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Genetics

Terroir संकल्पना अंगूर बेरी Metabolomics और transcriptomics के माध्यम से व्याख्या

Published: October 5, 2016 doi: 10.3791/54410
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1,2, 3, 1, 1, 1, 1, 1
1Biotechnology Department, University of Verona, 2Lab. of Bioorganic Chemistry, Physics Department, University of Trento, 3S-IN Soluzioni Informatiche
* These authors contributed equally

Summary

यह लेख आदेश terroir अवधारणा, यानी में जानकारी हासिल करने में अलक्षित metabolomics, transcriptomics और अंगूर बेरी टेप और चयापचयों को बहुभिन्नरूपी सांख्यिकीय विश्लेषण के आवेदन का वर्णन, बेरी गुणवत्ता के लक्षण पर वातावरण के प्रभाव।

Abstract

Terroir पर्यावरणीय कारकों कि इस तरह की चर्चा (द्राक्षा) के रूप में फसलों की विशेषताओं को प्रभावित विशेष रूप से निवास और प्रबंधन के तरीकों के अनुसार के संयोजन को दर्शाता है। इस लेख से पता चलता है कि कैसे कुछ terroir हस्ताक्षर बेरी metabolome और बहुभिन्नरूपी सांख्यिकीय विश्लेषण का उपयोग कर चर्चा फसल Corvina की transcriptome में पता लगाया जा सकता है। विधि पहले एक उचित नमूना योजना की आवश्यकता है। इस मामले के अध्ययन में, Corvina फसल का एक विशिष्ट क्लोन आनुवंशिक मतभेदों को कम करने के लिए चयनित किया गया था, और नमूने तीन अलग-अलग बढ़ती मौसम के दौरान तीन अलग-अलग मैक्रो-क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले सात अंगूर के बागों से एकत्र किए गए थे। एक अलक्षित नियंत्रण रेखा एमएस metabolomics दृष्टिकोण इसकी उच्च संवेदनशीलता की वजह से सिफारिश, MZmine सॉफ्टवेयर और एक metabolite पहचान विखंडन पेड़ विश्लेषण के आधार पर रणनीति का प्रयोग कुशल डाटा प्रोसेसिंग के साथ है। व्यापक transcriptome विश्लेषण प्रोटीन का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकताजिसमें जांच, को कवर ~ सभी की भविष्यवाणी की चर्चा के जीनों का 99% अलग TERROIRS के संदर्भ में सभी विभिन्न व्यक्त जीनों के एक साथ विश्लेषण की इजाजत दी। अंत में, बहुभिन्नरूपी डेटा प्रक्षेपण तरीकों के आधार पर विश्लेषण की अनुमति Metabolomics और transcriptomics डेटा एकीकृत और विस्तार से विश्लेषण जानकारीपूर्ण सह-संबंध की पहचान करने के लिए किया जाना है, मजबूत पुरानी विशिष्ट प्रभाव को दूर करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

बड़े पैमाने पर डेटा जीनोम, transcriptomes, proteomes और पौधों की metabolomes के आधार पर विश्लेषण इस तरह शराब की terroir विशेषताओं जो चर्चा पौधों और उनके पर्यावरण के बीच बातचीत को प्रतिबिंबित के रूप में जटिल प्रणालियों के व्यवहार में अभूतपूर्व अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। क्योंकि एक शराब की terroir अलग हो सकता है यहां तक ​​कि जब समान चर्चा क्लोन विभिन्न अंगूर के बागों में बड़े हो रहे हैं, जीनोमिक्स विश्लेषण क्योंकि प्रतिरूप जीनोम समान हैं कम इस्तेमाल की है। इसके बजाय यह जीन अभिव्यक्ति और जामुन, जो शराब की गुणवत्ता निर्धारित लक्षण के चयापचय गुणों के बीच सह-संबंध को देखने के लिए आवश्यक है। सभी टेप के इसी तरह के रासायनिक गुण है, जो प्रोटीन पर स्थिर जांच करने के लिए इस तरह के संकरण के रूप में सार्वभौमिक विशेषताओं शोषण से मात्रात्मक विश्लेषण की सुविधा से transcriptome लाभ के स्तर पर जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण। इसके विपरीत, प्रोटिओमिक्स एक में सार्वभौमिक विश्लेषणात्मक तरीकोंएन डी metabolomics व्यक्तिगत प्रोटीन और चयापचयों का विशाल भौतिक और रासायनिक विविधता की वजह से अधिक चुनौती दे रहे हैं। metabolomics के मामले में इस विविधता भी अधिक चरम है, क्योंकि अलग-अलग चयापचयों आकार, polarity, बहुतायत और अस्थिरता में बेहद अलग है, इसलिए कोई भी निकालने की प्रक्रिया या विश्लेषणात्मक विधि एक समग्र दृष्टिकोण प्रदान करता है।

(एचपीएलसी एमएस) अनह्रासी चयापचयों के लिए उपयुक्त विश्लेषणात्मक प्लेटफार्मों के बीच, उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी के आधार पर उन मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए युग्मित ज्यादा ऐसे पराबैंगनी या डायोड सरणी डिटेक्टरों के साथ एचपीएलसी (एचपीएलसी यूवी, एचपीएलसी-पिता के रूप में विकल्पों की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं ) या परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, लेकिन एचपीएलसी-एमएस द्वारा मात्रात्मक विश्लेषण इस तरह के मैट्रिक्स प्रभाव और आयन दमन / वृद्धि 1-3 के रूप में घटना से प्रभावित किया जा सकता है। एचपीएलसी-एमएस द्वारा Corvina अंगूर जामुन के विश्लेषण के दौरान इस तरह के प्रभाव की जांच के लिए एक electrospray आयनीकरण स्रोत का उपयोग कर (एचपीएलसी-ईएसआई एमएस), पता चला है कि शर्करा और सबसे कम प्रतिधारण समय के साथ अन्य अणुओं दृढ़ता से कम बताई थे, शायद यह भी इस क्षेत्र में अणुओं की बड़ी संख्या को दर्शाती है, और अन्य अणुओं की बहुतायत है, को कम करके आंका जा सकता है कि मैट्रिक्स प्रभाव से overestimated या अप्रभावित , लेकिन मैट्रिक्स प्रभाव के लिए डेटा सामान्य समग्र परिणाम 4,5 पर सीमित प्रभाव है लग रहा था। विधि यहाँ बताया पकने के दौरान मध्यम polarity चयापचयों कि अंगूर जामुन में उच्च स्तर पर जमा के विश्लेषण के लिए अनुकूलित है, और जो काफी terroir से प्रभावित कर रहे हैं। वे anthocyanins, flavonols, flavan-3-OLS, procyanidins, अन्य flavonoids, resveratrol, stilbenes, hydroxycinnamic एसिड और hydroxybenzoic एसिड होता है, जो एक साथ रंग, स्वाद और वाइन के स्वास्थ्य से संबंधित गुणों का निर्धारण शामिल हैं। ऐसे शर्करा और स्निग्ध कार्बनिक अम्ल के रूप में अन्य चयापचयों, मैट्रिक्स effec के कारण नजरअंदाज कर दिया जाता है, क्योंकि एचपीएलसी-एमएस द्वारा quantitation अविश्वसनीय हैटी और आयन दमन घटना 5। इस विधि द्वारा चयनित polarity सीमा के भीतर, दृष्टिकोण में यह संभव के रूप में 6 के रूप में कई अलग अलग चयापचयों का पता लगाने के लिए करना है कि अलक्षित है।

Transcriptomics तरीकों कि चर्चा के टेप के हजारों एक साथ नजर रखी जा करने की अनुमति पूरा चर्चा जीनोम अनुक्रम 7.8 की उपलब्धता से मदद कर रहे हैं। प्रारंभिक transcriptomics उच्च throughput अनुक्रमण सीडीएनए पर आधारित विधियों प्रक्रियाओं सामूहिक रूप से शाही सेना Seq प्रौद्योगिकी के रूप में वर्णित के एक संग्रह में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के आगमन के साथ विकसित किया है। यह दृष्टिकोण तेजी से transcriptomics अध्ययन के लिए पसंद की विधि बनता जा रहा है। हालांकि, साहित्य का एक बड़ा शरीर माइक्रोएरे, जो टेप के हजारों संकरण से समानांतर में मात्रा निर्धारित किया जा करने की अनुमति के आधार पर चर्चा के लिए जमा किया है। दरअसल, इससे पहले कि शाही सेना Seq एक मुख्य धारा प्रौद्योगिकी बन गया है, कई समर्पित वाणिज्यिक माइक्रोएरे प्लेटफार्मों किया गया थाविकसित की इजाजत दी चर्चा transcriptome बहुत विस्तार से निरीक्षण किया। प्लेटफार्मों की विशाल विविधता में, केवल दो जीनोम चौड़ा transcriptome विश्लेषण 9 की अनुमति दी। सबसे विकसित सरणी एक डिवाइस पर करने के लिए 12 स्वतंत्र नमूने के संकरण की अनुमति दी है, इस प्रकार एक प्रयोग की लागत को कम करने। 12 उप-सरणियों प्रत्येक 135,000 60-मेर 29549 चर्चा टेप का प्रतिनिधित्व जांच शामिल थे। इस डिवाइस के अध्ययन 10-24 की एक बड़ी संख्या में इस्तेमाल किया गया है। इन दो प्लेटफार्मों अब बंद कर दिया गया है, लेकिन एक नए कस्टम माइक्रोएरे हाल ही में डिजाइन किया गया है और एक और अधिक हाल ही में विकास का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में यह अतिरिक्त नव की खोज की चर्चा जीन 25 प्रतिनिधित्व कर जांच के लिए एक भी अधिक से अधिक संख्या में शामिल हैं।

बड़े-बिक्री transcriptomics और metabolomics विश्लेषण द्वारा उत्पादित डेटासेट डेटा विश्लेषण के लिए उपयुक्त सांख्यिकीय तरीकों, बहुभिन्नरूपी तकनीक अलग फार्म के बीच सह-संबंध का निर्धारण करने की आवश्यकता सहितडेटा के एस। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल किया बहुभिन्नरूपी तकनीक प्रक्षेपण के आधार पर उन लोगों के हैं, और इन जैसे प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए), या के रूप में, पूछना हो सकता है इस तरह के अव्यक्त संरचनाओं विभेदक विश्लेषण (O2PLS-डीए) 26 द्विदिश orthogonal प्रक्षेपण के रूप में, निगरानी की। इस लेख में प्रस्तुत प्रोटोकॉल नमूने के समूहों के बीच मतभेद की पहचान करने के लिए खोजपूर्ण डेटा विश्लेषण और O2PLS-डीए के लिए पीसीए का इस्तेमाल करता है।

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Protocol

1. उपयुक्त सामग्री का चयन करें और एक नमूना योजना का निर्माण

  1. एक उचित नमूना योजना के विकास के द्वारा प्रयोग शुरू करते हैं। वहाँ कोई सामान्य और सार्वभौमिक दृष्टिकोण तो एक मामला-दर-मामला आधार पर प्रत्येक योजना का मूल्यांकन है। सुनिश्चित नमूना योजना में कहा गया है कि नमूना स्थानों, बार और सटीक नमूना प्रक्रिया। नमूना इस मामले अध्ययन में इस्तेमाल की योजना के लिए चित्रा 1 देखें।
    नोट: इस मामले का अध्ययन में, एक एकल क्लोन (। द्राक्षा सीवी Corvina, क्लोन 48) से अंगूर जामुन वेरोना के प्रांत में तीन अलग-अलग वृहद क्षेत्र (झील Garda, Valpolicella और Soave) में सात वाणिज्यिक अंगूर के बागों से एकत्र किए गए थे। प्रत्येक दाख की बारी के प्रिंसिपल सुविधाओं तालिका 1 में संक्षेप हैं। जामुन तीन बिंदुओं पर समय तीन बढ़ मौसम (2006, 2007, और 2008) के दौरान एकत्र किए गए थे, veraison (पकने की शुरुआत), मध्य पकने और पका हुआ जामुन के लिए इसी।
    1. accessions के प्रत्येक (विन के लिएeyard / वर्ष / पकने चरण), बेतरतीब हाइट्स और संयंत्र पर स्थानों के साथ दो बेल पंक्तियों के साथ विभिन्न पदों से फसल 30 समूहों।
    2. प्रत्येक क्लस्टर से बेतरतीब ढंग से तीन जामुन का चयन करें, दिखाई क्षति और / या संक्रमण के लक्षण के साथ उन लोगों से परहेज।
    3. दोहराएँ कदम 1.1.1 और 1.1.2 तीन स्वतंत्र पूल प्राप्त करने के लिए।
    4. जामुन Deseed और तरल नाइट्रोजन में तुरंत फली फ्रीज।
    5. एक स्वचालित चक्की चक्की के साथ प्रत्येक पूल से 10 जमे हुए बेरीज क्रश, और दो बराबर भागों, transcriptomics विश्लेषण के लिए एक और metabolomics विश्लेषण के लिए एक में प्रत्येक पाउडर नमूना विभाजित।
    6. -80 डिग्री सेल्सियस पर पाउडर स्टोर।
AM बी ० ए बी.एम. सीएस एफए एम.एन. PM
मैक्रो-जोन Soave झील Garda Valpolicella झील Garda Valpolicella Valpolicella Soave
ऊंचाई (मीटर) 250 120 450 100 130 250 130
rootstock 41B S04 K5BB 420A 420A K5BB 41B
इस पंक्ति की दिशा ईडब्ल्यू एन एस ईडब्ल्यू ईडब्ल्यू ईडब्ल्यू एन एस एन एस
प्रशिक्षण प्रणाली ओवरहेड प्रणाली (Pergola) ओवरहेड प्रणाली (Pergola) कार्यक्षेत्र को गोली मार पोजिशनिंग (Guyot) ओवरहेड प्रणाली (Pergola) Overheविज्ञापन प्रणाली (Pergola) कार्यक्षेत्र को गोली मार पोजिशनिंग (Guyot) कार्यक्षेत्र को गोली मार पोजिशनिंग (Guyot)
मिट्टी के प्रकार गाद भरी मिट्टी चिकनी बलुई मिट्टी चिकनी मिट्टी चिकनी बलुई मिट्टी मिट्टी दोमट दोमट मिट्टी मिट्टी दोमट
रोपण लेआउट (एम) 3.20 x 1.00 4.50 x 0.80 4.00 x 1.25 3.50 x 1.20 3.50 x 0.75 2.80 x 1.00 1.80 x 0.80
कुल चूना% 3.9 19.3 18.3 14.4 31 5.9 27.9
सक्रिय चूना% 0.5 2.6 9.4 6.3 11.3 3.1 8.3
रेत % 15 47 66 42 29 13 36
दोमट% 43 36 21 37 39 67 36
चिकनी मिट्टी % 42 17 13 21 32 20 28
मृदा पीएच 8.3 7.9 7.8 8.2 8.2 7.8 7.9
कार्बनिक पदार्थ (%) 2.9 2.5 2.2 1.2 2.9 1.6 2.5
विनिमेय फास्फोरस (मिलीग्राम / किग्रा) 26 73 73 68 48 47 64
विनिमेय पोटेशियम (मिलीग्राम / किग्रा) 190 376 620 230 168 154 126
विनिमेय मैग्नीशियम (मिलीग्राम / किग्रा) 272 468 848 623 294 293 183
विनिमेय कैल्शियम (मिलीग्राम / किग्रा) 6500 5380 7358 6346 4652 10055 2878
बेरी को कम शुगर्स 2006 211.25 ± 1.20 176.20 ± 0.42 187.40 ± 0.00 203.70 ± 1.13 212.55 ± 0.64 195.20 ± 0.00 211.65 ± 0.64
बेरी को कम शुगर्स 2007 190.00 ± 1.27 165.25 ± 0.49 153.00 ± 0.42 203.60 ± 0.71 210.90 ± 0.71 192.25 ± 0.64 188.70 ± 1.84
बेरी को कम शुगर्स 2008 191.35 ± 0.64 178.90 ± 0.57 170.05 ± 0.49 205.15 ± 1.48 188.70 ± 0.57 169.35 ± 0.49 108.05 ± 1.06
बेरी पीएच 2006 3.01 ± 0.01 2.96 ± 0.01 2.84 ± 0.00 2.9 ± 0.00 2.98 ± 0.00 3.02 ± 0.00 3.06 ± 0.01
बेरी पीएच 2007 2.97 ± 0.00 3.00 ± 0.00 2.74 ± 0.00 3.07 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.87 ± 0.01 3.09 ± 0.00
बेरी पीएच 2008 2.83 ± 0.00 3.04 ± 0.01 2.71 ± 0.00 2.98 ± 0.01 2.98 ± 0.00 2.82 ± 0.00 3.11 ± 0.00
कटाई की तिथि 2006 2007 2008
Veraison 8 अगस्त 18 जुलाई 12 अगस्त
मिड पकने 4-Sep 8 अगस्त 2-Sep
परिपक्व 18-Sep 29 अगस्त 23-Sep

तालिका 1: प्रत्येक दाख की बारी के प्रधानाचार्य सुविधाओं औरनमूना संग्रह तिथियाँ। एम = मीटर, ईडब्ल्यू = खाओ-पश्चिम, उत्तर-दक्षिण एन एस =।
आकृति 1
चित्रा 1:। नमूना प्रक्रिया की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व तीन शराब उत्पादन वृहद क्षेत्रों वेरोना, वेनेटो क्षेत्र, इटली के शहर के आसपास में स्थित हैं। तीन बार के अंक veraison (वी) अंगूर की खेती में पकने की शुरुआत का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, मध्य पकने (एमआर) और पका हुआ जामुन (आर)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. तैयार बेरी पाउडर अर्क, चयापचयों का विश्लेषण और डेटा की प्रक्रिया

  1. विश्लेषण के लिए बेरी पाउडर के नमूने तैयार करें।
    1. तीन खंडों में कमरे के तापमान पर बेरी के नमूनों की चयापचय अर्क तैयार (डब्ल्यू / वी) 0.1% के साथ अम्लीय मेथनॉल (वी / वी) के लिए15 मिनट के लिए 40 kHz पर एक अल्ट्रासोनिक स्नान में माइक एसिड। नियंत्रण रेखा-MS-ग्रेड पानी और फार्मिक एसिड, और HPLC ग्रेड मेथनॉल का प्रयोग करें।
    2. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अर्क अपकेंद्रित्र।
    3. दो खंडों (वी / वी) विआयनीकृत पानी की सतह पर तैरनेवाला में कदम 2.1.2 से पतला और एक 0.2 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से गुजरती हैं।
  2. एचपीएलसी-ईएसआई एमएस द्वारा बेरी के अर्क का विश्लेषण।
    1. आपूर्तिकर्ता की सिफारिशों के अनुसार सेट अप एचपीएलसी-ईएसआई एमएस प्रणाली।
      नोट: इस मामले के अध्ययन में, सेटअप एक एचपीएलसी एक autosampler के साथ सुसज्जित प्रणाली, एक आयन जाल मास स्पेक्ट्रोमीटर और electrospray आयनीकरण स्रोत के साथ लाइन में जुड़े हुए थे।
    2. एक C18 गार्ड स्तंभ (7.5 x 2.1 मिमी 2) और एक उलट चरण C18 स्तंभ (150 x 2.1 मिमी 2, कण आकार 3 माइक्रोन) के साथ एचपीएलसी सिस्टम से कनेक्ट।
    3. मोबाइल चरण के रूप में इस्तेमाल सॉल्वैंट्स तैयार करें। एस विलायक के रूप में एक के रूप में पानी और 100% acetonitrile में 5% (वी / वी) acetonitrile, 0.5% (वी / वी) फार्मिक एसिड का उपयोगolvent बी उपयोग नियंत्रण रेखा एमएस ग्रेड acetonitrile, पानी और फार्मिक एसिड।
    4. 0.2 मिलीलीटर मिनट -1 30 μl का एक नमूना इंजेक्शन की मात्रा का उपयोग करने का एक निरंतर प्रवाह दर पर सॉल्वैंट्स ए और बी के एक रेखीय ढाल के साथ एचपीएलसी जुदाई चलाएँ।
      1. शुरू में 100% विलायक ए के साथ स्तंभ संतुलित करना नमूना इंजेक्शन, एक ढाल 0% से 10% विलायक बी करने के लिए 5 मिनट में, 20% विलायक बी करने के लिए 20 मिनट में, 25% विलायक बी करने में स्थापित 10% से 20% से बाद 5 मिनट, और 25% से 70% से 15 मिनट में विलायक बी।
      2. दो प्रतियों में प्रत्येक नमूना विश्लेषण। नमूना विश्लेषण अनियमित साधन संचालित प्रभाव से बचने के लिए। प्रत्येक विश्लेषण के बीच 100% विलायक एक साथ फिर से संतुलन के लिए 20 मिनट की अनुमति दें।
    5. वैकल्पिक नकारात्मक और सकारात्मक आयनीकरण मोड में जन स्पेक्ट्रा मोल। इस मामले का अध्ययन में वर्णित परिणामों के लिए, 2 टेबल में के रूप में मानकों की स्थापना की। सटीक मशीन की स्थापना विशेष मंच पर निर्भर करता है।
      नोट: वैकल्पिक, अन्य सूट का उपयोगविशिष्ट मंच के अनुसार सक्षम तरीकों।
      1. सभी मामलों में, किसी भी जुदाई मंच के साथ के रूप में, एक उपयुक्त फिर से संतुलन समय का उपयोग करने के लिए, क्रम में अवधारण समय reproducibility है करने के लिए सुनिश्चित करें। जब नमूनों की संख्या अधिक है (दस नमूने ऊपर), 9-10 नमूनों की बैचों में उन्हें विश्लेषण प्रत्येक बैच के बीच chromatographic स्तंभ सफाई कार्यक्रम (दो क्षालन सॉल्वैंट्स के बीच धीमी गति से ढ़ाल) के साथ। पर्याप्त अवधारण समय reproducibility करवाने के लिए, यह सुनिश्चित करें कि प्रत्येक बैच की पहली chromatographic विश्लेषण एक खाली विश्लेषण है (यानी, विलायक का विश्लेषण)।
    6. इसके अलावा खंडित नकारात्मक और सकारात्मक आयन विखंडन विकल्प (दो आयन व्यापारियों, एमएस 3) की स्थापना मोड में जन स्पेक्ट्रा के अधिग्रहण। विखंडन पेड़ विश्लेषण (एमएस / एमएस और एमएस 3) निर्माता के निर्देशों के अनुसार चयापचयों व्याख्या।
      नोट: इस संयंत्र चयापचयों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, क्योंकि वे अक्सर ग्लाइकोसिलेटेड कर रहे हैं, वहाँefore पहले विखंडन (एमएस / एमएस) मुक्त aglycone आयन, और बाद में विखंडन (एमएस) 3 छोड़ने चीनी moieties को दूर करने के लिए जाता एक प्रामाणिक मानकों पुस्तकालय के खिलाफ aglycone की पहचान करने में मदद करता है।
    7. एमएस / एमएस और एमएस 3 स्पेक्ट्रा मोल मी / z रेंज 50-1,500 1 वी वैकल्पिक रूप से एक विखंडन आयाम के साथ में, विशेष मंच के अनुसार अन्य उपयुक्त तरीकों का उपयोग करें।
    8. प्रत्येक मी / z संकेत के लिए, निर्माता के निर्देशों के अनुसार प्रामाणिक मानकों पुस्तकालय के लिए एमएस / एमएस और एमएस 3 विखंडन पैटर्न और प्रतिधारण बार की तुलना करें।
      नोट: प्लेटफार्मों के कई प्रकार के प्रामाणिक मानकों के विश्लेषण के माध्यम से पुस्तकालय के इस तरह के निर्माण के लिए सॉफ्टवेयर की सुविधा शामिल है। यह संकेतों के कई की पहचान करनी चाहिए, लेकिन नहीं सभी संकेतों एनोटेट कर दिया जाएगा।
    9. शेष गुमनाम संकेतों के लिए, साहित्य, searc में प्रकाशित उन लोगों के साथ एमएस / एमएस और एमएस 3 विखंडन पैटर्न की तुलनामी / z मूल्यों (यानी, अमेरिका "मी / z 353" प्रकाशनों में ऐसे मी / z उल्लेख कर रहे हैं के साथ अणुओं के लिए देखने के लिए) आम खोज इंजन से किसी के साथ स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है, या इस तरह के MassBank के रूप में ऑनलाइन डेटाबेस का उपयोग करें (www के लिए hing .massbank.jp / एन / database.html) और मानव Metabolome डाटाबेस (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search)।
मास स्पेक्ट्रोमीटर घटकों समारोह पैरामीटर्स
Electrospray ionization स्रोत nebulizing गैस 50 साई, 350 डिग्री सेल्सियस
सुखाने गैस 10 एल मिनट -1
आयन जाल और डिटेक्टर स्कैन पूर्ण स्कैन मोड, 13,000 मी / z प्रति सेकंड, सीमा 50-1,500 मी / z
400 मी / z
टकराव गैस हीलियम
वैक्यूम दबाव 1.4 x 10 -5 मिलीबार
केशिका स्रोत 4000 वि
अंत प्लेट ऑफसेट -500 वी
पौना -40 वी
कैप बाहर निकलें -121 वी
Oct, 1 डीसी -12 वी
Oct, 2 डीसी -1.7 वी
लेन्स की 1 5 वी
लेंस 2 60 वी
सकारात्मक आयनीकरण मोड के लिए आईसीसी 20.000
नकारात्मक आयनीकरण मोड के लिए आईसीसी 7000

तालिका 2: जन स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए प्रधान पैरामीटर सेट।

ऑपरेशन चयन समारोह पैरामीटर्स मान
चोटी का पता लगाने मास का पता लगाने केन्द्रक शोर का स्तर 3,500
chromatogram बिल्डर उच्चतम डेटा बिंदु न्यूनतम समय अवधि 0.15
न्यूनतम ऊंचाई 4000
मी / z सहिष्णुता 0.3
चोटी का पता लगाने पीक deconvolution स्थानीय न्यूनतम खोज chromatographic दहलीज 70
आर टी रेंज में खोजें न्यूनतम (मिनट) 0:50
न्यूनतम रिश्तेदार ऊंचाई 15%
न्यूनतम पूर्ण ऊंचाई 4000
चोटी के शीर्ष / बढ़त के न्यूनतम अनुपात 2
अवधि सीमा (न्यूनतम) 0-10
आइसोटोप समस्थानिक चोटियों ग्रूपर - मी / z सहिष्णुता 1.2
आर टी सहिष्णुता 0:50
monotonic आकार नहीं
अधिकतम शुल्क 3
प्रतिनिधि आइसोटोप नहीं
संरेखण एलाइनर जुडें - मी / z सहिष्णुता 1.2
मी / z के लिए भार 10
अवधारण समय सहिष्णुता 0:50
आरटी के लिए भार 5
एक ही चार्ज राज्य की आवश्यकता नहीं
एक ही आईडी की आवश्यकता नहीं
आइसोटोप पैटर्न की तुलना करें नहीं
कमी भरना पीक खोजक - तीव्रता सहिष्णुता 20%
मी / z सहिष्णुता 0.9
अवधारण समय सहिष्णुता 0:40
आरटी सुधार नहीं
छनन पीक फिल्टर डुप्लिकेट - मी / z सहिष्णुता 1.2
आर टी सहिष्णुता 0:30
एक ही पहचान की आवश्यकता नहीं

तालिका 3: विशिष्ट मूल्यों के साथ Mzmine कार्यप्रवाह नकारात्मक नियंत्रण रेखा एमएस अंगूर बेरी डेटा फाइलों पर कार्रवाई करने के लिए।

  1. नियंत्रण रेखा एमएस डेटा की प्रक्रिया।
    1. Access याएक डाटा प्रोसेसिंग सॉफ्टवेयर पैकेज है कि कई कच्चे chromatograms से प्रासंगिक जानकारी निकालने के लिए और एक डाटा मैट्रिक्स, जिसमें प्रत्येक का पता चला मेटाबोलाइट प्रत्येक नमूने में मात्रा निर्धारित है निर्माण कर सकते हैं डाउनलोड करें।
      नोट: नीचे प्रोटोकॉल कदम खुला स्रोत सॉफ्टवेयर MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net) के लिए सिलवाया रहे हैं। यह नियंत्रण रेखा एमएस डेटा पर मुख्य ध्यान देने के साथ बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री डाटा प्रोसेसिंग के लिए एक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर है। 27
    2. उपकरण निर्माता द्वारा प्रदान की सॉफ्टवेयर का उपयोग कर netCDF प्रारूप में नियंत्रण रेखा एमएस वर्णलेख डेटा रूपांतरण। यहाँ वर्णित परिणामों के लिए, Bruker Daltonics एस्क्वायर v5.2 और डेटा विश्लेषण v3.2 सॉफ्टवेयर का उपयोग करें और निर्माता के निर्देशों के अनुसार चरणों का प्रदर्शन।
      नोट: अन्य कन्वर्टर्स इस्तेमाल किया जा सकता है (विभिन्न मुक्त-बर्तन कन्वर्टर्स उपलब्ध हैं)।
    3. सॉफ्टवेयर में .cdf फ़ाइलें आयात करें।
    4. paramet के साथ चोटी का पता लगाने, संरेखण, खाई को भरने और शिखर छानने प्रक्रियाओं को लागूनेताओं तालिका 3 में सूचना दी।
      1. पहले कदम के रूप में, एक आयातित .cdf फ़ाइल का चयन करें, तो दृश्य → घरेलू / XIC Visualizer के पास जाओ। वर्णलेख में सबसे छोटी चोटी के आधार पर कर्सर रखो और आधार आयन की न्यूनतम तीव्रता संकेत के बारे में ध्यान रखना। तो कच्चे डेटा के तरीके → चोटी का पता लगाने के लिए जाना।
      2. मास का पता लगाने का चयन करें और प्रत्येक स्कैन के लिए व्यक्तिगत आयनों का पता लगाने और एक आयन सूची बनाने के लिए संकेत स्तर भरें।
        नोट: एल्गोरिथ्म चेक द्रव्यमान का पता लगाने के प्रयास के पूर्व - यह मास स्पेक्ट्रोमीटर पर निर्भर करता है। हमारे मामले में, हम Centroid का चयन करें।
      3. Chromatogram बिल्डर का चयन करें और संकेत स्तर के साथ भरने आयन सूची से डेटा बिंदुओं से कनेक्ट और प्रत्येक जन के मूल्य के लिए एक वर्णलेख बनाने के लिए। मापदंडों के मास स्पेक्ट्रोमीटर मैनुअल मिनट का समय काल और मी / z सहिष्णुता को समायोजित करने में निर्दिष्ट देखें।
      4. अगले, पीक सूची के तरीके → चोटी का पता लगाने → chromatogram Deconvo करने के लिए जानाlution। अलग-अलग चोटियों में प्रत्येक वर्णलेख की जुदाई की अनुमति के लिए उपयुक्त एल्गोरिथ्म (इस मामले में स्थानीय न्यूनतम खोजें में) का चयन करें।
      5. मैन्युअल chromatograms का निरीक्षण निम्नलिखित मानकों के लिए उचित मूल्यों पता लगाने के लिए। शोर हटाने और 2 (मिनट) के लिए आर टी रेंज में खोजें न्यूनतम दो चोटियों भेदभाव करने के लिए कम से कम स्थानीय लोगों की उपस्थिति की पहचान करने के लिए 30% करने के लिए Chromatographic सीमा निर्धारित।
      6. 2.0 में निर्धारित न्यूनतम रिश्तेदार ऊंचाई। मैन्युअल रूप से उस पृष्ठभूमि करने के लिए एक पीक करने के लिए नहीं है और मेल खाती संकेत के न्यूनतम पूर्ण ऊंचाई की पहचान करने के वर्णलेख निरीक्षण; निरपेक्ष ऊँचाई (उदाहरण के लिए, प्रस्तुत प्रयोग में 10,000) के रूप में इस मूल्य निर्धारित किया है।
      7. ऊपर और एक चोटी के निम्नतम बिंदु डेटा तीव्रता के बीच न्यूनतम अनुपात राज्य के लिए 1.1 पीक शीर्ष / एज की न्यूनतम अनुपात निर्धारित एक सच्चे शिखर के रूप में मान्यता प्राप्त हो।
      8. मैन्युअल chromatograms का निरीक्षण देखने के लिए जो प्रयोग किया जाता chromat में विभिन्न चोटियों की न्यूनतम अवधि हैographic की स्थिति (उदाहरण के लिए, 0.2 और 2 मिनट, यौगिक के आधार पर प्रस्तुत प्रयोगों में) के बीच है, और फलस्वरूप पीक अवधि रेंज (न्यूनतम) के रूप में इन मूल्यों की अवधि के रूप में स्वीकार्य चोटी लंबाई की सीमा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल करते हैं।
      9. फिर शिखर सूची के तरीके → आइसोटोप → समस्थानिक चोटियों समूहक पर, एक चोटी में आइसोटोप समूह के लिए जाना आम तौर पर सबसे तीव्र में। नोट: मापदंडों के मास स्पेक्ट्रोमीटर के संकल्प और प्रतिधारण बार के reproducibility पर निर्भर करते हैं।
      10. अंत में, एक मैच के स्कोर का उपयोग करके अपने मी / z और प्रतिधारण समय पर निर्भर करता चोटियों के लिए पंक्ति में पीक सूची के तरीके → संरेखण → Aligner शामिल होने के लिए जाना।
    5. चोटियों संरेखित करने के बाद, भरने → पीक खोजक पीक सूची के तरीके → गैप पर क्लिक करके किसी भी डेटा अंतराल को भरने के। अंत में, फिल्टर पर पीक सूची के तरीके → छनन → डुप्लिकेट पीक फ़िल्टर पर क्लिक करके डेटा बिंदुओं नकली।
    6. एक सीएस के रूप में जिसके परिणामस्वरूप डाटासेट निर्यातवी फ़ाइल।
    7. मैन्युअल बदल जाते हैं। एक। Txt विस्तार करने के लिए सीएसवी विस्तार। कोई फाइल एक्सटेंशन दिखाई दे रहे हैं, तो फ़ाइल एक्सटेंशन प्रकट करने के लिए कंप्यूटर सेटिंग्स बदल जाते हैं। एक्सप्लोरर विकल्प → देखें → उन्नत सेटिंग्स फ़ाइल और बॉक्स 'ज्ञात फ़ाइल प्रकारों के एक्सटेंशन छिपाएं' अचयनित करने के लिए जाओ।
    8. एक स्प्रेडशीट में .txt फ़ाइलें आयात करें। यह एक डाटा मैट्रिक्स, जिसमें सभी का पता चला चयापचयों, एक पहचान संख्या, मी / z मूल्य और अवधारण समय से मान्यता प्राप्त है, अपने चरम क्षेत्र मूल्यों के संदर्भ में सभी नमूनों में मात्रा निर्धारित कर रहे हैं पैदा करता है।

3. Transcriptome विश्लेषण के लिए बेरी पाउडर अर्क तैयार और डेटा की प्रक्रिया

  1. बेरी नमूने से कुल शाही सेना निकालें और शाही सेना गुणवत्ता निर्धारित करते हैं।
    1. बेरी के नमूनों से कुल शाही सेना निकालें।
      नोट: इस मामले का अध्ययन, एक मालिकाना किट और एक संशोधित प्रक्रिया है कि अणुओं है कि इंटर का पूरी तरह हटाने सुनिश्चित मेंऐसे polysaccharides और polyphenols के रूप में शाही सेना के विश्लेषण के साथ Fere, इस्तेमाल किया गया। नीचे दिए गए निर्देशों इस किट 18 के लिए विशिष्ट हैं।
      1. प्रत्येक नमूना के लिए बेरी पाउडर के 400 मिलीग्राम वजन, यह दो भागों में विभाजित है और दो microfuge ट्यूबों में प्रत्येक 200 मिलीग्राम जगह है।
      2. कम से कम 30 सेकंड के लिए तुरंत और सख्ती पाउडर और भंवर के प्रत्येक 200 मिलीग्राम (किट में प्रदान की) β-mercaptoethanol युक्त lysis समाधान के 900 μl जोड़ें। 5 मिनट के लिए 800 rpm पर झटकों के लिए 56 डिग्री सेल्सियस पर नमूना हीट।
      3. 10 मिनट के लिए एक benchtop microfuge में अधिकतम गति पर नमूने अपकेंद्रित्र सेलुलर मलबे गोली।
      4. Pipet किट (ब्लू अनुचर अंगूठी) में प्रदान की निस्पंदन स्तंभ एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में बैठा में सतह पर तैरनेवाला के 700 μl। अवशिष्ट मलबे को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए एक benchtop microfuge में अधिकतम गति पर टोपी और सेंट्रीफ्यूज को बंद करें। इस चरण को दोहराएँ दो बार, एक ही निस्पंदन स्तंभ लेकिन एक ताजा संग्रह ट्यूब का उपयोग कर तीन टी में जिसके परिणामस्वरूपubes प्रत्येक युक्त ~ 700 स्पष्ट lysate के μl।
      5. Pipet बाध्यकारी समाधान (किट में आपूर्ति) स्पष्ट lysate के प्रत्येक ट्यूब में 750 μl और नीचे कम से कम पांच बार ऊपर pipetting और तुरंत मिश्रण। किट (लाल अनुचर अंगूठी) में प्रदान की बाध्यकारी स्तंभ एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में बैठा लिए इस मिश्रण के 700 μl स्थानांतरण। आरएनए बाध्य करने के लिए 1 मिनट के लिए एक benchtop microfuge में अधिकतम गति पर टोपी और सेंट्रीफ्यूज को बंद करें।
      6. प्रवाह के माध्यम से अंश छानना, पलटना संग्रह ट्यूब और अवशिष्ट तरल निकास के लिए शोषक कागज का एक स्वच्छ पैड पर इसे संक्षेप में नल।
      7. संग्रह ट्यूब के लिए स्तंभ लौटें और इसी कॉलम में शेष मिश्रण pipet और centrifugation और decanting चरणों को दोहराएँ। दोहराएँ जब तक पूरे मिश्रण एक ही लाल बाध्यकारी स्तंभ में छान कर दिया गया है।
      8. अब किट में शेष निर्देशों का पालन करें और 50 μl क्षालन बफर में शाही सेना (किट में आपूर्ति) और मैं दुकान elute-80 डिग्री सेल्सियस पर टी गुणवत्ता नियंत्रण के कदम के लिए तैयार है।
    2. मात्रा और आरएनए एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग की शुद्धता निर्धारित करते हैं। रिकॉर्ड absorbance के अनुपात में जो प्रोटीन (ए 260/280) और polyphenols / polysaccharides (ए 260/230) के साथ प्रदूषण की डिग्री प्रकट करते हैं।
      नोट: माइक्रोएरे संकरण के लिए उपयुक्त आरएनए स्कोर चाहिए दोनों अनुपात के लिए कम से कम 1.8।
    3. शाही सेना की अखंडता को निर्धारित करते हैं।
      नोट: विभिन्न प्रणालियों में इस्तेमाल किया जा सकता है। एक डिजिटल अधिग्रहण है कि एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ संयोजन में एक केशिका electrophoretic रन करता है इस मामले का अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था। माइक्रोएरे संकरण के लिए उपयुक्त आरएनए कम से कम 8 के एक आरएनए वफ़ादारी संख्या (Rin) होना चाहिए।
  2. नमूने तैयार है और एक कस्टम माइक्रोएरे शाही सेना संकरण।
    1. शाही सेना के समाधान विआयनीकृत RNase मुक्त पानी के साथ कदम 3.1.1.8 में प्राप्त गिराए द्वारा 200 एनजी को माइक्रोएरे विश्लेषण के लिए कुल शाही सेना के शुरू राशि निर्धारित करें। जोड़ें1.5 μl के अंतिम मात्रा में एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब आरएनए की उचित मात्रा में।
    2. प्रत्येक शाही सेना नमूना पतला कील मिश्रण के 2 μl जोड़ें और पहली कतरा सीडीएनए संश्लेषण क्रेना में इस नक़ल और जाती 3CTP साथ क्रेना लेबल करने के लिए निर्माता के निर्देशों का पालन करें।
    3. निर्माता के निर्देशों के अनुसार लेबल क्रेना शुद्ध और 30 μl RNase मुक्त पानी में elute।
    4. एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर तीन मूल्यों की रिकॉर्डिंग के द्वारा प्रत्येक क्रेना की उपज और विशिष्ट गतिविधि का निर्धारण: 3 जाती डाई एकाग्रता (μl -1 pmol), आरएनए पवित्रता (ए 260/280) और क्रेना एकाग्रता (एनजी μl -1)। फार्मूले के निर्माता के अनुदेश मैनुअल क्रेना उपज (माइक्रोग्राम) और विशिष्ट गतिविधि (माइक्रोग्राम प्रति क्रेना pmol Cy3) की गणना करने में पाया प्रयोग करें।
      नोट: अनुशंसित पैदावार और विशिष्ट गतिविधियों विशिष्ट माइक्रोएरे प्रारूप के आधार पर भिन्न होते हैं। इस मामले का अध्ययन में एक 4 पैक 44K प्रारूप थाचुना है, की सिफारिश की उपज 1.65 था और विशिष्ट गतिविधि 9 था।
    5. जांच के डिजाइन के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कस्टम माइक्रोएरे डिजाइन।
      1. इस मामले का अध्ययन में वर्णित परिणामों के लिए, कस्टम माइक्रोएरे डिजाइन और oligonucleotide पुस्तकालयों के लिए एक वेब आधारित अनुप्रयोग का उपयोग करके एक नए कस्टम माइक्रोएरे, 4-पैक 44K प्रारूप पर डिजाइन तैयार करते हैं। डिजाइन जांच 34,651 लक्ष्य टेप मैच के लिए, 29,971 भविष्यवाणी Pinot नॉई V1 सरणी से टेप सहित, 4500 नई लोकी Corvina transcriptome पुनर्निर्माण और 180 प्राइवेट Corvina जीन 25 से Pinot फसल में पहचान की।
        नोट: यह 34,651 विशिष्ट 60-मेर जांच के उत्पादन शामिल है, जिसमें 29,798 Pinot नॉई भविष्यवाणी टेप, 4392 नई Pinot लोकी और 179 Corvina प्राइवेट जीनों।
    6. संकरण 4-पैक प्रारूप विशिष्टताओं के आधार पर इस प्रकार के रूप विधानसभा तैयार करें।
      1. Cy3 लेबल क्रेना के 1.65 माइक्रोग्राम 41.8 के अंतिम मात्रा में रखेंविआयनीकृत RNase मुक्त पानी के μl। 10x अवरुद्ध एजेंट के 11 μl और 2.2 μl 25x विखंडन बफर जोड़ें। एक थर्मास्टाटिक स्नान में 30 मिनट के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर सेते टुकड़ा करने के लिए आरएनए। इसके तत्काल बाद 1min के लिए बर्फ पर शांत।
      2. अंत में, 2x संकरण बफर के 55 μl जोड़ने आरटी पर 15,500 XG पर 1 मिनट के लिए pipetting और स्पिन से अच्छी तरह मिला लें। तुरंत बर्फ पर microcentrifuge ट्यूब जगह है। तुरंत प्रयोग करें, यह दुकान नहीं है।
    7. कस्टम माइक्रोएरे लोड इस प्रकार है।
      1. लेबल एक संकरण चैम्बर के आधार में सामना करना पड़ के साथ एक गैसकेट स्लाइड लोड। धीरे-धीरे अच्छी तरह से प्रत्येक गैसकेट पर कदम 3.2.6.2 में प्राप्त संकरण नमूने के 100 μl लोड, पिपेट की नोक के साथ तरल वितरण, बुलबुले से परहेज।
      2. धीरे-धीरे कस्टम माइक्रोएरे नीचे का सामना करना पड़, यह सुनिश्चित करना है कि संख्यात्मक बारकोड का सामना करना पड़ रहा है जगह है। सुनिश्चित करें कि सैंडविच जोड़ी ठीक से गठबंधन किया है। अंत में बैठा पर संकरण कक्ष के कवर के लिए जगहस्लाइड और कक्ष पर दबाना हाथ कस लें। बुलबुले की गतिशीलता का आकलन करने के लिए इकट्ठा चैम्बर घुमाएँ।
    8. ओवन 65 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट एक संकरण में एक rotisserie में इकट्ठे स्लाइड चैम्बर रखें। 10 rpm पर बारी बारी से करने रोटेटर सेट करें। संकरण 17 घंटे के लिए आगे बढ़ने की अनुमति दें।
    9. इस प्रकार के रूप माइक्रोएरे स्लाइड धोने के साथ आगे बढ़ें।
      1. सबसे पहले, तीन स्लाइड धुंधला व्यंजन तैयार करने और उन्हें उचित कपड़े धोने buffers के साथ भरने: आरटी पर धो बफर 1 से 2 व्यंजन और पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) धो बफर 2 के साथ 1 पकवान।
      2. संकरण कक्ष जुदा और सैंडविच निकाल दें। माइक्रोएरे स्लाइड संख्यात्मक बारकोड का सामना करना पड़ के साथ, पहली स्लाइड धुंधला आरटी पर धो बफर 1 के साथ भरा डिश में डूब सैंडविच और स्वच्छ, संदंश की मदद से माइक्रोएरे स्लाइड से गैसकेट अलग। जल्दी से एक स्लाइड रैक में माइक्रोएरे स्लाइड हस्तांतरण और दूसरी स्लाइड धुंधला धो बफर 1 के साथ भरा पकवान में जगहआरटी पर।
      3. एक चुंबकीय उत्तेजक पर स्लाइड धुंधला पकवान रखो और मध्यम सरगर्मी के साथ 1 मिनट धो लें। जल्दी तीसरे स्लाइड धुंधला पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) धो बफर 2 के साथ भरा डिश में स्लाइड रैक हस्तांतरण और मध्यम सरगर्मी के साथ 1 मिनट धो लें।
      4. धीरे-धीरे स्लाइड धुंधला पकवान से रैक को हटाने और ध्यान से रैक से स्लाइड हटाने, बूंदों से परहेज।
        नोट: कपड़े धोने बफ़र्स के लिए ट्राइटन X-102 जोड़ने और acetonitrile धोने कदम न आना मत करो।
    10. कमरे के तापमान पर अंधेरे में धोया चिप की दुकान।
  3. माइक्रोएरे स्कैन और मुख्य विशेषताएं निकालें।
    1. माइक्रोएरे स्लाइड एक उपयुक्त स्कैनर में रखें और माइक्रोएरे निर्माता के निर्देशों के मैनुअल में सिफारिश पैरामीटर सेटिंग्स का उपयोग कर प्रत्येक सरणी स्कैन। यहाँ वर्णित परिणामों के लिए, एक स्लाइड धारक में प्रत्येक माइक्रोएरे स्लाइड जगह स्कैनिंग प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाने के लिए।
    2. उत्पादन आयात .shpएक उपयुक्त सॉफ्टवेयर है कि संख्यात्मक फ्लोरोसेंट मूल्यों में एक डिजिटल सिग्नल में परिवर्तित करने में सक्षम है में दायर। यह सुनिश्चित करने के संकरण प्रक्रिया सफल रहा था गुणवत्ता नियंत्रण रिपोर्ट की जाँच करें।
      1. यहाँ वर्णित परिणामों के लिए, सुविधा निकासी सॉफ्टवेयर के अनुदेश मैनुअल में सिफारिश पैरामीटर सेटिंग्स का उपयोग करें और गुणवत्ता नियंत्रण की रिपोर्ट का निरीक्षण सुनिश्चित करने के लिए कि तालिका 4 में सूचीबद्ध मापदंडों के निर्माता द्वारा दिए गए सामान्य सीमा के भीतर कर रहे हैं।
मैट्रिक का नाम ऊपरी सीमा निचली सीमा विवरण
AnyColorPrcntFeatNonUnif 1.00 NA सुविधाओं का प्रतिशत है कि या तो चैनल में सुविधा गैर एकरूपता outliers हैं
पहचान सीमा 2.00 0.10 औसत प्लस 1 रेखीय एकाग्रता रेंज के नीचे कील आईएनएस के मानक विचलन
absGE1E1aSlope 1.20 0.90 बनाम E1A जांच की एकाग्रता सिग्नल के लिए फिट की ढलान के निरपेक्ष
MedCVProcSignal 8.00 NA प्रसंस्कृत सिग्नल के लिए माध्य% सीवी
gNegCtrlAveBGSubSig 5.00 -10.00 पृष्ठभूमि की औसत घटाया सभी inlier नकारात्मक नियंत्रण का संकेत (BGSubSignal सुविधा से BGUsed नामक एक मूल्य substracting मतलब संकेत द्वारा गणना की जाती है)
gNegCtrlAveNetSig 40.00 NA सभी inlier नकारात्मक नियंत्रण का शुद्ध संकेत के औसत
gNegCtrlSDevBGSubSig 10.00 NA का मानक विचलनपृष्ठभूमि सभी inlier नकारात्मक नियंत्रण के संकेतों घटाया
gNonCntrlMedCVProcSignal 8.00 NA गैर नियंत्रण जांच के प्रसंस्कृत सिग्नल के लिए माध्य% सीवी
gSpatialDetrendRMSFilter 15.00 NA पृष्ठभूमि detrending फिट की अवशिष्ट

तालिका 4: प्रिंसिपल मापदंडों के माइक्रोएरे संकरण की गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए जाँच की जाए।

  1. माइक्रोएरे डेटा की प्रक्रिया।
    1. एक बार सभी माइक्रोएरे स्लाइड्स स्कैन किया गया है और गुणवत्ता नियंत्रण सकारात्मक मूल्यांकन किया गया है, प्रत्येक एकल subarray परिणाम फ़ाइल से gProcessedSignal मूल्यों का चयन, प्रत्येक जांच के कच्चे प्रतिदीप्ति तीव्रता का प्रतिनिधित्व द्वारा एक टैब-सीमांकित डेटा मैट्रिक्स तैयार करते हैं।
    2. एक स्प्रेडशीट में, प्रत्येक सरणी (पी मान) और calcul के भीतर 75 वें प्रतिशतक पर डेटा मानकआर अनुपात की गणना करने के लिए सभी विभिन्न उप-सरणियों के बीच सभी पी मूल्यों की औसत खा लिया।
    3. फिर, एक ही स्प्रेडशीट पर, अपने खुद के उप-सरणी के आर अनुपात करने के लिए प्रत्येक gProcessedSignal मूल्य मानक के अनुसार।

4. Metabolomics और transcriptomics आंकड़ों का विस्तृत सांख्यिकीय विश्लेषण बाहर ले जाने

  1. सांख्यिकीय विश्लेषण सॉफ्टवेयर तैयार करें।
    नोट: इस मामले का अध्ययन, एक सॉफ्टवेयर पीसीए प्रदर्शन करने में सक्षम में, PLS-डीए और O2PLS-डीए इस्तेमाल किया गया था।
    1. Metabolomics और transcriptomics डेटा आयात करें। → नई नियमित रूप से परियोजना → MZmine सॉफ्टवेयर के साथ प्राप्त डाटा मैट्रिक्स आयात पर नए नियमित रूप से परियोजना की फाइल करने के लिए जाओ। तो फिर क्लिक करें → संपादित पूरे मैट्रिक्स → होम स्थानांतरित और उचित प्राथमिक और माध्यमिक आईडी → समाप्त आवंटित पर।
    2. डेटा सेंटर और परेटो पैमाने का उपयोग कर उन्हें पैमाने मतलब है। होम विंडो में, संपादन → एम 1 के लिए जाना है और उचित parame बदलडेटा के आधार मंत्रियों। यहाँ वर्णित परिणामों के लिए, बराबर करने के लिए यूनिट विचरण से स्केल बदल जाते हैं।
    3. यूनिट विचरण सेटिंग का उपयोग transcriptomics डेटा स्केल।
  2. बहुभिन्नरूपी सांख्यिकीय विश्लेषण बाहर ले जाने।
    1. पीसीए लागू करने के रूप में एफ igure 2 में दिखाया गया है। इस मामले के अध्ययन में, पीसीए नमूनों के बीच मुख्य अंतर है, अलग अलग चरणों पकने को दर्शाती है और बढ़ मौसम का पता चलता है।
      1. Workset विंडो में, मॉडल प्रकार के रूप में पीसीए-एक्स का चयन करें। प्रेस ऑटोफ़िट। R2X (सह) और Q2 (सह) पर ध्यान देना मूल्यों के रूप में वे मॉडल की गुणवत्ता के बारे में एक विचार दे।
        नोट: आम तौर पर, उच्च मूल्यों बेहतर मॉडल है, लेकिन बहुत उच्च R2X (सह) के साथ मॉडल डेटा पर फिट हो सकता है। अनुभवजन्य नियम के रूप में, हम प्रमुख घटक जोड़ने के लिए बंद जब Q2 (सह) मूल्य में कमी करने के लिए शुरू होता है।
      2. फिर, साजिश है कि नमूने के संभावित समूहीकरण शो देखने के लिए स्कोर → तितर बितर का चयन करें।
      3. पीसीए का निरीक्षणप्लॉट स्कोर। एक अच्छा मॉडल प्राप्त की है, तो (Q2cum> 0.5), नमूने का एक ही वर्गों का उपयोग एक O2PLS-डीए मॉडल (कदम 4.2.2) का निर्माण करने के लिए।
    2. नमूने वृहद क्षेत्र द्वारा वर्गीकृत उपयोग करते हुए दो O2PLS-डीए मॉडल का निर्माण और 200 क्रमपरिवर्तन के साथ एक क्रमचय परीक्षण का उपयोग कर मॉडल को मान्य।
      1. घर खिड़की → नए रूप में → एम 1 → टिप्पणियों के लिए जा रहा द्वारा कक्षाओं में निरुपित। वांछित कक्षाएं निर्धारित करें। फिर, पीसीए-एक्स से मॉडल प्रकार O2PLS-डीए करने के लिए बदल जाते हैं। प्रेस ऑटोफ़िट। सुनिश्चित करें कि PLS-डीए मॉडल के घटकों की संख्या O2PLS-डीए के रूप में ही है।
      2. O2PLS-डीए मॉडल को मान्य करने के लिए, CV-एनोवा का विश्लेषण करने के लिए जाना है और सही पी मूल्य देखते हैं। इसके अलावा, पर नया क्लिक करें घर खिड़की → M2 के रूप में और बदल PLS-डीए को O2PLS-डीए से मॉडल प्रकार। प्रेस ऑटोफ़िट।
      3. → क्रमपरिवर्तन का विश्लेषण और 200 क्रमपरिवर्तन (डी-चुनें पुनर्गणना परम्युटेशन्स विकल्प) प्रदर्शन करने के लिए जाओ।
        नोट: अंतिम उत्पादन एक खिड़की से पता चलता है जो R2 मूल्य दिवा मेंएलडी आम तौर पर, 0,4 के तहत मूल्यों में वाई अक्ष मारा जबकि Q2 वाई अक्ष के नकारात्मक हिस्सा हिट चाहिए। R2 और / या Q2 मूल्यों गलत हैं, तो घटकों के दोनों PLS-डीए और O2PLS-डीए मॉडल में संख्या कम है।
      4. परियोजना विंडो में M2 चयन और बिखराव → पर क्लिक करें स्कोर साजिश और नमूना वर्गों की स्थिति को देखने के लिए आगे बढ़ें। निरीक्षण करने के लिए क्या एक या एक से अधिक विशिष्ट वर्गों की चयापचयों, साजिश करने के लिए / सूची → तितर बितर जाना।
      5. टिप्पणियों के लिए चयन डेटा प्रकार बदलें और लोडिंग → क्रमश पीक्यू (CORR) और Pred कंप्यूटर अनुप्रयोग में सीरीज जोड़ें और एक्स-एक्सिस और श्रृंखला में आइटम को संशोधित 1 और 2 या आगे घटकों में जब वर्तमान।
      6. माउस के दाहिने भूखंड पर दबाया बटन के साथ, के लिए संपत्ति → रंग जाना और द्वारा शर्तों को चुनने के अणुओं और वर्गों के बीच साजिश प्रतीकों भेद करने के लिए। वांछित विशेषताओं के साथ साजिश को संशोधित करने के लिए लेआउट → प्रारूप प्लॉट → एक्सिस और / या शैली के लिए जाना।
      3. <li> metabolomics O2PLS-डीए विश्लेषण, विशिष्ट चयापचयों या histograms के रूप में चयापचयों की कक्षाओं के सापेक्ष स्तरों में मौजूद मतभेदों के परिणामों के आधार पर।
    3. Transcriptomics O2PLS-डीए विश्लेषण के परिणामों के आधार पर, पुनः प्राप्त करने और विभिन्न संग्राहक जीन आवंटित करने के लिए जीन (जाओ) आंटलजी वर्गीकरण 28।
    4. मेटाबोलाइट का स्तर और मैन्युअल जीन अभिव्यक्ति के बीच संबंधों को पहचानें।

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Representative Results

मामला इस आलेख में वर्णित अध्ययन 552 संकेतों (मी / z सुविधाओं) आणविक आयनों के साथ साथ उनके आइसोटोप, adducts और कुछ टुकड़े भी शामिल है, अपेक्षाकृत 189 नमूनों के बीच मात्रा निर्धारित (7 अंगूर के बागों एक्स 3 पकने चरणों एक्स 3 एक्स बढ़ मौसम जिसमें एक अंतिम डाटा मैट्रिक्स झुकेंगे 3 जैविक प्रतिकृति)। डेटा बिंदुओं के लिए कुल संख्या इसलिए 104,328 थी। विखंडन पेड़ विश्लेषण 282 मी / z सुविधाओं का एनोटेशन में हुई, चयापचयों प्लस adducts, आइसोटोप और टुकड़े करने के लिए इसी। पीसीए द्वारा पूरे डाटा मैट्रिक्स की खोजपूर्ण विश्लेषण से पता चला है कि नमूने क्लस्टर पकने चरण के अनुसार (veraison, मध्य पकने और परिपक्व) पहले और दूसरे प्रमुख घटक (T1-T2, चित्रा 2A) के साथ, और साथ में बढ़ती मौसम के अनुसार तीसरे प्रमुख घटक (T1-T3, चित्रा 2 बी)।

चित्र 2 src = "/ files / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg" />
चित्रा 2:। पूरे metabolomics डाटा मैट्रिक्स के पीसीए unsupervised पीसीए एक्स स्कोर बिखराव तीन अलग-अलग बढ़ मौसम (2006, 2007, और 2008) के दौरान एकत्र की चर्चा के नमूनों की क्लस्टरिंग दिखा और चरणों पकने भूखंडों (veraison, मध्य पकने और पका हुआ जामुन )। पहले साजिश (ए) के नमूने दूसरा (बी) में, पकने चरणों के अनुसार क्लस्टर में जबकि वे बढ़ती मौसम के अनुसार क्लस्टर। रंग हरे (veraison) के रूप में पकने चरणों, गुलाबी (मध्य पकने) और बैंगनी (पका हुआ जामुन) पर प्रकाश डाला। हलकों (2006), चौराहों (2007) और त्रिकोण (2008) .Component T1: Q2: प्रतीकों बढ़ मौसम का प्रतिनिधित्व 0.34; R2X: 0.331; Q2cum: 0.304; घटक T2: Q2: 0.185; R2X: 0.155; Q2cum: 0.433; घटक T3: Q2: 0.145; R2X: 0.0924; Q2cum: 0.515।जेपीजी "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Unsupervised पीसीए विशिष्ट terroir सुविधाओं, जो प्रचलित पुरानी प्रभाव के नीचे छिपा कर रहे हैं प्रकट करने में असमर्थ था, तो एक निगरानी O2PLS-डीए दृष्टिकोण दो अलग डेटासेट, यानी, जामुन veraison पर और पूरी तरह से पका हुआ जामुन करने के लिए लागू किया गया था। यह इन पकने चरणों में इन क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले विशिष्ट terroir हस्ताक्षर की पहचान करने के पकने के दो प्रमुख चरणों में तीन मैक्रो-क्षेत्र (झील Garda, Valpolicella और Soave) का प्रतिनिधित्व चयापचय मतभेदों के अन्वेषण के लिए अनुमति देता है।

चित्र तीन
चित्रा 3: veraison और पके अंगूर जामुन के O2PLS-डीए। O2PLS-डीए स्कोर बिखराव झील Garda में एकत्र नमूनों की चर्चा क्लस्टरिंग दिखा भूखंडों ( नीला), Soave (हरा) और Valpolicella (गुलाबी) veraison (ए) और जब जामुन पके थे (बी पर वृहद क्षेत्र)। चयापचयों क्लस्टरिंग (ए) में मनाया जाता है और (बी) के लिए जिम्मेदार सह-संबंध लोड हो रहा है भूखंडों (सी) और (डी) क्रमश में दिखाई दे रहे हैं। चयापचयों, त्रिकोण के रूप में प्रतिनिधित्व के समूहों, flavan-3-OLS / procyanidins, और अन्य flavonoids के लिए पीले रंग के लिए resveratrol और stilbenes, anthocyanins के लिए गुलाबी के लिए नीले, hydroxycinnamic और hydroxybenzoic एसिड के लिए हरे, बैंगनी हैं। एक: घटक P1: Q2: 0.278; R2X: 0.0529; Q2cum: 0.278; घटक P2: Q2: 0.33; R2X: 0.0394; Q2cum: 0.608। बी: घटक P1: Q2: 0.353; R2X: 0.0639; Q2cum: 0.353; घटक P2: Q2: 0.188; R2X: 0.0374; Q2cum:। .541 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

_content "fo: रख-together.within-पेज =" 1 "> चित्रा 4
चित्रा 4: तीन मैक्रो-क्षेत्रों के बीच चयापचय मार्कर का वितरण:। झील Garda, Soave, और Valpolicella Metabolite का स्तर मानक त्रुटि ± मतलब प्रतिबिंबित (एन = गार्डा और Soave, Valpolicella वृहद क्षेत्र के लिए 27 के लिए 18) अलग ग्लाइकोसिलेटेड की और acylated anthocyanins, resveratrol / stilbenes और तीन अलग अलग बढ़ मौसम (2006, 2007, और 2008) में पका हुआ जामुन Corvina में flavonoids। विभिन्न पत्र समूहों है कि काफी अलग रूप में एक टी परीक्षण (पी <0.05) द्वारा निर्धारित किया गया है प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

सात अलग-अलग दाख की विशिष्ट हस्ताक्षर का उपयोग कर एक विशेष पहचान की गईसांख्यिकीय दृष्टिकोण 10 ized। दो O2PLS-डीए मॉडल बनाया गया था, एक जामुन veraison पर तीन मैक्रो-क्षेत्रों में उगाया के बीच मतभेद परिपक्व जामुन के बीच तीन मैक्रो-क्षेत्रों में मतभेद की खोज के अन्य खोज, और। मॉडल पार मान्य, एक क्रमचय टेस्ट (200 क्रमपरिवर्तन) दिखा रहा है कि मॉडल तीन वृहद क्षेत्र में परिपक्व जामुन का वर्णन वैध था का उपयोग करते हुए, जबकि केवल गार्दा झील के नमूने veraison पर अन्य नमूनों से अलग थे (नहीं दिखाया गया है)।

दो मॉडल है, जो प्रदर्शन कैसे veraison और परिपक्वता पर तीन मैक्रो-क्षेत्रों से नमूने चयापचयों के वितरण के अनुसार अलग हो रहे हैं के स्कोर भूखंडों, आंकड़े 3 ए और 3 बी में दिखाया जाता है। इन मॉडल के रूप में पीक्यू (CORR), यानी, पी (नमूने के वर्ग) और क्यू (चयापचयों) के बीच के संबंध में व्यक्त की लोडिंग भूखंडों, चित्रा में दिखाया जाता हैएस -3 सी और 3 डी। लोड हो रहा है भूखंडों में, लाल वर्गों के नमूनों का वर्ग (मैक्रो-क्षेत्र) प्रतिनिधित्व करते हैं और रंग का त्रिकोण व्यक्ति चयापचयों प्रतिनिधित्व करते हैं। चयापचयों और नमूने के बीच की दूरी अपने संबंधों को दर्शाता है। चयापचयों कलर-कोडेड उनकी रासायनिक वर्ग के हिसाब से कर रहे हैं।

veraison मॉडल की कम सांख्यिकीय वैधता दी गई क्रमचय परीक्षण द्वारा दिखाया गया है, यह overfitting से ग्रस्त होने की संभावना है। इसलिए, निम्न टिप्पणियों परिपक्व बेरी के नमूने, जिसका मॉडल सांख्यिकीय मान्य था के लिए पूरी तरह देखें। लोड हो रहा है साजिश चित्रा 3 डी में दिखाया गया है, stilbenes, झील Garda वृहद क्षेत्र की ओर स्थानांतरित कर रहे हैं, जबकि flavonoids Soave और Valpolicella मैक्रो-क्षेत्रों की ओर स्थानांतरित कर रहे हैं। व्यक्तिगत चयापचयों पर एक करीब देखो, anthocyanins के विषम वितरण का पता चलता है peonidin और उसके डेरिवेटिव झील gar में अधिक प्रचलित साथडा मैक्रो-क्षेत्र और अन्य anthocyanins Valpolicella वृहद क्षेत्र में अधिक प्रचलित (चित्रा 4)। सरल एंथोसायनिन-3-ओ-glucosides Valpolicella वृहद क्षेत्र में अधिक प्रचलित है, जबकि acylated और coumarated डेरिवेटिव Soave वृहद क्षेत्र में अधिक प्रचलित हो रहे हैं।

इस मामले का अध्ययन का transcriptomics घटक मूल रूप से है कि अब समर्थित नहीं है एक transcriptomics मंच का उपयोग कर बाहर था। एक परिणाम के रूप में, हम अभी भी उपलब्ध मंच के साथ एक वैकल्पिक प्रक्रिया की स्थापना; नया मंच पुराने एक से अधिक जांच, 249 अधिक Pinot NOIR के टेप, 4392 नव पहचान Pinot लोकी और 179 Corvina प्राइवेट जीन 25 भविष्यवाणी सहित शामिल हैं।

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Discussion

यह लेख metabolomics, transcriptomics और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रोटोकॉल अंगूर बेरी terroir अवधारणा की व्याख्या करने के लिए इस्तेमाल का वर्णन है। Metabolomics विश्लेषण एचपीएलसी-ईएसआई एमएस से काफी संवेदनशील एक साथ चयापचयों की बड़ी संख्या का पता लगाने के लिए है, लेकिन रिश्तेदार quantitation मैट्रिक्स प्रभाव और आयन दमन / वृद्धि से प्रभावित है। हालांकि, एक समान दृष्टिकोण पहले ही पकने और Corvina जामुन के बाद फसल सूख वर्णन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, और मैट्रिक्स प्रभाव के सुधार के परिणाम 5 पर एक सीमित प्रभाव पड़ा। इसके अलावा, हाल ही में एक बड़े पैमाने पर बहु-साधन अंतर-प्रयोगशाला में एक ही नमूने का उपयोग अलक्षित metabolomics के लिए एनएमआर और नियंत्रण रेखा एमएस के तुलनात्मक मजबूती निर्धारित करने के लिए अध्ययन से पता चला है कि विभिन्न उपकरणों और तकनीकों के अनुरूप परिणाम 6 झुकेंगे। मामले के अध्ययन के साथ साथ वर्णित तीन मैक्रो-जेड में सात अंगूर के बागों से तीन चरणों में पकने संग्रह और नमूनों के विश्लेषण शामिलतीन सत्रों में बढ़ रहा है लोगों को। इस के साथ साथ, terroir हस्ताक्षर मैक्रो-जोन स्तर पर जांच की गई (झील Garda और Soave, प्रत्येक दो अंगूर के बागों का प्रतिनिधित्व करती है, और Valpolicella, तीन अंगूर के बागों द्वारा प्रतिनिधित्व) पीसीए और O2PLS-डीए बहुभिन्नरूपी आँकड़ों का उपयोग। व्यक्तिगत अंगूर के बागों के बीच मतभेद और अधिक सूक्ष्म होते हैं और अधिक परिष्कृत और संवेदनशील सांख्यिकीय दृष्टिकोण 10 की आवश्यकता है। प्रस्तावित प्रोटोकॉल के विभिन्न चरणों के लिए महत्वपूर्ण हैं और सफलतापूर्वक अंगूर की गुणवत्ता पर terroir प्रभावों के बारे में जैविक सवालों का जवाब देने के लिए में विचार किया जाना है।

सबसे पहले, उचित नमूना योजना महत्वपूर्ण है: एक विशिष्ट क्लोन के चुनाव आनुवंशिक मतभेद और नमूने के कई साल की अवधि के लिए विभिन्न TERROIRS के बीच असली, ध्वनि मतभेदों को उजागर करने की अनुमति देता है कम से कम। दूसरी ओर, प्रस्तावित अनुसंधान एक terroir अंगूर की खेती के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है कि भीतर प्रदर्शन किया गया था, और यह कर सकता है मिनीअंगूर की गुणवत्ता पर terroir मतभेद MIZE। इस प्रकार, यह एक ही किस्म में एक कम इष्टतम क्षेत्र में उगाई तुलना लेकिन जाहिर है, करने के लिए बहुत दिलचस्प होगा, इन अंगूर के बागों आसानी से उपलब्ध नहीं हो सकता है।

उच्च विभिन्न विश्लेषण में अवधारण समय में मतभेद, उच्च अंतिम डाटासेट में चोटी के संरेखण में गलतियों की संख्या के बाद से देखने के तकनीकी बिंदु से, एचपीएलसी के माध्यम से एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मेटाबोलाइट जुदाई, अच्छा डाटा मैट्रिक्स प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस प्रकार, यह एक उचित संतुलन फिर से समय निर्धारित उन दोनों के बीच chromatographic स्तंभ सफाई के चक्र के साथ 9-10 नमूने के बैच में नमूने विभाजित करने के लिए है और प्रत्येक बैच के पहले नमूने के रूप में खाली नमूने का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है। नियंत्रण रेखा एमएस अस्थिरता की एक निश्चित डिग्री है, जो नमूने है कि साधन संचालित कर रहे हैं के बीच मतभेद का परिणाम हो सकता से प्रभावित है। इस समस्या को आंशिक रूप से, नमूना विश्लेषण के randomization द्वारा हल किया जा सकता है, क्योंकि इस पत्र में दिखाया गया है। एक iMविधि की provement प्रत्येक बैच में उचित गुणवत्ता नियंत्रण के नमूनों का उपयोग करते हैं, कि मंच पर राज्य को सूचित कर सकते हैं। एक उचित स्तर यौगिक मिश्रण (यानी, मी / z मूल्यों और प्रतिधारण बार पूरे मी / z और अवधारण समय सीमा में फैले के साथ मानक यौगिकों) और एक नया नियंत्रण नमूना सभी नमूनों मंच के बारे में सूचित कर सकते हैं से पाउडर के बराबर भागों के मिश्रण से प्राप्त प्रभाव और भी अंततः एक-अनुभवजन्य डेटा सामान्य बनाने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।

आदेश में तुलना करने के लिए Metabolomics और transcriptomics परिणामों में एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु दोनों के विश्लेषण के लिए वास्तव में एक ही सामग्री (यानी, एक ही कुचल नमूने) का उपयोग करने के लिए किया गया था। डेटा विश्लेषण में, यह इस तरह के OPLS-डीए, जो इस तरह के पीसीए के रूप में तरीकों के संबंध में जीन अभिव्यक्ति और मेटाबोलाइट संचय के मामले में मतभेद की आसान व्याख्या की अनुमति देता है के रूप में एक उचित सांख्यिकी विधि, का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। दृष्टिकोण के इस तरह के प्रमुख सीमाओं में से एक हैtranscriptomics और metabolomics डेटा एकीकरण के लिए मजबूत तरीकों का अभाव। डेटा सहसंबंध के विभिन्न प्रकार के लिए उपयुक्त तरीकों के विकास के क्रम में transcriptomics और metabolomics डेटा के बीच एक मजबूत और विश्वसनीय सह-संबंध बनाने के लिए आवश्यक है।

तकनीक इस आलेख में वर्णित स्पष्ट रूप से पकने और बेरी metabolome पर विंटेज प्रभाव का पता चला है, लेकिन तीन मैक्रो-क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करने वाले विशिष्ट रासायनिक हस्ताक्षर भी प्रचलित पुरानी प्रभाव के नीचे पका हुआ जामुन में पहचान की गई। दिलचस्प बात यह है veraison जामुन का विश्लेषण एक सांख्यिकीय मान्य मॉडल उपज नहीं था, यह दर्शाता है कि terroir अवधारणा मुख्य रूप से चयापचयों कि पहले से ही अपरिपक्व जामुन में मौजूद लोगों की तुलना में (जैसे, anthocyanins और stilbenes) पकने के दौरान जमा से प्रकट होता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Mill Grinder IKA IKA A11 basic
HPLC Autosampler Beckman Coulter  - System Gold 508 Autosampler
HPLC System Beckman Coulter  - System Gold 127 Solvent Module HPLC
C18 Guard Column Grace  - Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column
C18 Column Grace  - Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column
Mass Spectometer Bruker Daltonics  - Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap.
Extraction solvents and HPLC buffers Sigma 34966 Methanol LC-MS grade
Sigma 94318 Formic acid LC-MS grade
Sigma 34967 Acetonitrile LC-MS grade
Sigma 39253 Water  LC-MS grade
Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) Sartorius 17764
Softwares for data collection (a) and processing (b) Bruker Daltonics - Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b)
Spectrum Plant Total RNA kit Sigma-Aldrich STRN250-1KT For total RNA extractino from grape pericarps
Nanodrop 1000 Thermo Scientific 1000
BioAnalyzer 2100 Agilent Technologies G2939A
RNA 6000 Nano Reagents Agilent Technologies 5067-1511
RNA Chips Agilent Technologies 5067-1511
Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 Agilent Technologies 5188-5325
Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 Agilent Technologies 5188-5326
LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color Agilent Technologies 5190-2305
Kit RNA Spike In - One-Color Agilent Technologies 5188-5282
Gene Expression Hybridization Kit Agilent Technologies 5188-5242
RNeasy Mini Kit (50) Qiagen 74104 For cRNA Purification
Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray Agilent Technologies G2514F-048771 
eArray Agilent Technologies - https://earray.chem.agilent.com/earray/
Gasket slides Agilent Technologies G2534-60012 Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization
Thermostatic bath Julabo -
Hybridization Chamber Agilent Technologies G2534-60001
Microarray Hybridization Oven Agilent Technologies G2545A
Hybridization Oven Rotator Rack Agilent Technologies G2530-60029
Rotator Rack Conversion Rod Agilent Technologies G2530-60030
Staining kit Bio-Optica 10-2000 Slide-staining dish and Slide rack
Magnetic stirrer device AREX Heating Magnetic Stirrer F20540163 
Thermostatic Oven Thermo Scientific Heraeus - 6030
Agilent Microarray Scanner Agilent Technologies G2565CA
Scanner Carousel, 48-position Agilent Technologies G2505-60502
Slide Holders Agilent Technologies G2505-60525
Feature extraction software v11.5 Agilent Technologies - inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA
SIMCA + V13 Software Umetrics

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References

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आनुवंशिकी अंक 116 Metabolomics transcriptomics terroir चर्चा बहुभिन्नरूपी सांख्यिकीय विश्लेषण प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) अव्यक्त संरचनाओं के लिए द्विदिश orthogonal प्रक्षेपण विभेदक विश्लेषण (O2PLS-डीए) जैव रसायन
Terroir संकल्पना अंगूर बेरी Metabolomics और transcriptomics के माध्यम से व्याख्या
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Dal Santo, S., Commisso, M., D'Incà, E., Anesi, A., Stocchero, M., Zenoni, S., Ceoldo, S., Tornielli, G. B., Pezzotti, M., Guzzo, F. The Terroir Concept Interpreted through Grape Berry Metabolomics and Transcriptomics. J. Vis. Exp. (116), e54410, doi:10.3791/54410 (2016).

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