Protocol
Все эксперименты, проведенные на животных были одобрены Комитетом по лабораторному уходу и использованию автономного национального университета Мексики (УНАМ) животного происхождения, под номером CICUAL-протокола: FLC40-14. (CICUAL: "Comité Institucional пункт эль Cuidado у Uso-де-лос-Animales де Laboratorio дель Instituto де Fisiologìa Celular, Национальный автономный университет Мехико").
1. Получение экстракта Эмбрион белка
- Собирают 100 - 200 эмбрионов для каждого условия для сравнения (морфанты против дикого типа) на желаемой стадии, например, 72 часов после оплодотворения (HPF).
- Место эмбрионов в чашки Петри , содержащие воду рыбы (см таблицу 1) и вручную dechorionate эмбрионов с помощью остроконечного пинцета. Не следует использовать проназу во время этого шага (или любой другой протеазы по всему протоколу), поскольку она может переваривать целевой рецептор.
- Место эмбрионов в 1,5 мл пробирке с и мыть эмбрионов Twлед с раствором 1x фосфатного буфера (PBS) (таблица 1).
- Добавьте 500 мкл буфера deyolk (таблица 1).
- Выпуск большинство желтка, осторожно пипеткой вверх и вниз (около 30 - 40 раз) эмбрионов в растворе. Для 72 и 48 часов после оплодотворения эмбрионов HPF используют синие и желтые наконечники пипеток, соответственно. Желтые советы, возможно, должны быть немного сократить, чтобы избежать уничтожения эмбрионов. Успешный выпуск желток может быть проверена путем наблюдения эмбрионов под микроскопом.
- Сбор эмбрионов путем центрифугирования при 600 мкг в течение 15 сек.
- Удалите супернатант осторожно с помощью пипетки.
- Вымойте эмбрионов в два раза с 500 мкл буфера для промывки (таблица 1), осторожно встряхивая на самой низкой скорости.
- Сбор эмбрионов путем центрифугирования при 600 мкг в течение 15 сек.
- Начиная отсюда, продолжить процедуру при температуре 4 ° С.
- Удалите супернатант осторожно с помощью пипетки.
- Ресуспендируют эмбрионов в 350 мкл буфера для лизиса (Таблица 1) и гомогенизируют с помощью пластикового пестика.
- Выдержите лизируют эмбрионов через 30 мин при перемешивании на качалке пробирке при 4 ° С.
- Центрифуга лизируют эмбрионов при 11000 х г в течение 15 мин, чтобы удалить нерастворимые твердые частицы.
- Передача очищается супернатанта с помощью пипетки в свежую пробирку.
- Определить общий белок по Бредфорда белка 4, или другой подходящей процедурой. Если Бредфорда используется, выполняют калибровочную кривую в присутствии эквивалентных концентраций детергентов подарков в буфере для лизиса, так как они вызывают недооценку белка стандартного 4.
2. Обнаружение эндогенного белка рецептора
- Аффинное мечение и иммунопреципитация (все эти шаги при 4 ° С)
- Поместите 400 - 500 мкг общего белка эмбрионов в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и разбавляют до 1 мкг / мкл буфера 1 (таблица 1).
Примечание: Для того чтобы получить 500 мкг общего белка эмбрионов, около 100 - 200 эмбрионов должны быть первоначально обработаны. 72 HPF эмбрионов обычно дают ~ 5 мкг общего белка эмбриона, который является достаточным для обнаружения betaglycan. - Добавьте достаточный объем меченого TGF-бета 2 запаса для достижения конечной концентрации 150 мкМ и инкубировать при перемешивании на пробирке качающегося 2 ч при 4 ° С. TGF-β2 должны быть помечены перед запуском AFLIP, с 125 I с помощью метода хлорамина Т , как описано Cheifetz и др. 5.
ВНИМАНИЕ: Используйте экранирование для минимизации воздействия при обращении с 125 I меченый лиганд. - Добавьте достаточно объема неразбавленного антител против рецептора интереса для того, чтобы достичь разведение 1: 100 и продолжают инкубацию еще в течение 2 ч при 4 ° С (инкубационный может быть O / N). Это оптимальное разведение антисыворотки # 31, используемый в данном исследовании , и описано в другом месте 3, но в зависимости от качества апtibody, большее или меньшее разбавления может быть оптимальным.
- Добавляют 50 мкл подходящей иммуноглобулина связывания гранул (например, G-белок-сефарозой, которая была предварительно уравновешенную в TNTE и ресуспендировали 1: 5 своего первоначального объема в TNTE) и инкубировать в течение 50 мин при перемешивании на качалке пробирке при 4 ° C.
- Восстановить бусы микроцентрифугированием при 11000 мкг в течение 20 сек.
- Удалите супернатант в соответствующем контейнере радиоактивного хлама.
- Вымойте IP - бусинок три раза с 1 мл промывочного буфера IP (см таблицу 1), путем встряхивания и микроцентрифугированием при 11000 мкг в течение 20 секунд каждый раз.
- Ресуспендируют IP-бусины в 250 мкл буфера IP промывной.
- Добавить 1,5 мкл дисукцинимидилсуберат (DSS, растворенного в ДМСО с концентрацией 10 мг / мл). Приготовьте раствор DSS как раз перед его использованием в этом шаге.
- Инкубировать в течение 15 мин при 4 ° С при перемешивании.
- Для того, чтобы погасить реакцию сшивания, добавляют 500 мкл Oе IP промывочный буфер, с добавлением достаточно Трис-Cl рН 7,4 запаса достигнет 25 мМ Трис-Cl. Свободные аминогруппы в Трис захвата непрореагировавший DSS.
- Центрифуга при 11000 мкг в течение 20 секунд, чтобы собрать IP-шарики и отбросить супернатант.
- Ресуспендируют IP-бусины в 30 мкл буфера снижения Laemmli.
- Варить образцы 5 мин при 94 ° С.
- Необязательно проводить анализ проб в гамма-счетчике с использованием протокола производителя.
- Поместите 400 - 500 мкг общего белка эмбрионов в 1,5 мл микроцентрифужную пробирку и разбавляют до 1 мкг / мкл буфера 1 (таблица 1).
- Анализ проб
- Предметные образцы денатурирующих SDS-PAGE. Использование полиакриламида на соответствующий процент по массе рецептора и гель-под стандартной процедурой.
- Погружают гель в Фиксирующий раствор (таблица 1) в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Вымойте гель с дистиллированной водой в течение 15 мин.
- Поместите гель в предварительно гидратированных фильтровальную бумагу и накрыть Саран оберточной пленкой.
- Сухой гель при 80 ° С в течение 1 часа.
- Expose гель на белом Phosphorimager Screан при RT O / N.
- Сканирование подвергается экран с помощью Phosphorimager с использованием протокола производителя.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 1 показана репрезентативная результат , полученный с AFLIP. Сигналы в Дорожка 1 поступают из 125 I-лиганд , ковалентно связанный либо с данио betaglycan корового белка (сердечник BG, ниже 150 кДа маркер) или ядро BG, которое было обработано в его протеогликанов форме путем присоединения гликозаминогликаны (ГАГ, мазка в пределах от 170 кДа до верхней части геля). Эта модель миграции, острый белок ядра плюс смазывают протеогликанов (из - за неоднородности в длине рвотный цепей), характерно для TGFBR3 2. Так как ДСС не ковалентно связывают каждый комплекс лиганд-рецептор сформирован, существует свободный 125 I-лиганд , появляющийся на миграционный передней части геля (125 I-TGF & beta ; 2-). Этот свободный лиганд, связанный с рецептором, и были переплетены в течение иммунопреципитации, но так как он не был ковалентно присоединен, отделиться во время процедуры SDS-PAGE. Нетnetheless, сила его сигнала по-прежнему коррелирует с тем, которое меченым рецептором. Это можно оценить путем сравнения полосы 2 и 3. На 48 HPF данио эмбрионов демонстрируют меньшие количества , чем BG 72 HPF эмбрионов 3, которые можно увидеть с помощью слабых сигналов на GAG и ядро BG, которые соответствуют его интенсивности сигналы, подаваемые свободным лигандом, присутствующим на передней части геля (дорожка 2). Учитывая , что антитела против крысы Б.Г. 6 не вступают в перекрестную реакцию с ZF BG, антитела при применении в AFLIP не давала никакого сигнала, таким образом, служит в качестве отрицательного контроля (дорожка 3). Подобные отрицательные результаты были получены с предварительно иммуносывороткой противокавитационной ZF BG антителом 3.
На рисунке 2 показано , как AFLIP может использоваться , чтобы измерить уровни экспрессии данного рецептора у эмбрионов , подвергнутых экспериментальной манипуляции, в этом случае, снижение betaglycan из - за морфолино в3 проекция. Дорожка 1 показывает уровень TGFBR3 в 72 HPF дикого типа эмбрионов, в то время как полоса 2 показывает эффект введения 7 нг морфолиновое, направленного на exon2-intron2 границы первичного транскрипта ZF BG. Обратите внимание, что БГ понижающую регуляцию, полученные с применением морфолино не воспроизводится его несогласованной контроля (дорожка 3). Эти результаты подтвердили , что фенотип , полученные с применением морфолино был специфичным для нокдауна TGFBR3 , как описано выше 3.
Рисунок 1. AFLIP Обнаружение BG у эмбрионов данио рерио. Общий экстракт белка из эмбрионов на 72 ч после оплодотворения (ФВЧ) (Дорожки 1 и 3) и 48 ФВЧ (дорожка 2) были подвергнуты 125 I-TGF-бета 2 маркировки с последующим сродства по IP с кроличьими анти-данио BG (Дорожки 1 и 2, ZBG) или кролика против крысы BG (дорожка 3, RBG) В качестве контроля. В авторадиографии BG могут быть обнаружены без ГАГ (ядра BG) или в виде гликозаминогликанов модифицированного BG (ГАГ). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Б. Г. морфолино нокдаун Обнаружил AFLIP. 125 I-TGF-β2 аффинных меток BG из необработанных эмбрионов WT (lane1), микроинъекции с конкретным BG морфолино (дорожка 2) , либо контроля рассогласования (дорожка 3). Подсчеты на миллион (СРМ) восстановился после того , как иммунопреципитация и сшивающий шаг обозначены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| буфер | Состав |
| Буфер 1 | 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 0,1% Тритон Х-100 |
| буфер Deyolk | 55 мМ NaCl, 1,8 мМ KCl, 1,25 мМ NaHCO 3 |
| Рыба вода | См Материалы таблицу |
| Фиксирующий раствор | 50% CH 3 OH, 12% СН 3 СООН, 0,185% НСНО |
| Буфер IP стирки | 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ КН 2 РО 4, 137 мМ NaCl, 2,7 мМ КСl, 0,1% Тритон Х-100, 0,02% ДСН, рН 7,4 |
| Laemmli буфер | 2% ДСН, 10% глицерина, 100 мМ ДТТ, 60 мМ Трис (рН 6,8), 0,001% бромфеноловый синий. |
| буфер для лизиса | 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ФМСФ, 0,5% Тритон Х-100, 0,1% SDS, 0,5% натрия DeoxychOlate |
| PBS | 137 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na 2 HPO 4, 2 мМ KH 2 PO 4, pH 7,4 |
| TNTE | 50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% Тритона Х-100 |
| Промывочный буфер | 110 мМ NaCl, 3,5 мМ КСl, 2,7 мМ CaCl 2, 10 мМ Трис-HCl , рН 8,5 |
Таблица 1: буферные композиции
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование Вестерн - блоттинга со специфическим антителом против представляющего интерес белка является ценным инструментом для изучения его экспрессии 7 во время эмбриогенеза. Тем не менее, иммуно высоко гликозилированных белков не был очень успешным из - за их неэффективной передачи и слабое связывание на нитроцеллюлозные или PVDF мембраны 8,9.
Протеогликанов являются хорошим примером этого недостатка, из-за их ковалентно присоединенных гликозаминогликановых цепей (ГАГ), которые отрицательно заряженными и не хорошо связываются с поверхностями либо пенополистирол или гидрофобных блоттинга мембран. Кроме того, размер гетерогенность рвотный цепей "распространяется" белок над сектором геля, эффективно уменьшая его количество на единицу площади блоте. Кроме того, если интересующий белок имеет низкие уровни экспрессии, его обнаружение с помощью регулярных западных помарки, является трудной задачей. Фактор роста типа III трансформирующий β-рецептора (TGFBR3) или betaglycan(BG), мембранный рецептор с двумя узлами крепления ГАГ у млекопитающих 1 и один в данио 3, имеет все эти свойства. Несмотря на то , протоколы , чтобы преодолеть эти препятствия были разработаны, как и обнаружение с помощью авидин-биотин сложной системы (ABC) 10,11 или immunobloting протеогликанов на положительно заряженных мембран 12, они не могут решить обе проблемы в том же протоколе. Воспользовавшись высоким сродством BG для его природного лиганда TGFβ2 и наличия специфических антител, AFLIP, метод, который сочетает в себе преимущества маркировки степенью сродства и иммунопреципитации, обсуждаемым выше ограничения Вестерн-блот обнаружения могут быть преодолены.
Affinity маркировка мембраносвязанных рецепторов с их меченных лигандов является хорошо используемым инструментом , который играет важную роль для идентификации и определения характеристик ряда важных факторов роста рецепторов в культивируемых клетках 13-16.В то время как в обычном аффинное мечение монослой клеток подвергается ковалентными лиганд маркировке на блюдо культуры ткани, а затем лизируют в AFLIP комплексы лиганд-рецептор сначала формируется в зародыше лизатов, затем очищают с помощью иммунопреципитации и, наконец, ковалентно сшитыми. Из-за его использования радиоактивно меченных лигандов, AFLIP является очень чувствительным и, в принципе, могут быть адаптированы к другим факторам роста или цитокины рецепторов, к которым меченный лиганд и хороший ответ антител доступны. Этот потенциал AFLIP помогло бы обнаружение этих низких обильными, но физиологических соответствующих молекул.
Из-за присущей изменчивости в сшивающего стадию мечения сродства, AFLIP не могут быть использованы для количественного определения уровней измеренных рецепторов. Тем не менее, если выполняются с адекватными параллельными управления, он может обеспечить достаточно точное замеры относительного уровня их экспрессии. В качестве AFLIP используют общие экстракты белка, оно не restriИДКТК к одной конкретной клеточной локализации рецептора, он раскрывает свое выражение в целом лица или органа, если применительно к расчлененным взрослых особей. И, наконец, в случае необходимости AFLIP может быть связан с другими биохимическими протоколами, как углеводных ферментативных варок, чтобы дополнительно характеризовать рецептор интерес.
Подобно обычной маркировке сродства, настоятельно рекомендуется свеже 125 I-меченый лиганд. Учитывая короткий период полураспада 125 I, лиганд должен быть использован в течение первых 2 -х недель после мечения со свежим изотопом. Хотя большинство предостережений протокола были упомянуты в соответствующих шагов, одно специальное упоминание должно быть уделено тщательному удалению желтка, который должен быть максимально полным и равномерным, насколько это возможно. Оставляя неравные количества желтка приведет к неправильному количественному добросовестных белка эмбриона в лизатах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Disuccinimidyl suberate (DSS) | ThermoFisher Scientific | 21555 | |
| Protein G Sepharose 4 Fast Flow | GE Healthcare Life Sciences | 17-0618-01 | |
| Gel Dryer Model 583 | BIO-RAD | 1651745 | |
| Typhoon 9400 | GE Healthcare Life Sciences | 63-0055-78 | |
| Cobra II Auto gamma counter | Packard | ||
| Exposure Cassette | Molecular Dynamics | 63-0035-44 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624 | |
| KCl | J.T. Baker | 3040 | |
| Na2HPO4 | J.T. Baker | 3828 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3246 | |
| CH3OH | J.T. Baker | 9070 | |
| CH3COOH | J.T. Baker | 9508 | |
| HCHO | J.T. Baker | 2106 | |
| SDS | Sigma-Aldrich | L4509 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3306 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| PMSF | Sigma-Aldrich | P7626 | |
| Crystal Sea Marine Mix | Marine Enterprises International | http://www.meisalt.com/Crystal-Sea-Marinemix |
References
- López-Casillas, F., et al. Structure and expression of the membrane proteoglycan betaglycan, a component of the TGF-β receptor system. Cell. 67 (4), 785-795 (1991).
- Cheifetz, S., Andres, J. L., Massague, J. The transforming growth factor-beta receptor type III is a membrane proteoglycan. Domain structure of the receptor. J. Biol. Chem. 263 (32), 16984-16991 (1988).
- Kamaid, A., et al. Betaglycan knock-down causes embryonic angiogenesis defects in zebrafish. Genesis. 53, 583-603 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Cheifetz, S., et al. Distinct transforming growth factor-b receptor subsets as determinants of cellular responsiveness to three TGF-b isoforms. J. Biol. Chem. 265, 20533-20538 (1990).
- López-Casillas, F., Wrana, J. L., Massagué, J. Betaglycan presents ligand to the TGFβ signaling receptor. Cell. 73 (7), 1435-1444 (1993).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Maccari, F., Volpi, N. Direct and specific recognition of glycosaminoglycans by antibodies after their separation by agarose gel electrophoresis and blotting on cetylpyridinium chloride-treated nitrocellulose membranes. Electrophoresis. 24 (9), 1347-1352 (2003).
- Volpi, N., Maccari, F. Glycosaminoglycan blotting and detection after electrophoresis separation. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 1312, 119-127 (2015).
- Guesdon, J. L., Ternynck, T., Avrameas, S. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques. J Histochem Cytochem. 27 (8), 1131-1139 (1979).
- Bratthauer, G. L. The avidin-biotin complex (ABC) method and other avidin-biotin binding methods. Methods Mol Biol (Clifton, N.J). 588, 257-270 (2010).
- Heimer, R., Molinaro, L., Sampson, P. M. Detection by 125I-cationized cytochrome c of proteoglycans and glycosaminoglycans immobilized on unmodified and on positively charged Nylon 66. Anal. Biochem. 165 (2), 448-455 (1987).
- Das, M., et al. Specific radiolabeling of a cell surface receptor for epidermal growth factor. PNAS USA. 74 (7), 2790-2794 (1977).
- Massague, J., Guillette, B., Czech, M., Morgan, C., Bradshaw, R. Identification of a nerve growth factor receptor protein in sympathetic ganglia membranes by affinity labeling. J. Biol. Chem. 256 (18), 9419-9424 (1981).
- Massague, J., Pilch, P. F., Czech, M. P. Electrophoretic resolution of three major insulin receptor structures with unique subunit stoichiometries. PNAS USA. 77 (12), 7137-7141 (1980).
- Hoosein, N. M., Gurd, R. S. Identification of Glucagon Receptors in Rat Brain. PNAS USA. 81, 4368-4372 (1984).
