Protocol
Alle eksperimenter utført på dyr ble godkjent av komiteen for Laboratory Animal Care og bruk av den autonome National University of Mexico (UNAM), under CICUAL-protokollen Nummer: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologìa Celular, Universidad Nacional Autónoma de México").
1. Utarbeidelse av Embryo Protein Extract
- Samle 100 - 200 embryoer for hver betingelse for å sammenligne (morphants vs. villtype) på ønsket tidspunkt, for eksempel 72 timer etter befruktning (HPF).
- Plasser embryo i petriskåler med fisk vann (se tabell 1) og manuelt dechorionate embryoer ved hjelp av fin-tipped tang. Unngå å bruke pronase i løpet av dette trinnet (eller en hvilken som helst annen protease hele protokoll) som det kan fordøye den målrettede reseptoren.
- Plasser embryo i en 1,5 ml mikrosentrifugerør og vaske embryoer twis med 1x fosfatbufferoppløsning (PBS) (se tabell 1).
- Legg 500 mL av deyolk buffer (se tabell 1).
- Frigi mesteparten av eggeplomme ved forsiktig pipettering opp og ned (ca. 30 - 40 ganger) embryoene i oppløsningen. For 72 HPF og 48 HPF embryoer bruke blå og gule pipettespisser, henholdsvis. Gule tips må kanskje litt kutte for å unngå å ødelegge embryoer. Den vellykkede plomme utgivelsen kan kontrolleres ved å observere embryoer henhold mikroskop.
- Samle embryoer ved sentrifugering ved 600 xg i 15 sek.
- Kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
- Vask embryoer to ganger med 500 ul vaskebuffer (se tabell 1) ved å forsiktig virvling ved laveste hastighet.
- Samle embryoer ved sentrifugering ved 600 xg i 15 sek.
- Starter fra her, fortsetter prosedyren ved 4 ° C.
- Kast supernatanten forsiktig ved hjelp av en pipette.
- Resuspender embryoer i 350 ul lyseringsbuffer (se tabell 1) og homogeniseres ved hjelp av en plast pistill.
- Inkuber lysert embryoer 30 min med omrøring på et prøverør vippe ved 4 ° C.
- Sentrifuger lysert embryoer ved 11 000 xg i 15 minutter for å fjerne uoppløselige rester.
- Overføring erte supernatant ved anvendelse av en pipette til et nytt rør.
- Bestemme totalt protein ved Bradford proteinanalyse 4, eller en annen egnet prosedyre. Hvis Bradford assay brukes, utføre kalibreringskurven i nærvær av ekvivalente konsentrasjoner av de vaskemidler presenterer i lyseringsbuffer, som de forårsaker en undervurdering av proteinet standard 4.
2. Påvisning av endogen Receptor Protein
- Affinity Merking og Immunpresipitasjon (alle disse trinnene på 4 o C)
- Plasser fra 400 - 500 mikrogram total embryo protein i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og fortynnet til 1 pg / pl med buffer 1 (se tabell 1).
Bemerk: For å oppnå 500 ug av total embryo protein, ca 100-200 embryoer først må behandles. 72 HPF embryoer som rutinemessig ga ~ 5 pg av total embryo protein, noe som er tilstrekkelig for betaglycan deteksjon. - Tilsett nok volum av merket TGF-β2 lager for å nå en endelig konsentrasjon på 150 pM og inkuber med risting på et reagensglass vippe 2 timer ved 4 ° C. TGF-β2 skal merkes før AFLIP startes med 125I ved kloramin T-metoden som beskrevet av Cheifetz et al., 5.
FORSIKTIG: Bruk skjerming for å redusere eksponering ved håndtering av 125 Jeg merket ligand. - Tilsett nok volum av ufortynnet antistoff mot reseptoren av interesse, for å oppnå en 1: 100-fortynning og fortsette inkubasjon i ytterligere 2 timer ved 4 ° C (inkubasjon kan være O / N). Dette er den optimale fortynning av antiserum # 31, anvendt i denne studien og beskrevet andre steder 3, men avhengig av kvaliteten på entibody, kan en større eller mindre fortynning være optimal.
- Tilsett 50 ul av passende immunoglobulin bindende kuler (eksempel G-protein-Sepharose, som på forhånd var ekvilibrert i TNTE og resuspendert 1: 5 av sitt opprinnelige volum i TNTE) og inkuberes i 50 min under omrøring på et prøverør vippe ved 4 ° C.
- Gjenopprette perlene ved mikrosentrifugering ved 11 000 xg i 20 sek.
- Kast supernatanten i en egnet radioaktivt avfallscontainer.
- Vask IP-perlene tre ganger med 1 ml av IP-vaskebuffer (se tabell 1), ved virvling og mikrosentrifugering ved 11 000 xg i 20 sekunder hver gang.
- Resuspender IP-perler i 250 ul av IP-vaskebuffer.
- Tilsett 1,5 mL av disuksinimidylsuberat (DSS, oppløst i DMSO ved 10 mg / ml). Klargjør DSS løsning like før bruk i dette trinnet.
- Inkuber i 15 minutter ved 4 ° C under omrøring.
- For å slukke tverrbindingsreaksjonen, tilsett 500 ul of IP-vaskebuffer, supplert med nok Tris-Cl pH 7,4 lager for å nå 25 mM Tris-Cl. De frie aminogrupper i Tris ta ureagert DSS.
- Sentrifuger ved 11 000 xg i 20 sekunder for å samle inn IP-perler og kast supernatanten.
- Resuspender IP-perler i 30 pl av reduserende Laemmli-buffer.
- Kok prøvene 5 min ved 94 ° C.
- Eventuelt kan analysere prøver i en gamma-teller ved hjelp av produsentens protokoll.
- Plasser fra 400 - 500 mikrogram total embryo protein i et 1,5 ml mikrosentrifugerør og fortynnet til 1 pg / pl med buffer 1 (se tabell 1).
- Sample Analysis
- Subject prøvene til denaturering SDS-PAGE. Bruk polyakrylamid ved den passende prosentandel for massen av reseptoren og drives gel i henhold til standard prosedyre.
- Dyppe gel i fiksativ-løsning (se tabell 1) i 30 minutter ved RT.
- Vask gelen med destillert vann i 15 min.
- Plasser gel i tidligere hydrert filter papir og dekk med Saran vikle film.
- Tørr gel ved 80 ° C i 1 time.
- Expose gel på en hvit phosphorimager skrueno på RT O / N.
- Skann utsatt skjermen ved hjelp av en phosphorimager hjelp produsentens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 viser et representativt resultat som oppnås med AFLIP. Signaler i Lane en kommer fra 125 I-ligand kovalent bundet til enten sebrafisk betaglycan kjernen protein (BG kjerne, under 150 kDa markør) eller BG kjerne som har blitt behandlet for sin proteoglykan form ved feste av glykosaminoglykaner (GAG, smøre strekker seg fra 170 kDa til toppen av gelen). Dette mønsteret av migrasjon, en skarp kjerneprotein pluss et utflytende proteoglykan (på grunn av heterogenitet i lengden av GAG-kjeder), er karakteristisk for TGFBR3 2. Ettersom DSS ikke kovalent koble hver enkelt ligand-reseptor-komplekset som dannes, er det fri 125I-ligand som opptrer ved migrering forsiden av gel (125 I-TGF-β2). Denne fri ligand var bundet til reseptoren, og forble bundet i løpet av immunoutfelling, men siden det ikke var kovalent bundet, frittliggende i løpet av SDS-PAGE prosedyre. NeiNetheless, styrken av sitt signal fortsatt korrelerer til en gitt av den merkede reseptor. Dette kan forstås ved å sammenligne baner 2 og 3. Ved 48 HPF sebrafisk embryoer oppviser lavere mengder av BG enn 72 HPF embryo 3, som kan sees av de svake signaler ved GAG og BG kjerne, som svarer til intensiteten av signaler fra den frie ligand som vises på forsiden av gelen (kolonne 2). Gitt at antistoffer mot rotte BG 6 ikke kryssreagerer med ZF BG, antistoffer når de anvendes i AFLIP ga ikke noe signal, og derfor tjener som en negativ kontroll (felt 3). Lignende negative resultater ble oppnådd med pre-immunserum for anti-ZF BG-antistoff 3.
Figur 2 viser hvordan AFLIP kan benyttes for å måle nivået av ekspresjon av en gitt reseptor i embryoer som er utsatt for en eksperimentell manipulasjon, i dette tilfellet reduksjon av betaglycan grunn morfolino ijection tre. Bane 1 viser nivået av TGFBR3 i en 72 HPF villtype embryo, mens felt 2 viser virkningen av administrering av 7 ng av en morfolino rettet mot exon2-intron2 grense av ZF BG primære transkript. Legg merke til at BG nedregulering oppnådd med denne morfolino ikke blir gjengitt ved sin mis-matchet kontroll (felt 3). Disse resultatene bekrefter at den oppnådd med denne morfolino fenotype var spesifikk for den knockdown av TGFBR3 som beskrevet tidligere tre.
Figur 1. AFLIP Påvisning av BG i Sebrafisk Embryos. Total proteinekstrakt fra embryoer ved 72 timer etter befruktning (HPF) (felt 1 og 3) og 48 HPF (kolonne 2) ble utsatt for 125 I-TGF-β2 affinitet merking etterfulgt ved IP med kanin anti-sebrafisk BG (kolonnene 1 og 2, zBG) eller kanin-anti-rotte BG (felt 3, RBG) Som en kontroll. I autoradiografi BG kan oppdages uten GAG (BG kjerne) eller som en glykosaminoglykanmodifiserte BG (GAG). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. BG Morpholino knockdown oppdaget av AFLIP. 125 I-TGF-β2 affinitet merking av BG fra ubehandlede WT embryoer (lane1), microinjected med spesifikk BG morfolino (Lane 2) eller en mismatch kontroll (Lane 3). De teller per million (CPM) utvinnes etter immunoprecipitation og kryssbindingstrinn er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Buffer | sammensetning |
| buffer 1 | 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 |
| Deyolk buffer | 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM NaHCO3 |
| Fish vann | Se Materialer Table |
| fiksativ løsning | 50% CH3OH, 12% CH3COOH, 0,185% HCHO |
| IP vaskebuffer | 10 mM Na HPO 2 4, 2 mM KH 2PO 4 '137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 0,02% SDS, pH 7,4 |
| Laemmli buffer | 2% SDS, 10% glyserol, 100 mM DTT, 60 mM Tris (pH 6,8), 0,001% bromfenol-blått. |
| lyseringsbuffer | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,5% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% Natrium Deoxycholate |
| PBS | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na-HPO 2 4, 2 mM KH 2PO 4, pH 7,4 |
| TNTE | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 |
| Vaske buffer | 110 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2,7 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8.5 |
Tabell 1: Buffer Komposisjoner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruken av Western blot med et spesifikt antistoff mot et protein av interesse er et verdifullt verktøy for å studere dets ekspresjon 7 i løpet av embryogenesen. Imidlertid immunoblotting av høyt-glykosylerte proteiner har ikke vært meget vellykkede på grunn av deres ineffektiv overføring og svak binding til nitrocellulose eller PVDF-membraner 8,9.
Proteoglykaner er et godt eksempel på dette brist, på grunn av deres kovalent bundet glycosaminoglycan kjeder (GAG) som er negativt ladet, og ikke binder godt til enten polystyren overflater eller hydrofobe blotting membraner. Også størrelsen heterogeniteten til GAG chains "spres" proteinet over en sektor av gelen, effektivt reduserte dens mengde pr område av blottet. I tillegg, hvis for proteinet av interesse har lave nivåer av ekspresjon, er dens deteksjon av vanlige Western blot en vanskelig oppgave. Den type III transformerende vekstfaktor-reseptor β (TGFBR3) eller betaglycan(BG), en membran reseptor med to GAG vedlegg nettsteder i pattedyr 1 og en i sebrafisk 3, har alle disse egenskapene. Selv om protokoller for å overvinne disse hindringene har blitt utviklet, slik som påvisning av avidin-biotin kompleks (ABC) system 10,11 eller immunobloting av proteoglykaner på positivt ladede membraner 12, de kan ikke løse begge problemer i samme protokoll. Å dra nytte av den høye affinitet av BG til sin naturlige ligand TGFβ2 og av tilgjengeligheten av et spesifikt antistoff, AFLIP, en teknikk som kombinerer fordelene med affinitet merking og immunopresipitering, de ovenfor omtalte begrensninger ved western blot deteksjon kan bli overvunnet.
Affinity merking av membranbundne reseptorer med deres radiomerkede ligander er et godt brukt verktøy som har vært medvirkende til identifisering og karakterisering av flere viktige vekstfaktorer reseptorer på dyrkede celler 13-16.Mens i konvensjonelle affinitet merking av et monolag av celler som er utsatt for kovalent ligand merking på den vevskulturskål og deretter lysert, i AFLIP de ligand-receptor-komplekser blir først dannet i embryo lysater, deretter renset ved immunoutfelling og til slutt, kovalent tverrbundne. På grunn av bruken av radioaktivt merkede ligander, er AFLIP meget følsom og i prinsippet kan tilpasses på andre vekstfaktorer eller cytokiner reseptorer som en merket ligand og en god antistoff er tilgjengelige. Dette potensialet av AFLIP ville hjelpe påvisning av disse lave rikelig men fysiologiske relevante molekyler.
På grunn av den iboende variabilitet i tverrbindingstrinnet av affinitet merking, kan AFLIP ikke benyttes til å kvantitativt bestemme nivåene av de målte reseptorer. Imidlertid, hvis det utføres med tilstrekkelig parallelle kontroller, kan det tilveiebringe en helt nøyaktig måling av relative nivåer av deres ekspresjon. Som AFLIP bruke totale proteinekstrakter, er det ikke restricted til en bestemt cellulær plassering av reseptoren, avslører det uttrykket i hele individ eller organ, hvis den anvendes til dissekert voksne individer. Endelig, om nødvendig AFLIP kan være knyttet til andre biokjemiske protokoller, slik som karbohydrat-enzymatiske spaltninger, for ytterligere å karakterisere reseptoren av interesse.
I likhet med konvensjonelle tilhørighet merking, er en fersk 125-merket ligand anbefales sterkt. Følge av den korte halveringstiden til 125I, må liganden brukes i løpet av de første 2 ukene etter merking med frisk isotop. Selv om de fleste av de begrensningene av protokollen har blitt nevnt i de tilsvarende trinnene, skal en spesiell omtale gis til forsiktig fjerning av eggeplomme, som må være så fullstendig og jevn som mulig. Leaving ujevne mengder eggeplomme vil resultere i feil kvantifisering av bona fide embryo protein i lysatene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
- López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
- Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
- Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
- Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
- Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
- Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
- Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
- Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
- Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).
