איתור תיוג זיקה של אנדוגני רצפטורים מעוברים דג הזברה

Protocol

כל הניסויים שבוצעו בחיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים במעבדה ושימוש של האוניברסיטה הלאומית האוטונומית של מקסיקו (UNAM), תחת מספר CICUAL-Protocol: FLC40-14. (CICUAL: "פסקה Comité Institucional אל Cuidado y שימוש עכשווי de los Animales דה Laboratorio del Instituto de Celular Fisiologìa, México Universidad de הלאומית האוטונומית").

1. הכנת תמצית חלבון העובר

1. אסוף 100 - 200 עובריים עבור כל תנאים להשוות (morphants לעומת סוג בר) בשלב רצוי עבור שלאחר הפריה למשל 72 שעות (hpf).
2. עוברת מקום צלחות פטרי המכילות מי דגים (ראה טבלה 1) באופן ידני dechorionate עובר באמצעות קנס שקצו מלקחיים. הימנע משימוש pronase במהלך שלב זה (או כל פרוטאז אחר ברחבי לפרוטוקול) כפי שהוא עשוי לעכל את הקולטן הממוקד.
3. עוברים מקום בתוך שפופרת 1.5 מ"ל microfuge ולשטוף עוברים twקרח עם פתרון חיץ פוספט 1x (PBS) (ראו טבלה 1).
4. הוסף 500 μl של חיץ deyolk (ראה טבלה 1).
5. שחרר ביותר של חלמון ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה (כ -30 - 40 פעמים) את העוברים בתמיסה. במשך 72 hpf ו -48 עובר hpf להשתמש טיפי פיפטה כחולים וצהובים, בהתאמה. טיפים צהובים ייתכן שיהיו צורך לחתוך מעט כדי למנוע השמדה עוברת. מהדורת החלמון המוצלחת יכולה להיבדק על ידי התבוננות עוברים תחת מיקרוסקופ.
6. איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות.
7. בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet.
8. לשטוף עוברים פעמיים עם 500 חיץ כביסה μl (ראה טבלה 1) על ידי vortexing בעדינות במהירות הנמוכה ביותר.
9. איסוף עוברים על ידי צנטריפוגה ב 600 XG במשך 15 שניות.
10. החל מכאן, להמשיך את ההליך ב 4 ° C..
11. בטל supernatant בזהירות באמצעות pipet.
12. עוברים Resuspend ב 350 μl של חיץ תמוגה (ראה טבלה 1) ו homogenize באמצעות עלי פלסטיק.
13. דגירה עוברים lysed 30 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדה מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס.
14. צנטריפוגה lysed העוברת על 11,000 XG במשך 15 דקות על מנת להסיר שאריות מסיסות.
15. העברת פינת supernatant באמצעות pipet לצינור טרי.
16. לקבוע חלבון הכולל ידי השיטה ברדפורד ^4, או הליך מתאים אחר. אם assay ברדפורד משמש, לבצע את עקומת הכיול בנוכחות ריכוזים המקבילים של המתנות דטרגנטים במאגר תמוגה, כפי שהן גורמות הערכה נמוכה מדי של החלבון ⁴ הסטנדרטי.

2. איתור של חלבון קולטן אנדוגני

1. זיקה סימון Immunoprecipitation (כל השלבים הבאים ב 4 ^מעלות צלסיוס)
   1. מניחים 400 - 500 מיקרוגרם של חלבון העובר סך צינור 1.5 מ"ל microfuge לדלל עד 1 מיקרוגרם / μl עם חיץ 1 (ראה טבלה 1).
      הערה: על מנת לקבל 500 מיקרוגרם של חלבון העובר בסך הכל, כ 100 - 200 עוברים חייבים להיות מעובד בתחילה. 72 hpf עוברים באופן שגרתי להניב ~ 5 מיקרוגרם של חלבון העובר הכולל, וזה מספיק לגילוי betaglycan.
   2. הוספת נפח מספיק של מניות TGF-β2 שכותרתו להגיע לריכוז סופי של 150 בערב, דגירה עם תסיסה על hr נדנדה 2 מבחנה ב 4 מעלות צלזיוס. חייב להיות מתויג TGF-β2 לפני AFLIP הוא התחיל, עם ¹²⁵ ואני בשיטת T chloramine כפי שתואר על ידי Cheifetz et al. ^5.
      זהירות: השתמש מגן כדי לצמצם את החשיפה תוך טיפול ¹²⁵ ואני שכותרתו ליגנד.
   3. הוספת נפח מספיק של נוגדן חי נגד הקולטן של עניין על מנת להגיע דילול 1: 100 ולהמשיך דגירה של עוד 2 שעות ב 4 ° C (דגירה יכולה להיות O / N). זהו דילול אופטימלי של antiserum # 31, ששימשו במחקר זה מתואר במקומות אחרים ^3, אבל תלוי באיכות שלtibody, דילול גדול יותר או קטן יותר עשוי להיות אופטימלי.
   4. הוסף 50 μl של חרוזים מחייבים אימונוגלובולינים מתאימים (למשל, G- חלבון-Sepharose, אשר היה equilibrated בעבר TNTE ו resuspended 1: 5 של נפח המקורי TNTE) דגירה במשך 50 דקות עם תסיסה על כיסא נדנדת מבחנה ב 4 ° ג
   5. לשחזר את החרוזים על ידי microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות.
   6. בטל supernatant במיכל אשפה רדיואקטיבית המתאימה.
   7. לשטוף שלוש פעמים-חרוזים IP עם 1 מ"ל של חיץ לשטוף IP (ראו טבלה 1), על ידי vortexing ו microcentrifugation ב 11,000 XG במשך 20 שניות בכל פעם.
   8. Resuspend IP-החרוזים 250 μl של חיץ לשטוף IP.
   9. הוסף 1.5 μl של disuccinimidyl suberate (DSS, מומס DMSO ב 10 מ"ג / מ"ל). הכן את פתרון DSS רק לפני השימוש בו בשלב זה.
   10. דגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C עם תסיסה.
   11. כדי להרוות את התגובה crosslinking, להוסיף 500 μl of IP לשטוף חיץ, השלימו עם מספיק טריס-Cl-pH 7.4 המניה להגיע 25 מ"מ טריס-Cl. הקבוצות אמינו חופשיות ב טריס ללכוד DSS unreacted.
   12. צנטריפוגה ב 11,000 XG במשך 20 שניות כדי לאסוף IP-חרוזים להשליך supernatant.
   13. Resuspend IP-החרוזים 30 μl של צמצום מאגר Laemmli.
   14. מרתיח דגימות 5 דקות ב 94 מעלות צלזיוס.
   15. לחלופין, לנתח דגימות דלפק גמא באמצעות הפרוטוקול של היצרן.
2. ניתוח מדגם
   1. דגימות בכפוף denaturing SDS-PAGE. השתמש polyacrylamide על האחוז המתאים המסה של הקולט ולהפעיל ג'ל תחת הליך רגיל.
   2. לטבול ג'ל בתמיסה מקבעת (ראה טבלה 1) במשך 30 דקות ב RT.
   3. לשטוף ג'ל עם מים distillated במשך 15 דקות.
   4. מניחים ג'ל בנייר מסנן hydrated בעבר ומכסים בניילון נצמד הסרט.
   5. ג'ל ניקוי על 80 מעלות צלזיוס למשך 1 שעה.
   6. לחשוף ג'ל על scre phosphorimager לבןen ב RT O / N.
   7. סרוק מסך חשוף באמצעות phosphorimager באמצעות הפרוטוקול של היצרן.

Representative Results

איור 1 מציג תוצאה נציג שהושג עם AFLIP. אותות ליין 1 באים ¹²⁵ ליגנד קשרו קוולנטית או חלבון ליבת betaglycan דג הזברה (ליבת BG, מתחת 150 בסמן KDA) או בליבתו BG כי תעובד לצורת proteoglycan שלה על ידי התקשרות של glycosaminoglycans (GAG, למרוח החל 170 kDa לחלק העליון של הג'ל). דפוס זה של הגירה, חלבון ליבה חד בתוספת proteoglycan מרווחת (בשל ההטרוגניות אורך שרשרות GAG), הוא מאפיין של TGFBR3 ^2. מאז DSS אינו לקשר קוולנטית כל מורכבות ליגנד לרצפטור יחידות נוצרו, יש חינם ¹²⁵ I-ליגנד המופיע בחזית ההגירה של הג'ל ⁽¹²⁵ I-TGF-β2). ליגנד החופשי הזאת היה כרוך לקולטן, ו נשאר צמוד במהלך immunoprecipitation, אבל מכיוון שזה לא היה קשור קוולנטית, מנותק במהלך הליך SDS-PAGE. לאnetheless, את עוצמת האות שלה עדיין וקושר לזו שנתנה קולטן שכותרתו. זה יכול להיות מוערך על ידי השוואת נתיבים 2 ו 3. 48 hpf העוברים דג זברת תערוכת כמויות נמוכות של BG מ -72 עוברי hpf ^3, אשר ניתן לראות על ידי האותות החלשים בשורש GAG ליבת BG, התואמים את העוצמת אותות שנתנו ליגנד החופשי להופיע בקדמת הג'ל (ליין 2). בהתחשב בכך נוגדנים נגד עכברוש BG ⁶ לא צולבות להגיב עם BG ZF, הנוגדנים כאשר נעשה שימוש AFLIP לא נתן שום אות, ולכן, המשרתים כביקורת שלילית (מסלול 3). תוצאות שליליות דומות התקבלו עם הסרום מראש החיסוני של נוגדן ³ אנטי ZF BG.

איור 2 מראה כיצד AFLIP ניתן להשתמש כדי לאמוד את רמות ביטוי של הקולטן נתון בעוברים נתונים מניפולציה ניסויית, במקרה זה, הירידה של betaglycan בשל morpholino בjection ^3. ליין 1 מציג את רמת TGFBR3 בעובר סוג בר hpf 72, בעוד ליין 2 מראה את ההשפעה של מתן 7 ng של morpholino מופנה הגבול exon2-intron2 לפרוטוקול העיקרי ZF BG. ראוי לציין, כי BG למטה הרגולציה שהושגה עם morpholino זו אינה משוחזרת על ידי שליטת mis בהתאמה שלה (מסלול 3). תוצאות אלו אישרו כי הפנוטיפ שהושג עם morpholino זה היה ספציפי עבור מציאה של TGFBR3 כפי שתואר קודם לכן ^3.

איור 1. AFLIP איתור של BG עוברי דג הזברה. תמצית חלבון סה"כ מעוברים ב 72 שעות לאחר ההפריה (hpf) (Lanes 1 ו -3) ו -48 hpf (ליין 2) נחשפו ¹²⁵ I-TGF-β2 תיוג זיקה ואחריו על ידי IP עם BG נגד דג הזברה ארנב (Lanes 1 ו -2, zBG) או BG נגד חולדה ארנב (Lane 3, RBG כמו) כביקורת. בשנות ה autoradiography BG ניתן לאתר ללא GAG (הליבה BG) או כמו BG glycosaminoglycan-שונה (GAG). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. BG Morpholino מציאה זוהה על ידי AFLIP. ¹²⁵ I-TGF-β2 תיוג זיקה של BG מעוברים מטופל WT (lane1), microinjected עם ספציפיים BG morpholino (ליין 2) או פקד חוסר התאמה (מסלול 3). הספירה למ' (CPM) התאוששה לאחר immunoprecipitation וצעד cross-linking מסומן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

ה- i-next.within-page = "תמיד">

בַּלָם	הרכב
הצפת 1	50 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 מ"מ NaCl, 0.1% Triton X-100
חיץ Deyolk	55 מ"מ NaCl, 1.8 מ"מ KCl, 1.25 מ"מ NaHCO 3
מי דגים	ראה חומרי טבלה
פתרון מקבע	50% CH 3 OH, 12% CH 3 COOH, 0.185% HCHO
חיץ לשטוף IP	10 מ"מ Na 2 4 HPO, 2 מ"מ KH 2 PO 4, 137 מ"מ NaCl, KCl 2.7 מ"מ, 0.1% Triton X-100, 0.02% SDS, pH 7.4
חיץ Laemmli	2% SDS, 10% גליצרול, 100 מ"מ DTT, 60 מ"מ טריס (pH 6.8), כחול bromphenol 0.001%.
חיץ תמוגה	50 mM Tris-HCl pH7.4, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 1 מ"מ PMSF, 0.5% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% נתרן Deoxycholate
PBS	137 מ"מ NaCl, 2.7 מ"מ KCl, 10 מ"מ Na 2 4 HPO, 2 מ"מ KH 2 PO 4, pH7.4
TNTE	50 mM Tris-HCl pH7.4, 150 מ"מ NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Triton X-100
חיץ כביסה	110 מ"מ NaCl, KCl 3.5 מ"מ, 2.7 מ"מ CaCl 2, 10 mM Tris-HCl pH 8.5

טבלה 1: קומפוזיציות הצפת

Discussion

השימוש כתם המערבי עם נוגדן ספציפי נגד חלבון של עניין הוא כלי רב ערך כדי ללמוד את ביטוייה ⁷ במהלך embryogenesis. עם זאת, immunoblotting של חלבונים הפערים glycosylated לא היה מוצלח מאוד בשל העברתם יעיל מחייב חלש ממברנות nitrocellulose או PVDF ^8,9.

Proteoglycans הם דוגמה טובה של חיסרון זה, בגלל שרשראות גליקוז המצורפים שלהם קוולנטית (GAG) כי הם טעונים שלילית ואינם נקשרים היטב משני משטחי קלקר או ממברנות סופג הידרופובי. כמו כן, ההטרוגניות הגודל של רשתות GAG "מתפשט" החלבון על פני מגזר של ג'ל, הפחתת סכומה ביעילות ליחידת שטח של הכתם. בנוסף, אם החלבון של עניין יש רמות נמוכות של ביטוי, זיהוי על ידי כתמים מערביים קבועים הוא משימה קשה. כאשר גורם הגדילה סוג III ששינתה את המציאות β רצפטור (TGFBR3) או betaglycan(BG), קולטן קרום עם שני אתרי ההתקשרות של GAG ביונקים ¹ ואחד דג הזברה ^3, יש את כל המאפיינים האלה. אמנם, פרוטוקולים כדי להתגבר על המכשולים הללו כבר המציאו, כמו זיהוי על ידי מערכת מורכבת ביוטין avidin (ABC) ^10,11 או immunobloting של proteoglycans על ממברנות בעלי מטען חשמלי חיובי ^12, הם לא יכולים לפתור את שתי הבעיות באותו פרוטוקול. ניצול של הזיקה הגבוהה של BG עבור TGFβ2 ליגנד הטבעי של הזמינות של נוגדנים ספציפיים, AFLIP, טכניקה המשלבת את היתרונות של תיוג זיקת immunoprecipitation, שנדון לעיל מגבלות של גילוי כתם המערבי ניתן להתגבר.

תיוג זיקה של קולטני קרום נכנס עם ליגנדים radiolabeled שלהם הוא כלי המשמש גם כי כבר סייע לזיהוי והאפיון של צמיחה חשובה מספר גורמי קולטנים בתאים בתרבית ^13-16.בעוד זיקה קונבנציונלית תיוג בשכבה של תאים הוא נתון קוולנטיים תיוג ליגנד על הצלחת בתרבית רקמה ואז lysed, ב AFLIP מתחמי קולטן ליגנד הנוצרות ראשונות lysates העובר, ולאחר מכן מטוהר על ידי immunoprecipitation ולבסוף, קוולנטית צולבת. בשל השימוש של הליגנדים רדיואקטיבי, AFLIP מאוד רגיש באופן עקרוני ניתן להתאים גורמי גדילה אחרים או קולטני ציטוקינים עבורו ליגנד שכותרתו נוגדן טוב זמינים. פוטנציאל זה של AFLIP יעזור זיהוי של מולקולות הרלוונטיות שופעות אלא פיסיולוגיות הנמוכות אלה.

בגלל השוני הפנימי בשלב cross-linking של תיוג זיקה, AFLIP לא ניתן להשתמש כדי לקבוע את הרמות של קולטני נמדד כמותית. עם זאת, אם נעשה שולט במקביל מספק, הוא יכול לספק מודד מדויק למדי של רמות היחסיות של הביטוי שלהם. כפי AFLIP להשתמש תמציות חלבון כוללות, הוא לא restricted למיקום הסלולר ספציפי אחת של הקולטן, הוא חושף את ביטוייה הפרט או האיבר השלם, אם להחיל דגימות מבוגרות גזורות. לבסוף, אם AFLIP למשהו יכולים להיות מקושרים פרוטוקולים ביוכימיים אחרים, כמו digestions פחמימות האנזימטית, כדי להמשיך לאפיין את הקולטן של עניין.

בדומה תיוג זיקה מקובל, טרי ¹²⁵ I-שכותרתו ליגנד מומלץ בחום. בהינתן זמן מחצית החיים הקצר של ¹²⁵ ואני, ליגנד חייב לשמש בתוך 2 השבועות הראשונים לאחר תיוג עם איזוטופ טרי. למרות שרוב האזהרות של הפרוטוקול הוזכר בשלבים המקבילים, לציון מיוחד אחד יינתן על הסרה הזהירה של החלמון, אשר חייב להיות מלא ואחיד ככל האפשר. השארת סכומים אחידים של חלמון תגרום quantitation לא נכונה של חלבון העובר בתום לב ב lysates.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disuccinimidyl suberate (DSS)	ThermoFisher Scientific	21555
Protein G Sepharose 4 Fast Flow	GE Healthcare Life Sciences	17-0618-01
Gel Dryer Model 583	BIO-RAD	1651745
Typhoon 9400	GE Healthcare Life Sciences	63-0055-78
Cobra II Auto gamma counter	Packard
Exposure Cassette	Molecular Dynamics	63-0035-44
NaCl	J.T. Baker	3624
KCl	J.T. Baker	3040
Na2HPO4	J.T. Baker	3828
K2HPO4	J.T. Baker	3246
CH3OH	J.T. Baker	9070
CH3COOH	J.T. Baker	9508
HCHO	J.T. Baker	2106
SDS	Sigma-Aldrich	L4509
EDTA	Sigma-Aldrich	ED
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3306
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
PMSF	Sigma-Aldrich	P7626
Crystal Sea Marine Mix	Marine Enterprises International	http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix