Protocol
Alla experiment som utförts i djur godkändes av kommittén för Laboratory Animal Care och användning av den autonoma National University of Mexico (UNAM), enligt CICUAL-Protokollnummer: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional para el Cuidado y Uso de los Animales de Laboratorio del Instituto de Fisiologìa Celular, Universidad Nacional Autònoma de México").
1. Framställning av Embryo proteinextrakt
- Samla 100 - 200 embryon för varje tillstånd att jämföra (morphants vs vild typ) vid önskad scen, t ex 72 timmar efter befruktning (HPF).
- Placera embryon i petriskålar innehållande fisk vatten (se tabell 1) och manuellt dechorionate embryon med hjälp spetsig pincett. Undvik att använda pronas under detta steg (eller någon annan proteas hela protokollet) eftersom det kan smälta riktade receptorn.
- Placera embryon i ett 1,5 ml mikrofugrör och tvätta embryon TWis med 1x fosfatbuffertlösning (PBS) (se tabell 1).
- Tillsätt 500 pl av deyolk buffert (se tabell 1).
- Frigöra det mesta av äggula genom att försiktigt pipettera upp och ner (ca 30 till 40 gånger) embryona i lösningen. För 72 HPF och 48 HPF embryon använder blå och gula pipettspetsar resp. Gula tips kan behöva sänkas något för att undvika att förstöra embryon. Den framgångsrika äggula frisättning kan kontrolleras genom att observera embryon under mikroskop.
- Samla in embryon genom centrifugering vid 600 xg under 15 sek.
- Kassera supernatanten försiktigt med hjälp av en pipett.
- Tvätta embryon två gånger med 500 pl tvättbuffert (se tabell 1) genom att försiktigt vortexa på lägsta hastighet.
- Samla in embryon genom centrifugering vid 600 xg under 15 sek.
- Från och med här, fortsätter förfarandet vid 4 ° C.
- Kassera supernatanten försiktigt med hjälp av en pipett.
- Resuspendera embryon i 350 pl lysbuffert (se tabell 1) och homogenisera med användning av en plastmortelstöt.
- Inkubera lyserade embryon 30 minuter under omrörning på ett provrör rocker vid 4 ° C.
- Centrifugera lyserade embryon vid 11.000 xg under 15 min för att avlägsna olösligt skräp.
- Överföring rensas supernatanten med hjälp av en pipett till ett nytt rör.
- Bestämma totalt protein genom Bradford-proteinanalys 4, eller något annat lämpligt förfarande. Om Bradford analys används, utför kalibreringskurvan i närvaro av motsvarande koncentrationer av rengöringsmedel presenterar i lysbuffert, eftersom de orsakar en underskattning av proteinstandard 4.
2. Detektion av endogen receptorprotein
- Affinity Märkning och Immunoprecipitation (alla dessa steg vid 4 ° C)
- Placera 400-500 gg totalt embryo protein i en 1,5 ml mikrofugrör och späd till 1 mikrogram / l med buffert 1 (se tabell 1).
Obs: För att erhålla 500 ug av totalt embryo protein, ca 100-200 embryon måste först bearbetas. 72 HPF embryon rutinmässigt utbyte ge ~ 5 ^ g av total embryo protein, vilket är tillräckligt för betaglykan detektering. - Lägga tillräckligt med volym av märkt TGF-β2 lager för att nå en slutlig koncentration av 150 pM och inkubera under omröring på ett provrör rocker 2 h vid 4 ° C. TGF-β2 måste märkas innan AFLIP startas med 125 I genom kloramin T-metoden som beskrivs av Cheifetz et al. 5.
VARNING: Använd avskärmning för att minimera exponeringen vid hantering 125 Jag märkt ligand. - Tillsätt tillräckligt volym av koncentrerad antikropp mot receptorn av intresse för att nå en 1: 100 spädning och fortsätta inkubation under ytterligare 2 h vid 4 ° C (inkubation kan vara O / N). Detta är den optimala spädningen av antiserum # 31, som används i denna studie och beskrivs på annat håll 3, men beroende på kvaliteten på entibody kan en större eller mindre utspädning vara det optimala.
- Tillsätt 50 pl av lämplig immunglobulinbindande pärlor (t.ex. G-protein-Sepharose, som tidigare jämviktats i TNTE och återsuspenderades 1: 5 av sin ursprungliga volym i TNTE) och inkubera i 50 min med omröring på ett provrör rocker vid 4 ° C.
- Återskapa pärlorna genom mikrocentrifugering vid 11.000 xg under 20 sekunder.
- Kassera supernatanten i en lämplig radioaktiv sopcontainer.
- Tvätta IP-pärlor tre gånger med 1 ml av IP-tvättbuffert (se tabell 1), genom att vortexa och mikrocentrifugering vid 11.000 xg under 20 sek varje gång.
- Resuspendera IP-pärlor i 250 l av IP tvättbuffert.
- Tillsätt 1,5 pl av disuccinimidylsuberat (DSS, löst i DMSO vid 10 mg / ml). Förbered DSS lösning strax före dess användning i detta steg.
- Inkubera i 15 min vid 4 ° C under omrörning.
- I syfte att släcka tvärbindningsreaktionen, tillsätt 500 | il of IP tvättbuffert, kompletterad med tillräckligt Tris-Cl pH 7,4 lager för att nå 25 mM Tris-Cl. De fria aminogrupperna i Tris fånga oreagerad DSS.
- Centrifugera vid 11.000 xg under 20 sek för att samla in IP-pärlor och kassera supernatanten.
- Resuspendera IP-pärlor i 30 pl minska Laemmli buffert.
- Koka proverna 5 min vid 94 ° C.
- Eventuellt, analysera prov i en gammaräknare med användning av tillverkarens protokoll.
- Placera 400-500 gg totalt embryo protein i en 1,5 ml mikrofugrör och späd till 1 mikrogram / l med buffert 1 (se tabell 1).
- prov~~POS=TRUNC
- Angående prover denaturering SDS-PAGE. Använd polyakrylamid vid lämplig procentsats för massan av receptorn och kör gel under standardförfarande.
- Fördjupa gel i fixeringslösning (se tabell 1) under 30 min vid RT.
- Tvätta gelén med destillerades vatten under 15 min.
- Placera gel i tidigare hydrerad filterpapper och täck med plastfolie film.
- Torra gelén vid 80 ° C under 1 timme.
- Exponera gelén på en vit fosfor screen vid RT O / N.
- Skanna exponerade skärmen med en fosfor använder tillverkarens protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar ett representativt resultat som erhölls med AFLIP. Signaler i Lane 1 kommer från 125 I-ligand kovalent bunden till antingen den zebrafisk betaglykan kärnproteinet (BG kärna, nedanför kDa markör 150) eller BG kärna som har bearbetats till sin proteoglykan form genom fastsättning av glykosaminoglykaner (GAG, smear som sträcker sig från 170 kDa till toppen av gelén). Detta mönster av migration, en skarp kärnprotein plus ett utsmetat proteoglykan (på grund av heterogenitet i längden av de GAG-kedjor), är kännetecknande för TGFBR3 2. Eftersom DSS inte kovalent inte länka varje ligand-receptorkomplex bildas, det finns gratis 125I-ligand uppträder vid migrations framför gel (125 I-TGF-β2). Denna fria ligand bunden till receptorn, och förblev bunden under immunoprecipitation, men eftersom det inte var kovalent bundna, lossnar under SDS-PAGE-förfarande. Nejnetheless, korrelerar hållfastheten hos dess signal fortfarande till den som ges av den märkta receptorn. Detta kan inses genom att jämföra körfält 2 och 3. På 48 HPF de zebrafisk embryon uppvisar lägre mängder av BG än 72 HPF embryon 3, som kan ses genom de svaga signalerna vid GAG och BG kärna, som motsvarar intensiteten hos den signaler som ges av den fria liganden som uppträder vid den främre delen av gelén (Lane 2). Med tanke på att antikroppar mot rått-BG 6 inte korsreagerar med ZF BG, antikropparna när de används i AFLIP gav ingen signal, därför, som tjänar som en negativ kontroll (bana 3). Liknande negativa resultat erhölls med pre-immunserum av anti-ZF BG-antikropp 3.
Figur 2 visar hur AFLIP kan användas för att mäta nivåerna av expression av en given receptor i embryon som utsatts för en experimentell manipulation, i detta fall, minskningen av betaglykan grund av morfolino iprojicerings 3. Bana 1 visar nivån för TGFBR3 i en 72 HPF vildtyp embryo, medan Lane 2 visar effekten av administrering av 7 ng av en morfolinogrupp riktad mot exon2-intron2 gränsen av ZF BG primärt transkript. Observera att BG nedreglering erhållas med denna morpholino inte återges av dess mis-matchad kontrollgrupp (Lane 3). Dessa resultat bekräftar att fenotypen erhålls med denna morpholino var specifik för knockdown av TGFBR3 som beskrivits tidigare tre.
Figur 1. AFLIP Detektion av BG i Zebrafish embryon. Totalt proteinextrakt från embryon vid 72 h efter befruktning (HPF) (Spår 1 och 3) och 48 HPF (Lane 2) utsattes för 125 I-TGF-β2 affinitetsmärkning följt genom IP med kanin-anti-zebrafisk BG (spår 1 och 2, ZBG) eller kanin-anti-rått-BG (Lane 3, RBG) Som en kontroll. I autoradiografi BG kan upptäckas utan GAG (BG kärna) eller som en glykosaminoglykan-modifierat BG (GAG). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. BG Morfolino Knockdown detekteras av AFLIP. 125 I-TGF-β2 affinitetsmärkning av BG från obehandlade WT-embryon (lane1), mikroinjicerade med specifik BG morfolino (Lane 2) eller en obalans kontroll (bana 3). Räkningarna per miljon (CPM) återhämtade sig efter immunoutfällning och tvärbindningssteget indikeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Buffert | Sammansättning |
| buffert 1 | 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100 |
| Deyolk buffert | 55 mM NaCl, 1,8 mM KCl, 1,25 mM NaHCOs 3 |
| fisk vatten | Se Material Tabell |
| fixeringslösning | 50% CH3OH, 12% CH3COOH, 0,185% HCHO |
| IP tvättbuffert | 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,1% Triton X-100, 0,02% SDS, pH 7,4 |
| Laemmli-buffert | 2% SDS, 10% glycerol, 100 mM DTT, 60 mM Tris (pH 6,8), 0,001% bromfenolblått. |
| lysbuffert | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 0,5% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,5% natrium Deoxycholat |
| PBS | 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 2 mM KH 2 PO 4, pH 7,4 |
| TNTE | 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% Triton X-100 |
| tvättbuffert | 110 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 2,7 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl pH 8,5 |
Tabell 1: Buffert Kompositioner
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Användningen av Western-blottar med en specifik antikropp mot ett protein av intresse är ett värdefullt verktyg för att studera dess uttryck 7 under fosterutvecklingen. Emellertid har immunoblotting av högt glykosylerade proteiner inte varit särskilt framgångsrika på grund av deras ineffektiv överföring och svag bindning till nitrocellulosa eller PVDF-membran 8,9.
Proteoglykaner är ett bra exempel på denna brist, på grund av deras kovalent bundna glykosaminoglykankedjor (GAG) som är negativt laddade och inte binder väl till antingen polystyrenytor eller hydrofoba blotting-membran. Även storleken heterogenitet GAG kedjorna "sprider" proteinet över en sektor av gel, effektivt minska dess belopp per område i blöt. Dessutom, om det intressanta proteinet har låga nivåer av uttryck, är dess detektering genom regelbundna western blottar en svår uppgift. Typ III transformerande tillväxtfaktor β-receptorn (TGFBR3) eller betaglykan(BG), en membranreceptor med två GAG: s bindningsställen hos däggdjur 1 och ett i zebrafisk 3, har alla dessa egenskaper. Även om, protokoll för att övervinna dessa hinder har uppfunnits, i likhet med detektering genom avidin-biotin-komplex (ABC) systemet 10,11 eller immunobloting av proteoglykaner på positivt laddade membran 12, kan de inte lösa båda problemen i samma protokoll. Med utnyttjande av den höga affiniteten av BG för dess naturliga ligand TGFP2 och av tillgängligheten av en specifik antikropp, AFLIP, en teknik som kombinerar fördelarna med affinitetsmärkning och immunutfällning, de ovan diskuterade begränsningarna hos western blot-detektion kan övervinnas.
Affinity märkning av membranbundna receptorer med sina radiomärkta ligander är ett väl använt verktyg som har varit avgörande för identifiering och karakterisering av flera viktiga tillväxtfaktorer receptorer i odlade celler 13-16.Medan i konventionella affinitetsmärkning ett monoskikt av celler utsattes för kovalent ligand märkning på vävnadsodlingsplatta och sedan lyseras, i AFLIP de ligand-receptorkomplex först bildas i embryo lysat, renade sedan genom immunfällning och slutligen, kovalent tvärbundna. Grund av dess användning av radioaktivt märkta ligander, är AFLIP mycket känslig och i princip kan anpassas till andra tillväxtfaktorer eller cytokiner receptorer för vilka en märkt ligand och en bra antikropp finns tillgängliga. Denna potential AFLIP skulle hjälpa att upptäcka dessa låga rikliga men fysiologiska relevanta molekyler.
På grund av den inneboende variabilitet i tvärbindningssteget av affinitetsmärkning, kan AFLIP inte användas för att kvantitativt bestämma halterna av de uppmätta receptorer. Men om den utförs med lämpliga parallella kontroller, kan det ge en helt korrekt mätning av relativa nivåer av deras uttryck. Som AFLIP använda totala proteinextrakt, är det inte restricted till en specifik cellulär plats av receptorn, avslöjar sitt uttryck i hela individen eller organ, om de tillämpas på dissekerade vuxna exemplar. Slutligen, om det behövs AFLIP kan kopplas till andra biokemiska protokoll, som kolhydrat enzymatiska klyvningar, för att ytterligare karaktärisera receptorn av intresse.
Liknar konventionell affinitetsmärkning, är en nyligen 125 I-märkt ligand rekommenderas starkt. Med tanke på den korta halveringstiden av 125 I, måste liganden användas inom de första 2 veckorna efter märkning med färsk isotop. Även om de flesta varningar i protokollet har nämnts i motsvarande steg, ska ett särskilt omnämnande ges till noggrann borttagning av äggula, som måste vara så fullständigt och enhetligt som möjligt. Lämnar ojämna mängder av äggula skulle resultera i felaktig kvantifiering av bona fide embryo protein i lysaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
- López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
- Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
- Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
- Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
- Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
- Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
- Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
- Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
- Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).
