Protocol
동물에서 수행 모든 실험은 CICUAL 프로토콜 번호로, 실험 동물 관리 및 멕시코의 자치 대학교 (UNAM)의 사용을위한위원회의 승인을했다 : FLC40-14. (CICUAL "Comité Institucional 파라 엘 Cuidado y를 USO 드 로스 짐승 같은 드하기 Laboratorio 델 연구소의 드 Fisiologìa Celular, 대학교 나시 오날 자치시 드 멕시코").
배아 단백질 추출물 1. 준비
- 각 조건은 예를 들어 72 시간 포스트 수정 (HPF)를 위해, 원하는 단계에서 (morphants 대 야생형)을 비교하기 위해 200 배아 - (100)를 수집합니다.
- 물고기의 물을 함유하는 배양 접시에 장소 배아는 (표 1 참조) 수동 뾰족한 집게를 사용하여 배아를 dechorionate. 이 대상 수용체을 소화 수 있으므로이 단계 (또는 프로토콜을 통해 다른 단백질 분해 효소) 동안 프로 나제를 사용하지 마십시오.
- 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 넣어 배아 및 배아 TW 씻어1X 인산 완충 용액 (PBS)와 얼음 (표 1 참조).
- deyolk 버퍼 500 μL를 추가 (표 1 참조).
- (- 40 배 30) 용액에 배아를 부드럽게 아래로 피펫 팅에 의해 노른자의 대부분을 놓습니다. 72 HPF, 48 HPF의 배아를 들어 각각 파란색과 노란색 피펫 팁을 사용합니다. 노란색 끝은 약간 배아를 파괴하지 않도록 절단해야 할 수도 있습니다. 성공적인 노른자 자료는 현미경으로 배아를 관찰하여 확인할 수 있습니다.
- 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
- 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
- 워시 배아 회 500 ㎕의 세척 완충액으로 부드럽게 최저 속도 텍싱하여 (표 1 참조).
- 15 초 동안 600 XG에서 원심 분리하여 배아를 수집합니다.
- 여기에서 시작, 4 ° C에서 절차를 계속합니다.
- 피펫을 사용하여 조심스럽게 상층 액을 버린다.
- 용해 완충액 350 μL에 재현 탁 배아 (표 1 참조)과 플라스틱 유봉을 사용하여 균질화한다.
- 4 ° C에서 테스트 튜브 로커에 용해 배아를 교반하면서 30 분을 품어.
- 원심 분리하여 불용성 잔사를 제거하기 위해 15 분 동안 11,000 XG에서 배아를 용해.
- 전송 신선한 튜브에 피펫을 이용하여 상층 액을 깨끗이 밀어 냈습니다.
- 브래드 포드 (Bradford) 단백질 분석 (4), 또는 다른 적절한 방법에 의해 전체 단백질을 결정한다. 브래드 포드 분석법이 사용되는 경우가 4 표준 단백질의 과소 원인으로, 용해 버퍼에 세제 선물 동등한 농도의 존재 검량선을 수행한다.
2. 감지 내인성 수용체 단백질의
- 선호도 라벨링 및 면역 침전 (모든 단계 4 O를 C에서)
- 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 총 배아 단백질의 500 μg의 버퍼 1 (표 1 참조) 1 μg의 / μL로 희석 - (400)를 배치합니다.
주 : 약 100 배의 총 단백질 500 μg의 획득하기 위해서 - 200 배아 초기 처리되어야한다. 72 HPF 배아는 정기적으로 betaglycan 검출을위한 충분한 총 배아 단백질의 ~ 5 μg의를 얻을. - 150 오후 최종 농도에 도달하고 4 ° C에서 테스트 튜브 로커 2 시간에 교반 배양 표시 TGF-β2 주식의 충분한 볼륨을 추가합니다. AFLIP이 시작되기 전에 Cheifetz 등. (5)에 의해 설명 된 바와 같이 TGF-β2는 클로라민 T 법에 의해 125 I로 표시해야합니다.
주의 : 내가 리간드 레이블 (125)를 처리하는 동안 노출을 최소화하기 위해 차폐. - (100) 희석 (배양이 O / N 수있다) 4 ° C에서 또 다른 2 시간 동안 배양을 계속 : 1에 도달하기 위해 관심있는 수용체에 대한 희석 항체의 충분한 볼륨을 추가합니다. 따라서 본 연구에서 사용하고 다른 3을 설명하지만,의 품질에 따라, 항혈청 번호 (31)의 최적의 희석이고tibody, 큰 또는 작은 희석 최적 일 수있다.
- 적절한 면역 글로불린 결합 구슬의 50 μl를 추가합니다 (예를 들어, 이전에 TNTE에서 평형 1 재현 탁 G 단백질 세 파로스, : TNTE에서 원래 볼륨의 5)를 4 °에서 테스트 튜브 로커에 교반과 함께 50 분 동안 품어 기음.
- 20 초 동안 11,000 XG에서 microcentrifugation으로 구슬을 복구 할 수 있습니다.
- 적절한 방사성 쓰레기 용기에 상층 액을 버린다.
- 20 초 때마다 11,000 XG에, 텍싱 및 microcentrifugation에 의해 IP 세척 버퍼 (표 1 참조) 1 ㎖로 IP-구슬 세 번 씻으십시오.
- 재현 탁 IP-구슬 IP 세척 버퍼 250 μL있다.
- (10 ㎎ / ㎖에서 DMSO에 용해 DSS) 숙신 이미 딜 수베의 1.5 μl를 추가합니다. 바로이 단계에서의 사용 전에 DSS 솔루션을 준비합니다.
- 교반 4 ° C에서 15 분 동안 품어.
- 가교 반응을 종결하기 위해, 500 ㎕의 O를 추가충분히 트리스 - CL pH 7.4의 재고 보충 F IP 세척 버퍼는 25 mM 트리스 - (CL)에 도달한다. 트리스의 유리 아미노산 그룹은 미 반응 DSS를 캡처합니다.
- 20 초 동안 11,000 XG에 원심 분리기는 IP-구슬을 수집하고 뜨는을 폐기합니다.
- 재현 탁 IP 비드 램리 완충액 30 μL 감소한다.
- 삶아 샘플 94 ° C에서 5 분.
- 선택적으로, 제조업 자의 프로토콜을 사용하여 감마 계수기에서 샘플을 분석한다.
- 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 총 배아 단백질의 500 μg의 버퍼 1 (표 1 참조) 1 μg의 / μL로 희석 - (400)를 배치합니다.
- 샘플 분석
- SDS-PAGE를 변성에 따라 샘플. 수용체의 질량에 해당하는 비율로 폴리 아크릴 아미드를 사용하여 표준 절차에 따라 젤을 실행합니다.
- 고정 제 용액에서 겔을 담그고 실온에서 30 분 동안 (표 1 참조).
- 15 분 동안 증류수로 젤을 씻으십시오.
- 이전에 수화 필터 종이에 젤을 놓고 사란 랩 필름 커버.
- 1 시간 동안 80 ° C에서 건조 젤.
- 흰색은 phosphorimager의 scre에 젤을 노출RT O / N에서 엉.
- 제조 업체의 프로토콜을 사용하여은 phosphorimager를 사용하여 노출 된 화면을 검색합니다.
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Representative Results
그림 1은 AFLIP 얻은 대표적인 결과를 보여줍니다. 125 I-리간드에서 온 레인 1 신호는 공유 (150 kDa의 마커 아래 BG 코어) 제브라 피쉬 betaglycan 핵심 단백질 또는 글리코 사 미노 글리 칸의 첨부 파일 (GAG, 도말하여 프로테오글리칸 형태로 처리 된 BG 코어 중 하나에 연결된 ) 170 kDa 내지 겔의 상단까지. 마이그레이션이 패턴 날카로운 코어 단백질 플러스 (GAG 때문에 사슬의 길이 이질성)를 도말 프로테오글리칸은 TGFBR3이 특징이다. DSS에 공유 결합 매 리간드 - 수용체 복합체 형성에 연결되지 않기 때문에, 겔 (125 I-TGF-β2)의 이동 앞에 나타나는 125 I-리간드 무연있다. 이 유리 리간드가 수용체에 결합하고, 결합 된 면역 중에 남아 있지만 공유 결합 부착되지 때문에, SDS-PAGE 과정에서 분리. 아니netheless으로, 그 신호의 세기가 여전히 표지 수용체에 의해 주어진 하나로 상관. 이것은 강도에 대응 GAG 및 BG 코어에서 약한 신호에 의해 알 수있는 72 HPF 배아 3보다 BG 낮은 양, 제브라 피쉬 배아 HPF (48)에서, 레인 2 및 3과 비교하여 나타내 알 수 겔의 전면에 나타나는 유리 리간드에 의해 주어진 신호 (레인 2). AFLIP 사용할 때 쥐에 대한 항체가 BG 6 ZF BG와 교차 반응하지 않는 점을 감안, 항체는 음성 대조군 (레인 3) 역할을, 따라서 아무런 신호도주지 않았다. 유사 부정적인 결과를 방지 ZF BG 항체 (3)의 전 면역 혈청을 얻었다.
도 2는 AFLIP에 의한 모르으로,이 경우, 실험 조작을 실시 배아 betaglycan의 감소는 주어진 수용체의 발현 수준을 측정하는 방법을 보여주는이 켜졌 3. 레인 2는 ZF BG 차 전 사체의 exon2-intron2 경계에 관한 모르 폴리 7 NG 투여의 효과를 나타내고있다 레인 (1)는, HPF (72) 야생형 배아 TGFBR3의 수준을 나타낸다. 이 모르 폴리 노 얻은 BG 다운 규제는 그 잘못 일치 제어 (레인 3)에 의해 재생되지 않습니다. 이 결과는 세 이전에 기재 한 바와 같이 얻은 모르 표현형이 TGFBR3의 최저 특정 것을 확인 하였다.
Zebrafish의 태아에 BG의 그림 1. AFLIP 탐지. 72 시간 포스트 수정 (HPF)에서 배아에서 총 단백질 추출물 (레인 1, 3) 48 HPF (레인 2) 다음에 125 I-TGF-β2 친 화성 라벨링을 실시 하였다 BG (레인 3 RBG 토끼 항 제브라 BG (레인 1 및 2 zBG) 또는 토끼 항 - 래트와 IP에 의해) 제어 등. 자가 방사선에 BG는 GAG (BG 코어)없이 검출 할 수 또는 글리코 사 미노 글리 칸 수정 BG (GAG)로. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. BG 모르 폴리 노 최저입니다. AFLIP에 의해 감지 된 특정 BG 모르 폴리 노 (레인 2) 또는 불일치 제어 (레인 3)과 미세 주입 치료 WT 배아 (lane1)에서 BG의 125 I-TGF-β2 친 화성 라벨. 만 (CPM) 당 카운트는 면역 및 가교 단계가 표시됩니다 후. 회복 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 완충기 | 구성 |
| 버퍼 1 | pH가 7.5의 50 mM 트리스 -HCl, 150 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트리톤 X-100 |
| Deyolk 버퍼 | 55 mM의 염화나트륨, 1.8 밀리미터의 KCl, 1.25 밀리미터의 NaHCO3 |
| 물고기 물 | 자료 표를 참조하십시오 |
| 정착액 솔루션 | 50 % CH 3 OH, 12 % CH 3 COOH, 0.185 %의 HCHO |
| IP 세척 버퍼 | 10 mM의 나트륨 2 HPO 4, 2 mM의 KH 2 PO 4, 137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 0.1 % 트리톤 X-100, 0.02 % SDS, pH 7.4의 |
| 램 믈리 버퍼 | 2 % SDS, 10 % 글리세롤, 100 mM의 DTT, 60 mM 트리스 (산도 6.8), 0.001 %의 브로 모 페놀 블루. |
| 용해 완충액 | 50mM 트리스 - 염산 pH 7.4로 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 1mM의 PMSF, 0.5 % 트리톤 X-100, 0.1 % SDS, 0.5 % 나트륨 Deoxych올 레이트 |
| PBS | HPO 4 137 mM의 염화나트륨, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나트륨 2, 2 mM의 KH 2 PO 4 pH 7.4로 |
| TNTE | 50mM 트리스 - 염산 pH 7.4로 150 mM의 염화나트륨, 1 mM의 EDTA, 0.1 % 트리톤 X-100 |
| 세척 버퍼 | 110 mM의 염화나트륨, 3.5 밀리미터의 KCl, 2.7 mM의 염화칼슘 2, 10 mM 트리스 - 염산 pH가 8.5 |
표 1 : 버퍼 조성물
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Discussion
관심의 단백질에 대한 특이 항체와 서양 말의 사용은 배아 발생 동안 발현 7을 연구하는 유용한 도구입니다. 그러나, 높은 당화 단백질의 면역 인해 자신의 비효율적 인 전송 및 니트로 셀룰로오스 또는 PVDF 막 8,9 약한 결합을 매우 성공적으로되지 않았습니다.
프로테오글리칸 때문에 음전하를하고 폴리스티렌 표면 또는 소수성 블로 팅 막 중 하나에 잘 결합하지 않는 자신의 공유 부착 글리코 사 미노 글리 칸 체인 (GAG)으로, 이러한 단점의 좋은 예이다. 또한, GAG 사슬의 크기 이질성 효과적으로 오의 면적당의 양을 감소 겔의 섹터에 걸쳐 단백질을 "확산". 관심의 단백질 발현 수준이 낮은 경우뿐만 아니라, 정기적 인 웨스턴 블랏에 의해 그 검출은 어려운 작업이다. 수용체 (TGFBR3) 또는 betaglycan β 유형 III 형질 전환 성장 인자(BG), 제브라 피쉬 3 개의 GAG의 부착 포유 동물 1 사이트와 하나 막 수용체는 이러한 특성을 모두 가지고있다. 이러한 장애물을 극복하는 프로토콜이 고안되었습니다 만, 아비딘 - 비오틴 복합체 (ABC) 시스템 10, 11 또는 양으로 대전 된 막 (12)에 프로테오글리칸의 immunobloting에 의해 검출처럼, 그들은 같은 프로토콜에서 두 문제를 해결할 수 없습니다. 자연 리간드 TGFβ2 대한 특정 항체의 가용성 BG의 높은 친 화성을 활용 AFLIP, 친화 라벨링 및 면역 침전의 이점을 결합하는 기술들은, 위에서 웨스턴 블롯 검출 한계는 극복 될 수 논의.
자신의 방사성 표지 된 리간드와 막 결합 수용체의 선호도 표시는 몇 가지 중요한 성장의 식별 및 특성에 대한 쓸모 배양 된 세포 13-16에서 수용체 요인했습니다 잘 사용하는 도구입니다.세포 단층을 라벨링 종래 친 화성 조직 배양 접시에 리간드 라벨 공유 결합을 실시하고 용해되지만, AFLIP에서 리간드 - 수용체 복합체는 제 배아 용해질 다음, 면역 침전에 의해 정제하여 최종적으로 공유 가교 결합을 형성한다. 왜냐하면 방사성 리간드의 사용으로, AFLIP 다른 성장 인자 또는 표지 된 리간드와 함께 좋은 항체를 사용할 수있는 사이토 카인 수용체에 적용 할 수있는 매우 중요한 원칙이다. AFLIP이 가능성이 낮은 풍부하지만 생리 관련 분자의 검출을 도움이 될 것이다.
이 때문에 친 화성 라벨의 가교 공정에서의 고유의 변동, AFLIP 정량적 측정 수용체의 수준을 결정하기 위해 사용될 수 없다. 적절한 제어 병렬로 수행하는 경우에는, 그들의 발현의 상대 수준의 매우 정확한 계측을 제공 할 수있다. AFLIP 총 단백질 추출물을 사용하여, 그것은 restri되지해부 성인 표본에 적용하는 경우, 수용체의 하나의 특정한 셀룰러 위치 cted, 그것은 전체 개인 또는 기관에서의 발현을 보여준다. 필요한 AFLIP 다른 생화학 프로토콜에 링크 될 수 있다면 마지막 탄수화물 효소 digestions 같이, 상기 관심의 수용체를 특성화한다.
기존의 친 화성 라벨링과 유사하게, 갓 (125) 내가 표지 리간드는 것이 좋습니다. 125 I의 짧은 반감기를 고려할 때, 리간드 신선한 동위 원소로 라벨링 후 처음 2 주 이내에 사용해야합니다. 프로토콜의주의 사항의 대부분이 해당 단계에서 언급되었지만, 하나의 특별한 언급은 가능한 한 완전하고 균일해야 노른자의주의 제거에 제공해야한다. 노른자의 불균일 한 금액을두면 해물에서 선의의 배아 단백질의 잘못된 정량 될 것입니다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
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