en større eller mindre fortynding være det optimale.
- Der tilsættes 50 pi egnet immunoglobulinbindende perler (f.eks G-protein-Sepharose, som tidligere var ækvilibreret i TNTE og resuspenderet 1: 5 i dens oprindelige volumen i TNTE) og inkuberes i 50 min under omrøring på et reagensglas rocker ved 4 ° C.
- Gendan perlerne ved mikrocentrifugering ved 11.000 xg i 20 sek.
- Supernatanten kasseres i et passende radioaktivt trash container.
- Vask de IP-beads tre gange med 1 ml IP vaskebuffer (se tabel 1), ved hvirvelblanding og mikrocentrifugering ved 11000 xg i 20 sek hver gang.
- Resuspender IP-perler i 250 pi IP-vaskebuffer.
- Tilføj 1,5 pi disuccinimidylsuberat (DSS, opløst i DMSO ved 10 mg / ml). Forbered DSS løsningen lige før dens anvendelse i dette trin.
- Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C med omrøring.
- For at standse tværbindingsreaktionen, tilsættes 500 pi of IP vaskebuffer, suppleret med nok Tris-CI pH 7,4 lager til at nå 25 mM Tris-CI. De frie aminogrupper i Tris fange uomsat DSS.
- Centrifuger ved 11.000 xg i 20 sek til at indsamle IP-perler og kassér supernatanten.
- Resuspender IP-perler i 30 pi reducerende Laemmli-buffer.
- Boil prøverne 5 min ved 94 ° C.
- Eventuelt analysere prøver i en gammatæller efter fabrikantens protokol.
- Placer 400 - 500 pg af totalt embryo protein i et 1,5 ml mikrocentrifugerør og fortyndes til 1 pg / pl med puffer 1 (se tabel 1).
- Sample Analysis
- Emne prøver til denaturering SDS-PAGE. Brug polyacrylamid ved passende procentdel for massen af receptoren og køre gel under standard procedure.
- Fordybe gel i fikseringsopløsning (se tabel 1) i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Vask gel med destilleres vand i 15 min.
- Placer gel i tidligere hydreret filtrerpapir og dække med Saran wrap film.
- Tørre gel ved 80 ° C i 1 time.
- Expose gel på en hvid phosphorimager skrueen ved RT O / N.
- Scan udsat skærm ved anvendelse af en phosphorimager hjælp producentens protokol.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et repræsentativt resultat opnået med AFLIP. Signaler i Bane 1 kommer fra 125I-ligand er kovalent bundet til enten zebrafisk betaglycan kerneprotein (BG kerne, under 150 kDa-markør) eller BG kerne, der er blevet behandlet til sin proteoglycan form ved binding af glycosaminoglycaner (GAG, smøre i området fra 170 kDa til toppen af gelen). Dette mønster af migration, et kerneprotein skarp plus en smurt proteoglycan (på grund af heterogenitet i længden af gag kæder), er karakteristisk for TGFBR3 2. Da DSS ikke kovalent at binde hver enkelt ligand-receptor-kompleks dannet, er der fri 125I-ligand forekommer ved migration foran gel (125I-TGF-β2). Denne fri ligand blev bundet til receptoren, og forblev bundet under immunfældning, men da det ikke er kovalent bundet, løs under SDS-PAGE procedure. Ingennetheless, styrken af signalet stadig korrelerer til den, givet ved den mærkede receptor. Dette kan forstås ved at sammenligne banerne 2 og 3. Ved 48 HPF zebrafisk embryoner udviser lavere mængder af BG end 72 HPF embryoner 3, som kan ses af de svage signaler ved GAG og BG kerne, der svarer til intensiteten af den signaler afgivet af den frie ligand vises på forsiden af gelen (bane 2). Eftersom antistoffer mod rotte BG 6 ikke krydsreagerer med ZF BG antistofferne, når de anvendes i AFLIP gav noget signal derfor tjener som en negativ kontrol (bane 3). Tilsvarende negative resultater blev opnået med præ-immun serum af anti-ZF BG antistof 3.
Figur 2 viser, hvordan AFLIP kan anvendes til at måle niveauerne af ekspression af en given receptor i embryoner udsat for en eksperimentel manipulation, i dette tilfælde, faldt betaglycan grund morpholino iFremragning 3. Bane 1 viser niveauet af TGFBR3 i en 72 HPF vildtype embryo, mens bane 2 viser virkningen af administrering 7 ng af en morpholino rettet mod exon2-intron2 grænse af ZF BG primære transkript. Bemærk, at BG nedregulering opnået med denne morpholino ikke gengives af sin mis-matchet kontrol (bane 3). Disse resultater bekræftede, at det opnåede med denne morpholino fænotype var specifik for knockdown af TGFBR3 som beskrevet før 3.
Figur 1. AFLIP Påvisning af BG i zebrafisk embryoer. Total proteinekstrakt fra embryoer ved 72 timer efter befrugtning (HPF) (bane 1 og 3) og 48 HPF (bane 2) blev underkastet 125I-TGF-β2 affinitetsmærkning efterfulgt ved IP med kanin-anti-zebrafisk BG (bane 1 og 2, zBG) eller kanin-anti-rotte BG (bane 3, RBG) Som en kontrol. I autoradiografi kan påvises BG uden GAG (BG kerne) eller som et glycosaminoglycan-modificeret BG (GAG). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. BG Morpholino Knockdown detekteret ved AFLIP. 125I-TGF-β2 affinitet mærkning af BG fra ubehandlede WT embryoner (bane 1), mikroinjiceret specifikke BG morpholino (bane 2) eller en fejlparringskontrol (bane 3). Tællingerne per million (CPM) genvundet efter immunpræcipitering og tværbindingstrin er angivet. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Buffer | Sammensætning |
| puffer 1 | 50 mM Tris-HCI pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 |
| Deyolk buffer | 55 mM NaCl, 1,8 mM KCI, 1,25 mM NaHCO3 |
| Fish vand | Se Materialer Table |
| fikseringsopløsning | 50% CH3OH, 12% CH3COOH, 0,185% HCHO |
| IP vaskepuffer | 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 0,1% Triton X-100, 0,02% SDS, pH 7,4 |
| Laemmli buffer | 2% SDS, 10% glycerol, 100 mM DTT, 60 mM Tris (pH 6,8), 0,001% bromphenolblåt. |
| lyseringsbuffer | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,5% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% Sodium Deoxycholat |
| PBS | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 |
| TNTE | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 |
| vaskebuffer | 110 mM NaCl, 3,5 mM KCI, 2,7 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCI pH 8,5 |
Tabel 1: Buffer Sammensætninger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anvendelsen af Western blots med et specifikt antistof mod et protein af interesse er et værdifuldt redskab til at studere dets ekspression 7 under embryogenese. Imidlertid har immunoblotting af højt glycosylerede proteiner ikke været meget vellykket på grund af deres ineffektive overførsel og svag binding til nitrocellulose eller PVDF-membraner 8,9.
Proteoglycaner er et godt eksempel på denne mangel på grund af deres kovalent bundne glycosaminoglycankæder (GAG), der er negativt ladede og ikke binder godt til enten polystyren overflader eller hydrofobe blotting-membraner. Også størrelsen heterogenitet af gag kæder "spreder" proteinet over en sektor af gelen, effektivt at reducere antallet af beløb pr areal af blottet. Desuden, hvis proteinet af interesse har lave niveauer af ekspression, dens påvisning ved regelmæssige western blots er en vanskelig opgave. Type III transformerende vækstfaktor β receptor (TGFBR3) eller betaglycan(BG), en membran receptor med to GAG s bindingssteder i pattedyr 1 og én i zebrafisk 3, har alle disse egenskaber. Selv protokoller at overvinde disse forhindringer er blevet udtænkt, ligesom påvisning ved avidin-biotin-kompleks (ABC) systemet 10,11 eller immunobloting af proteoglycaner på positivt ladede membraner 12, de kan ikke løse begge problemer i den samme protokol. Ved at udnytte den høje affinitet af BG for sin naturlige ligand TGFβ2 og af tilgængeligheden af et specifikt antistof, AFLIP, en teknik, der kombinerer fordelene ved affinitet mærkning og immunfældning, ovenfor diskuterede begrænsninger western blot-påvisning kan overvindes.
Affinity mærkning af membranbundne receptorer med deres radioaktivt mærkede ligander er et godt brugt værktøj, der har været medvirkende til identifikation og karakterisering af flere vigtige vækstfaktorer receptorer i dyrkede celler 13-16.Mens på konventionel affinitetsmærkning et monolag af celler udsættes for kovalent ligand mærkning på vævskulturskål og derefter lyseret, i AFLIP ligand-receptor komplekser først dannet i embryo lysater, derefter oprenset ved immunopræcipitation og endelig covalent tværbundne. På grund af sin anvendelse af radiomærkede ligander, AFLIP er meget følsom og i princippet kan tilpasses til andre vækstfaktorer eller cytokiner receptorer for hvilke en mærket ligand og en god antistof er tilgængelige. Dette potentiale af AFLIP ville hjælpe påvisning af disse lave rigelige men fysiologisk relevante molekyler.
På grund af den iboende variation i tværbindingstrin af affinitetsmærkning, kan AFLIP ikke anvendes til kvantitativt bestemme niveauerne for de målte receptorer. Men hvis den udføres med passende parallelle kontrol, kan det give en helt præcis profilen for relative niveauer af deres udtryk. Som AFLIP bruge totale proteinekstrakter, er det ikke restriCTED til en specifik cellulær placering af receptoren, det afslører dets ekspression i hele individ eller organ, hvis de anvendes på dissekerede voksne fisk. Endelig, hvis nødvendigt AFLIP kunne knyttes til andre biokemiske protokoller, som kulhydrat enzymatiske fordøjelser, for yderligere at karakterisere receptoren af interesse.
Svarende til konventionel mærkning affinitet, er en frisk 125I-mærket ligand anbefales kraftigt. I betragtning af den korte halveringstid af 125I, skal liganden anvendes inden for de første 2 uger efter mærkning med frisk isotop. Selv om de fleste af de forbehold i protokollen er blevet nævnt i de tilsvarende trin, skal man særlig omtale gives til den omhyggelige fjernelse af blommen, som skal være så komplet og ensartet som muligt. Forlader ujævne mængder af æggeblomme ville resultere i ukorrekt kvantificering af bona fide embryo protein i lysater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
- López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
- Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
- Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
- Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
- Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
- Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
- Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
- Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
- Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).
