Protocol
Toutes les expériences réalisées chez l'animal ont été approuvés par le Comité de laboratoire soin et l'utilisation de l'Université nationale autonome du Mexique (UNAM) des animaux, sous le numéro CICUAL-Protocole: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de fisiologia Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").
1. Préparation de l'extrait Embryo Protein
- Recueillir 100 - 200 embryons pour chaque condition de comparer (morphants vs type sauvage) au stade désiré, par exemple 72 heures après la fécondation (HPF).
- La place des embryons dans des boîtes de Pétri contenant de l' eau de poissons (voir tableau 1) et dechorionate manuellement des embryons en utilisant une pince à pointe fine. Éviter d'utiliser pronase pendant cette étape (ou toute autre protéase tout au long du protocole), tel qu'il peut digérer le récepteur ciblé.
- La place des embryons dans un tube de 1,5 ml et laver les embryons twla glace avec une solution tampon de phosphate de 1x (PBS) (voir tableau 1).
- Ajouter 500 pi de tampon de deyolk (voir le tableau 1).
- Relâchez la plupart de jaune par pipetage de haut en bas (environ 30 - 40 fois) les embryons dans la solution. Pour 72 HPF et 48 embryons HPF utiliser des embouts de pipette bleu et jaune, respectivement. peuvent devoir être légèrement coupé pour éviter la destruction d'embryons pointes jaunes. La libération de jaune réussie peut être vérifiée par l'observation des embryons au microscope.
- Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec.
- Rejeter le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette.
- Embryons laver deux fois avec 500 pi de tampon de lavage (voir le tableau 1) faisant tourbillonner doucement à la vitesse la plus basse.
- Recueillir des embryons par centrifugation à 600 xg pendant 15 sec.
- A partir de là, poursuivre la procédure à 4 ° C.
- Rejeter le surnageant avec précaution à l'aide d'une pipette.
- Resuspendre les embryons dans 350 pi de tampon de lyse (voir le tableau 1) et homogénéiser à l' aide d' un pilon en plastique.
- Incuber embryons lysées 30 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C.
- Centrifugeuse lysée embryons à 11.000 xg pendant 15 min pour éliminer les débris insolubles.
- Transfert autorisé surnageant à l'aide d'une pipette dans un tube frais.
- Déterminer la protéine totale par Bradford protéine test 4, ou toute autre procédure appropriée. Si dosage de Bradford est utilisé, effectuer la courbe d'étalonnage en présence de concentrations équivalentes des détergents présents dans le tampon de lyse, car ils provoquent une sous - estimation de la protéine standard 4.
2. Détection de Endogène Receptor Protein
- Affinity Étiquetage et Immunoprécipitation (toutes ces étapes à 4 o C)
- Placez 400 - 500 ug de protéine embryonnaire totale dans un tube de 1,5 ml et diluer à 1 ug / ul avec un tampon 1 (voir le tableau 1).
Remarque: Pour obtenir 500 ug de protéine d'embryon total, environ 100 - 200 embryons doivent être d'abord traitées. 72 HPF embryons produisent couramment ~ 5 pg de protéine totale d'embryons, ce qui est suffisant pour la détection bêtaglycan. - Ajouter un volume suffisant de marqué TGF-β2 stocks pour atteindre une concentration finale de 150 pM et incuber avec agitation sur un tube à essai culbuteur 2 h à 4 ° C. Le TGF-β2 doit être marqué avant aflip est démarré, avec 125I par la méthode à la chloramine T comme décrit par Cheifetz et al. , 5.
ATTENTION: L' utilisation de blindage pour minimiser l' exposition lors de la manipulation 125 I ligand marqué. - Ajouter un volume suffisant d'anticorps non dilué contre le récepteur d'intérêt afin de parvenir à une dilution de 1: 100 et continuer l'incubation pendant 2 heures à 4 ° C (incubation peut être O / N). Ceci est la dilution optimale de l' antisérum # 31, utilisé dans cette étude et décrit par ailleurs 3, mais en fonction de la qualité de l'tibody, une dilution plus ou moins grande peut être optimal.
- Ajouter 50 ul de billes de liaison d'immunoglobuline appropriée (par exemple, la protéine G-Sepharose, qui a été préalablement équilibrée en TNTE et remis en suspension 1: 5 de son volume initial en TNTE) et incuber pendant 50 min avec agitation sur une bascule de tube à essai à 4 ° C.
- Récupérer les billes par microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 sec.
- Rejeter le surnageant dans une poubelle radioactive appropriée.
- Laver les IP-billes trois fois avec 1 ml de tampon de lavage IP (voir le tableau 1), par tourbillonnement et microcentrifugation à 11.000 xg pendant 20 secondes à chaque fois.
- Resuspendre IP-billes dans 250 pi de tampon de lavage IP.
- Ajouter 1,5 ul de subérate de disuccinimidyle (DSS, dissous dans du DMSO à 10 mg / ml). Préparer la solution DSS juste avant son utilisation dans cette étape.
- Incuber pendant 15 min à 4 ° C sous agitation.
- Pour arrêter la réaction de réticulation, ajouter 500 pi otampon de lavage f IP, complété avec suffisamment de Tris-Cl pH 7,4 actions pour atteindre 25 mM Tris-Cl. Les groupes amino libres dans Tris capturer DSS n'a pas réagi.
- Centrifugeuse à 11.000 xg pendant 20 secondes pour recueillir IP perles et éliminer le surnageant.
- Resuspendre IP billes dans 30 pl de tampon réducteur de Laemmli.
- échantillons Faire bouillir 5 min à 94 ° C.
- Le cas échéant, analyser les échantillons dans un compteur gamma en utilisant le protocole du fabricant.
- Placez 400 - 500 ug de protéine embryonnaire totale dans un tube de 1,5 ml et diluer à 1 ug / ul avec un tampon 1 (voir le tableau 1).
- Analyse des échantillons
- échantillons soumis à une dénaturation SDS-PAGE. Utilisez polyacrylamide le pourcentage correspondant à la masse du récepteur et exécuter un gel selon la procédure standard.
- Immergez gel dans la solution de fixation (voir le tableau 1) pendant 30 min à température ambiante.
- Laver le gel avec de l'eau distillée pendant 15 min.
- Placer le gel dans du papier filtre préalablement hydratée et couvrir avec un film de saran wrap.
- gel sec à 80 ° C pendant 1 heure.
- Exposer gel sur une phosphorimager scre blancfr à TA O / N.
- Numérisation écran exposé en utilisant un phosphorimager en utilisant le protocole du fabricant.
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Representative Results
La figure 1 montre un résultat représentatif obtenu avec aflip. Les signaux dans la piste 1 proviennent de la I-ligand 125 lié de manière covalente soit à la protéine de poisson zèbre bêtaglycan noyau (core BG, au- dessous du marqueur 150 kDa) ou le noyau BG qui a été traité à sa forme de protéoglycanes par l' attachement des glycosaminoglycanes (GAG, frottis allant de 170 kDa à la partie supérieure du gel). Ce modèle de la migration, une protéine de base forte , plus un protéoglycane barbouillé ( en raison de l' hétérogénéité de la longueur des chaînes de GAG), est caractéristique de la TGFBR3 2. Étant donné que le DSS ne lie pas de manière covalente à chaque complexe ligand-récepteur unique formé, il est libre de 125 I-ligand apparaissant à l'avant de la migration du gel (125 I-TGF-β2). Ce ligand libre a été lié au récepteur, et est resté lié au cours de l'immunoprécipitation, mais comme il n'a pas été fixé de manière covalente, détachée pendant la procédure SDS-PAGE. Nonnetheless, la force de son signal est corrélée encore à celle donnée par le récepteur marqué. Cela peut être apprécié en comparant les voies 2 et 3. A 48 HPF les embryons de poisson zèbre présentent des quantités inférieures de BG que 72 HPF embryons 3, qui peut être vu par les signaux faibles au GAG et le noyau BG, qui correspondent à l'intensité de la les signaux donnés par le ligand libre apparaissant à l'avant du gel (piste 2). Étant donné que les anticorps contre le rat BG 6 ne font pas de réaction croisée avec le ZF BG, les anticorps lorsqu'ils sont utilisés dans le aflip donné aucun signal, par conséquent, servant de témoin négatif (piste 3). Résultats négatifs similaires ont été obtenus avec le sérum pré-immun de l'anticorps anti-ZF BG 3.
La figure 2 montre comment aflip peut être utilisé pour mesurer les niveaux d'expression d'un récepteur donné dans les embryons soumis à une manipulation expérimentale, dans ce cas, la diminution du bêtaglycan due à morpholino dansjection 3. La ligne 1 montre le niveau de TGFBR3 dans un type sauvage HPF embryon 72, tandis que Lane 2 montre l'effet de l'administration de 7 ng d'un morpholino dirigé vers la frontière exon2-intron 2 du transcrit primaire ZF BG. Notez que la réglementation BG bas obtenu avec cette morpholino ne se reproduit pas par son contrôle mal adapté (Lane 3). Ces résultats confirment que le phénotype obtenu avec cette morpholino était spécifique pour le knockdown de l'TGFBR3 comme décrit précédemment 3.
Figure 1. aflip Détection de BG dans Zebrafish Embryons. Extrait de protéine totale à partir d' embryons à 72 heures après la fécondation (HPF) (pistes 1 et 3) et 48 HPF (piste 2) ont été soumis à l' étiquetage d'affinité 125 I-TGF-β2 suivi par IP avec lapin anti-poisson zèbre BG (Lanes 1 et 2, ZBG) ou de lapin anti-rat BG (Lane 3, RBG) Comme témoin. Dans le autoradiographie BG peut être détectée sans GAG (noyau BG) ou en tant que BG glycosaminoglycanes modifié (GAG). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. BG morpholino Knockdown détecté par aflip. 125 I-TGF-β2 marquage d'affinité de BG à partir d' embryons non traités WT (de piste 1), microinjection avec BG spécifique morpholino (Lane 2) ou un contrôle de décalage (Lane 3). Les chiffres par million (cpm) récupérés après l'immunoprécipitation et l'étape de réticulation sont indiqués. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Tampon | Composition |
| Buffer 1 | 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% de Triton X-100 |
| tampon Deyolk | 55 mM de NaCl, 1,8 mM de KCl, 1,25 mM NaHCO3 |
| l'eau du poisson | Voir le tableau Matériaux |
| solution de fixation | 50% CH 3 OH, 12% CH 3 COOH, 0,185% HCHO |
| tampon de lavage IP | 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,02% de SDS, pH 7,4 |
| tampon de Laemmli | 2% SDS, 10% Glycérine, DTT 100 mM, Tris 60 (pH 6,8), 0,001% de bleu de bromophénol. |
| Le tampon de lyse | 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, 0,5% de Triton X-100, 0,1% de SDS, 0,5% de sodium Deoxycholate |
| PBS | 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 2 mM de KH 2 PO 4, pH7,4 |
| TNTE | 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 0,1% de Triton X-100 |
| Tampon de lavage | 110 mM de NaCl, 3,5 mM de KCl, 2,7 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8,5 , |
Tableau 1: Buffer Compositions
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Discussion
L'utilisation de Western blots avec un anticorps spécifique contre une protéine d'intérêt est un outil précieux pour étudier son expression 7 au cours de l' embryogenèse. Cependant, immunotransfert de protéines hautement glycosylées n'a pas eu beaucoup de succès en raison de leur transfert inefficace et faible liaison à nitrocellulose ou PVDF membranes 8,9.
Les protéoglycanes sont un bon exemple de cette lacune, en raison de leurs chaînes de glycosaminoglycanes fixés de manière covalente (GAG) qui sont chargés négativement et ne se lient pas bien à soit des surfaces de polystyrène ou des membranes buvards hydrophobes. Par ailleurs, l'hétérogénéité de taille des chaînes GAG "se répand" la protéine sur un secteur du gel, ce qui diminue efficacement sa quantité par unité de surface de l'empreinte. En outre, si la protéine d'intérêt a de faibles niveaux d'expression, sa détection par western blots régulières est une tâche difficile. Le facteur de croissance de type III transformant β du récepteur (TGFBR3) ou bêtaglycan(BG), un récepteur membranaire avec deux sites de fixation de GAG chez les mammifères 1 et un en zebrafish 3, possède toutes ces propriétés. Bien que, les protocoles pour surmonter ces obstacles ont été mis au point, comme la détection par le système complexe avidine-biotine (ABC) 10,11 ou immunobloting des protéoglycanes sur les membranes chargées positivement 12, ils ne peuvent pas résoudre les problèmes dans le même protocole. Profitant de la forte affinité du BG pour son ligand naturel TGFß2 et de la disponibilité d'un anticorps spécifique, aflip, une technique qui combine les avantages de l'étiquetage d'affinité et immunoprécipitation, ci-dessus discuté des limites de détection western blot peuvent être surmontés.
Étiquetage affinité des récepteurs liés à la membrane avec leurs ligands radiomarqués est un outil bien utilisé qui a joué un rôle déterminant pour l'identification et la caractérisation de plusieurs facteurs de croissance importante des récepteurs dans les cellules cultivées 13-16.Alors que l'affinité classique marquage d'une monocouche de cellules est soumise à covalentes marquage du ligand sur la boîte de culture tissulaire, puis lysées dans aflip les complexes ligand-récepteur sont d'abord formés dans des lysats d'embryons, puis purifié par immunoprécipitation et enfin, de manière covalente réticulés. En raison de son utilisation de ligands radiomarqués, aflip est très sensible et, en principe, peut être adapté à d'autres facteurs de croissance ou cytokines récepteurs pour lesquels un ligand marqué et un bon anticorps sont disponibles. Ce potentiel de aflip permettrait la détection de ces molécules à faible pertinentes abondantes mais physiologiques.
En raison de la variabilité inhérente à l'étape de reticulation de marquage d'affinité, aflip ne peut pas être utilisé pour déterminer quantitativement les niveaux des récepteurs de mesure. Cependant, si elle est effectuée en parallèle avec des commandes adéquates, il peut fournir un calibrage très précis des niveaux relatifs de leur expression. Aflip que l'utilisation d'extraits de protéines totales, on ne RESTRICTED une localisation cellulaire spécifique du récepteur, elle révèle son expression dans l'individu tout entier ou d'un organe, si elle est appliquée à des spécimens adultes disséqués. Enfin, si aflip nécessaire pourrait être lié à d'autres protocoles biochimiques, comme digestions enzymatiques d'hydrates de carbone, pour caractériser davantage le récepteur d'intérêt.
Semblable à l' étiquetage d'affinité classique, un ligand fraîchement 125 I-marqué est fortement recommandé. Compte tenu de la courte demi-vie de 125 I, le ligand doit être utilisé dans les 2 premières semaines après marquage avec un isotope frais. Bien que la plupart des mises en garde du protocole ont été mentionnés dans les étapes correspondantes, une mention spéciale doit être accordée à l'élimination soigneuse du jaune, qui doit être aussi complète et uniforme que possible. Laissant des quantités inégales de jaune se traduirait par une quantification incorrecte de bona fide protéines d'embryons dans les lysats.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
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