Summary
En este artículo se describe la aplicación de la metabolómica no focalizados, transcriptómica y análisis estadístico multivariado para transcripciones de bayas de uva y metabolitos con el fin de profundizar en el concepto de terroir, es decir, el impacto del medio ambiente sobre los rasgos de calidad de las bayas.
Abstract
Terroir se refiere a la combinación de factores ambientales que afectan a las características de los cultivos como la vid (Vitis vinifera) de acuerdo con hábitats particulares y prácticas de gestión. Este artículo muestra cómo ciertas firmas de terroir se pueden detectar en el metaboloma de bayas y transcriptoma de la Corvina vid cv utilizando el análisis estadístico multivariado. El método requiere en primer lugar un plan de muestreo apropiado. En este caso de estudio, se seleccionó un clon específico del cultivar Corvina para minimizar las diferencias genéticas, y las muestras se obtuvieron de siete viñedos que representan las tres macro zonas diferentes durante tres temporadas de cultivo diferentes. Un enfoque metabolómica LC-MS no directo se recomienda debido a su alta sensibilidad, acompañado de procesamiento de datos eficiente utilizando software MZmine y una estrategia de identificación de metabolitos basado en análisis de árbol de fragmentación. Análisis completo transcriptoma se puede lograr utilizando microarrayssondas que contienen cubriendo ~ 99% de todos los genes de vid predichos, lo que permite el análisis simultáneo de todos los genes expresados diferencialmente en el contexto de diferentes terroirs. Por último, el análisis de datos multivariados basado en métodos de proyección se puede usar para superar el efecto fuerte-vendimia específica, permitiendo que los metabolómica y datos transcriptómica a integrarse y se analizaron en detalle para identificar correlaciones informativos.
Introduction
análisis de datos a gran escala basado en los genomas, proteomas y transcriptomes, metabolomes de plantas ofrece una visión sin precedentes en el comportamiento de los sistemas complejos, tales como las características de terroir del vino, que reflejan las interacciones entre plantas de vid y su entorno. Debido a que el terroir de un vino puede ser distinto, incluso cuando los clones de vid idénticas se cultivan en diferentes viñedos, el análisis de la genómica es de poca utilidad debido a que los genomas clonados son idénticos. En cambio, es necesario tener en cuenta las correlaciones entre la expresión génica y las propiedades metabólicas de las bayas, que determinan las características de calidad de vino. El análisis de la expresión génica a nivel de los beneficios del transcriptoma de las propiedades químicas similares de todas las transcripciones, lo que facilita el análisis cuantitativo mediante la explotación de características universales tales como la hibridación con sondas inmovilizadas en microarrays. En contraste, los métodos analíticos universales en la proteómica unand metabolómica son más difíciles debido a la enorme diversidad física y química de las proteínas y los metabolitos individuales. En el caso de la metabolómica esta diversidad es aún más extrema porque metabolitos individuales difieren enormemente en tamaño, polaridad, la abundancia y la volatilidad, así que no hay proceso de extracción simple o método de análisis ofrece un enfoque holístico.
Entre las plataformas de análisis adecuado para metabolitos no volátiles, los basados en cromatografía líquida de alto rendimiento acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS) son mucho más sensibles que otras alternativas tales como HPLC con rayos ultravioletas o de diodos detectores de matriz (HPLC-UV, HPLC-DAD ) o espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), pero el análisis cuantitativo por HPLC-MS puede ser influenciada por fenómenos tales como el efecto de la matriz y la supresión de iones / mejora 1-3. La investigación de tales efectos durante el análisis de bayas de uva Corvina por HPLC-MS usando una fuente de ionización por electropulverización (HPLC-ESI-MS), mostró que los azúcares y otras moléculas con los tiempos más bajos de retención fueron fuertemente subregistro, probablemente también refleja el gran número de moléculas en esta zona, y que la abundancia de otras moléculas se puede subestimar, sobrestimado o no afectado por el efecto de la matriz , pero la normalización de datos para el efecto de la matriz parecía tener un impacto limitado en el resultado global de 4,5. El método descrito en este documento se optimiza para el análisis de metabolitos a medio de polaridad que se acumulan en altos niveles en las bayas de uva durante la maduración, y que se ven afectados significativamente por el terroir. Ellos incluyen antocianinas, flavonoles, flavan-3-oles, procianidinas, otros flavonoides, resveratrol, estilbenos, ácido hidroxicinámico y ácidos hidroxibenzoico, que en conjunto determinan el color, el sabor y las propiedades relacionadas con la salud de los vinos. Otros metabolitos, tales como azúcares y ácidos orgánicos alifáticos, son ignorados debido a la cuantificación por HPLC-MS es poco fiable debido a la matriz efect y la supresión de iones fenómenos 5. Dentro de la gama de polaridad seleccionado por este método, el enfoque es no directo en que tiene por objeto detectar como muchos metabolitos diferentes como sea posible 6.
Transcriptómica métodos que permiten a miles de transcripciones de vid para controlar de forma simultánea se ven facilitadas por la disponibilidad de la secuencia completa del genoma de la vid 7,8. métodos transcriptómica temprana basada en la secuencia de ADNc de alto rendimiento se han desarrollado con el advenimiento de la secuenciación de próxima generación en una colección de procedimientos que se describen colectivamente como tecnología de RNA-Seq. Este enfoque se está convirtiendo rápidamente en el método de elección para estudios de transcriptómica. Sin embargo, una gran cantidad de literatura sobre la base de microarray, que permiten a miles de transcripciones para ser cuantificados en paralelo por la hibridación, se ha acumulado para la vid. De hecho, antes de RNA-Seq se convirtió en una tecnología dominante, muchas plataformas de microarrays comerciales dedicados habían sidodesarrollado permitiendo transcriptoma de la vid a inspeccionar con gran detalle. Entre la gran variedad de plataformas, sólo dos, efectuar análisis de transcriptoma en todo el genoma 9. La matriz más evolucionado permitió la hibridación de hasta 12 muestras independientes en un solo dispositivo, lo que reduce los costes de cada experimento. Los 12 sub-series compuestas cada 135.000 sondas 60-mer que representan 29.549 transcripciones de vid. Este dispositivo ha sido utilizado en un gran número de estudios 10-24. Estas dos plataformas se han interrumpido, sino una nueva costumbre de microarrays se ha diseñado recientemente y representa un desarrollo más reciente, ya que contiene un número aún mayor de las sondas que representan los genes recién descubiertos vid adicionales 25.
Los conjuntos de datos de gran venta producidas por la transcriptómica y metabolómica análisis requieren métodos estadísticos adecuados para el análisis de datos, incluyendo las técnicas multivariantes para determinar las correlaciones entre la forma diferentes de datos. Las técnicas multivariantes más utilizados son los basados en la proyección, y estos pueden ser sin supervisión, tales como el análisis de componentes principales (PCA), o supervisado, como la proyección ortogonal bidireccional a las estructuras latentes análisis discriminante (O2PLS-DA) 26. El protocolo presentado en este artículo utiliza PCA para el análisis exploratorio de datos y O2PLS-DA para identificar las diferencias entre los grupos de muestras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Seleccionar los materiales adecuados y construir un plan de muestreo
- Comenzar el experimento mediante el desarrollo de un plan de muestreo apropiado. No existe un enfoque genérico y universal, de modo de evaluar cada plan sobre una base caso por caso. Asegúrese de que el plan de muestreo indica los lugares de toma de muestras, los tiempos y el procedimiento de muestreo preciso. Véase la Figura 1 para el plan de muestreo utilizado en este estudio de caso.
NOTA: En este estudio de caso, las bayas de uva a partir de un único clon (. Vitis vinifera cv Corvina, clon 48) se obtuvieron de siete viñedos comerciales en tres diferentes zonas horarias de macro en la provincia de Verona (Lago Garda, Valpolicella y Soave). Las principales características de cada viñedo se resumen en la Tabla 1. Las bayas se recogieron durante tres temporadas de crecimiento (2006, 2007, y 2008) en tres puntos de tiempo, correspondiente a la pinta (el inicio de la maduración), a mediados de la maduración y bayas maduras.- Para cada una de las adhesiones (vineyard / año / grado de maduración), cosecha 30 grupos de diferentes posiciones a lo largo de dos hileras de vid, con alturas y ubicaciones en la planta aleatorios.
- Seleccione tres bayas al azar de cada grupo, evitando aquellos con daños y / o signos de infección visible.
- Repita los pasos 1.1.1 y 1.1.2 para obtener tres piscinas independientes.
- Deseed las bayas y congelar el pericarpio inmediatamente en nitrógeno líquido.
- Crush 10 bayas congeladas de cada grupo con una amoladora automática de molino, y dividir cada muestra en polvo en dos partes iguales, una para el análisis de transcriptómica y uno para el análisis de la metabolómica.
- Almacenar los polvos a -80 ° C.
| A.M | licenciado en Letras | BM | CS | FA | Minnesota | PM | |
| Macrozona | Soave | lago de Garda | Valpolicella | lago de Garda | Valpolicella | Valpolicella | Soave |
| Altura (m) | 250 | 120 | 450 | 100 | 130 | 250 | 130 |
| Rizoma | 41B | S04 | K5BB | 420A | 420A | K5BB | 41B |
| dirección de la fila | EW | NS | EW | EW | EW | NS | NS |
| sistema de formación | Sistema de sobrecarga (Pergola) | Sistema de sobrecarga (Pergola) | Posicionamiento Vertical disparar (Guyot) | Sistema de sobrecarga (Pergola) | OverheSistema de publicidad (Pergola) | Posicionamiento Vertical disparar (Guyot) | Posicionamiento Vertical disparar (Guyot) |
| Tipo de suelo | arcilla limosa | Marga | Arcilla | Marga | Franco arcilloso | franco limoso | franco arcilloso |
| Diseño de la plantación (m) | 3.20 x 1.00 | 4.50 x 0.80 | 4.00 x 1.25 | 3.50 x 1.20 | 3,50 x 0,75 | 2.80 x 1.00 | 1.80 x 0.80 |
| Cal Total% | 3.9 | 19.3 | 18.3 | 14.4 | 31 | 5.9 | 27.9 |
| Caliza activa% | 0,5 | 2.6 | 9.4 | 6.3 | 11.3 | 3.1 | 8.3 |
| Sand% | 15 | 47 | 66 | 42 | 29 | 13 | 36 |
| marga% | 43 | 36 | 21 | 37 | 39 | 67 | 36 |
| arcilla% | 42 | 17 | 13 | 21 | 32 | 20 | 28 |
| El pH del suelo | 8.3 | 7.9 | 7.8 | 8.2 | 8.2 | 7.8 | 7.9 |
| Sustancia orgánica (%) | 2.9 | 2.5 | 2.2 | 1.2 | 2.9 | 1.6 | 2.5 |
| Fósforo intercambiable (mg / kg) | 26 | 73 | 73 | 68 | 48 | 47 | 64 |
| Potasio intercambiable (mg / kg) | 190 | 376 | 620 230 | 168 | 154 | 126 | |
| Magnesio intercambiable (mg / kg) | 272 | 468 | 848 | 623 | 294 | 293 | 183 |
| Calcio intercambiable (mg / kg) | 6500 | 5380 | 7358 | 6346 | 4652 | 10055 | 2878 |
| Berry Azúcares Reductores 2006 | 211.25 ± 1.20 | 176.20 ± 0.42 | 187.40 ± 0.00 | 203.70 ± 1.13 | 212,55 ± 0,64 | 195.20 ± 0.00 | 211.65 ± 0.64 |
| Berry Azúcares Reductores 2007 | 190.00 ± 1.27 | 165.25 ± 0.49 | 153.00 ± 0.42 | 203,60 ± 0,71 | 210,90 ± 0,71 | 192,25 ± 0,64 | 188,70 ± 1,84 |
| Berry Azúcares Reductores 2008 | 191.35 ± 0.64 | 178,90 ± 0,57 | 170,05 ± 0,49 | 205.15 ± 1.48 | 188.70 ± 0.57 | 169.35 ± 0.49 | 108.05 ± 1.06 |
| Berry pH 2006 | 3.01 ± 0.01 | 2,96 ± 0,01 | 2.84 ± 0.00 | 2,9 ± 0,00 | 2.98 ± 0.00 | 3.02 ± 0.00 | 3,06 ± 0,01 |
| Berry pH 2007 | 2.97 ± 0.00 | 3.00 ± 0.00 | 2.74 ± 0.00 | 3,07 ± 0,01 | 2.98 ± 0.00 | 2,87 ± 0,01 | 3.09 ± 0.00 |
| Berry pH 2008 | 2.83 ± 0.00 | 3,04 ± 0,01 | 2.71 ± 0.00 | 2,98 ± 0,01 2.98 ± 0.00 | 2.82 ± 0.00 | 3.11 ± 0.00 | |
| Fecha de cosecha | 2006 | 2007 | 2008 | ||||
| envero | 8 de agosto | 18-Jul | 12-Aug | ||||
| mediados de maduración | 4-Sep | 8 de agosto | 2-Sep | ||||
| Maduro | 18-Sep | 29-Ago | 23-Sep |
Tabla 1: Principales características de cada viñedo ymuestra de la colección fechas. m = metros, EW = Coma-Oeste, NS = Norte-Sur. 
Figura 1:. Representación esquemática del procedimiento de muestreo de la producción de vino de tres macro zonas están situadas en los alrededores de la ciudad de Verona, región de Véneto, Italia. Los tres puntos de tiempo son envero (V) que representa el inicio de la maduración en la viticultura, a mediados de la maduración (MR) y bayas maduras (R). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
2. Preparar polvo de la baya Extractos, Analizar los metabolitos y procesar los datos
- Preparar las muestras de polvo de la baya para el análisis.
- Preparar los extractos metabólicos de las muestras de bayas a temperatura ambiente en tres volúmenes (w / v) de metanol acidificado con 0,1% (v / v) paraácido micrófono en un baño de ultrasonidos a 40 kHz durante 15 min. Use agua LC-MS-grado y el ácido fórmico y metanol grado HPLC.
- Centrifugar los extractos a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Diluir el sobrenadante de la etapa 2.1.2 en dos volúmenes (v / v) de agua desionizada y pasar a través de un filtro de 0,2-m.
- Analizar los extractos de baya por HPLC-ESI-MS.
- Configurar el sistema de HPLC-ESI-MS de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
NOTA: En este estudio de caso, la configuración compuesta por un sistema de HPLC equipado con un muestreador automático, conectado en línea con un espectrómetro de masas de trampa de iones y fuente de ionización por electrospray. - Conectar el sistema de HPLC con una columna de guarda C18 (7,5 x 2,1 mm 2) y una columna de fase inversa C18 (150 x 2,1 mm 2, tamaño de partícula 3 micras).
- Preparar los disolventes utilizados como fase móvil. Usar 5% (v / v) de acetonitrilo, 0,5% (v / v) de ácido fórmico en agua como disolvente A y 100% de acetonitrilo como solvent B. Uso acetonitrilo LC-MS-grado, agua y ácido fórmico.
- Ejecutar la separación por HPLC con un gradiente lineal de disolventes A y B a un caudal constante de 0,2 ml min -1 utilizando un volumen de inyección de muestra de 30 microlitros.
- Inicialmente equilibrar la columna con 100% A. disolvente Después de la inyección de la muestra, establecer un gradiente de 0% a 10% de disolvente B en 5 min, de 10% a 20% de disolvente B en 20 min, de 20% a 25% de disolvente B en 5 min, y del 25% al 70% de disolvente B en 15 min.
- Analizar cada muestra por duplicado. Selección aleatoria de análisis de la muestra para evitar los efectos del instrumento impulsado. Permitir 20 min para re-equilibrado con 100% de disolvente A entre cada análisis.
- Adquirir los espectros de masas en modos de ionización positivo y negativo alternos. Para los resultados descritos en este estudio de caso, establecer los parámetros que en la Tabla 2. El ajuste de la máquina depende de la plataforma específica.
NOTA: Como alternativa, utilice otro palométodos capaces de acuerdo con la plataforma específica.- En todos los casos, como con cualquier plataforma de separación, asegúrese de usar un tiempo de re-equilibrio adecuado, con el fin de tener tiempo de retención reproducibilidad. Cuando el número de muestras es alta (por encima de diez muestras), analizarlos en lotes de 9-10 muestras, con los programas de limpieza de la columna cromatográfica (gradientes lentos entre los dos disolventes de elución) entre cada lote. Para tener suficiente reproducibilidad tiempo de retención, asegúrese de que el primer análisis cromatográfico de cada lote es un análisis en blanco (es decir, el análisis del disolvente).
- También adquirir los espectros de masas en modo de iones negativos y positivos fragmentados Ajuste de las opciones de fragmentación (dos precursores de iones, EM 3). Anotar los metabolitos de análisis del árbol de fragmentación (MS / MS y MS 3) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Este es particularmente adecuado para metabolitos de las plantas, ya que son a menudo glicosilados, Therntes de la primera fragmentación (MS / MS) tiende a eliminar los restos de azúcar que salen del ion aglicona libre, y la posterior fragmentación (MS 3) ayuda a identificar la aglicona contra una auténtica biblioteca estándares. - Adquirir MS / MS y MS 3 espectros en el intervalo m / z 50-1,500 con una amplitud de fragmentación de 1 V. Alternativamente, utilizar otros métodos adecuados de acuerdo con la plataforma específica.
- Para cada señal de m / z, comparar la MS / MS y MS 3 patrones de fragmentación y los tiempos de retención a la auténtica biblioteca normas de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Muchos tipo de plataformas incluyen las instalaciones de software para construir este tipo de bibliotecas a través del análisis de patrones auténticos. Esto debe identificar muchas de las señales, pero no todas las señales será anotada. - Para las señales anónimas restantes, comparar los patrones de MS 3 fragmentación / MS y MS con los publicados en la literatura, searcHing, para valores de m / z (es decir, el dígito "m / z 353" para buscar publicaciones en las que las moléculas con tales m / z se mencionan) con cualquiera de los motores de búsqueda común de libre disposición, o utilizar bases de datos en línea, como MassBank (www .massbank.jp / es / database.html) y la Base de Datos Metaboloma humano (www.hmdb.ca/search/spectra?type=ms_search).
- Configurar el sistema de HPLC-ESI-MS de acuerdo con las recomendaciones del proveedor.
| Componentes del espectrómetro de masas | Función | parámetros |
| Fuente de ionización electrospray | nebulización de gas | 50 psi, 350 ° C |
| gas de secado | 10 L min -1 | |
| trampa de iones y el detector | Escanear | Modo de barrido completo, 13.000 m / z por segundo, 50-1,500 gama m / z |
| 400 m / z | ||
| colisión de gas | Helio | |
| La presión de vacío | 1,4 x 10 -5 mbar | |
| fuente capilar | 4000 V | |
| Placa final compensado | -500 V | |
| Desnatadora | -40 V | |
| salida Cap | -121 V | |
| Oct 1 pb | -12 V | |
| Oct 2 pb | -1.7 V | |
| 1 lente | 5 V | |
| Objetivo 2 | 60 V | |
| CPI para modo de ionización positiva | 20.000 | |
| CPI para el modo de ionización negativa | 7.000 |
Tabla 2: Principales conjunto de parámetros para la adquisición de espectros de masas.
| Operación | Selección | Función | parámetros | Valores |
| detección de pico | detección de masas | centroide | Nivel de ruido | 3.500 |
| constructor cromatograma | El punto más alto de datos | lapso de tiempo mínimo | 0.15 | |
| altura min | 4.000 | |||
| m / z tolerancia | 0,3 | |||
| detección de pico | deconvolución pico | Búsqueda mínimo local | umbral cromatográfico | 70 |
| Buscar mínimo en el rango de RT (min) | doce y cincuenta | |||
| altura relativa mínima | 15% | |||
| Altura mínima absoluta | 4.000 | |||
| proporción mínima del pico superior / EDGE | 2 | |||
| gama Duración (min) | 0-10 | |||
| isótopos | picos isotópicos mero | - | m / z tolerancia | 1.2 |
| la tolerancia RT | doce y cincuenta | |||
| forma monótona | No | |||
| La carga máxima | 3 | |||
| representante de isótopos | No | |||
| Alineación | Únete alineador | - | m / z tolerancia | 1.2 |
| Peso de m / z | 10 | |||
| Retención de tolerancia de tiempo | doce y cincuenta | |||
| Peso para la RT | 5 | |||
| Requerir mismo estado de carga No | ||||
| Requerir mismo ID | No | |||
| Comparar el patrón de isótopos | No | |||
| relleno de espacios | buscador de pico | - | tolerancia a la intensidad | 20% |
| m / z tolerancia | 0,9 | |||
| Retención de tolerancia de tiempo | doce y cuarenta | |||
| corrección de RT | No | |||
| Filtración | Duplicar filtro de pico | - | m / z tolerancia | 1.2 |
| la tolerancia RT | doce y media | |||
| Requerir misma identificación | No |
Tabla 3: Flujo de trabajo MZmine con valores específicos para procesar archivos de datos de bayas de uva LC-MS negativos.
- Procesar los datos de LC-MS.
- acceso odescargar un paquete de software de procesamiento de datos que puede extraer información relevante de muchos cromatogramas primas y construir una matriz de datos en la que cada metabolito detectado es cuantificada en cada muestra.
NOTA: El protocolo pasos a continuación están diseñados para el código abierto de software v2.14 MZmine (http://mzmine.sourceforge.net). Es un software de código abierto para el procesamiento de datos de espectrometría de masas, con el foco principal en los datos LC-MS. 27 - Transformar los datos del cromatograma LC-MS en formato netCDF mediante el software proporcionado por el fabricante del equipo. Para los resultados descritos aquí, utilizar la v5.2 Bruker Daltonics Esquire y softwares v3.2 de análisis de datos y realizar los pasos de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
NOTA: Otros convertidores pueden usar varios convertidores (free-mercancías están disponibles). - Importar los archivos .cdf en el software.
- Poner en práctica los procedimientos de filtrado de detección de picos, de alineación, de carencias y de pico con el PARAMETERS exponen en la Tabla 3.
- Como primer paso, seleccione un archivo de .cdf importada, y luego ir a la visualización → TIC / XIC visualizador. Ponga el cursor sobre la base del pico más pequeño en el cromatograma y tomar nota sobre la señal de intensidad mínima de la base de iones. A continuación, vaya a métodos de datos sin procesar → detección de picos.
- Seleccione detección de masas y llenar el nivel de la señal para detectar iones individuales para cada exploración y crear una lista de iones.
NOTA: Compruebe el algoritmo antes de realizar la detección de masas - que depende del espectrómetro de masas. En nuestro caso, seleccionamos Centroide. - Seleccionar Cromatograma Constructor y rellenar con el nivel de señal para conectar los puntos de datos de la lista de iones y construir un cromatograma para cada valor de la masa. Ver los parámetros especificados en el manual del espectrómetro de masas para ajustar el Intervalo de tiempo mínima y la tolerancia m / z.
- A continuación, vaya a pico Lista de métodos de detección de pico → → Cromatograma Deconvolución. Seleccione el algoritmo adecuado (en este caso, la búsqueda local mínimo) para permitir la separación de cada cromatograma en picos individuales.
- inspeccionar manualmente los cromatogramas para averiguar los valores adecuados para los parámetros siguientes. Establecer el umbral cromatográfico al 30% para eliminar el ruido y la mínima en Buscar RT rango de 2 (mínimo) para identificar la presencia de los locales mínimos para discriminar dos picos.
- Conjunto Mínimo Altura Relativa a 2,0. inspeccionar manualmente el cromatograma para identificar la altura absoluta mínima de la señal que corresponde a un pico y no al fondo; establecer este valor como Absoluto Altura (por ejemplo, 10.000 en el experimento presentado).
- Establecidos de la relación mínima de pico superior / Borde de 1,1 a afirmar la relación mínima entre la parte superior y las intensidades de los puntos de datos más bajos de un pico a ser reconocido como un pico verdadero.
- inspeccionar manualmente los cromatogramas para ver cuál es la duración mínima de los diversos picos en el cromato utilizadocondiciones ographic (por ejemplo, entre 0,2 y 2 min, dependiendo del compuesto, en los experimentos presentados), y por lo tanto utilizan estos valores como Pico Duración Rango (min) para establecer el rango de longitud de pico aceptable como la duración.
- A continuación, vaya a Pico métodos de listas → → Los isótopos isotópica Picos Mero al grupo de los isótopos en un pico, por lo general en el más intenso. Nota: Los parámetros dependen de la resolución del espectrómetro de masas y la reproducibilidad de los tiempos de retención.
- Por último, vaya a Pico Lista Métodos de alineación → → Únete alineador para alinear los picos en función de su m / z y tiempo de retención usando una puntuación de correspondencia.
- Después de alinear los picos, llenar las lagunas en los datos haciendo clic en el Pico de métodos de listas → → relleno de espacios Buscador de pico. Por último, el filtro de duplicar los puntos de datos, haga clic en Lista de pico Métodos → Filtrado → Duplicar filtro de picos.
- Exportar el conjunto de datos resultante como un .csv archivo.
- Cambiar manualmente la. Extensión csv a una. Txt. Si no hay extensiones de archivo son visibles, cambiar la configuración del ordenador para revelar las extensiones de archivo. Ir al archivo del explorador Opciones → Ver → Configuración avanzada y desactive la casilla "Ocultar las extensiones para tipos de archivo conocidos".
- Importar los archivos .txt en una hoja de cálculo. Esto produce una matriz de datos en la que todos los metabolitos detectados, reconocidos por un tiempo el número de identificación, m / z valor y la retención, se cuantifican en todas las muestras en términos de sus valores de área de pico.
- acceso odescargar un paquete de software de procesamiento de datos que puede extraer información relevante de muchos cromatogramas primas y construir una matriz de datos en la que cada metabolito detectado es cuantificada en cada muestra.
3. Preparar polvo de la baya extractos para el análisis del transcriptoma y procesar los datos
- Extraer el ARN total de las muestras de bayas y determinar la calidad del ARN.
- Extraer el ARN total de las muestras de bayas.
NOTA: En este estudio de caso, un kit de propiedad y un procedimiento modificado que garantiza la eliminación completa de moléculas que interfere con el análisis de ARN, tales como polisacáridos y polifenoles, se utilizaron. Las siguientes instrucciones son específicas para este kit 18.- Pesar 400 mg de polvo de bayas para cada muestra, se divide en dos porciones y colocar 200 mg cada una en dos tubos de microcentrífuga.
- Añadir 900 l de la solución de lisis que contenía β-mercaptoetanol (proporcionado en el kit) a cada 200 mg de polvo y agitar inmediata y vigorosamente durante al menos 30 seg. Calentar la muestra a 56 ° C durante 5 min con agitación a 800 rpm.
- Centrifugar las muestras a la velocidad máxima en una microcentrífuga de sobremesa durante 10 minutos para sedimentar los restos celulares.
- Pipetear 700 l del sobrenadante en la columna de filtración proporcionado en el (anillo azul de retención) kit sentado en un tubo de recogida de 2 ml. Cerrar el tapón y centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa para 1 min para eliminar los desechos residuales. Repita este paso dos veces utilizando la misma columna de filtración pero un tubo de recogida fresco, resultando en tres tUBE conteniendo cada uno ~ 700 l de lisado clarificado.
- Pipetear 750 l de solución de enlace (suministrado en el kit) en cada tubo de lisado clarificado y mezclar inmediatamente por la pipeta hacia arriba y hacia abajo por lo menos cinco veces. Transferir 700 l de esta mezcla a la columna de unión proporcionado en el (anillo de retención rojo) kit sentado en un tubo de recogida de 2 ml. Cerrar el tapón y centrifugar a máxima velocidad en una microcentrífuga de mesa para 1 min de obligar a la ARN.
- Se decanta la fracción de flujo continuo, invierta el tubo de recogida y pulse brevemente sobre una almohadilla limpia de papel absorbente para drenar el líquido residual.
- Retorno de la columna para el tubo de recogida y pipetear la mezcla restante en la misma columna y repetir la centrifugación y etapas de decantación. Repetir hasta que toda la mezcla se ha filtrado en la misma columna de unión rojo.
- Ahora siga las instrucciones restantes del kit y eluir el ARN en tampón de elución de 50 l (suministrado en el kit) y almacenar it a -80 ° C listo para los pasos de control de calidad.
- Determinar la cantidad y pureza del ARN usando un espectrofotómetro. Registrar los razón de absorbancia que revelan el grado de contaminación con proteínas (A 260/280) y polifenoles / polisacáridos (A 260/230).
NOTA: ARN adecuado para la hibridación de microarrays debe marcar al menos 1,8 para ambas relaciones. - Determinar la integridad del ARN.
NOTA: Varios sistemas pueden ser utilizados. A adquirente digital que realiza una carrera de electroforesis capilar en combinación con un colorante fluorescente se utilizó en este estudio de caso. RNA adecuado para la hibridación de microarrays debe tener un número de integridad del ARN (RIN) de al menos 8.
- Extraer el ARN total de las muestras de bayas.
- Preparar muestras e hibridar el RNA a una costumbre de microarrays.
- Establecer el importe de partida de ARN total para el análisis de microarrays a 200 ng por dilución de la solución de ARN obtenido en la etapa 3.1.1.8 con agua desionizada libre de ARNasa. Añade elcantidad apropiada de RNA a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml en un volumen final de 1,5 l.
- Añadir 2 l de mezcla pico diluido a cada muestra de ARN y siga las instrucciones del fabricante para sintetizar la primera cadena de ADNc, transcribir esto en cRNA y la etiqueta de la cRNA con 3CTP cianina.
- Se purifica el cRNA marcado de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se eluye en 30 l de agua libre de RNasa.
- Determinar el rendimiento y la actividad específica de cada cRNA mediante el registro de tres valores en un espectrofotómetro: cianina 3 concentración de colorante (pmol l -1), la pureza de ARN (A 260/280) y la concentración cRNA (ng l -1). Utilice las fórmulas dadas en el manual de instrucciones del fabricante para calcular el rendimiento de cRNA (g) y la actividad específica (pmol Cy3 por g cRNA).
NOTA: Se recomienda rendimientos y actividades específicas difieren sobre la base del formato de microarray específico. En este estudio de caso un formato 44K paquete de 4 eraelegido, el rendimiento recomendado era 1,65 y la actividad específica era 9. - Diseñar el microarray personalizado utilizando el software adecuado para el diseño de la sonda.
- Para los resultados descritos en este estudio de caso, preparar una nueva costumbre de microarrays, diseñado en el formato 44K 4-Pack mediante una aplicación basada en web para los diseños de encargo de microarrays de oligonucleótidos y bibliotecas. Sondas de diseño para que coincida con 34,651 transcripciones de destino, incluyendo 29.971 transcripciones de la Pinot Noir serie V1 predijo, 4.500 nuevos loci identificados en el cultivar Pinot Corvina por la reconstrucción del transcriptoma y 180 genes Corvina privadas 25.
NOTA: Esto implicó la producción de sondas específicas 34,651 60-mer, que comprende 29.798 Pinot Noir predijo transcripciones, 4,392 nuevos loci Pinot y 179 genes Corvina privadas.
- Para los resultados descritos en este estudio de caso, preparar una nueva costumbre de microarrays, diseñado en el formato 44K 4-Pack mediante una aplicación basada en web para los diseños de encargo de microarrays de oligonucleótidos y bibliotecas. Sondas de diseño para que coincida con 34,651 transcripciones de destino, incluyendo 29.971 transcripciones de la Pinot Noir serie V1 predijo, 4.500 nuevos loci identificados en el cultivar Pinot Corvina por la reconstrucción del transcriptoma y 180 genes Corvina privadas 25.
- Preparar el montaje hibridación basado en las especificaciones de formato 4-pack de la siguiente manera.
- Colocar 1,65 g de cRNA marcado con Cy3 en un volumen final de 41,8l de agua desionizada libre de ARNasa. Añadir 11 l de 10x Agente bloqueador y 2,2 l de 25x tampón de fragmentación. Incubar a 60 ° C durante 30 min en un baño termostático a fragmento de ARN. Inmediatamente enfriar en hielo durante 1 minuto.
- Por último, añadir 55 l de tampón de hibridación 2x, mezclar bien pipeteando y centrifugado durante 1 min a 15.500 xg a TA. Prontitud colocar el tubo de microcentrífuga en hielo. Utilizar inmediatamente, no lo guarde.
- Cargar la costumbre de microarrays de la siguiente manera.
- Cargar una diapositiva junta con la etiqueta hacia arriba en la base de una cámara de hibridación. cargar lentamente 100 l de muestra de hibridación obtenidas en la etapa 3.2.6.2 en cada junta así, dispensar el líquido con la punta de la pipeta, evitando las burbujas.
- Lentamente coloque la costumbre de microarrays hacia abajo, lo que garantiza que el código de barras numérico esté hacia arriba. Asegúrese de que el par de sándwich está correctamente alineado. Por último colocar la tapa de la cámara de hibridación en el intercaladodiapositivas y de la mano a apretar la abrazadera sobre la cámara. Girar la cámara de ensamblado para evaluar la movilidad de burbujas.
- Coloque la cámara de deslizamiento montado en un asador en un horno de hibridación fijado a 65 ° C. Ajuste el rotor para girar a 10 rpm. Permitir la hibridación de proceder durante 17 horas.
- Proceder con el lavado de microarrays de diapositivas de la siguiente manera.
- En primer lugar, preparar tres platos deslizables manchas y llenarlos con los tampones de lavado apropiados: 2 platos con tampón de lavado 1 a RT y 1 plato con pre-calentado (37 ° C) Tampón de lavado 2.
- Desmontar la cámara de hibridación y retire el sándwich. Con el código de barras numérico microarray diapositiva hacia arriba, sumergir el emparedado en el primer plato deslizable tinción lleno de tampón de lavado 1 a la temperatura ambiente y, con la ayuda de pinzas limpias, separar la junta de la diapositiva de microarrays. transferir rápidamente los microarrays de diapositivas en una cubeta de portaobjetos y lo coloca en el segundo plato deslizable tinción llena de tampón de lavado 1a TA.
- Poner el plato deslizable tinción en un agitador magnético y lavar 1 min con agitación moderada. transferir rápidamente la parrilla corrediza en el tercer plato deslizable tinción lleno de pre-calentado (37 ° C) Tampón de lavado 2 y lavar 1 min con agitación moderada.
- Retire lentamente el soporte del plato deslizable manchas y retirar con cuidado la corredera de la cremallera, evitando las gotitas.
NOTA: No añadir Triton X-102 a los tampones de lavado y omitir la etapa de lavado acetonitrilo.
- Almacenar el chip se lava en la oscuridad a temperatura ambiente.
- Analiza los microarrays y extraer las características más destacadas.
- Colocar el portaobjetos en un escáner de microarrays adecuado y escanear cada array usando los ajustes de los parámetros recomendados en el manual de instrucciones del fabricante de microarrays. Para los resultados aquí descritos, coloque cada microarray de diapositivas en un portaobjetos a facilitar el proceso de escaneado.
- Importar la salida .shppresentar en un software apropiado que es capaz de convertir una señal digital en valores numéricos fluorescentes. Compruebe el informe de control de calidad para garantizar que el procedimiento de hibridación se ha realizado correctamente.
- Para los resultados aquí descritos, utilice los ajustes de los parámetros recomendados en el manual de instrucciones del software de extracción de características e inspeccionar el informe de control de calidad para garantizar que los parámetros que se enumeran en la Tabla 4 se encuentran dentro del rango normal indicada por el fabricante.
| Nombre métrica | Limite superior | Límite inferior | Descripción |
| AnyColorPrcntFeatNonUnif | 1.00 | N / A | Porcentaje de características que se incluyen los valores extremos no uniformidad en cualquiera de los canales |
| Límite de detección | 2.00 | 0.10 | más media 1 desviación estándar de las ins pico por debajo del intervalo de concentración lineal |
| absGE1E1aSlope | 1.20 | 0.90 | Absoluto de la pendiente del ajuste de la señal frente a la concentración de las sondas E1a |
| MedCVProcSignal | 8.00 | N / A | % CV mediana para la señal procesada |
| gNegCtrlAveBGSubSig | 5.00 | -10.00 | Media de antecedentes y resta la señal de todos los controles negativos inlier (BGSubSignal se calcula restando un valor llamado BGUsed de la característica de la señal media) |
| gNegCtrlAveNetSig | 40.00 | N / A | Promedio de la señal neta de todos los controles negativos inlier |
| gNegCtrlSDevBGSubSig | 10.00 | N / A | desviación estándar deantecedentes y resta señales de todos los controles negativos inlier |
| gNonCntrlMedCVProcSignal | 8.00 | N / A | % CV mediana para la señal procesada de las sondas de control no |
| gSpatialDetrendRMSFilter | 15.00 | N / A | Residual de fondo eliminar la tendencia ajuste |
Tabla 4: Principales parámetros de comprobación para verificar la calidad de la hibridación de microarrays.
- Procesar los datos de microarrays.
- Una vez que todas las diapositivas de microarrays se han escaneado y el control de calidad ha sido evaluada positivamente, preparar una matriz de datos delimitado por tabuladores mediante la selección de los valores de cada archivo gProcessedSignal resultado de un solo subconjunto, que representa la intensidad de fluorescencia de cada sonda primas.
- En una hoja de cálculo, normalizar los datos sobre el percentil 75 de cada array (valores de p) y calculcomió el promedio de todos los valores de p entre todas las diferentes sub-series para calcular la relación R.
- A continuación, en la misma hoja de cálculo, normalizar cada valor gProcessedSignal a la relación R de su propia sub-matriz.
4. Llevar a cabo el análisis detallado de Estadística de la metabolómica y transcriptómica de Datos
- Preparar el software de análisis estadístico.
NOTA: En este estudio de caso, un software capaz de realizar la ACP se utilizó PLS-DA-DA y O2PLS.- Importar los datos de la metabolómica y la transcriptómica. Ir a Archivo → Nuevo proyecto Regular → Nuevo proyecto regular para importar la matriz de datos obtenida con el software MZmine. A continuación, haga clic en Editar → Transportar toda la matriz → Hogar y asignar la identificación → acabado principal y secundaria apropiada.
- La media de centrar los datos y escalar utilizando la escala de Pareto. En la ventana de inicio, vaya a Editar → M1 y cambiar el pará apropiadatros en función de los datos. Para los resultados aquí descritos, cambiar la escala de la unidad de diferencia a la par.
- Escalar los datos transcriptómica utilizando el ajuste de varianza unitaria.
- Llevar a cabo el análisis estadístico multivariado.
- Implementar el PCA como se muestra en la FIGURA 2. En este estudio de caso, PCA revela las principales diferencias entre las muestras, lo que refleja las diferentes etapas de maduración y estaciones de crecimiento.
- En la ventana Plan de trabajo, seleccione PCA-X como el tipo de modelo. Presione Autofit. Prestar atención a la R2X (cum) y Q2 (cum) Los valores, ya que dan una idea de la calidad del modelo.
NOTA: Por lo general, cuanto mayor sea el valor mejor es el modelo, pero los modelos con muy alta R2X (cum) podrían exceso de ajustar los datos. Como regla empírica, dejamos de añadir componentes principales cuando el valor (cum) Q2 empieza a disminuir. - A continuación, seleccione → Decenas de dispersión para ver el diagrama que muestra la posible agrupación de las muestras.
- Inspeccionar el PCAPuntuación Terreno. Si se obtiene un buen modelo (Q2cum> 0,5), usar las mismas clases de muestras para construir un modelo O2PLS-DA (paso 4.2.2).
- En la ventana Plan de trabajo, seleccione PCA-X como el tipo de modelo. Presione Autofit. Prestar atención a la R2X (cum) y Q2 (cum) Los valores, ya que dan una idea de la calidad del modelo.
- La construcción de dos modelos O2PLS-DA utilizando las muestras clasificadas por macro-zona y validar los modelos usando una permutación de prueba con 200 permutaciones.
- Asignar las clases por ir a la ventana de Inicio → Nueva Como → → M1 Observaciones. Establecer las clases deseadas. A continuación, cambie el tipo de modelo de PCA-X para O2PLS-DA. Presione Autofit. Asegúrese de que el número de componentes del modelo PLS-DA es la misma que la de la O2PLS-DA.
- Para validar el modelo O2PLS-DA, vaya a analizar CV-ANOVA y ver el valor de p derecha. Por otra parte, haga clic en Nuevo Al igual que en la ventana Inicio → M2 y cambiar el tipo de modelo de O2PLS-DA a PLS-DA. Presione Autofit.
- Ir a → Analizar y realizar permutaciones permutaciones 200 (de-seleccione la opción Recalcular permutaciones).
Nota: La salida final muestra una ventana en la que el valor de R2 should generalmente golpeó el eje Y en valores por debajo de 0,4, mientras que el Q2 debe golpear la parte negativa del eje y. Si los valores de R2 y / o Q2 son incorrectos, reducir el número de componentes, tanto en los modelos de PLS-DA y O2PLS-DA. - Proceda a seleccionar M2 en la ventana del proyecto y haga clic en Marcadores → dispersión para ver la trama y la posición de las clases de muestra. Para observar lo metabolitos caracterizan una o más clases específicas, vaya a Parcela / Lista → dispersión.
- Seleccione cambiar el tipo de datos a las observaciones y las cargas → Añadir Series y modifican el artículo en el eje X y la serie en pq (corr) y Pred Comp en 1 y 2 o más componentes, cuando están presentes, respectivamente.
- Con el botón derecho del ratón pulsado sobre el terreno, ir a la propiedad → Color y seleccione Por Términos de distinguir los símbolos de la trama entre las moléculas y las clases. Ir a la presentación → Formato → Eje Parcela y / o estilos de modificar la parcela con las características deseadas.
<li> Sobre la base de los resultados de los análisis de la metabolómica O2PLS-DA, presentan diferencias en los niveles relativos de metabolitos específicos o clases de metabolitos como histogramas.
- Implementar el PCA como se muestra en la FIGURA 2. En este estudio de caso, PCA revela las principales diferencias entre las muestras, lo que refleja las diferentes etapas de maduración y estaciones de crecimiento.
- Con base en los resultados del análisis de transcriptómica O2PLS-DA, recuperar y asignar los genes diferencialmente moduladas a Gene Ontología (GO) Clasificaciones 28.
- Identificar las relaciones entre los niveles de metabolitos y la expresión génica de forma manual.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
El estudio de caso descrito en este artículo produjo una matriz de datos final que comprende 552 señales (m / z características) incluyendo iones moleculares más sus isótopos, aductos y algunos fragmentos, relativamente cuantificados entre 189 muestras (7 viñedos x 3 estados de madurez x 3 estaciones de crecimiento x 3 réplicas biológicas). El número total de puntos de datos, por lo tanto era 104.328. Análisis del árbol de fragmentación dio lugar a la anotación de 282 funciones m / z, correspondiente a metabolitos más aductos, isótopos y fragmentos. El análisis exploratorio de toda la matriz de datos por PCA mostró que las muestras agrupadas de acuerdo a la etapa de maduración (envero, a mediados de la maduración y maduro) a lo largo de la primera y segunda componentes principales (T1-T2, Figura 2A), y de acuerdo a la temporada de crecimiento a lo largo de la tercera componente principal (t1-t3, la Figura 2B).
src = "/ files / ftp_upload / 54410 / 54410fig2.jpg" />
Figura 2:. PCA de toda la matriz de datos metabolómica no supervisada PCA-X gráficos de dispersión de puntuación que muestra el agrupamiento de muestras de vid recogidas durante tres estaciones de crecimiento diferentes (2006, 2007, y 2008) y de maduración etapas (envero, a mediados de maduración y bayas maduras ). En la primera parcela (A) las muestras agrupadas de acuerdo a las etapas de maduración, mientras que en el segundo (B) se agrupan de acuerdo a la temporada de crecimiento. Los colores destacan los estados de madurez como verde (envero), rosa (mediados de maduración) y (bayas maduras) de color púrpura. Los símbolos representan las estaciones de crecimiento: círculos (2006), plazas (2007) y triángulos (2008) .Componente t1: P2: 0,34; R2X: 0,331; Q2cum: 0,304; Componente t2: P2: 0,185; R2X: 0,155; Q2cum: 0.433; Componente t3: P2: 0,145; R2X: 0,0924; Q2cum: 0,515.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El PCA no supervisado no pudo revelar características específicas de terroir, que están ocultos bajo los efectos predominantes de época, por lo que un enfoque O2PLS-DA supervisada se aplicó a dos grupos de datos separados, es decir, las bayas en el envero y bayas completamente maduras. Esto permite la exploración de las diferencias metabólicas que representan las tres zonas de macros (Lago Garda, Valpolicella y Soave) en dos etapas clave de la maduración, para identificar las firmas de terroir específicos que representan a esas zonas en estas etapas de maduración.
Figura 3: O2PLS-DA de la pinta y bayas de uva madura. O2PLS-DA parcelas puntuación de dispersión que muestra el agrupamiento de muestras de vid recogidas en el Lago de Garda ( azul), Soave (verde) y Valpolicella (rosa) macro zonas en el envero (A) y cuando las bayas estaban maduras (B). Los metabolitos responsables de la agrupación observada en (A) y (B) son visibles en los gráficos de correlación de carga (C) y (D), respectivamente. Grupos de metabolitos, representados como triángulos, son de color azul para el resveratrol y estilbenos, rosa para las antocianinas, verde para el ácido hidroxicinámico y hidroxibenzoico, púrpura para flavan-3-oles / procianidinas, y amarillo para otros flavonoides. A: componente P1: P2: 0,278; R2X: 0,0529; Q2cum: 0,278; componente P2: P2: 0,33; R2X: 0,0394; Q2cum: 0,608. B: P1 componente: P2: 0,353; R2X: 0,0639; Q2cum: 0,353; componente P2: P2: 0,188; R2X: 0,0374; Q2cum:. 0.541 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Distribución de marcadores metabólicos entre los tres macro-zonas:. Lago de Garda, Soave y Valpolicella niveles de metabolitos reflejan la media ± error estándar (n = 18 para Garda y Soave, 27 de Valpolicella macro-zona) de diferentes glicosilada y acilados antocianinas, el resveratrol / estilbenos y flavonoides en las bayas maduras Corvina en las tres estaciones de crecimiento diferentes (2006, 2007, y 2008). Letras diferentes representan grupos que fueron significativamente diferentes según se determina mediante una prueba t (p <0,05). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las firmas específicas de los siete viñedos individuales se identificaron utilizando un especialzado enfoque estadístico 10. Dos modelos O2PLS-DA fueron construidas, una exploración de las diferencias entre las bayas que crecen en las tres zonas de macro en el envero, y el otro a explorar las diferencias en las tres macro-zonas entre las bayas maduras. Los modelos fueron validación cruzada utilizando una prueba de permutación (200 permutaciones) que muestra que el modelo que describe las bayas maduras a través de las tres zonas de macro era válido, mientras que sólo las muestras Lago Garda eran distintas de las otras muestras de la pinta (no mostrados).
Las parcelas resultado de las dos modelos, que demuestran cómo las muestras de las tres zonas de macro en el envero y madurez se separan de acuerdo con la distribución de los metabolitos, se muestran en las figuras 3A y 3B. Las parcelas de carga de estos modelo expresado como pq (corr), es decir, la correlación entre p (la clase de muestras) y q (los metabolitos), se muestran en la figuras 3C y 3D. En las parcelas de carga, los cuadrados rojos representan la clase de muestras (macro zonas) y los triángulos de colores representan los metabolitos individuales. La distancia entre los metabolitos y las muestras refleja sus relaciones. Los metabolitos son codificados por colores de acuerdo a su clase química.
Dada la baja validez estadística del modelo pinta como se muestra mediante la prueba de permutación, es probable que sufren de sobreajuste. Por lo tanto, las siguientes observaciones se refieren únicamente a las muestras de bayas maduras, cuyo modelo fue estadísticamente válida. En la parcela de carga se muestra en la figura 3D, los estilbenos se desplazan hacia la macro-zona del Lago de Garda, mientras que los flavonoides se desplazan hacia las macro zonas Soave y Valpolicella. Una mirada más cercana a los distintos metabolitos revela la distribución asimétrica de las antocianinas, con peonidina y sus derivados más prevalentes en el lago Garda macro-zona y otras antocianinas más prevalentes en la macro-zona de Valpolicella (Figura 4). Sencilla antocianina-3-O-glucósidos son más prevalentes en la macro-zona de Valpolicella, mientras que los derivados acilados y coumarated son más prevalentes en la macro-zona de Soave.
El componente transcriptómica de este estudio de caso fue originalmente a cabo utilizando una plataforma transcriptómica que ya no es compatible. Como consecuencia de ello, hemos creado un procedimiento alternativo, con la plataforma todavía disponibles; la nueva plataforma contiene más sondas que el anterior, incluyendo 249 más Pinot noir predijo transcripciones, 4392 recién identificado loci Pinot y 179 genes Corvina privadas 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este artículo describe las metabolómica, transcriptómica y protocolos de análisis estadísticos utilizados para interpretar el concepto de terroir baya de la uva. análisis metabolómica por HPLC-ESI-MS es lo suficientemente sensible para detectar un gran número de metabolitos al mismo tiempo, pero la cuantificación relativa se ve afectada por el efecto de la matriz y de iones de supresión / mejora. Sin embargo, un enfoque similar ya se ha utilizado para describir el proceso de maduración y fulminante post-cosecha de bayas Corvina, y la corrección de los efectos de matriz tenido un impacto limitado en los resultados 5. Por otra parte, un multi-instrumento de estudio entre laboratorios a gran escala reciente para determinar la solidez comparativa de RMN y LC-MS para la metabolómica no focalizados utilizando las mismas muestras reveló que los diferentes instrumentos y tecnologías proporcionaron resultados consistentes 6. El estudio de caso descrito en este documento consistió en la recogida y análisis de muestras en tres estados de madurez de siete viñedos en tres macro-zlos más de tres estaciones de crecimiento. En este documento, la firma terroir se investigó a nivel macro-zona (Lago de Garda y Soave, cada uno representado por dos viñas, y Valpolicella, representado por tres viñedos) usando PCA y la estadística multivariante O2PLS-DA. Las diferencias entre los viñedos individuales son más sutiles y requieren enfoques estadísticos más sofisticados y sensibles 10. Varias etapas de los protocolos propuestos son fundamentales y tienen que ser considerados con el fin de responder correctamente a las preguntas acerca de las influencias biológicas terroir en la calidad de la uva.
En primer lugar, el plan de muestreo apropiado es fundamental: la elección de un clon específico para reducir al mínimo las diferencias genéticas y la duración de varios años de la toma de muestras permite poner de relieve las diferencias reales, sonido entre los diferentes terruños. Por otro lado, la investigación propuesta se llevó a cabo dentro de un terroir que es particularmente adecuada para la viticultura, y esto podría Minimizar los terroir-diferencias en la calidad de la uva. Por lo tanto, sería muy interesante comparar el mismo cultivar crecido en una zona menos óptimo, pero, obviamente, estos viñedos podría ser simplemente no está disponible.
Desde el punto de vista técnico, una separación metabolito altamente reproducible a través de HPLC es fundamental para obtener una buena matriz de datos, ya que la mayor de las diferencias en el tiempo de retención en los diversos análisis, mayor será el número de errores en la alineación de pico en el conjunto de datos final. Por lo tanto, es de importancia crítica para ajustar una hora de re-equilibrio apropiado, para dividir las muestras en lotes de muestras con 9-10 ciclos de lavado de la columna cromatográfica entre ellos y utilizar muestras en blanco como la primera muestra de cada lote. LC-MS se ve afectada por un cierto grado de inestabilidad, lo que puede dar lugar a diferencias entre las muestras que son instrumento guiado. Este problema puede ser resuelto parcialmente por la aleatorización de análisis de la muestra, como se muestra en este documento. un immejo- del método es el uso de muestras de control de calidad apropiados en cada lote, que puede informar sobre el estado de la plataforma. Una mezcla de compuesto estándar apropiado (es decir, compuestos estándar con valores m / z y tiempos de retención que abarca más de todo el m / z y el tiempo de retención de gama) y una nueva muestra de control obtenida mediante la mezcla de partes iguales de polvo de todas las muestras pueden informar acerca de la plataforma efectos y eventualmente también ser utilizado para a posteriori-normalización de datos.
Otro punto importante a fin de comparar la metabolómica y transcriptómica resultados era utilizar exactamente el mismo material (es decir, las mismas muestras trituradas) tanto para los análisis. En el análisis de datos, es importante utilizar un método estadísticas apropiado, tal como OPLS-DA, lo que permite un fácil interpretación de las diferencias en términos de la expresión génica y la acumulación de metabolito con respecto a métodos tales como PCA. Una de las principales limitaciones de este tipo de enfoque es elA falta de métodos fuertes para transcriptómica y metabolómica datos integración. El desarrollo de métodos adecuados para diferentes tipos de correlación de datos es necesario con el fin de construir una correlación fuerte y fiable entre transcriptómica y metabolómica datos.
Las técnicas descritas en este artículo revelan claramente la maduración y los efectos de la vendimia en el metaboloma baya, pero las firmas químicas específicas que representan las tres zonas de macro también se identificaron en las bayas maduras debajo el efecto predominante de la vendimia. Curiosamente, el análisis de bayas envero no dió un modelo estadísticamente válida, lo que indica que el concepto terroir es predominantemente manifiesta por los metabolitos que se acumulan durante la maduración (por ejemplo, antocianinas y estilbenos) de los ya presentes en las bayas inmaduras.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mill Grinder | IKA | IKA A11 basic | |
| HPLC Autosampler | Beckman Coulter | - | System Gold 508 Autosampler |
| HPLC System | Beckman Coulter | - | System Gold 127 Solvent Module HPLC |
| C18 Guard Column | Grace | - | Alltima HP C18 (7.5 mm x 2.1 mm; 5 μm) Guard Column |
| C18 Column | Grace | - | Alltima HP C18 (150 mm x 2.1 mm; 3 μm) Column |
| Mass Spectometer | Bruker Daltonics | - | Bruker Esquire 6000; The mass spectometer was equipped with an ESI source and the analyzer was an ion trap. |
| Extraction solvents and HPLC buffers | Sigma | 34966 | Methanol LC-MS grade |
| Sigma | 94318 | Formic acid LC-MS grade | |
| Sigma | 34967 | Acetonitrile LC-MS grade | |
| Sigma | 39253 | Water LC-MS grade | |
| Minisart RC 4 Syringe filters (0.2 μm) | Sartorius | 17764 | |
| Softwares for data collection (a) and processing (b) | Bruker Daltonics | - | Bruker Daltonics Esquire 5.2 Control (a); Esquire 3.2 Data Analysis and MzMine 2.2 softwares (b) |
| Spectrum Plant Total RNA kit | Sigma-Aldrich | STRN250-1KT | For total RNA extractino from grape pericarps |
| Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | 1000 | |
| BioAnalyzer 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| RNA 6000 Nano Reagents | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| RNA Chips | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 1 | Agilent Technologies | 5188-5325 | |
| Agilent Gene Expression Wash Buffer 2 | Agilent Technologies | 5188-5326 | |
| LowInput QuickAmp Labeling kit One-Color | Agilent Technologies | 5190-2305 | |
| Kit RNA Spike In - One-Color | Agilent Technologies | 5188-5282 | |
| Gene Expression Hybridization Kit | Agilent Technologies | 5188-5242 | |
| RNeasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | For cRNA Purification |
| Agilent SurePrint HD 4X44K 60-mer Microarray | Agilent Technologies | G2514F-048771 | |
| eArray | Agilent Technologies | - | https://earray.chem.agilent.com/earray/ |
| Gasket slides | Agilent Technologies | G2534-60012 | Enable Agilent SurePrint Microarray 4-array Hybridization |
| Thermostatic bath | Julabo | - | |
| Hybridization Chamber | Agilent Technologies | G2534-60001 | |
| Microarray Hybridization Oven | Agilent Technologies | G2545A | |
| Hybridization Oven Rotator Rack | Agilent Technologies | G2530-60029 | |
| Rotator Rack Conversion Rod | Agilent Technologies | G2530-60030 | |
| Staining kit | Bio-Optica | 10-2000 | Slide-staining dish and Slide rack |
| Magnetic stirrer device | AREX Heating Magnetic Stirrer | F20540163 | |
| Thermostatic Oven | Thermo Scientific | Heraeus - 6030 | |
| Agilent Microarray Scanner | Agilent Technologies | G2565CA | |
| Scanner Carousel, 48-position | Agilent Technologies | G2505-60502 | |
| Slide Holders | Agilent Technologies | G2505-60525 | |
| Feature extraction software v11.5 | Agilent Technologies | - | inside the Agilent Microarray Scanner G2565CA |
| SIMCA + V13 Software | Umetrics |
References
- Jessome, L. L., Volmer, D. A. Ion suppression: A major concern in mass spectrometry. Lc Gc N Am. 24 (5), 498-510 (2006).
- Kim, H. K., Choi, Y. H., Verpoorte, R. NMR-based plant metabolomics: where do we stand, where do we go? Trends Biotech. 29 (6), 267-275 (2011).
- Sumner, L. W., Mendes, P., Dixon, R. A. Plant metabolomics: large-scale phytochemistry in the functional genomics era. Phytochem. 62 (6), 817-836 (2003).
- Bottcher, C., von Roepenack-Lahaye, E., Willscher, E., Scheel, D., Clemens, S. Evaluation of matrix effects in metabolite profiling based on capillary liquid chromatography electrospray ionization quadrupole time-of-flight mass spectrometry. Anal Chem. 79 (4), 1507-1513 (2007).
- Toffali, K., et al. Novel aspects of grape berry ripening and post-harvest withering revealed by untargeted LC-ESI-MS metabolomics analysis. Metabolomics. 7 (3), 424-436 (2011).
- Martin, J. C., et al. Can we trust untargeted metabolomics? Results of the metabo-ring initiative, a large-scale, multi-instrument inter-laboratory study. Metabolomics. 11 (4), 807-821 (2015).
- Jaillon, O., et al. The grapevine genome sequence suggests ancestral hexaploidization in major angiosperm phyla. Nature. 449 (7161), 463-467 (2007).
- Velasco, R., et al. A high quality draft consensus sequence of the genome of a heterozygous grapevine variety. Plos One. 2 (12), (2007).
- Tornielli, G. B., Zamboni, A., Zenoni, S., Delledonne, M., Pezzotti, M. Ch. 11. The Biochemestry of the Grape Berry. Gerós, H., Chaves, M., Delrot, S. 11, Bentham Science Publishers. (2012).
- Anesi, A., et al. Towards a scientific interpretation of the terroir concept: plasticity of the grape berry metabolome. BMC Plant Biol. 15, 1-17 (2015).
- Berdeja, M., et al. Water limitation and rootstock genotype interact to alter grape berry metabolism through transcriptome reprogramming. Hort Res. 2, 1-13 (2015).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Solar ultraviolet radiation is necessary to enhance grapevine fruit ripening transcriptional and phenolic responses. BMC Plant Biol. 14, 1-16 (2014).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Reducing sampling bias in molecular studies of grapevine fruit ripening: transcriptomic assessment of the density sorting method. Theor Exp Plant Phys. 28 (1), 109-129 (2016).
- Carbonell-Bejerano, P., et al. Circadian oscillatory transcriptional programs in grapevine ripening fruits. BMC Plant Biol. 14, 1-15 (2014).
- Cavallini, E., et al. Functional diversification of grapevine MYB5a and MYB5b in the control of flavonoid biosynthesis in a petunia anthocyanin regulatory mutant. Plant & Cell Physiol. 55 (3), 517-534 (2014).
- Cramer, G. R., et al. Transcriptomic analysis of the late stages of grapevine (Vitis vinifera cv. Cabernet Sauvignon) berry ripening reveals significant induction of ethylene signaling and flavor pathways in the skin. BMC Plant Biol. 14, 1-21 (2014).
- Dal Santo, S., et al. The plasticity of the grapevine berry transcriptome. Genome Biol. 14 (6), 1-17 (2013).
- Fasoli, M., et al. The Grapevine Expression Atlas Reveals a Deep Transcriptome Shift Driving the Entire Plant into a Maturation Program. Plant Cell. 24 (9), 3489-3505 (2012).
- Gambino, G., et al. Co-evolution between Grapevine rupestris stem pitting-associated virus and Vitis vinifera L. leads to decreased defence responses and increased transcription of genes related to photosynthesis. J Exp Bot. 63 (16), 5919-5933 (2012).
- Ghan, R., et al. Five omic technologies are concordant in differentiating the biochemical characteristics of the berries of five grapevine (Vitis vinifera L.) cultivars. BMC Genomics. 16 (1), 1-26 (2015).
- Pastore, C., et al. Selective defoliation affects plant growth, fruit transcriptional ripening program and flavonoid metabolism in grapevine. BMC Plant Biol. 13, 1-13 (2013).
- Pastore, C., et al. Increasing the source/sink ratio in Vitis vinifera (cv Sangiovese) induces extensive transcriptome reprogramming and modifies berry ripening. BMC Genomics. 12, 1-23 (2011).
- Rinaldo, A. R., et al. A Grapevine Anthocyanin Acyltransferase, Transcriptionally Regulated by VvMYBA, Can Produce Most Acylated Anthocyanins Present in Grape Skins. Plant Physiol. 169 (3), 1897-1916 (2015).
- Royo, C., et al. Developmental, transcriptome, and genetic alterations associated with parthenocarpy in the grapevine seedless somatic variant Corinto bianco. J Exp Bot. , 259-273 (2015).
- Venturini, L., et al. De novo transcriptome characterization of Vitis vinifera cv. Corvina unveils varietal diversity. BMC Genomics. 14, 1-13 (2013).
- Commisso, M., Strazzer, P., Toffali, K., Stocchero, M., Guzzo, F. Untargeted metabolomics: an emerging approach to determine the composition of herbal products. Comput Struct Biotechnol J. 4, 1-7 (2013).
- Pluskal, T., Castillo, S., Villar-Briones, A., Oresic, M. MZmine 2: Modular framework for processing, visualizing, and analyzing mass spectrometry-based molecular profile data. BMC Bioinformatics. 11, 1-11 (2010).
- Ashburner, M., et al. Gene Ontology: tool for the unification of biology. Nat Genet. 25 (1), 25-29 (2000).
