Summary
Denne artikel beskriver anvendelsen af ikke-målrettede metabolomics, transcriptomics og multivariat statistisk analyse til drue bær udskrifter og metabolitter for at få indsigt i terroir koncept, dvs. virkningen af miljøet på bær kvalitet træk.
Abstract
Terroir refererer til kombinationen af miljømæssige faktorer, der påvirker karakteristika afgrøder såsom Grapevine (Vitis vinifera) i henhold til særlige levesteder og ledelsespraksis. Denne artikel viser, hvordan visse terroir signaturer kan påvises i bær metabolomet og transkriptom af vinavlsprodukter kultivar Corvina hjælp multivariat statistisk analyse. Metoden kræver først en passende stikprøveplan. I dette casestudie blev en specifik klon af Corvina sorten valgte at minimere genetiske forskelle, og prøver blev indsamlet fra syv vinmarker, der repræsenterer tre forskellige makro-zoner i løbet af tre forskellige vækstsæsoner. Det anbefales ikke-målrettede LC-MS metabolomics tilgang på grund af sin høje følsomhed, ledsaget af effektiv databehandling under anvendelse MZmine software og en metabolit identifikation strategi baseret på fragmentering træ analyse. Omfattende transkriptom analyse kan opnås ved anvendelse microarraysindeholdende prober dækker ~ 99% af alle forudsagte grapevine gener, tillade samtidig analyse af alle differentielt udtrykte gener i forbindelse med forskellige terroirs. Endelig kan anvendes multivariate data analyse baseret på projektion metoder til at overvinde den stærke årgang-specifik virkning, og metabolomics og transcriptomics data, der skal integreres og analyseret i detaljer for at identificere informative korrelationer.
Introduction
Storstilet dataanalyse baseret på genomer, transcriptomes, proteomer og metabolomes af planter giver en hidtil uset indsigt i adfærd af komplekse systemer, såsom terroir karakteristika vin, der afspejler samspillet mellem grapevine planter og deres omgivelser. Fordi terroir af en vin kan være selvstændig, selv når identiske vinavlsprodukter kloner dyrkes i forskellige vinmarker, genomforskning analyse er til megen nytte, fordi klonede genomer er identiske. er stedet er det nødvendigt at se på sammenhænge mellem genekspression og de metaboliske egenskaber af de bær, der bestemmer kvaliteten træk af vin. Analysen af genekspression på niveau med transkriptomet fordelene ved de tilsvarende kemiske egenskaber for alle transkripter, hvilket letter kvantitativ analyse ved at udnytte universelle egenskaber såsom hybridisering til immobiliserede prober på microarrays. I modsætning hertil universelle analytiske metoder i proteomics ennd metabolomics er mere udfordrende på grund af den enorme fysiske og kemiske diversitet individuelle proteiner og metabolitter. I tilfælde af metabolomics denne mangfoldighed er endnu mere ekstrem, fordi de enkelte metabolitter varierer voldsomt i størrelse, polaritet, overflod og volatilitet, så ingen enkelt udvinding proces eller analysemetode tilbyder en holistisk tilgang.
Blandt de analytiske platforme er egnede til ikke-flygtige metabolitter, der er baseret på højtryksvæskekromatografi koblet til massespektrometri (HPLC-MS) er langt mere følsomme end alternativer såsom HPLC med ultraviolet eller diode array detektorer (HPLC-UV, HPLC-DAD ) eller kernemagnetisk resonans (NMR) spektroskopi, men kvantitativ analyse ved HPLC-MS kan påvirkes af fænomener som matrix effekt og ion suppression / enhancement 1-3. Undersøgelsen af sådanne virkninger under analysen af Corvina vindruer ved HPLC-MS ved anvendelse af en elektrospray-ioniseringskilde (HPLC-ESI-MS), viste, at sukkere og andre molekyler med de laveste retentionstider var stærkt underrapporteret, sandsynligvis også afspejler det store antal molekyler i denne zone, og at den overflod af andre molekyler kan undervurderes, utilstrækkeligt eller upåvirket af matrixeffekten , men de data, normalisering for matrix effekt syntes at have begrænset indvirkning på den overordnede resultater 4,5. Den her beskrevne metode er optimeret til analyse af mellemlange polaritet metabolitter, der ophobes ved høje niveauer i drue bær under modningen, og som i væsentlig grad påvirket af terroir. De omfatter anthocyaniner, flavonoler, flavan-3-oler, procyanidiner, andre flavonoider, resveratrol, stilbener, hydroxycinnamic syrer og hydroxybenzoesyre syrer, der tilsammen bestemmer farve, smag og sundhedsmæssige egenskaber af vine. Andre metabolitter, såsom sukkerarter og alifatiske organiske syrer, ignoreres, fordi kvantificering ved HPLC-MS er upålidelige på grund matricen effekt og ion suppression fænomener 5. Inden polariteten område udvalgt af denne metode, tilgangen er irrelevante, da den har til formål at opdage så mange forskellige metabolitter som muligt 6.
Transcriptomics metoder, der tillader tusinder af vinavlsprodukter udskrifter skal overvåges samtidig lettes ved tilgængeligheden af komplette vinstok genom sekvens 7,8. Tidlige transcriptomics metoder baseret på high-throughput cDNA sekventering har udviklet sig med fremkomsten af næste generations sekventering til en samling af procedurer kollektivt beskrevet som RNA-Seq teknologi. Denne fremgangsmåde bliver hurtigt den foretrukne metode til transcriptomics studier. Men en stor mængde litteratur baseret på microarray, der tillader tusinder af udskrifter skal kvantificeres parallelt af hybridisering, har oparbejdet til vinstok. Faktisk før RNA-Seq blev en mainstream teknologi, havde mange dedikerede kommercielle microarray platforme væretudviklet så vinstok transkriptom skal inspiceres i stor detalje. Blandt de mange forskellige platforme, kun to tilladt genom-dækkende transkriptom analyse 9. Den mest udviklede vifte tillod hybridisering af op til 12 uafhængige stikprøver på en enkelt enhed og dermed reducere omkostningerne ved hvert forsøg. De 12 sub-arrays hver omfattede 135.000 60-mer sonder repræsenterer 29,549 vinavlsprodukter udskrifter. Denne enhed har været anvendt i en lang række undersøgelser 10-24. Disse to platforme er nu indstillet, men en ny brugerdefineret microarray er for nylig blevet designet og repræsenterer en nyere udvikling, da det indeholder et endnu større antal sonder, der repræsenterer yderligere nyopdagede vinavlsprodukter gener 25.
De store sale datasæt produceret af transcriptomics og metabolomics analyser kræver egnede statistiske metoder til analyse af data, herunder multivariate teknikker til at bestemme sammenhænge mellem anden forms af data. De mest anvendte multivariate teknikker er dem baseret på fremskrivning, og disse kan være uden opsyn, såsom principal komponent analyse (PCA), eller overvåget, såsom tovejs retvinklede projektion til latente strukturer diskriminant analyse (O2PLS-DA) 26. Protokollen præsenteres i denne artikel benytter PCA til analyse sonderende data og O2PLS-DA til at identificere forskelle mellem grupper af prøver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Vælg egnede materialer og konstruere en prøveudtagningsplan
- Begynd eksperimentet ved at udvikle en passende stikprøveplan. Der er ingen generisk og universel tilgang, så vurdere hver enkelt plan fra sag til sag. Sørg for, at prøveudtagningsplanen hedder prøveudskillelsesfiltrene steder, tider og den præcise prøveudtagning. Se figur 1 for prøvetagningsplan i dette casestudie.
BEMÆRK: I dette tilfælde undersøgelse blev drue bær fra en enkelt klon (. Vitis vinifera cv Corvina, klon 48) indsamlet fra syv kommercielle vinmarker i tre forskellige makro-zoner i provinsen Verona (Gardasøen, Valpolicella og Soave). De vigtigste features for hvert vingård er sammenfattet i tabel 1. Bær blev indsamlet i løbet af tre vækstsæsoner (2006, 2007, og 2008) på tre tidspunkter, svarende til Veraison (begyndelsen af modning), mid-modning og modne bær.- For hver af tiltrædelserne (VINeyard / år / modning fase), høst 30 klynger fra forskellige positioner langs to vin rækker, med randomiserede højder og steder på planten.
- Vælg tre bær tilfældigt fra hver klynge, undgå dem med synlige skader og / eller tegn på infektion.
- Gentag trin 1.1.1 og 1.1.2 for at opnå tre uafhængige puljer.
- Fjern kernerne bærrene og fryse skallerne straks i flydende nitrogen.
- Crush 10 frosne bær fra hver pulje med en automatisk mølle slibemaskine, og deler hver pulveriserede prøve i to lige store dele, en for transcriptomics analyse og en for metabolomics analyse.
- Opbevar pulverne ved -80 ° C.
| ER | BA | BM | CS | FA | MN | PM | |
| Makrozone | Soave | Gardasøen | Valpolicella | Gardasøen | Valpolicella | Valpolicella | Soave |
| Højde (m) | 250 | 120 | 450 | 100 | 130 | 250 | 130 |
| grundstammer | 41B | S04 | K5BB | 420A | 420A | K5BB | 41B |
| række retning | EW | NS | EW | EW | EW | NS | NS |
| uddannelsessystem | Overhead System (Pergola) | Overhead System (Pergola) | Lodret Shoot Positionering (Guyot) | Overhead System (Pergola) | Overhead System (Pergola) | Lodret Shoot Positionering (Guyot) | Lodret Shoot Positionering (Guyot) |
| jordtype | mudrede ler | lerjord | Ler | lerjord | Clay Loam | silt ler | Clay ler |
| Plantning layout (m) | 3.20 x 1.00 | 4,50 x 0,80 | 4.00 x 1.25 | 3,50 x 1,20 | 3,50 x 0,75 | 2,80 x 1,00 | 1,80 x 0,80 |
| Samlet lime% | 3.9 | 19.3 | 18.3 | 14.4 | 31 | 5.9 | 27,9 |
| Aktiv lime% | 0.5 | 2.6 | 9.4 | 6.3 | 11.3 | 3.1 | 8.3 |
| Sand% | 15 | 47 | 66 | 42 | 29 | 13 | 36 |
| lerjord% | 43 | 36 | 21 | 37 | 39 | 67 | 36 |
| Ler % | 42 | 17 | 13 | 21 | 32 | 20 | 28 |
| Jordens pH | 8.3 | 7.9 | 7.8 | 8.2 | 8.2 | 7.8 | 7.9 |
| Organisk stof (%) | 2.9 | 2.5 | 2.2 | 1.2 | 2.9 | 1.6 | 2.5 |
| Udskiftelig phosphor (mg / kg) | 26 | 73 | 73 | 68 | 48 | 47 | 64 |
| Udskiftelig kalium (mg / kg) | 190 | 376 | 620 230 | 168 | 154 | 126 | |
| Udskiftelig magnesium (mg / kg) | 272 | 468 | 848 | 623 | 294 | 293 | 183 |
| Udskiftelig calcium (mg / kg) | 6500 | 5380 | 7358 | 6346 | 4652 | 10055 | 2878 |
| Berry reducerende sukre 2006 | 211,25 ± 1,20 | 176,20 ± 0,42 | 187,40 ± 0,00 | 203,70 ± 1,13 | 212,55 ± 0,64 | 195,20 ± 0,00 | 211,65 ± 0,64 |
| Berry reducerende sukre 2007 | 190,00 ± 1,27 | 165,25 ± 0,49 | 153,00 ± 0,42 | 203,60 ± 0,71 | 210,90 ± 0,71 | 192,25 ± 0,64 | 188,70 ± 1,84 |
| Berry reducerende sukre 2008 | 191,35 ± 0,64 | 178,90 ± 0,57 | 170,05 ± 0,49 | 205,15 ± 1,48 | 188,70 ± 0,57 | 169,35 ± 0,49 | 108,05 ± 1,06 |
| Berry pH 2006 | 3,01 ± 0,01 | 2,96 ± 0,01 | 2,84 ± 0,00 | 2,9 ± 0,00 | 2,98 ± 0,00 | 3,02 ± 0,00 | 3,06 ± 0,01 |
| Berry pH 2007 | 2,97 ± 0,00 | 3,00 ± 0,00 | 2,74 ± 0,00 | 3,07 ± 0,01 | 2,98 ± 0,00 | 2,87 ± 0,01 | 3,09 ± 0,00 |
| Berry pH 2008 | 2,83 ± 0,00 | 3,04 ± 0,01 | 2,71 ± 0,00 | 2,98 ± 0,01 2,98 ± 0,00 | 2,82 ± 0,00 | 3.11 ± 0.00 | |
| høst Dato | 2006 | 2007 | 2008 | ||||
| Veraison | 8-Aug | 18-Jul | 12-Aug | ||||
| Mid Modning | 4 Sep | 8-Aug | 2 Sep | ||||
| Moden | 18 Sep | 29-Aug | 23 Sep |
Tabel 1: Vigtigste træk ved hver vinmark ogprøvetagning datoer. m = meter, EW = Eat-West, NS = Nord-Syd. 
Figur 1:. Skematisk fremstilling af prøveudtagnings- De tre vinproduktion makro-zoner er beliggende i omegnen af byen Verona, Veneto-regionen, Italien. De tre tidspunkter er Veraison (V), der repræsenterer begyndelsen af modning i vindyrkning, mid-modning (MR) og modne bær (R). Klik her for at se en større version af dette tal.
2. Forbered Berry Powder Ekstrakter, Analyser metabolitter og behandle data
- Forbered Berry Pulver prøver til analyse.
- Forbered de metaboliske ekstrakter af bær prøver ved stuetemperatur i tre bind (w / v) methanol forsuret med 0,1% (v / v) formic syre i et ultralydsbad ved 40 kHz i 15 min. Brug LC-MS-grade vand og myresyre, og HPLC-grade methanol.
- Centrifugere ekstrakterne ved 16.000 xg i 10 min ved 4 ° C.
- Fortynd supernatanten fra trin 2.1.2 i to bind (vol / vol) deioniseret vand og passere gennem et 0,2-um filter.
- Analyser Berry Uddrag ved HPLC-ESI-MS.
- Opsætning af HPLC-ESI-MS system ifølge leverandørens anbefalinger.
BEMÆRK: I dette casestudie, opsætningen bestod et HPLC-system udstyret med en autosampler, forbundet in-line med en ion trap massespektrometer og elektrosprayionisering kilde. - Forbind HPLC-system med en C18 forkolonne (7,5 x 2,1 mm2) og en omvendt-fase C18-søjle (150 x 2,1 mm2, partikelstørrelse 3 um).
- Forbered de anvendte opløsningsmidler som den mobile fase. Anvend 5% (v / v) acetonitril, 0,5% (v / v) myresyre i vand som opløsningsmiddel A og 100% acetonitril som solvent B. Anvendelse LC-MS-grade acetonitril, vand og myresyre.
- Kør HPLC-adskillelse med en lineær gradient af opløsningsmidler A og B ved en konstant strømningshastighed på 0,2 ml min-1 under anvendelse af en prøve injektionsvolumen på 30 pi.
- Oprindeligt ækvilibrere kolonnen med 100% væske A. Efter prøve injektion, etablere en gradient fra 0% til 10% opløsningsmiddel B i 5 min, fra 10% til 20% opløsningsmiddel B i 20 min, fra 20% til 25% opløsningsmiddel B i 5 min, og fra 25% til 70% opløsningsmiddel B i 15 min.
- Analyser hver prøve i to eksemplarer. Tilfældig prøveanalyse at undgå instrument-drevne effekter. Tillad 20 min for re-ækvilibrering med 100% opløsningsmiddel A mellem hver analyse.
- Erhverve massespektre i alternative negative og positive ionisering modes. For resultaterne er beskrevet i denne case, indstille parametre som i tabel 2. Indstillingen præcise maskine afhænger af den specifikke platform.
BEMÆRK: Alternativt kan du bruge anden kulørstand fremgangsmåder ifølge den specifikke platform.- I alle tilfælde, som med enhver adskillelse platform, så sørg for at bruge en passende re-Ekvilibreringstiden, for at få retentionstiden reproducerbarhed. Når antallet af prøver er høj (over ti prøver), analysere dem i partier af 9-10 prøver, med kromatografisk kolonne rengøringsprogrammer (langsomme gradienter mellem de to Elueringsvæsker) mellem hver batch. At have nok opholdstid reproducerbarhed, sikre, at den første kromatografisk analyse af hvert parti er en tom analyse (dvs. analyse af opløsningsmidlet).
- Erhverve Også massespektre i fragmenterede negative og positive ion modes der fastsætter fragmentering muligheder (to ion forstadier, MS 3). Anmærke metabolitter ved fragmentering træ analyse (MS / MS og MS 3) i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Denne er specielt velegnet til plantemetabolitter fordi de ofte er glycosylerede, therør den første fragmentering (MS / MS) har tendens til at fjerne sukker dele forlader den frie aglycon ion, og efterfølgende opsplitning (MS 3) hjælper med at identificere aglyconen mod en autentisk standarder bibliotek. - Anskaf MS / MS og MS 3 spektre i m / z rækkevidde 50-1,500 med en fragmentering amplitude på 1 V. Alternativt kan du bruge andre egnede metoder i henhold til den specifikke platform.
- For hver m / z signal, sammenligne MS / MS og MS 3 fragmenteringsmønstre og retentionstider til den autentiske standarder Bibliotek ifølge producentens anvisninger.
BEMÆRK: Mange type platforme omfatter software faciliteter til at bygge denne form for bibliotek gennem analyse af autentiske standarder. Dette bør identificere mange af de signaler, men ikke alle signaler vil blive kommenteret. - For de resterende anonyme signaler, sammenligne MS / MS og MS 3 fragmenteringsmønstre med dem, der offentliggøres i litteraturen, Søgenhing til m / z-værdier (dvs. ciffer "m / z 353" til at lede efter publikationer, hvor molekyler med en sådan m / z er nævnt) med nogen af de fælles søgemaskine frit tilgængelige, eller bruge online-databaser såsom MassBank (www .massbank.jp / da / database.html) og human metabolomet Database (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
- Opsætning af HPLC-ESI-MS system ifølge leverandørens anbefalinger.
| Masse spektrometer komponenter | Fungere | Parametre |
| Elektrospray ioniseringskilde | forstøvende gas | 50 psi, 350 ° C |
| tørregas | 10 L min -1 | |
| Ionfælde og detektor | Scan | Fuld scanning, 13.000 m / z per sekund, rækkevidde 50-1,500 m / z |
| 400 m / z | ||
| Kollision Gas | Helium | |
| Vakuum pres | 1,4 x 10 -5 mbar | |
| kapillær kilde | 4000 V | |
| Endeplade offset | -500 V | |
| skimmer | -40 V | |
| Cap exit | -121 V | |
| Okt 1 fm | -12 V | |
| Okt 2 st | -1,7 V | |
| Objektiv 1 | +5 V | |
| Lens 2 | 60 V | |
| ICC for positiv ioniseringsmodus | 20.000 | |
| ICC for negativ ionisering tilstand | 7.000 |
Tabel 2: Principal parametersæt for at erhverve masse spektre.
| Operation | Udvælgelse | Fungere | Parametre | Værdier |
| Peak Detection | massedetektion | tyngdepunkt | støjniveau | 3.500 |
| kromatogram builder | Højeste datapunkt | min tidsrum | 0,15 | |
| min højde | 4.000 | |||
| m / z tolerance | 0,3 | |||
| Peak Detection | Peak udfoldning | Lokale minimum søgning | chromatografisk tærskel | 70 |
| Søgning minimum i RT interval (min) | 00:50 | |||
| Mindste relative højde | 15% | |||
| Minimum absolutte højde | 4.000 | |||
| Min-forhold på top top / kant | 2 | |||
| Varighed interval (min) | 0-10 | |||
| isotoper | Isotopiske toppe havaborre | - | m / z tolerance | 1.2 |
| RT tolerance | 00:50 | |||
| monoton form | Ingen | |||
| Maksimal opladning | 3 | |||
| repræsentant isotop | Ingen | |||
| Justering | Deltag aligner | - | m / z tolerance | 1.2 |
| Vægt til m / z | 10 | |||
| Retention tolerance tid | 00:50 | |||
| Vægt for RT | 5 | |||
| Kræv samme ladning tilstand Ingen | ||||
| Kræv samme ID | Ingen | |||
| Sammenlign isotop mønster | Ingen | |||
| Gap påfyldning | Peak finder | - | Intensitet tolerance | 20% |
| m / z tolerance | 0.9 | |||
| Retention tolerance tid | 00:40 | |||
| RT korrektion | Ingen | |||
| Filtrering | Duplicate Peak filter | - | m / z tolerance | 1.2 |
| RT tolerance | 00:30 | |||
| Kræv samme identifikation | Ingen |
Tabel 3: Mzmine workflow med bestemte værdier til at behandle negative LC-MS drue bær datafiler.
- Proces LC-MS data.
- Access ellerdownloade en databehandling softwarepakke, der kan udtrække relevante oplysninger fra mange rå kromatogrammer og opbygge en data matrix, hvor hvert detekteret metabolit er kvantificeret i hver prøve.
BEMÆRK: protokoltrin nedenfor er skræddersyet til open source-software MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net). Det er en open-source-software til masse-spektrometri databehandling, med hovedfokus på LC-MS-data. 27 - Omdan LC-MS chromatogramprofiler data i NetCDF format ved hjælp af software leveret af producenten udstyr. For resultaterne beskrevet her, skal du bruge Bruker Daltonics Esquire V5.2 og Dataanalyse V3.2 software og udfører trin i henhold til producentens anvisninger.
BEMÆRK: Andre omformere kan bruges (forskellige gratis-ware konvertere er tilgængelige). - Importer .cdf filer ind i softwaren.
- Gennemføre peak afsløring, justering, gap påfyldning og peak filtrering procedurer med PARAMETERS rapporteret i tabel 3.
- Som første skridt skal du vælge en importeret .cdf fil, derefter gå til visualisering → TIC / XIC Visualizer. Sæt markøren på bunden af den mindste top i kromatogrammet og noterer om med minimum signal af basen ion. Så gå til rådata Metoder → Peak Detection.
- Vælg Mass Detection og fylde signalniveauet at opdage individuelle ioner for hver scanning og skabe en ion listen.
BEMÆRK: Kontroller algoritmen før udførelse af massen detektion - det afhænger af massespektrometeret. I vores tilfælde, vælger vi tyngdepunkt. - Vælg Kromatogram Builder og fyld med signalniveauet at forbinde datapunkter fra ion listen og bygge et kromatogram for hver masse værdi. Se de parametre, der er angivet i massespektrometer manual for at justere Min Time Span og m / z tolerance.
- Gå derefter til Peak List Metoder → Peak Detection → Kromatogram Deconvolution. Vælg den relevante algoritme (i dette tilfælde lokalt minimum Søg) for at tillade adskillelse af hvert kromatogram i individuelle toppe.
- Manuelt inspicere kromatogrammer at finde ud af de relevante værdier for følgende parametre. Indstil Chromatografisk Threshold til 30% for at fjerne støj og Søg Minimum i RT Range til 2 (min) til at identificere tilstedeværelsen af minimum lokale til at diskriminere to toppe.
- Set Minimum Relativ Højde på 2,0. Manuelt inspicere chromatogram for at bestemme den minimale absolutte højde af signal, der svarer til en top og ikke til baggrunden; indstille denne værdi som Absolut højde (f.eks 10.000 i den præsenterede eksperiment).
- Set Min Ratio af Peak Top / Edge til 1,1, hvilke minimumsoplysninger forholdet mellem toppen og de laveste data punkt intensiteter af en top til at blive anerkendt som en ægte højdepunkt.
- Manuelt inspicere kromatogrammer for at se, hvilket er den mindste varighed af de forskellige toppe i den anvendte chromatographic betingelser (f.eks mellem 0,2 og 2 min, afhængigt af forbindelsen, i de præsenterede forsøg), og følgelig anvende disse værdier som Peak Varighed Range (min) for at indstille området for acceptabelt peak længde som varighed.
- Så gå til Peak List Metoder → Isotoper → Isotopanalyse Peaks Grouper til gruppe isotoper i en top, som regel i de mest intense. Bemærk: Parametrene afhænger løsningen af massespektrometer og reproducerbarheden af retentionstiderne.
- Endelig skal du gå til Peak List Metoder → Justering → Deltag Aligner at tilpasse toppe afhængigt af deres m / z og opholdstid ved hjælp af en match score.
- Efter justering toppene, udfylde eventuelle manglende data ved at klikke på Peak List Metoder → Gap Påfyldning → Peak Finder. Endelig filter duplikere datapunkter ved at klikke på Peak List Metoder → Filtrering → Duplicate Peak Filter.
- Eksporter den resulterende datasæt som en .CSv fil.
- Manuelt ændre. Csv udvidelse til en. Txt forlængelse. Hvis der ikke filtypenavne er synlige, ændre computerens indstillinger for at afsløre filtypenavne. Gå til File Explorer Valg → Vis → Avancerede indstillinger og fjerne markeringen i feltet 'Skjul filtypenavne for kendte filtyper ".
- Importer .txt-filer i et regneark. Dette frembringer en datamatrix i hvilken alle påviste metabolitter, der genkendes af et identifikationsnummer, m / z-værdi og retentionstid, kvantificeres i alle prøver i form af deres Topareal værdier.
- Access ellerdownloade en databehandling softwarepakke, der kan udtrække relevante oplysninger fra mange rå kromatogrammer og opbygge en data matrix, hvor hvert detekteret metabolit er kvantificeret i hver prøve.
3. Forbered Berry Powder Ekstrakter til Transkriptomet Analyse og behandle data
- Uddrag Total RNA fra Berry Prøver og Bestem RNA kvalitet.
- Uddrag total RNA fra bær prøver.
BEMÆRK: I dette casestudie, en proprietær kit og en modificeret procedure, der sikrer fuldstændig fjernelse af molekyler, at interfere med RNA-analyse, såsom polysaccharider og polyphenoler, blev anvendt. Instruktionerne nedenfor er specifikke for dette kit 18.- Afvej 400 mg bær pulver for hver prøve, del den i to portioner og læg hver 200 mg i to mikrocentrifugerør.
- Tilføj 900 pi af lysis opløsning indeholdende β-mercaptoethanol (leveret med kittet) til hver 200 mg pulver og vortex straks og kraftigt i mindst 30 sek. Opvarmes prøven ved 56 ° C i 5 minutter rystning ved 800 rpm.
- Centrifugeres prøverne ved maksimal hastighed i en benchtop mikrofuge i 10 minutter til pelletering cellerester.
- Pipetter 700 pi af supernatanten i filtreringssøjle tilvejebragt i kit (blå holdering) siddende i en 2 ml opsamlingsrør. Luk hætten og centrifugeres ved maksimal hastighed i en benchtop mikrocentrifuge i 1 min for at fjerne resterende snavs. Gentag dette trin to gange under anvendelse af samme filtreringssøjle men en frisk opsamlingsrør, hvilket resulterer i tre tUBE'er hver indeholder ~ 700 pi af den klarede lysat.
- Pipetter 750 pi bindende opløsning (leveret i sættet) i hvert glas i klaret lysat og bland straks ved pipettering op og ned mindst fem gange. Overfør 700 ul af denne blanding til det bindende kolonnen følger med kittet (rød holdering) siddende i en 2 ml opsamlingsrør. Luk hætten og centrifugeres ved maksimal hastighed i en benchtop mikrocentrifuge i 1 min til at binde RNA.
- Dekanteres gennemstrømning fraktion vendes indsamlingen røret og trykke på det kort på en ren pad af absorberende papir til at dræne den resterende væske.
- Retur kolonnen til opsamlingsrøret og pipetteres den resterende blanding i den samme kolonne og gentag centrifugeringen og dekantering trin. Gentag, indtil hele blandingen er blevet filtreret i det samme røde bindende kolonne.
- Følg nu andre anvisninger i kittet og eluering af RNA i 50 pi elueringsbuffer (leveret med kittet) og opbevares it ved -80 ° C klar til kvalitetskontrol trin.
- Bestemme mængden og renheden af RNA ved anvendelse af et spektrofotometer. Noter absorbansen nøgletal, som afslører graden af forurening med proteiner (A 260/280) og polyfenoler / polysaccharider (A 260/230).
BEMÆRK: RNA egnet til microarray hybridisering skal score mindst 1,8 for begge nøgletal. - Bestemme integriteten af RNA.
BEMÆRK: Forskellige systemer kan anvendes. En digital erhverver, der udfører en kapillarelektroforetisk løb kombination med et fluorescerende farvestof blev anvendt i dette case study. RNA egnet til microarray hybridisering bør have en RNA Integrity Number (RIN) på mindst 8.
- Uddrag total RNA fra bær prøver.
- Forbered Prøver og hybridisere RNA til en brugerdefineret Microarray.
- Indstil grundbeløbet for total RNA for microarray analyse til 200 ng ved at fortynde RNA opløsning opnået i trin 3.1.1.8 med deioniseret RNase-frit vand. Tilsætpassende mængde af RNA til et 1,5 ml mikrocentrifugerør i et endeligt volumen på 1,5 pi.
- Tilsæt 2 pi fortyndet spike mix til hver RNA prøve og følg producentens anvisninger til at syntetisere første streng cDNA, omskrive dette i cRNA og mærke cRNA med cyanin 3CTP.
- Oprens den mærkede cRNA ifølge producentens anvisninger og eluer i 30 pi RNase-frit vand.
- Bestem udbytte og specifikke aktivitet af hvert cRNA ved at optage tre værdier på et spektrofotometer: cyanin 3 koncentration farvestof (pmol pi -1), RNA renhed (A 260/280) og cRNA koncentration (ng pi -1). Brug formlerne findes i producentens betjeningsvejledning til at beregne cRNA udbytte (ug) og den specifikke aktivitet (pmol Cy3 pr ug cRNA).
BEMÆRK: Anbefales udbytter og specifikke aktiviteter varierer på basis af den specifikke microarray format. I dette tilfælde undersøgelse var en 4-pack 44K formatvalgt, er den anbefalede udbytte var 1,65 og den specifikke aktivitet var 9. - Design den brugerdefinerede microarray med egnet software til sonde design.
- For resultaterne er beskrevet i denne case, udarbejde en ny brugerdefineret microarray, designet på den 4-pack 44K-format ved hjælp af en web-baseret program til brugerdefinerede microarray design og oligonukleotidbiblioteker. Design sonder til at matche 34,651 mål udskrifter, herunder 29.971 forudsagde udskrifter fra Pinot noir V1 array, 4500 nye loci identificeret i Pinot kultivar af Corvina transkriptom genopbygning og 180 private Corvina gener 25.
BEMÆRK: Dette er involveret i produktion af 34,651 specifikke 60-mer sonder, bestående 29.798 Pinot noir forudsagt udskrifter, 4392 nye Pinot loci og 179 Corvina private gener.
- For resultaterne er beskrevet i denne case, udarbejde en ny brugerdefineret microarray, designet på den 4-pack 44K-format ved hjælp af en web-baseret program til brugerdefinerede microarray design og oligonukleotidbiblioteker. Design sonder til at matche 34,651 mål udskrifter, herunder 29.971 forudsagde udskrifter fra Pinot noir V1 array, 4500 nye loci identificeret i Pinot kultivar af Corvina transkriptom genopbygning og 180 private Corvina gener 25.
- Forbered hybridisering forsamling baseret på format specifikationer 4-pack som følger.
- Placer 1,65 ug Cy3-mærket cRNA i et endeligt volumen på 41,8pi deioniseret RNase-frit vand. Tilføj 11 pi 10x Blokering Agent og 2.2 pi 25x Fragmentering Buffer. Inkuber ved 60 ° C i 30 minutter i et termostatisk bad til fragmentering RNA. Umiddelbart køligt på is i 1min.
- Endelig tilsættes 55 pi 2x hybridiseringspuffer, bland godt ved pipettering og centrifugering i 1 min ved 15.500 xg ved stuetemperatur. Straks placere mikrocentrifugerør på is. Brug det samme, ikke gemme det.
- Læg det brugerdefinerede microarray som følger.
- Læg en pakning slide med etiketten opad ind i bunden af en hybridisering kammer. indlæses langsomt 100 pi hybridisering prøve opnået i trin 3.2.6.2 på hver pakning brønd, dispensering af væsken med spidsen af pipetten, undgå bobler.
- Langsomt placere brugerdefinerede microarray nedad, der sikrer, at den numeriske stregkoden vender opad. Sørg for, at sandwich par er korrekt justeret. Endelig placere dækslet hybridiseringskammeret onto klemtlysbilleder og hånd-spænd klemme på kammeret. Rotere den samlede kammer til at vurdere mobiliteten af bobler.
- Placer samles slide kammer i en rotisserie i en hybridisering ovn indstillet til 65 ° C. Indstil rotator at rotere ved 10 rpm. Tillad hybridisering til at fortsætte i 17 timer.
- Fortsæt med microarray slide vask som følger.
- Først forberede tre slide-farvning retter og fylde dem med de relevante vaskebuffere: 2 retter med vaskebuffer 1 ved RT og en skål med forvarmet (37 ° C) vaskebuffer 2.
- Skil hybridiseringskammeret og fjern sandwich. Med microarray slide numerisk stregkode opad, nedsænkes sandwich i den første slide-farvning fad fyldt med vaskebuffer 1 ved stuetemperatur, og med hjælp af rene pincet, adskille pakningen fra microarray dias. Hurtigt overføre microarray dias i et dias rack og placere den i den anden slide-farvning fad fyldt med vaskebuffer 1ved stuetemperatur.
- Sætte slide-farvning skålen på en magnetisk omrører og vask 1 minut med moderat omrøring. Hurtigt overføre objektglasset rack ind i det tredje slide-farvning fad fyldt med forvarmet (37 ° C) vaskebuffer 2 og vask 1 minut med moderat omrøring.
- Fjern langsomt stativet fra slide-farvning fad og fjern forsigtigt dias fra racket, undgå dråber.
BEMÆRK: Du må ikke tilføje Triton X-102 til vask buffere og udelade acetonitril vask trin.
- Opbevar vasket chip i mørke ved stuetemperatur.
- Scan Microarray og Uddrag de vigtigste træk.
- Placer microarray dias i en egnet scanner og scanne hvert array ved hjælp af parameterindstillinger anbefales i microarray producentens anvisninger manual. For resultaterne er beskrevet her, sted hver microarray dias i en Slide Holder til at lette scanning procedure.
- Importer output .shpfil i et passende software, der kan konvertere et digitalt signal til numeriske fluorescerende værdier. Tjek kvalitetskontrol rapporten at sikre, at hybridisering procedure lykkedes.
- For resultaterne er beskrevet her, skal du bruge parameterindstillinger der anbefales i brugsanvisningen af feature extraction software og inspicere kvalitetskontrol rapporten at sikre, at de parametre, der er anført i tabel 4 er inden for normalområdet givet af producenten.
| metric navn | Øverste grænse | Nedre grænse | Beskrivelse |
| AnyColorPrcntFeatNonUnif | 1.00 | NA | Procentdel af funktioner, der er har ikke-ensartethed outliers i enten kanal |
| DetectionLimit | 2.00 | 0.10 | Gennemsnitlig plus 1 standardafvigelse af spike ins under den lineære koncentrationsområde |
| absGE1E1aSlope | 1.20 | 0,90 | Absolutte hældningsgrad egnet til Signal vs. Koncentration af E1a prober |
| MedCVProcSignal | 8.00 | NA | Median% CV for det bearbejdede signal |
| gNegCtrlAveBGSubSig | 5.00 | -10,00 | Gennemsnit af baggrunden trækkes signal af alle inlier negative kontroller (BGSubSignal beregnes ved at fratrække en værdi kaldet BGUsed fra funktionen betyder signal) |
| gNegCtrlAveNetSig | 40.00 | NA | Gennemsnit af netto signal af alle inlier negative kontroller |
| gNegCtrlSDevBGSubSig | 10.00 | NA | Standardafvigelse afbaggrund subtraheret signaler af alle inlier negative kontroller |
| gNonCntrlMedCVProcSignal | 8.00 | NA | Median% CV for det behandlede signal af de ikke-kontrol sonder |
| gSpatialDetrendRMSFilter | 15.00 | NA | Resterende af baggrunden detrending fit |
Tabel 4: Vigtigste parametre, der skal kontrolleres for at kontrollere kvaliteten af microarray hybridisering.
- Behandle Microarray data.
- Når alle microarray dias er blevet scannet og kvalitetskontrollen er vurderet positivt, forberede en tabulatorsepareret data-matrix ved at vælge gProcessedSignal værdier fra hver enkelt undergrupperingen resultat fil, der repræsenterer de rå fluorescensintensiteter af hver probe.
- I et regneark, normalisere data på de 75 percentil inden for hvert array (P-værdier) og calculspiste gennemsnittet af alle P-værdier blandt alle forskellige undergrupper arrays til at beregne R-forhold.
- Derefter på det samme regneark, normalisere hver gProcessedSignal værdi for forholdet R for sin egen sub-array.
4. Carry Out den detaljeret statistisk analyse af de Metabolomics og Transcriptomics data
- Forbered Software Statistisk analyse.
BEMÆRK: I dette casestudie, en software i stand til at udføre PCA, blev PLS-DA og O2PLS-DA brugt.- Importer metabolomics og transcriptomics data. Gå til Filer → Ny Regelmæssig Projekt → Ny Regelmæssig Project til at importere data matrix med MZmine software. Klik derefter på Rediger → Transpose hele matrix → Hjem og tildele passende primære og sekundære ID → Udfør.
- Mean centrere data og skalere dem ved hjælp af Pareto skala. I hjem vindue, gå til Edit → M1 og ændre den relevante ParameTERS afhængigt dataene. For resultaterne her beskrevne, ændre skalaen fra Unit Variance til Par.
- Skalere transcriptomics data ved hjælp af indstillingen Unit Variance.
- Udføre de Multivariate Statistisk analyse.
- Gennemføre PCA som vist i F igur 2. I denne case, PCA afslører de væsentligste forskelle mellem prøver, som afspejler de forskellige modning stadier og vækstsæsoner.
- I vinduet Workset Vælg PCA-X som modeltype. Tryk Autotilp. Vær opmærksom på R2X (cum) og Q2 (cum) værdier som de giver en ide om kvaliteten af modellen.
BEMÆRK: Generelt kan den højere værdierne jo bedre model, men modeller med meget høj R2X (cum) over-passer til dataene. Som empirisk regel holder vi tilføjer hovedkomponenter, når Q2 (cum) værdien begynder at falde. - Vælg derefter Scores → Scatter at se plottet, der viser den mulige gruppering af prøverne.
- Undersøg PCAScore Plot. Hvis der opnås en god model (Q2cum> 0,5), bruger de samme klasser af prøver til at bygge en O2PLS-DA-model (trin 4.2.2).
- I vinduet Workset Vælg PCA-X som modeltype. Tryk Autotilp. Vær opmærksom på R2X (cum) og Q2 (cum) værdier som de giver en ide om kvaliteten af modellen.
- Build to O2PLS-DA-modeller ved hjælp af prøver, der er klassificeret som makro-zone og validere modellerne bruger en permutation test med 200 permutationer.
- Tildel klasserne ved at gå til Home vindue → Ny Som → M1 → Observationer. Indstille de ønskede klasser. Derefter ændre Model fra PCA-X til O2PLS-DA. Tryk Autotilp. Sikre, at antallet af komponenter i PLS-DA model er den samme som den for O2PLS-DA.
- For at validere O2PLS-DA-model, skal du gå til Analyser CV-ANOVA og se den rigtige p-værdi. Desuden skal du klikke på Ny Som i vinduet Hjem → M2 og ændre Model fra O2PLS-DA til PLS-DA. Tryk Autotilp.
- Gå til Analyser → Permutationer og udfører 200 permutationer (de-vælge Genberegn Permutationer option).
Bemærk: Det endelige output viser et vindue, hvor R2 værdien should generelt ramt Y-aksen i værdier under 0,4, mens Q2 bør ramme den negative del af Y-aksen. Hvis R2 og / eller Q2 værdier er forkerte, reducere antallet af komponenter både i PLS-DA og O2PLS-DA-modeller. - Fortsæt for at vælge M2 i Project vinduet, og klik på Scores → Scatter at se plottet og placeringen af prøven klasser. At observere hvad metabolitter karakterisere en eller flere bestemte klasser, gå til Plot / List → Scatter.
- Skift Select Data Type til Observationer og belastninger → Tilføj serien og ændre Vare i X-akse og serien i pq (korr) og Pred Comp i 1 og enten 2 eller yderligere komponenter, når til stede, henholdsvis.
- Med musens højre knap trykket på grunden, gå til Property → Color og vælg Ved Vilkår til at skelne de plot symboler blandt molekyler og klasser. Gå til Layout → Format Plot → Axis og / eller Styles til at ændre plottet med de ønskede egenskaber.
<li> På baggrund af resultaterne af metabolomics O2PLS-DA-analyse, nuværende forskelle i de relative niveauer af bestemte metabolitter eller klasser af metabolitter som histogrammer.
- Gennemføre PCA som vist i F igur 2. I denne case, PCA afslører de væsentligste forskelle mellem prøver, som afspejler de forskellige modning stadier og vækstsæsoner.
- Baseret på resultaterne af transcriptomics O2PLS-DA-analyse, hente og tildele differentielt modulerede gener til Gene Ontology (GO) klassifikationer 28.
- Identificere forholdet mellem metabolitter og genekspression manuelt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Casestudiet beskrevet i denne artikel givet en endelig data matrix, der omfatter 552 signaler (m / z funktioner), herunder molekylære ioner plus deres isotoper, addukter og nogle fragmenter, relativt kvantificeres blandt 189 prøver (7 vinmarker x 3 modning etaper x 3 vækstsæsoner x 3 biologiske replikater). Det samlede antal for datapunkter var derfor 104.328. Fragmentering træ analyse resulterede i annotation af 282 m / z-funktioner, som svarer til metabolitter plus addukter, isotoper og fragmenter. Eksplorativ analyse af hele data matrix ved PCA viste, at prøver grupperet efter modningsfasen (Veraison, mid-modning og modne) langs den første og anden principale komponenter (T1-T2, figur 2A), og ifølge vækstsæsonen langs den tredje hovedkomponent (t1-t3, figur 2B).
src = "/ files / ftp_upload / 54.410 / 54410fig2.jpg" />
Figur 2:. PCA af hele metabolomics data matrix Unsupervised PCA-X score scatter plots viser gruppering af vinavlsprodukter prøver indsamlet i løbet af tre forskellige vækstsæsoner (2006, 2007, og 2008) og modning stadier (Veraison, mid-modning og modne bær ). I det første plot (A) prøverne grupperet efter de modning faser, hvorimod i den anden (B) grupperes de ifølge vækstsæsonen. Farverne fremhæve de modning stadier som grøn (Veraison), pink (mid-modning) og lilla (modne bær). Symbolerne repræsenterer vækstsæsoner: cirkler (2006), firkanter (2007) og trekanter (2008) .Component t1: Q2: 0,34; R2X: 0,331; Q2cum: 0,304; Komponent t2: Q2: 0,185; R2X: 0,155; Q2cum: 0,433; Komponent t3: Q2: 0,145; R2X: 0,0924; Q2cum: 0,515.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Den ukontrollerede PCA var ude af stand til at afsløre specifikke terroir funktioner, som er skjult under de fremherskende vintage effekter, så en overvåget O2PLS-DA fremgangsmåde blev anvendt på to separate datasæt, dvs., bær på Veraison og fuldt modne bær. Dette giver mulighed for udforskning af metaboliske forskelle, der repræsenterer de tre makro-zoner (Gardasøen, Valpolicella og Soave) i to centrale faser af modning, at identificere specifikke terroir underskrifter repræsenterer disse zoner på disse modning stadier.
Figur 3: O2PLS-DA af Veraison og modne drue bær. O2PLS-DA score scatter plots viser gruppering af vinavlsprodukter prøver indsamlet i Gardasøen ( blå), Soave (grøn) og Valpolicella (lyserød) makro-zoner på Veraison (A), og når bærrene var modne (B). De metabolitter, der er ansvarlige for den observerede i (A) klyngedannelse og (B) er synlige i sammenhæng lastning plots (C) og (D) henholdsvis. Grupper af metabolitter, repræsenteret som trekanter, er blå for resveratrol og stilbener, lyserødt til anthocyaniner, grøn for hydroxycinnamic og hydroxybenzoesyre syrer, lilla til flavan-3-oler / procyanidiner, og gul for andre flavonoider. A: komponent P1: Q2: 0,278; R2X: 0,0529; Q2cum: 0,278; komponent P2: Q2: 0,33; R2X: 0,0394; Q2cum: 0,608. B: komponent P1: Q2: 0,353; R2X: 0,0639; Q2cum: 0,353; komponent P2: Q2: 0,188; R2X: 0,0374; Q2cum:. 0,541 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Fordeling af metaboliske markører blandt de tre makro-zoner:. Gardasøen, Soave, og Valpolicella metabolitter afspejler middelværdien ± standardafvigelse (n = 18 for Garda og Soave, 27 for Valpolicella makro-zone) af forskellig glykosyleret og acylerede anthocyaniner, resveratrol / stilben og flavonoider i modne Corvina bær i de tre forskellige vækstsæsoner (2006, 2007, og 2008). Forskellige bogstaver repræsenterer grupper, der var signifikant forskellige som bestemt ved en t-test (p <0,05). Klik her for at se en større version af dette tal.
De specifikke underskrifter fra syv individuelle vinmarker blev identificeret ved hjælp af en særligliseret statistisk metode 10. To O2PLS-DA modeller blev bygget, en udforskning forskellene mellem de bær, der dyrkes i de tre makro-zoner på Veraison, og den anden at udforske forskellene i de tre makro-zoner blandt modne bær. Modellerne var cross-valideret ved hjælp af en permutation test (200 permutationer), der viser, at den model, der beskriver de modne bær på tværs af de tre makro-zoner var gyldig, hvorimod kun Gardasøen prøver var adskilt fra de andre prøver på Veraison (ikke vist).
De score plot af de to modeller, der viser, hvordan prøverne fra de tre makro-zoner på Veraison og modenhed er adskilt i overensstemmelse med fordelingen af metabolitter, er vist i figur 3A og 3B. Lastning plots af disse model udtrykt som pq (corr), dvs. korrelationen mellem p (klassen af prøver) og q (metabolitterne), er vist i figurs 3C og 3D. I lastning plots, de røde firkanter repræsenterer klassen af prøver (makro-zoner), og de farvede trekanter repræsenterer de enkelte metabolitter. Afstanden mellem metabolitter og prøverne afspejler deres relationer. Metabolitterne er farvekodede efter deres kemiske klasse.
Betragtning af det lave statistiske gyldighed Veraison model som vist ved permutation test, er det sandsynligt at lide af overfitting. Derfor er de følgende bemærkninger refererer udelukkende til de modne bær prøver, hvis model var statistisk gyldig. I lastning plottet vist i figur 3D, er stilbener forskudt mod Gardasøen makro-zone, mens flavonoider forskydes mod Soave og Valpolicella makro-zoner. Et nærmere kig på de enkelte metabolitter afslører den asymmetriske fordeling af anthocyaniner, med peonidin og dets derivater mere fremherskende i Lake Garda makro-zone og andre anthocyaniner mere fremherskende i Valpolicella makro-zone (figur 4). Simple anthocyanin-3-O-glykosider er mere udbredt i Valpolicella makrozone mens acylerede og coumarated derivater er mere udbredt i Soave makro-zone.
Den transcriptomics komponent i dette casestudie var oprindelig ved hjælp af en transcriptomics platform, der ikke længere understøttes. Som en konsekvens, vi oprettet en alternativ procedure, med stadig tilgængelig platform; den nye platform indeholder flere sonder end den gamle, herunder 249 mere Pinot noir forudsagt udskrifter, 4392 nyligt identificerede Pinot loci og 179 Corvina private gener 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel beskriver de metabolomics, transcriptomics og analyse protokoller statistiske bruges til at fortolke den drue bær terroir koncept. Metabolomics analyse ved HPLC-ESI-MS er følsom nok til at detektere et stort antal metabolitter samtidigt, men relativ kvantificering påvirkes af matrixeffekten og ion suppression / ekstraudstyr. Imidlertid har en lignende fremgangsmåde allerede blevet brugt til at beskrive modning og efter høst tilintetgørende af Corvina bær, og korrektionen af matrix effekter haft en begrænset indvirkning på resultaterne 5. Desuden er en nylig storstilet multi-instrument inter-laboratorieundersøgelse for at bestemme den komparative robusthed NMR og LC-MS for målrettede metabolomics bruger de samme prøver viste, at de forskellige instrumenter og teknologier gav ensartede resultater 6. Casestudiet beskrevet heri involverede indsamling og analyse af prøver på tre modning stadier fra syv vinmarker i tre makro-zdem over tre vækstsæsoner. Heri blev terroir signatur undersøgt på makro-zone-niveau (Gardasøen og Soave, hver repræsenteret af to vinmarker, og Valpolicella, repræsenteret ved tre vingårde) ved hjælp af PCA og O2PLS-DA multivariat statistik. Forskellene mellem de enkelte vinmarker er mere subtile og kræver mere avancerede og følsomme statistiske metoder 10. Forskellige trin i de foreslåede protokoller er kritiske og skal overvejes for at kunne besvare de biologiske spørgsmål om terroir indflydelse på drue kvalitet.
Først og fremmest, det passende stikprøveplan er kritisk: valget af en bestemt klon til at minimere de genetiske forskelle og multiple-års varighed af prøveudtagningen tillader at fremhæve de reelle, lyd forskelle mellem de forskellige terroirs. På den anden side, blev den foreslåede forskning udføres inden et terroir, der er specielt velegnet til vindyrkning, og dette kunne miniMize de terroir-forskelle på drue kvalitet. Det ville således være meget interessant at sammenligne den samme kultivar dyrket i en mindre optimal zone, men naturligvis kunne disse vinmarker simpelthen være ikke tilgængelig.
Fra teknisk synspunkt, en meget reproducerbar metabolit separation gennem HPLC er kritisk for at opnå gode data matrix, da højere forskellene i retentionstiden i de forskellige analyser, jo højere antallet af fejl i peak tilpasning i den endelige datasæt. Det er således af afgørende betydning at fastsætte en passende re-Ekvilibreringstiden, at opdele prøverne i partier af 9-10 prøver med cyklusser af kromatografisk kolonne rengøring mellem dem og til at bruge blindprøver som den første prøve af hvert parti. LC-MS påvirkes af en vis grad af ustabilitet, hvilket kan resultere i forskelle mellem prøver, der er instrument-drevet. Dette problem kan delvis løses ved randomisering af analysen, som vist i dette dokument. en imbedring af fremgangsmåden er anvendelsen af passende kvalitet kontrolprøver i hver batch, der kan oplyse på platformen tilstand. En passende standardforbindelse mix (dvs. faste forbindelser med m / z-værdier og retentionstider spænder over hele m / z og retentionstid interval), og en ny kontrol prøve opnået ved blanding af lige dele af pulver fra alle prøverne kan oplyse platform effekter og også i sidste ende bruges til en-posteriori data normalisering.
Et andet vigtigt punkt for at sammenligne metabolomics og transcriptomics resultater var at bruge nøjagtig det samme materiale (dvs. de samme knuste prøver) for begge analyserne. I dataanalyse, er det vigtigt at bruge en passende statistik metode, såsom OPLS-DA, der giver let fortolkning af forskelle i genekspression og metabolit ophobning med hensyn til metoder såsom PSA. En af de største begrænsninger ved denne form for fremgangsmåde er denfravær af stærke metoder til transcriptomics og metabolomik data integration. Udviklingen af egnede metoder til forskellige typer data korrelation er nødvendig for at opbygge en stærk og pålidelig sammenhæng mellem transcriptomics og metabolomik data.
De beskrives i denne artikel teknikker tydeligt afslørede modning og vintage effekter på bær metabolomet, men specifikke kemiske signaturer, der repræsenterer de tre makro-zoner blev også identificeret i modne bær nedenunder fremherskende vintage effekt. Interessant har analysen af Veraison bær ikke give en statistisk gyldig model, hvilket indikerer, at terroir konceptet overvejende manifesteres ved metabolitter, der akkumuleres under modningen (f.eks anthocyaniner og stilbener) end dem, der allerede er til stede i de umodne bær.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | - | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In - One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | - | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | - | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus - 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | - | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
