Summary
Den här artikeln beskriver tillämpningen av oriktade metabolomik, transkriptomik och multivariat statistisk analys till druv bär transkript och metaboliter i syfte att få insikt i terroir konceptet, det vill säga påverkan av miljön på bär kvalitetsegenskaper.
Abstract
Terroir avser en kombination av miljöfaktorer som påverkar egenskaperna hos grödor såsom vinranka (Vitis vinifera) enligt vissa livsmiljöer och förvaltningspraxis. Den här artikeln visar hur vissa terroir signaturer kan detekteras i bär Metabolome och transkriptom av grapevine sorten Corvina använder multivariat statistisk analys. Metoden kräver först en lämplig stickprovsplan. I denna fallstudie var en särskild klon av Corvina sort vald för att minimera genetiska skillnader, och prover samlades in från sju vingårdar som representerar tre olika makro zoner under tre olika växtsäsonger. En oriktade LC-MS metabolomik tillvägagångssätt rekommenderas på grund av dess höga känslighet, tillsammans med en effektiv databehandling med hjälp av MZmine programvara och en metabolit identifiering strategi baserad på fragmentering rädsanalys. Omfattande transkriptom analys kan åstadkommas med användning av mikromatriserinnehållande prober som täcker ~ 99% av alla förutsagda vinranka gener, vilket möjliggör samtidig analys av alla differentiellt uttryckta gener i samband med olika terroirs. Slutligen kan multivariat dataanalys baserad på projektionsmetoder användas för att övervinna den starka årgång-specifik effekt, vilket gör att metabolomik och transkriptomik data som skall integreras och analyseras i detalj för att identifiera informativa korrelationer.
Introduction
Storskalig dataanalys baserad på genomen, proteom och metabolom av växter ger oöverträffad inblick i beteendet hos komplexa system, såsom terroir egenskaperna hos vin som speglar samspelet mellan grapevine växter och deras miljö. Eftersom terroir av ett vin kan vara åtskilda även då identiska vinranka kloner odlas i olika vingårdar, är genomik analys av liten nytta eftersom klonala genomen är identiska. I stället är det nödvändigt att titta på korrelationer mellan genuttryck och metaboliska egenskaper bären, som bestämmer kvalitets drag av vin. Analysen av genexpression vid nivån för de transkriptom nytta av de likartade kemiska egenskaperna hos alla transkript, vilket underlättar kvantitativ analys genom att utnyttja universella egenskaper såsom hybridisering till immobiliserade prober på mikroarrayer. I motsats, universella analysmetoder proteomik ennd metabolomik är mer utmanande på grund av den enorma fysiska och kemiska olikhet enskilda proteiner och metaboliter. I fallet med metabolomik denna mångfald är ännu mer extrem eftersom enskilda metaboliter skiljer sig kraftigt i storlek, polaritet, överflöd och flyktighet, så ingen enskild utvinningsprocessen eller analysmetod erbjuder ett helhetsgrepp.
Bland de analytiska plattformar som lämpar sig för icke-flyktiga metaboliter, de som baseras på högupplösande vätskekromatografi kopplat till masspektrometri (HPLC-MS) är mycket känsligare än alternativ såsom HPLC med ultraviolett eller diodarraydetektorer (HPLC-UV, HPLC-DAD ) eller kärnmagnetisk resonans (NMR) -spektroskopi, men kvantitativ analys genom HPLC-MS kan påverkas av sådana fenomen som matriseffekt och jon undertryckande / förbättringen 1-3. Undersökningen av sådana effekter vid analys av Corvina vindruvor med HPLC-MS med hjälp av en elektro jonisering källa (HPLC-ESI-MS), visade att socker och andra molekyler med de lägsta retentionstiderna var starkt underreported, förmodligen också avspeglar det stora antalet molekyler i denna zon, och att det överflöd av andra molekyler kan underskattas, överskattade eller opåverkad av matriseffekt , men data normalisering för matriseffekt tycktes ha begränsad inverkan på den totala resultat 4,5. Den metod som beskrivs häri är optimerad för analys av medel polaritet metaboliter som ackumuleras vid höga nivåer i vindruvor under mognaden, och som avsevärt påverkas av jordmånen. De omfattar antocyaniner, flavonoler, flavan-3-oler, procyanidins, andra flavonoider, resveratrol, stilbener, hydroxikanelsyra syror och hydroxibensoesyrans syror, vilka tillsammans bestämmer färg, smak och hälsorelaterade egenskaper viner. Andra metaboliter, såsom sockerarter och alifatiska organiska syror, ignoreras eftersom kvantifiering genom HPLC-MS är otillförlitliga på grund av att matrisen effekt och jon undertryckande fenomen 5. Inom polariteten intervall som valts av denna metod är den metod oriktade i att det syftar till att upptäcka så många olika metaboliter som möjligt 6.
Transkriptomik metoder som gör tusentals vinranka transkript som skall övervakas samtidigt underlättas genom tillgängligheten av det kompletta vinranka genomsekvensen 7,8. Tidiga transkriptomik metoder baserade på hög genomströmning cDNA sekvense har utvecklats med tillkomsten av nästa generations sekvensering i en samling förfaranden kollektivt beskrivs som RNA-Seq teknik. Detta tillvägagångssätt har snabbt blivit den föredragna metoden för transkriptomik studier. Men en stor mängd litteratur baserad på microarray, som tillåter tusentals transkript som ska kvantifieras parallellt genom hybridisering, har samlat för vinrankor. I själva verket, innan RNA-Seq blev en mainstream-teknologi, hade många engagerade kommersiella microarray plattformar varitutvecklade tillåter vinranka transkriptom som skall inspekteras i detalj. Bland det stora utbudet av plattformar, endast två tillåtna genomet hela transkriptom analys 9. Den mest utvecklade array tillät hybridisering av upp till 12 oberoende prover på en enda enhet, vilket minskar kostnaderna för varje experiment. De 12 under arrayer var och en består 135.000 60-mer sonder representerande 29,549 Grapevine transkript. Denna enhet har använts i ett stort antal studier 10-24. Dessa två plattformar har nu upphört, men en ny anpassad microarray har nyligen utformats och representerar en senare utveckling eftersom det innehåller ett ännu större antal prober som representerar ytterligare nyupptäckta grapevine gener 25.
De stora försäljningsdatamängder som produceras av transkriptomik och metabolomik analys kräver lämpliga statistiska metoder för analys av data, inklusive multivariata metoder för att fastställa sambanden mellan annan forms från data. De mest använda multivariata metoder är de som är baserade på projektion, och dessa kan vara utan tillsyn, såsom principalkomponentanalys (PCA), eller övervakas, såsom dubbelriktad ortogonal projektion till latenta strukturer diskriminantanalys (O2PLS-DA) 26. Protokollet presenteras i denna artikel använder PCA för undersökande dataanalys och O2PLS-DA för att identifiera skillnader mellan grupper av prover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Välj lämpligt material och konstruera en provtagningsplan
- Börja experimentet genom att utveckla en lämplig stickprovsplan. Det finns ingen generell och universell metod så utvärdera varje plan på en bedömning från fall till fall. Se till att provtagningsplan anger provtagningsplatser, tider och exakt provtagningsmetoden. Se figur 1 för den provtagningsplan som används i denna studie.
OBS: I denna fallstudie var vindruvor från en enda klon (. Vitis vinifera cv Corvina, klon 48) samlas in från sju kommersiella vingårdar i tre olika makro zoner i provinsen Verona (Gardasjön, Valpolicella och Soave). De viktigaste funktionerna i varje vingård sammanfattas i tabell 1. Bär samlades under tre växtsäsonger (2006, 2007, och 2008) vid tre tidpunkter, motsvarande Veraison (uppkomsten av mognad), i mitten av mognad och mogna bär.- För var och en av anslutningarna (VINeyard / år / mognadsstadiet), skörd 30 kluster från olika positioner längs två vinstockar rader med randomiserade höjder och platser på anläggningen.
- Välj tre bär slumpmässigt från varje grupp, undvika de med synliga skador och / eller tecken på infektion.
- Upprepa steg 1.1.1 och 1.1.2 för att erhålla tre oberoende pooler.
- Deseed bären och frysa fruktväggen omedelbart i flytande kväve.
- Krossa 10 frysta bär från varje pool med en automatisk kvarn kvarn, och dela upp varje pulveriserad provet i två lika delar, en för transkriptomik analys och en för metabolomics analys.
- Lagra pulver vid -80 ° C.
| AM | BA | BM | CS | FA | MN | E.M | |
| Makro-zon | Soave | Gardasjön | Valpolicella | Gardasjön | Valpolicella | Valpolicella | Soave |
| Höjd (m) | 250 | 120 | 450 | 100 | 130 | 250 | 130 |
| rotstock | 41B | S04 | K5BB | 420A | 420A | K5BB | 41B |
| radriktning | EW | NS | EW | EW | EW | NS | NS |
| träningssystem | Overhead System (Pergola) | Overhead System (Pergola) | Vertikal Shoot Positionering (Guyot) | Overhead System (Pergola) | Overhead System (Pergola) | Vertikal Shoot Positionering (Guyot) | Vertikal Shoot Positionering (Guyot) |
| jordtyp | finkornig lera | Lerjord | Lera | Lerjord | Clay lerjord | silt loam | lera lerjord |
| Plantering layout (m) | 3,20 x 1,00 | 4,50 x 0,80 | 4,00 x 1,25 | 3,50 x 1,20 | 3,50 x 0,75 | 2,80 x 1,00 | 1,80 x 0,80 |
| Total kalk% | 3,9 | 19,3 | 18,3 | 14,4 | 31 | 5,9 | 27,9 |
| Aktiv kalk% | 0,5 | 2,6 | 9,4 | 6,3 | 11,3 | 3,1 | 8,3 |
| sand% | 15 | 47 | 66 | 42 | 29 | 13 | 36 |
| loam% | 43 | 36 | 21 | 37 | 39 | 67 | 36 |
| lera% | 42 | 17 | 13 | 21 | 32 | 20 | 28 |
| markens pH | 8,3 | 7,9 | 7,8 | 8,2 | 8,2 | 7,8 | 7,9 |
| Organisk substans (%) | 2,9 | 2,5 | 2,2 | 1,2 | 2,9 | 1,6 | 2,5 |
| Utbytbar fosfor (mg / kg) | 26 | 73 | 73 | 68 | 48 | 47 | 64 |
| Utbytbart kalium (mg / kg) | 190 | 376 | 620 230 | 168 | 154 | 126 | |
| Utbytbar magnesium (mg / kg) | 272 | 468 | 848 | 623 | 294 | 293 | 183 |
| Utbytbart kalcium (mg / kg) | 6500 | 5380 | 7358 | 6346 | 4652 | 10055 | 2878 |
| Berry Reducerande sockerarter 2006 | 211,25 ± 1,20 | 176,20 ± 0,42 | 187,40 ± 0,00 | 203,70 ± 1,13 | 212,55 ± 0,64 | 195,20 ± 0,00 | 211,65 ± 0,64 |
| Berry Reducerande sockerarter 2007 | 190,00 ± 1,27 | 165,25 ± 0,49 | 153,00 ± 0,42 | 203,60 ± 0,71 | 210,90 ± 0,71 | 192,25 ± 0,64 | 188,70 ± 1,84 |
| Berry Reducerande sockerarter 2008 | 191,35 ± 0,64 | 178,90 ± 0,57 | 170,05 ± 0,49 | 205,15 ± 1,48 | 188,70 ± 0,57 | 169,35 ± 0,49 | 108,05 ± 1,06 |
| Berry pH 2.006 | 3,01 ± 0,01 | 2,96 ± 0,01 | 2,84 ± 0,00 | 2,9 ± 0,00 | 2,98 ± 0,00 | 3,02 ± 0,00 | 3,06 ± 0,01 |
| Berry pH 2.007 | 2,97 ± 0,00 | 3,00 ± 0,00 | 2,74 ± 0,00 | 3,07 ± 0,01 | 2,98 ± 0,00 | 2,87 ± 0,01 | 3,09 ± 0,00 |
| Berry pH 2.008 | 2,83 ± 0,00 | 3,04 ± 0,01 | 2,71 ± 0,00 | 2,98 ± 0,01 2,98 ± 0,00 | 2,82 ± 0,00 | 3,11 ± 0,00 | |
| skörd Datum | 2006 | 2007 | 2008 | ||||
| veraison | 8-augusti | 18-JULI | 12 Aug | ||||
| mid Ripening | 4-september | 8-augusti | 2-september | ||||
| Mogen | 18-SEPTEMBER | 29-augusti | 23-SEPTEMBER |
Tabell 1: Viktigaste funktionerna i varje vingård ochprovsamling datum. m = meter, EW = Äter West, NS = nord-syd. 
Figur 1:. Schematisk bild av provtagningsförfarandet De tre vinproduktion makro zoner är belägna i närheten av staden Verona, Veneto, Italien. De tre tidpunkter är Veraison (V) representerar uppkomsten av mognad i vinodling, mitten mognar (MR) och mogna bär (R). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
2. Förbered Berry Powder Extrakt Analysera metaboliter och bearbeta data
- Förbered Berry Pulver prover för analys.
- Förbereda de metaboliska extrakt av berry prover vid rumstemperatur i tre volymer (vikt / volym) av metanol surgjordes med 0,1% (volym / volym) förmic syra i ett ultraljudsbad vid 40 kHz under 15 min. Använda LC-MS-grade vatten och myrsyra, och HPLC-kvalitet metanol.
- Centrifugera extrakten vid 16000 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Späd supernatanten från steg 2.1.2 i två volymer (volym / volym) avjoniserat vatten och passera genom en 0,2 | im filter.
- Analysera Berry Extrakt av HPLC-ESI-MS.
- Ställa in HPLC-ESI-MS-system i enlighet med leverantörens rekommendationer.
OBS: I denna fallstudie, inställnings omfattade en HPLC-system utrustat med en automatisk provtagare, som är ansluten i linje med en jonfälla-masspektrometer och elektrosprayjonisering källa. - Anslut HPLC-system med en C18 skyddskolonn (7,5 x 2,1 mm 2) och en omvänd fas C18-kolonn (150 x 2,1 mm 2, partikelstorlek 3 ^ m).
- Förbereda de lösningsmedel som används som den mobila fasen. Använda 5% (volym / volym) acetonitril, 0,5% (volym / volym) myrsyra i vatten som lösningsmedel A och 100% acetonitril som arolvent B. Användning LC-MS-grade acetonitril, vatten och myrsyra.
- Kör HPLC-separation med en linjär gradient av lösningsmedel A och B vid en konstant flödeshastighet av 0,2 ml min -1 användning av en provinjektionsvolym av 30 | il.
- Initialt jämvikta kolonnen med 100% lösningsmedel A. Efter provinjektion, etablera en gradient från 0% till 10% lösningsmedel B i 5 minuter, från 10% till 20% lösningsmedel B i 20 min, från 20% till 25% lösningsmedel B i 5 min, och från 25% till 70% lösningsmedel B i 15 min.
- Analysera varje prov i duplikat. Randomisera provanalys för att undvika instrumentstyrd effekter. Låt 20 minuter för återjämviktning med 100% lösningsmedel A mellan varje analys.
- Förvärva masspektra i alternativa negativa och positiva jonisering lägen. För de resultat som beskrivs i denna fallstudie, ställa in parametrarna som i tabell 2. Den exakta maskin inställningen beror på den specifika plattformen.
OBS: Du kan även använda andra kostymbara metoder enligt den specifika plattformen.- I alla fall, som med någon separation plattform, se till att använda en lämplig återjämviktstiden, för att få uppehållstid reproducerbarhet. När antalet prov är hög (över tio prov), analysera dem i omgångar av 9-10 prover med kromatografikolonn rengöringsprogram (långsamma gradienter mellan de två Elueringslösningarna) mellan varje sats. Att ha tillräckligt med uppehållstid reproducerbarhet, se till att den första kromatografiska analysen av varje sats är en tom analys (dvs. analys av lösningsmedlet).
- Även förvärva masspektra i fragmenterade negativa och positiva joner lägen inställning fragmenteringsalternativ (två ion prekursorer, MS 3). Kommentera metaboliter av fragmentering rädsanalys (MS / MS och MS 3) i enlighet med tillverkarens instruktioner.
OBS: Detta är särskilt lämplig för växtmetaboliter eftersom de ofta glykosylerade, theröre det första fragmentering (MS / MS) tenderar att avlägsna sockerdelarna som lämnar den fria aglykonen jon, och efterföljande fragmentering (MS 3) hjälper till att identifiera aglykonen mot en autentisk standard bibliotek. - Förvärva MS / MS och MS tre spektra i m / z intervall 50-1,500 med en fragmentering amplitud av en V. Alternativt kan du använda andra lämpliga metoder enligt den specifika plattformen.
- För varje m / z-signal, jämföra MS / MS och MS 3 fragmenteringsmönster och retentionstider för autentiskt standarder biblioteket enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Många typer av plattformar omfattar anläggningar programvara för att bygga denna typ av bibliotek genom analys av autentiska standarder. Detta bör identifiera många av de signaler, men inte alla signaler kommer att kommenteras. - För de återstående anonyma signaler, jämföra MS / MS och MS 3 fragmenteringsmönster med de som publicerats i litteraturen, searcHing för m / z-värden (dvs siffra "m / z 353" för att leta efter publikationer i vilka molekyler med sådan m / z nämns) med någon av de vanliga sökmotorn fritt tillgängliga, eller använda online databaser som MassBank (www .massbank.jp / sv / database.html) och Human Metabolome Database (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
- Ställa in HPLC-ESI-MS-system i enlighet med leverantörens rekommendationer.
| Masspektrometer komponenter | Fungera | parametrar |
| Elektrosprayjonisering Källa | dimmun Gas | 50 psi, 350 ° C |
| torkande gas | 10 L min -1 | |
| Jonfälla och detektor | Skanna | Full scanningsläge, 13.000 m / z per sekund, intervall 50-1,500 m / z |
| 400 m / z | ||
| kollision Gas | Helium | |
| vakuumtryck | 1,4 x 10 -5 mbar | |
| kapillär källa | 4000 V | |
| Ändplatta offset | -500 V | |
| Skimmer | -40 V | |
| Cap exit | -121 V | |
| 1 oktober DC | -12 V | |
| 2 oktober DC | -1,7 V | |
| linsen 1 | 5 V | |
| lins 2 | 60 V | |
| ICC för positiv jonisering läge | 20,000 | |
| ICC för negativ jonisering läge | 7000 |
Tabell 2: Huvudparameteruppsättning för att förvärva masspektra.
| Drift | Urval | Fungera | parametrar | värden |
| topp~~POS=TRUNC detektering~~POS=HEADCOMP | massdetektering | centroid | Ljudnivå | 3500 |
| Chromatogram builder | Högsta datapunkt | min tidsrymd | 0,15 | |
| min höjd | 4000 | |||
| m / z tolerans | 0,3 | |||
| topp~~POS=TRUNC detektering~~POS=HEADCOMP | topp avfaltning | Lokalt minimum sökning | kromatografisk tröskel | 70 |
| Sök minimum RT intervall (min) | 00:50 | |||
| Minsta relativ höjd | 15% | |||
| Minsta absoluta höjd | 4000 | |||
| Min förhållandet mellan topp topp / kant | 2 | |||
| Varaktighet intervall (min) | 0-10 | |||
| isotoper | Isotoptoppar grouper | - | m / z tolerans | 1,2 |
| RT tolerans | 00:50 | |||
| monoton form | Nej | |||
| maximal avgift | 3 | |||
| representativ isotop | Nej | |||
| Inriktning | Gå med aligner | - | m / z tolerans | 1,2 |
| Vikt för m / z | 10 | |||
| Retentionstid tolerans | 00:50 | |||
| Vikt för RT | 5 | |||
| Kräver samma laddningstillstånd Nej | ||||
| Kräver samma ID | Nej | |||
| Jämför isotopmönster | Nej | |||
| utfyllnad | topp finder | - | intensitet tolerans | 20% |
| m / z tolerans | 0,9 | |||
| Retentionstid tolerans | 00:40 | |||
| RT korrigering | Nej | |||
| filtrering | Duplicera Peak filter | - | m / z tolerans | 1,2 |
| RT tolerans | 00:30 | |||
| Kräver samma identifikation | Nej |
Tabell 3: Mzmine arbetsflöde med specifika värden för att bearbeta negativa LC-MS druva bär datafiler.
- Bearbeta LC-MS Data.
- tillgång ellerladda ner en databehandlings programpaket som kan extrahera relevant information från många råa kromatogram och bygga en datamatris där varje detekterad metabolit kvantifieras i varje prov.
OBS! Protokoll stegen nedan är skräddarsydda för öppen källkod MZmine v2.14 (http://mzmine.sourceforge.net). Det är en öppen källkod för masspektrometri databehandling, med tyngdpunkt på LC-MS-data. 27 - Omvandla kromatogram data LC-MS i netCDF format med hjälp av programvara som tillhandahålls av tillverkaren av utrustningen. För de resultat som beskrivs här använder Bruker Daltonics Esquire V5.2 och dataanalys V3.2 mjukvaror och utför steg enligt tillverkarens anvisningar.
OBS: Andra omvandlare kan användas (olika fri-ware omvandlare finns). - Importera .cdf filer i programvaran.
- Genomföra toppdetekterings, justering, utfyllnad och toppfiltreringsförfaranden med PARAMETers rapporteras i tabell 3.
- Som första steg, välj en importerad .cdf fil, sedan gå till visualisering → TIC / XIC Visualizer. Placera markören vid basen av den minsta toppen i kromatogrammet och ta anteckning om den minimala intensitetssignalen av basen jonen. Gå sedan till rådata metoder → Peak Detection.
- Välj Mass Detection och fylla signalnivån för att detektera individuella joner för varje skanning och skapa en jon lista.
OBS: Kontrollera algoritmen innan du utför mass upptäckt - det beror på masspektrometer. I vårt fall väljer vi Centroid. - Välj Kromatogram Builder och fyll med signalnivån för att ansluta datapunkter från jon listan och bygga ett kromatogram för varje massa värde. Se de parametrar som anges i masspektrometern anvisningen för att justera Min tidsperiod och m / z tolerans.
- Gå sedan till Peak List Metoder → Peak Detection → Kromatogram Deconvolution. Välja lämplig algoritm (i detta fall Local Minimum sökning) för att tillåta separation av varje kromatogram i individuella toppar.
- inspektera manuellt kromatogrammen att ta reda på lämpliga värden för följande parametrar. Ställ in Kromatografisk Threshold till 30% för att ta bort brus och Sök Minsta i RT Range till 2 (min) för att identifiera närvaron av minimilokalbefolkningen att diskriminera två toppar.
- Fastställa minimi relativ höjd på 2,0. inspektera manuellt kromatogrammet för att identifiera den minsta absoluta höjden av signal som motsvarar en topp och inte till bakgrunden; ange detta värde som absoluta höjden (till exempel, 10 tusen i den presenterade experimentet).
- Set Min Förhållande Peak Top / Edge till 1,1 att ange minimiförhållande mellan toppen och den lägsta datapunkt intensiteten hos en topp att bli erkänd som en sann topp.
- inspektera manuellt kromatogrammen att se vilken som är den minsta varaktigheten av de olika topparna i den använda Chromatographic förhållanden (t ex mellan 0,2 och 2 min, beroende på föreningen, i de presenterade experimenten), och därmed använda dessa värden som Peak Varaktighet Range (min) för att ställa in olika acceptabla topp längd som varaktighet.
- Gå sedan till Peak List Metoder → Isotoper → Isotop Peaks Grouper grupp isotoper i en topp, vanligtvis i den mest intensiva. Obs: Parametrarna beror på upplösningen av masspektrometer och reproducerbarhet retentionstiderna.
- Slutligen, gå till Peak listan metoder → Justering → Gå Aligner att anpassa toppar beroende på deras m / z och uppehållstid genom att använda en match värdering.
- Efter inriktning av toppar, fylla eventuella luckor i informationen genom att klicka på Peak List Metoder → utfyllnad → Peak Finder. Slutligen, filter duplicera datapunkter genom att klicka på Peak List Metoder → Filtrering → Duplicera Peak Filter.
- Exportera den resulterande datamängden som en .csv-fil.
- Manuellt ändra. Csv anknytning till en. Txt förlängning. Om inga filnamnstillägg är synliga, ändra datorns inställningar för att avslöja filnamnstillägg. Gå till File Explorer Val → Visa → Avancerade inställningar och avmarkera rutan "Dölj filnamnstillägg för kända filtyper".
- Importera .txt-filer i ett kalkylblad. Detta ger en datamatris där alla upptäckta metaboliter, som erkänns av ett identifikationsnummer, m / z-värde och uppehållstid, kvantifieras i samtliga prover i termer av deras toppvärden i området.
- tillgång ellerladda ner en databehandlings programpaket som kan extrahera relevant information från många råa kromatogram och bygga en datamatris där varje detekterad metabolit kvantifieras i varje prov.
3. Förbered Berry Powder Extrakt för transkriptom analys och processdata
- Utdrag Totalt RNA från Berry Prov och Bestäm RNA kvalitet.
- Utdrag totala RNA från berry prover.
OBS: I denna fallstudie, en patentskyddad kit och en modifierad procedur som säkerställer fullständigt avlägsnande av molekyler som interfere med RNA-analys, såsom polysackarider och polyfenoler, användes. Instruktionerna nedan är specifika för denna sats 18.- Väg 400 mg bär pulver för varje prov, dela den i två delar och placera 200 mg vardera i två mikrofugrör.
- Lägg 900 ul av lys lösning innehållande β-merkaptoetanol (tillhandahållet i kitet) till varje 200 mg pulver och virvla omedelbart och kraftfullt under minst 30 sekunder. Provet uppvärms vid 56 ° C under 5 min skakning vid 800 rpm.
- Centrifugera proverna vid maximal hastighet i en bordsmikrocentrifug under 10 min för att pelletera cellrester.
- Pipett 700 ul av supernatanten i filtreringskolonn i kitet (blå låsringen) sitter i en 2 ml provrör. Stäng locket och centrifugera vid maximal hastighet i en bords mikrofug under 1 min för att avlägsna kvarvarande skräp. Upprepa detta steg två gånger med samma filtreringskolonn men ett nytt provrör, vilket resulterar i tre tubes vardera innehållande ~ 700 | il av det klarnade lysatet.
- Pipett 750 pl bindningslösning (medföljer i satsen) i varje rör av klarnat lysat och blanda omedelbart genom att pipettera upp och ned minst fem gånger. Överför 700 | il av denna blandning till bindande kolumnen ingår i kitet (röd hållarringen) sitter i en 2 ml provrör. Stäng locket och centrifugera vid maximal hastighet i en bordsmikrocentrifug under 1 min för att binda RNA.
- Häll av genomströmningsfraktionen, vänd uppsamlingsröret och knacka på det kort på en ren dyna av absorberande papper för att tömma kvarvarande vätska.
- Återgå kolumnen till uppsamlingsröret och pipettera den återstående blandningen i samma kolumn och upprepa centrifugering och dekantering steg. Upprepa tills hela blandningen har filtrerats i samma röda bindande kolonn.
- Följ nu de återstående anvisningarna i satsen och eluera RNA i 50 pl elueringsbuffert (medföljer i satsen) och lagra it vid -80 ° C redo för kvalitetskontrollsteg.
- Bestämma kvantiteten och renheten hos RNA med användning av en spektrofotometer. Spela absorbansvärdena förhållanden som avslöjar graden av förorening med proteiner (A 260/280) och polyfenoler / polysackarider (A 260/230).
OBS: RNA lämplig för microarray-hybridisering ska uppnå minst 1,8 för båda förhållanden. - Bestämma integriteten av RNA.
OBS: Olika system kan användas. En digital förvärvare som utför en kapillär elektro körning i kombination med ett fluorescerande färgämne användes i denna fallstudie. RNA lämpligt för microarray-hybridisering bör ha en RNA Integrity Number (RIN) av minst 8.
- Utdrag totala RNA från berry prover.
- Förbered Prov och hybridisera RNA till en anpassad microarray.
- Ställ utgångsbeloppet för totalt RNA för microarray analys till 200 ng genom att späda RNA-lösningen som erhållits i steg 3.1.1.8 med avjoniserat RNas-fritt vatten. Lägg tilllämplig mängd RNA till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör i en slutlig volym av 1,5 | j, l.
- Tillsätt 2 l utspätt spik mix till varje RNA-prov och följa tillverkarens instruktioner för att syntetisera första sträng cDNA, transkribera detta till cRNA och märka cRNA med cyanin 3CTP.
- Rena den märkta cRNA enligt tillverkarens instruktioner och eluera i 30 | j, l RNas-fritt vatten.
- Bestäm utbytet och den specifika aktiviteten för varje cRNA genom att spela in tre värden på en spektrofotometer: cyanin 3 färgkoncentration (pmol il -1), RNA renhet (A 260/280) och cRNA koncentrations (ng l -1). Använd formlerna som finns i tillverkarens bruksanvisning för att beräkna cRNA avkastning (ig) och den specifika aktiviteten (pmol Cy3 per mikrogram cRNA).
OBS: Rekommenderade avkastning och specifika aktiviteter skiljer sig på grundval av den specifika microarray format. I denna fallstudie var en fyra-pack 44K-formatväljs, den rekommenderade utbytet var 1,65 och den specifika aktiviteten var 9. - Utforma anpassade microarray med hjälp av lämplig programvara för sonddesign.
- För de resultat som beskrivs i denna fallstudie, förbereda en ny anpassad microarray, utformas på 4-pack 44K format genom att använda en webbaserad applikation för anpassade microarray mönster och oligonukleotid bibliotek. Design sönder för att matcha 34,651 mål transkript, inklusive 29.971 förutspådde transkript från Pinot noir V1 array, 4500 nya loci som identifierats i Pinot sorten av Corvina transkriptom återuppbyggnad och 180 privata Corvina gener 25.
OBS: Detta innebar produktionen av 34,651 specifika 60-mer-sonder, som omfattar 29.798 Pinot noir förutspått transkript, 4392 nya Pinot loci och 179 Corvina privata gener.
- För de resultat som beskrivs i denna fallstudie, förbereda en ny anpassad microarray, utformas på 4-pack 44K format genom att använda en webbaserad applikation för anpassade microarray mönster och oligonukleotid bibliotek. Design sönder för att matcha 34,651 mål transkript, inklusive 29.971 förutspådde transkript från Pinot noir V1 array, 4500 nya loci som identifierats i Pinot sorten av Corvina transkriptom återuppbyggnad och 180 privata Corvina gener 25.
- Förbered hybridisering enheten baserat på 4-pack formatspecifikationer enligt följande.
- Placera 1,65 pg av Cy3-märkt cRNA i en slutlig volym av 41,8il avjoniserat RNas-fritt vatten. Lägg 11 pl 10x Blockering Agent och 2,2 l 25x Fragmentering buffert. Inkubera vid 60 ° C under 30 min i en termostatiskt bad för att fragmentera RNA. Omedelbart svalna på is under 1 min.
- Slutligen, tillsätt 55 pl 2x hybridiseringsbuffert, blanda väl genom att pipettera och snurra i 1 minut vid 15.500 xg vid rumstemperatur. Omgående placera mikrocentrifugrör på is. Använd omedelbart, inte lagra den.
- Ladda anpassade microarray enligt följande.
- Ladda en packning glida med etiketten uppåt i botten av en hybridisering kammare. Långsamt ladda 100 pl hybridisering prov erhållna i steg 3.2.6.2 på varje packning väl, dispensering av vätskan med spetsen av pipetten, undvika bubblor.
- Sakta placera anpassade microarray nedåt och se till att den numeriska streckkoden är vänd uppåt. Kontrollera att sandwichparet är korrekt inriktad. Slutligen lägger locket hybridiseringskammaren på inklämtdiabilder och dra åt klämman på kammaren. Vrid den sammansatta kammaren för att bedöma rörlighet bubblor.
- Placera monterade glidkammaren på ett spett i en hybridisering ugn inställd till 65 ° C. Ställa in rotatorn att rotera med 10 varv per minut. Tillåta hybridisering fortskrida under 17 h.
- Fortsätt med microarray bild tvätt enligt följande.
- Först förbereder tre slide-färgning rätter och fylla dem med lämpliga tvättbuffertar: 2 rätter med tvättbuffert 1 vid RT och en maträtt med förvärmd (37 ° C) tvättbuffert 2.
- Isär hybridisering kammaren och avlägsna smörgås. Med microarray bild numeriska streckkoden uppåt, dränka smörgåsen i den första glidfärgskål fylld med tvättbuffert 1 vid RT, och med hjälp av rena pincett, separera packningen från microarray bild. Snabbt överföra microarray bild i en bild rack och placera den i den andra glidfärgskål fylld med tvättbuffert 1vid RT.
- Sätt skjutfärgskål på en magnetisk omrörare och tvätta 1 minut med måttlig omrörning. Snabbt överföra bilden rack i den tredje glid färgning skål fylld med förvärmd (37 ° C) tvättbuffert 2 och tvätta 1 minut med måttlig omrörning.
- Sakta avlägsna stället från glid färgning skålen och försiktigt bort bilden från rack, undvika droppar.
OBS: Lägg inte till Triton X-102 till tvättbuffertar och utelämna acetonitril tvättsteg.
- Lagra den tvättade chip i mörker vid rumstemperatur.
- Skanna microarray och extrahera de framträdande dragen.
- Placera microarray bild i en lämplig scanner och scanna varje uppsättning med hjälp av parameterinställningar som rekommenderas i microarray tillverkarens bruksanvisning. För de resultat som beskrivs här, placera varje microarray bild i en objektglashållare för att underlätta skanningsförfarandet.
- Importera utsignalen .shpfilen i en lämplig programvara som kan konvertera en digital signal till numeriska fluorescerande värden. Kontrollera kvaliteten kontrollrapporten för att säkerställa att hybridisering förfarandet var framgångsrik.
- För de resultat som beskrivs här använder parameterinställningar som rekommenderas i bruksanvisningen för feature extraction programvara och kontrollera kvaliteten kontrollrapporten för att säkerställa att de parametrar som anges i tabell 4 är inom det normala intervallet ges av tillverkaren.
| metrisk Namn | Övre gräns | Lägre gräns | Beskrivning |
| AnyColorPrcntFeatNonUnif | 1,00 | NA | Andel av funktioner som är funktions olikformighet extremvärden i antingen kanal |
| DetectionLimit | 2,00 | 0,10 | Genomsnittlig plus en standardavvikelse av spik ins nedanför den linjära koncentrationsintervall |
| absGE1E1aSlope | 1,20 | 0,90 | Absolut lutnings passform för Signal vs. Koncentration av E1a- sonder |
| MedCVProcSignal | 8,00 | NA | Median% CV för den behandlade signalen |
| gNegCtrlAveBGSubSig | 5,00 | -10,00 | Genomsnitt av bakgrunds subtraherade signalen av alla inlier negativa kontroller (BGSubSignal beräknas genom att subtrahera ett värde som kallas BGUsed från funktionen innebär signal) |
| gNegCtrlAveNetSig | 40,00 | NA | Genomsnitt av nettosignalen av alla inlier negativa kontroller |
| gNegCtrlSDevBGSubSig | 10,00 | NA | Standardavvikelsen förbakgrund subtraheras signalerna hos alla inlier negativa kontroller |
| gNonCntrlMedCVProcSignal | 8,00 | NA | Median% CV för den behandlade signalen av icke-kontrollsonder |
| gSpatialDetrendRMSFilter | 15,00 | NA | Kvarvarande bakgrund detrending passform |
Tabell 4: De viktigaste parametrar som ska kontrolleras för att kontrollera kvaliteten på microarray-hybridisering.
- Bearbeta Microarray Data.
- När alla microarray slides har skannats och kvalitetskontroll har bedömts positivt, förbereda en tabbavgränsad datamatris genom att välja gProcessedSignal värdena från varje enda undergrupp resultatet fil, som representerar de råa fluorescensintensitet för varje sond.
- I ett kalkylblad, normalisera data för 75: e percentilen inom varje grupp (P-värden) och calculåt medelvärdet av alla de P-värden bland alla olika underarrangemang för att beräkna R-förhållandet.
- Sedan, på samma kalkylblad, normalisera varje gProcessedSignal värde anger förhållandet R för sin egen sub-array.
4. Genomför detaljerad statistisk analys av de Metabolomics och transkriptomik Data
- Förbered Statistical Analysis Software.
OBS: I denna fallstudie, en programvara kan utföra PCA var PLS-DA och O2PLS-DA används.- Importera metabolomik och transkriptomik data. Gå till Arkiv → Ny Regelbunden Projekt → Ny återkommande projekt för att importera datamatrisen som erhållits med MZmine programvara. Klicka sedan på Redigera → Införliva hela matrisen → Hem och tilldela lämpliga primära och sekundära ID → Finish.
- Menar centrera data och skala dem med Pareto skala. Hem fönster, gå till Redigera → M1 och ändra lämplig Paramegor beroende data. För de resultat som beskrivs här, ändra skalan från enhetsvariansen till Par.
- Skala transkriptomik data med hjälp av inställningen enhetsvariansen.
- Genomför Multivariate Statistical Analysis.
- Implementera PCA som visas i F igure 2. I denna fallstudie, PCA avslöjar de viktigaste skillnaderna mellan prover, vilket speglar de olika mognadsstadier och växtsäsonger.
- I Workset fönstret väljer PCA-X som modelltyp. Tryck på Auto-avpassning. Var uppmärksam på R2X (cum) och Q2 (cum) värden som de ger en uppfattning om kvaliteten på modellen.
OBS: I allmänhet kan ju högre värden desto bättre modell, men modeller med mycket hög R2X (cum) över passar data. Som empirisk regel slutar vi att lägga huvudkomponenter när Q2 (cum) värde börjar sjunka. - Välj sedan Scores → Scatter att se tomten som visar möjliga gruppering av proverna.
- Inspektera PCABetyg Plot. Om en bra modell erhålls (Q2cum> 0,5), använder samma klasser av prover för att bygga en O2PLS-DA-modellen (steg 4.2.2).
- I Workset fönstret väljer PCA-X som modelltyp. Tryck på Auto-avpassning. Var uppmärksam på R2X (cum) och Q2 (cum) värden som de ger en uppfattning om kvaliteten på modellen.
- Bygga två O2PLS-DA modeller med hjälp av prover som klassificerats av makro zon och validera modeller med hjälp av en permutation test med 200 permutationer.
- Tilldela klasser genom att gå till Hem fönster → Nytt Som → M1 → observationer. Ställ in önskade klasser. Sedan ändrar Model Type från PCA-X O2PLS-DA. Tryck på Auto-avpassning. Se till att antalet komponenter i PLS-DA-modellen är densamma som den för den O2PLS-DA.
- Att validera O2PLS-DA-modellen går att analysera CV-ANOVA och se rätt p-värde. Dessutom, klicka på Ny som i hemmet fönster → M2 och ändra typ av modell från O2PLS-DA till PLS-DA. Tryck på Auto-avpassning.
- Gå Analysera → permutationer och utföra 200 permutationer (de-select Räkna Permutations tillval).
Obs: Den slutliga utgång visar ett fönster där R2 värdet should slog generellt Y-axeln i värden under 0,4, under det att Q2 bör slå den negativa delen av Y-axeln. Om R2 och / eller Q2 värden är felaktiga, reducera antalet komponenter både i PLS-DA och O2PLS-DA-modeller. - Fortsätt att välja M2 i projektfönstret och klicka på Scores → Scatter att se tomten och läget för provklasser. Att observera vad metaboliter karakterisera en eller flera särskilda klasser, gå att rita / lista → Scatter.
- Ändra Välj datatyp observationer och belastningar → Lägg serien och ändra objektet i X-axel och Serie i pq (korr) och Pred Comp i 1 och antingen 2 eller ytterligare komponenter när de är närvarande, respektive.
- Med musens högra knapp trycks på tomten, gå till Property → Färg och välj med termer för att skilja tomten symboler bland molekyler och klasser. Gå till Layout → Format Plot → Axis och / eller stilar att ändra tomt med de önskade egenskaperna.
<li> Baserat på resultaten av metabolomik O2PLS-DA analys, nuvarande skillnader i de relativa nivåerna av specifika metaboliter eller klasser av metaboliter som histogram.
- Implementera PCA som visas i F igure 2. I denna fallstudie, PCA avslöjar de viktigaste skillnaderna mellan prover, vilket speglar de olika mognadsstadier och växtsäsonger.
- Baserat på resultaten av den transkriptomik O2PLS-DA-analys, hämta och tilldela differentiellt modulerade gener till Gene Ontology (GO) klassificeringar 28.
- Identifiera relationer mellan metabolitnivåer och genuttryck manuellt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fallstudien som beskrivs i den här artikeln gav en slutlig datamatris som innefattar 552 signaler (m / z funktioner) inklusive molekylära joner plus deras isotoper, addukter och några fragment, relativt kvantifierade bland 189 prover (7 vingårdar x 3 ripening scener x 3 säsonger x 3 biologiska replikat). Det totala antalet för datapunkter var därför 104.328. Fragmentering rädsanalys resulterade i kommentaren av 282 m / z funktioner, motsvarande metaboliter plus addukter, isotoper och fragment. Explorativ analys av hela datamatrisen genom PCA visade att prover klustrade enligt mognadssteget (Veraison, i mitten av mogning och mogen) längs de första och andra huvudkomponenter (T1-T2, fig 2A), och i enlighet med odlingssäsongen längs den tredje huvudsakliga komponenten (t1-t3, figur 2B).
src = "/ filer / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg" />
Figur 2:. PCA hela metabolomik datamatris Oövervakad PCA-X poäng scatter tomter visar klustring av grapevine prover som samlats in under tre olika växtsäsonger (2006, 2007, och 2008) och mognadsstadier (Veraison, mitten mognar och mogna bär ). I det första området (A) proverna klustrade enligt mognadsstadier, medan i det andra (B) klustrade de enligt växtsäsongen. Färgerna markerar mognadsstadier som grönt (Veraison), rosa (mid-mognad) och lila (mogna bär). Symbolerna representerar växtsäsonger: cirklar (2006), torg (2007) och trianglar (2008) .Component T1: Q2: 0,34; R2X: 0,331; Q2cum: 0,304; Komponent t2: Q2: 0,185; R2X: 0,155; Q2cum: 0,433; Komponent T3: Q2: 0,145; R2X: 0,0924; Q2cum: 0,515.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den okontrollerade PCA kunde inte avslöja specifika terroir funktioner, som är dolda under rådande vintage effekter, så en övervakad O2PLS-DA strategi applicerades på två separata dataset, det vill säga, bär på Veraison och fullt mogna bär. Detta möjliggör utforskandet av metaboliska skillnader representerar de tre makro zoner (Gardasjön, Valpolicella och Soave) i två viktiga skeden av mognad, för att identifiera specifika terroir signaturer som representerar dessa zoner vid dessa mognadsstadier.
Figur 3: O2PLS-DA för veraison och mogna vindruvor. O2PLS-DA poäng scatter tomter visar klustring av grapevine prov som tagits vid Gardasjön ( blå), Soave (grön) och Valpolicella (rosa) makro zoner vid Veraison (A) och när bären var mogen (B). Metaboliterna som ansvarar för klustring observerats i (A) och (B) är synliga i korrelationslastnings tomter (C) och (D) respektive. Grupper av metaboliter, företräddes av trianglar, är blå för resveratrol och stilbener, rosa för antocyaniner, grönt för hydroxikanelsyra och hydroxibensoesyrans syror, lila för flavan-3-oler / procyanidins och gult för andra flavonoider. A: komponent P1: Q2: 0,278; R2X: 0,0529; Q2cum: 0,278; komponent P2: Q2: 0,33; R2X: 0,0394; Q2cum: 0,608. B: komponent P1: Q2: 0,353; R2X: 0,0639; Q2cum: 0,353; komponent P2: Q2: 0,188; R2X: 0,0374; Q2cum. 0,541 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Fördelning av metabola markörer bland de tre makro zoner:. Gardasjön, Soave och Valpolicella metabolitnivåer återspeglar medelvärdet ± standardfel (n = 18 för Garda och Soave, 27 för Valpolicella makro zon) av olika glykosylerade och acylerade antocyaniner, resveratrol / stilbener och flavonoider i mogna Corvina bär i de tre olika växtsäsonger (2006, 2007 och 2008). Olika Bokstäverna representerar grupper som var signifikant annorlunda bestäms av en t-test (p <0,05). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
De specifika underskrifter de sju enskilda vingårdar identifierades med hjälp av en speciellized statistisk metod 10. Två O2PLS-DA modeller byggdes, en utforska skillnaderna mellan bären odlas i de tre makrozoner Veraison och andra undersöka skillnaderna i de tre makro zoner bland mogna bär. Modellerna var kors validerats med en permutation test (200 permutationer) visar att modellen beskriver de mogna bären över de tre makro zoner var giltig, medan endast Gardasjön proverna skiljer sig från de andra proverna vid Veraison (ej visad).
Poängen tomter av de två modellerna, som visar hur proverna från de tre makro zoner på Veraison och mognad separeras enligt fördelningen av metaboliter, visas i figurerna 3A och 3B. Last tomter av dessa modell uttryckt som pq (korr), det vill säga sambandet mellan p (klassen av prover) och q (metaboliter), visas i figurs 3C och 3D. I lastnings tomter, röda kvadrater representerar den klass av prover (makro zoner) och de färgade trianglarna representerar de individuella metaboliter. Avståndet mellan metaboliter och proverna återspeglar deras relationer. Metaboliterna är färgkodade enligt deras kemisk klass.
Med tanke på den låga statistiska giltigheten av Veraison modellen som visas genom permutation test är det sannolikt att drabbas av overfitting. Därför följande iakttagelser hänvisar enbart till de mogna bär prover, vars modell var statistiskt giltigt. I last tomt som visas i figur 3D, är stilbener förskjuts mot Gardasjön makroområdet, medan flavonoider skiftas mot Soave och Valpolicella makro zoner. En närmare titt på individuella metaboliter visar den asymmetriska fördelningen av antocyaniner, med peonidin och dess derivat vanligare i Lake Garda makroområdet och andra antocyaniner vanligare i Valpolicella makro zon (Figur 4). Enkel antocyanin-3-O-glukosider är vanligare i Valpolicella makro zon medan acylerade och coumarated derivat är vanligare i Soave makroområdet.
Den transkriptomik del av denna fallstudie var ursprungligen med hjälp av en transkriptomik plattform som inte längre stöds. Som en följd har vi inrättat ett alternativt förfarande, med fortfarande tillgängliga plattform; den nya plattformen innehåller flera sönder än den gamla, inklusive 249 mer Pinot noir förutspått transkript, 4392 nyligen identifierade Pinot loci och 179 Corvina privata gener 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den här artikeln beskriver de metabolomik, transkriptomik och protokoll statistisk analys som används för att tolka druv bär terroir konceptet. Metabolomics analys genom HPLC-ESI-MS är tillräckligt känslig för att detektera ett stort antal metaboliter samtidigt, men relativ kvantifiering påverkas av matriseffekt och jon undertryckande / förbättringen. Emellertid har ett liknande tillvägagångssätt som redan använts för att beskriva mognad och efter skörd förtvining av Corvina bär, och korrigering av matriseffekter haft en begränsad inverkan på resultatet 5. Dessutom en ny storskalig flera instrument mellan laboratoriestudie för att bestämma den jämförande robustheten i NMR och LC-MS för oriktade metabolomik med samma prover visade att de olika instrumenten och teknikerna gav konsekventa resultat 6. Fallstudien som beskrivs häri involverade insamling och analys av prover vid tre mognadsstadier från sju vingårdar i tre makro zsådana över tre växtsäsonger. Häri var terroir signaturen undersöktes på makroområdet nivå (Gardasjön och Soave, varje representeras av två vingårdar, och Valpolicella, representeras av tre vingårdar) med hjälp av PCA och O2PLS-DA multivariat statistik. Skillnaderna mellan de enskilda vingårdar är mer subtil och kräver mer sofistikerade och känsliga statistiska metoder 10. Olika stegen i de föreslagna protokollen är kritiska och måste övervägas för att framgångsrikt svara på biologiska frågor om terroir påverkan på druvornas kvalitet.
Först av allt, är det lämpligaste provtagningsplan kritisk: valet av en särskild klon för att minimera de genetiska skillnaderna och flera år långa provtagnings gör det möjligt att lyfta fram de verkliga, ljud skillnader mellan de olika terroir. Å andra sidan var den föreslagna forskningen utförs inom en terroir som är särskilt lämplig för vinodling, och detta kan miniMize terroiren skillnader på druvornas kvalitet. Således skulle det vara mycket intressant att jämföra samma sort som odlas i en mindre optimal zon, men självklart skulle dessa vingårdar helt enkelt inte vara tillgänglig.
Ur teknisk synvinkel är en mycket reproducerbar metabolit separation genom HPLC kritisk för att uppnå god datamatris, eftersom högre skillnaderna i uppehållstid i de olika analyserna, desto högre antal misstag i topp linje i den slutliga datauppsättningen. Således är det av avgörande betydelse att fastställa en lämplig återjämvikts tid att dela proverna i satser av 9-10 prover med cykler av kromatografikolonn rengöring mellan dem och att använda blankprov som det första provet i varje sats. LC-MS påverkas av en viss grad av instabilitet, vilket kan resultera i skillnader mellan prover som är instrumentstyrd. Detta problem kan delvis lösas genom randomisering av provanalys, såsom visas i detta dokument. en imbättring av metoden är användningen av lämpliga kvalitetskontrollprover i varje sats, som kan informera på plattformen tillstånd. En lämplig standard förening mix (dvs standardföreningar med m / z-värden och retentionstider som spänner över hela m / z och uppehållstid intervall) och en ny kontrollprov som erhållits genom att blanda lika delar av pulver från samtliga prover kan informera om plattform effekter och även så småningom användas för a-posteriori uppgifter normalisering.
En annan viktig punkt för att jämföra metabolomik och transkriptomik resultat var att använda exakt samma material (dvs samma krossade prover) för båda analyserna. I dataanalysen, är det viktigt att använda ett lämpligt statistik metod, såsom OPLS-DA, som gör det lätt att tolka skillnaderna i fråga om genuttryck och metabolit ackumulering med avseende på metoder som PCA. En av de stora begränsningarna med denna typ av tillvägagångssätt är denavsaknad av starka metoder för transkriptomik och metabolomik dataintegration. Utvecklingen av lämpliga metoder för olika typer av data korrelationen är nödvändigt för att bygga upp en stark och tillförlitlig korrelation mellan transkriptomik och metabolomik data.
De tekniker som beskrivs i den här artikeln avslöjade tydligt mognaden och vintage effekter på bär Metabolome, men specifika kemiska signaturer som representerar de tre makro zoner identifierades också i mogna bär nedanför den rådande tappning verkställer. Intressant nog analysen av Veraison bär inte att ge en statistiskt giltig modell, vilket indikerar att terroir konceptet huvudsakligen manifesteras av metaboliterna som ackumuleras under mognaden (t.ex. antocyaniner och stilbener) än de som redan finns i de omogna bär.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | - | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In - One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | - | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | - | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus - 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | - | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
