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Immunology and Infection

Evaluación rápida y específica de la peroxidasa Actividad de halogenación en muestras de sangre enriquecida en leucocitos

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

En este trabajo se describe un protocolo para el enriquecimiento rápido y estandarizado de los leucocitos de pequeñas muestras de sangre entera. Este procedimiento se basa en la lisis hipotónica de los eritrocitos y se puede aplicar a las muestras de humanos, así como a la sangre de origen no humano. El pequeño volumen de muestra inicial de alrededor de 50 a 100 l hace que este método es aplicable a muestras de sangre recurrente de pequeños animales de laboratorio. Por otra parte, el enriquecimiento de leucocitos se logra en cuestión de minutos y con esfuerzos materiales bajos en relación con los productos químicos y la instrumentación, por lo que este método aplicable en múltiples entornos de laboratorio.

Purificación estandarizada de los leucocitos se combina con un método altamente selectivo tinción para evaluar la actividad peroxidasa de halogenación de las peroxidasas heme, la mieloperoxidasa (MPO) y la peroxidasa de eosinófilos (EPO), es decir, la formación de hipocloroso y ácido hipobromoso (HOCl y HOBr). Mientras MPO se expresa fuertemente en neutrophils, el tipo de célula inmune más abundante en la sangre humana, así como en los monocitos, la enzima relacionada EPO se expresa exclusivamente en los eosinófilos. La actividad de halogenación de estas enzimas se aborda mediante la fluoresceína casi HOCl- y HOBr específica colorante aminofenil (APF) y el peróxido de hidrógeno sustrato de peroxidasa primaria. Tras el análisis de citometría de flujo subsiguiente todas las células peroxidasa positiva (neutrófilos, monocitos, eosinófilos) son distinguibles y su actividad peroxidasa de halogenación pueden ser cuantificados. Desde tinción APF se puede combinar con la aplicación de marcadores de superficie celular, este protocolo se puede extender para tratar específicamente de leucocitos subfracciones. El método es aplicable para detectar la producción de HOCl y HOBr tanto en humanos y en los leucocitos de roedores.

Dado el papel inmunológica ampliamente y diversamente discutido de estos productos enzimáticos en enfermedades inflamatorias crónicas, este protocolo puede contribuir a una mejor comprensión de larelevancia inmunológica de peroxidasas heme derivadas de leucocitos.

Introduction

Los leucocitos polimorfonucleares (PMNs, también llamados granulocitos) y los monocitos representan importantes componentes celulares del sistema inmune innato en el 1,2 sangre. Contribuyen a la principal defensa contra los patógenos, así como a la activación del sistema inmune adquirido y la iniciación de una respuesta inflamatoria sistémica 2-4. Sin embargo, especialmente neutrófilos, el tipo más abundante de los granulocitos y monocitos también contribuyen significativamente a la regulación y la terminación de los eventos inflamatorios agudos 5. Por lo tanto estas células también pueden desempeñar un papel importante en las enfermedades inflamatorias crónicas como la artritis reumatoide 6,7. De hecho, el asma, una enfermedad inflamatoria crónica de las vías respiratorias, se caracteriza por una apoptosis alterada de eosinófilos, el segundo tipo más de granulocitos en la sangre 8. Sin embargo, la apoptosis de los granulocitos y su rápida eliminación por macrófagos son dos pasos esenciales durante la terminación celularde la inflamación 9-11.

En las células inmunes con nombre dos enzimas estrechamente relacionadas, a saber, mieloperoxidasa (MPO, neutrófilos y monocitos) y eosinófilos peroxidasa (EPO, eosinófilos) se puede encontrar 12,13. Estos peroxidasas hemo están clásicamente relacionadas con la respuesta inmune humoral como se oxidan de dos electrónicamente (pseudo-) haluros a la hipo correspondiente (pseudo) ácidos halosos que son conocidos por sus propiedades bactericidas 14-16. En condiciones fisiológicas MPO principalmente forma ácido hipocloroso (HOCl) y hipotiocianito (- OSCN) mientras que el segundo y hipobromoso ácido (HOBr) están formados por EPO 17-19. Los nuevos resultados sugieren que este (pseudo-) la actividad enzimática de halogenación también puede contribuir a la regulación de las respuestas inflamatorias y para la terminación de las reacciones inmunes 20,21. De hecho, la producción de HOCl mediante MPO y los productos derivados, se mostró a suprimir T respuestas inmunitarias adaptativas basadas en células 22-24.

Con el fin de ganar más conocimientos sobre la función inmunológica de los leucocitos del sistema inmune innato en enfermedades inflamatorias crónicas y para determinar la contribución de MPO y EPO a esta función fisiológica, hemos desarrollado un método para enriquecer rápidamente leucocitos de pequeñas muestras de sangre para un posterior específica determinación de la actividad de halogenación peroxidasa en estas células. Para el agotamiento de eritrocitos hemos elegido un método estandarizado incluyendo dos posteriores etapas de lisis hipotónica con agua destilada, lo que conduce a un enriquecimiento de leucocitos rápida a bajas costes de material. Para la determinación posterior de la MPO de halogenación y actividad de la EPO se utilizó el colorante fluoresceína aminofenil HOCl- y HOBr-específica (APF) 25-27. En contraste con la aplicación de métodos de tinción de peroxidasa no específica 28,29, este enfoque permite la detección selectiva de la actividad de halogenación peroxidasa, que a menudo se deteriora en infl severainflamación 30,31.

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Protocol

Todas las muestras de sangre humana se obtuvieron de voluntarios sanos, y el protocolo de leucocitos enriquecimiento aplicado sigue las directrices de la Comisión de Ética de la Facultad de Medicina de la Universidad de Leipzig. Los experimentos con sangre de rata fueron aprobados por el comité de ética local responsable (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), de acuerdo con las directrices alemanas sobre el cuidado y uso de animales.

1. Configuración Experimental

NOTA: Como el procedimiento de lisis hipotónica para el agotamiento de los eritrocitos de las muestras de sangre es un procedimiento crítico en el tiempo, preparar todo el equipo necesario (por ejemplo, tampones) para esta parte del protocolo de antemano.

  1. Etiquetar un tubo de centrífuga de 15 ml para la lisis hipotónica y un tubo de muestra de 1,5 ml para su posterior fluoresceína aminofenil (APF) tinción por muestra de sangre.
    1. Si el enriquecimiento de leucocitos se llevará a cabo en condiciones estériles, realice este etiquetado bajo un flujocaja.
  2. Preparar sobre 12 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS, 10 mM) por muestra. Dependiendo de si los leucocitos se pueden aislar en condiciones estériles o no, preparar PBS, ya sea mediante el uso de solución lista estéril de un proveedor o por disolución de los comprimidos de PBS en agua destilada. Comprobar el valor del pH y, si es necesario, ajustar el pH a 7,4 mediante el uso de pequeñas cantidades de soluciones 0,1 M de HCl y NaOH.
    1. Disuelva las tabletas de PBS (véase la tabla de los Materiales) en 200 ml de agua destilada para obtener una solución tampón no estéril suficiente para alrededor de 16 muestras. Si se desea, esterilizar esta solución mediante filtración estéril.
  3. Preparar sobre 1 ml de solución de Hanks de sal equilibrada (HBSS) suplementado con Ca2 + por muestra.
    1. Disolver 970 mg de sal de HBSS en 100 ml (volumen final) de agua bidestilada. Antes de llenar hasta el volumen final, comprobar el valor de pH y ajustarlo a pH 7,4. Debido a su capacidad de amortiguación baja, la elaboración de este tampón recién cada día unad realizar el ajuste de pH con un cuidado especial mediante el uso de pequeñas cantidades de 0,1 M soluciones de HCl y NaOH.
      NOTA: la solución estéril se puede utilizar, dependiendo del experimento. La solución se puede esterilizar por filtración estéril.
  4. Además de los dos tampones, etiqueta y preparar un tubo (por ejemplo, 50 ml tubo de centrifugación) o frasco (por ejemplo, 250 ml del vaso dosificador) con agua bidestilada para el procedimiento de lisis hipotónica de antemano. Preparar aproximadamente 10 ml de agua por muestra.
  5. Preparar un recipiente con hielo picado para la tinción APF (sección 3), que se realiza en el hielo.
  6. Preparar alícuotas de APF con antelación para permitir la rápida preparación de soluciones de trabajo utilizados durante la tinción (paso 3.2) y para evitar la congelación y descongelación repetida de la solución APF.
    NOTA: APF se obtiene habitualmente como 5 mg / ml (11,81 mM) solución madre en acetato de metilo.
    1. Congelar alícuotas de 10-100 l en tubos de 0,5 ml. Para la tinción de una final de la APFconcentración de colorante de 10 mM se utiliza (paso 3.8).

2. hipotónica de lisis de los eritrocitos

NOTA: Realice los pasos lisis hipotónica (excepto los pasos de centrifugación) bajo un banco de flujo laminar para evitar la contaminación. Realice todo el procedimiento a temperatura ambiente. A medida que la lisis hipotónica es un proceso crítico tiempo, ajustar las pipetas para el agua (2 ml) y PBS (5 ml) la adición de antemano y abrir el agua y frascos de PBS antes de iniciar el procedimiento. Almacenar la solución de PBS y el agua destilada a temperatura ambiente antes de su uso.

  1. De cada muestra de sangre de transferencia de 100 l al tubo de centrifugación de 15 ml apropiado.
    NOTA: En nuestros experimentos muestras de sangre por lo general contienen de 10 U / ml de heparina para evitar la coagulación. Sin embargo, debido a las diferentes fuentes de material de la muestra de la naturaleza y la concentración del anticoagulante pueden ser diferentes. Su influencia en la tinción APF debe ser probado por comparing los resultados con los resultados obtenidos a partir de muestras de sangre suplementadas con otros tipos o concentraciones de anti-coagulante.
  2. Añadir 2 ml de agua destilada y mezclar las muestras mediante el uso de un mezclador de vórtice establecido en un nivel medio. Se incuban las muestras durante 60 segundos, a continuación, añadir 5 ml de PBS por muestra y mezclar con el mezclador de vórtice.
    NOTA: Hasta unos 5 muestras se puede preparar en paralelo. Mantenga el orden de la muestra de la misma para la adición de agua y PBS para alcanzar tiempos de incubación comparables.
  3. Después de la regeneración de las condiciones isotónicas mediante la adición de PBS (paso 2.2) sedimentar las células intactas restantes en todas las muestras por centrifugación durante 6 minutos a temperatura ambiente y 450 x g.
  4. Eliminar el sobrenadante por verterlo en un cubo de basura tabla. Eliminar la mayor cantidad de líquido posible invirtiendo el tubo de centrifugación y aprovechando la apertura en una toalla de papel. Asegúrese de que el sedimento celular es tan seco como sea posible.
  5. Repetir el procedimiento de lisis hipotónica como se ha descrito antes (paso 2.2).
    norteOTA: En principio, este procedimiento de lisis hipotónica (pasos 2.3 a 2.5) se puede repetir más de una vez, dependiendo de la pureza de la fracción de leucocitos mixta a obtener. Después de dos pasos de lisis la proporción de eritrocitos restante en la fracción celular mixto obtenido es de aproximadamente 25%.
  6. Sedimentar las células intactas restantes por centrifugación durante 6 minutos a temperatura ambiente y 450 x g. Eliminar el sobrenadante (véase el paso 2.4). Añadir 500 l HBSS al sedimento y suavemente disolverlo hasta que se obtiene una solución homogénea. Transferir cada muestra al tubo de muestra 1,5 ml en consecuencia etiquetado.
  7. Dependiendo del experimento analizar directamente las muestras obtenidas (por ejemplo, a través de citometría de flujo) 25, mancha con anticuerpos marcados con fluorescencia (para la identificación de tipos de células individuales) 32, incubar con estímulos de células (para los experimentos de activación de células) 33 o almacenado en el hielo y el uso luego. Dependiendo del objetivo del estudio, realizar inmediatamente posteriores experimentos enla fracción de leucocitos mixta desde los granulocitos tienen una bastante corta vida media de alrededor de 20 hr.
    NOTA: Esto también es válido para la tinción de actividad de la peroxidasa se describe a continuación.

3. Actividad peroxidasa de halogenación tinción

NOTA: HOCl- y HOBr-producción por las peroxidasas hemo derivados de la sangre de la MPO y la OEP se cuantifica mediante el uso de la APF, que se oxida a la fluoresceína por los ácidos hipohalosos con nombre. Por lo tanto si el etiquetado de células con anticuerpos marcados con fluorescencia se lleva a cabo en combinación con la tinción de APF, evitar fluoróforos que interfieren con la señal de emisión de la fluoresceína.

  1. Realizar tinción APF a 4 ° C en hielo.
  2. Para la preparación de una solución de trabajo de APF descongelar una alícuota apropiada del colorante (por ejemplo, 10 l, 11,81 mM) y diluir con HBSS a exactamente 1 mM (por ejemplo, agregar 108,1 l de tampón a la 10 l).
    1. Para cada muestra (500 l solución de células) preparar 5 μl de la solución de trabajo APF descrito. De acuerdo con ello, utilice uno 10 l de alícuota APF (11,81 mM), lo que da 118,1 l de solución de trabajo APF (1 mM) para preparar aproximadamente 20 muestras. Debido a la pérdida durante el pipeteado preparar aproximadamente 10% más de la solución de trabajo APF que el calculado.
  3. Con el fin de comprobar la especificidad de la tinción de peroxidasa APF, preparar muestras de control con el inhibidor de la peroxidasa heme hidrazida de ácido 4-aminobenzoico (4-ABAH) 35.
    1. Preparar una solución madre 1 M de 4-ABAH (151,17 g / mol) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) por dilución de 75,6 mg de 4 ABAH en 500 l de disolvente. a diluir 4-ABAH décimo en HBSS.
  4. Para la preparación de una etiqueta de solución H 2 O 2 de trabajo de dos tubos de 1,5 ml de centrifugación con "70 mM H 2 O 2" y "7 mM H 2 O 2", respectivamente.
    1. En el tubo con la etiqueta "70 mm de H 2 O 2", recién diluida 10 lde una solución madre 30% (8,8 mM) de H 2 O 2 usando 990 l de agua destilada para obtener una concentración de aproximadamente 88 mM. Almacenar en hielo y el uso dentro de 4 horas.
      NOTA: H 2 O 2 se suministra típicamente como un 30% de solución de stock de los proveedores. Cuando se almacena a 4 ° C, es estable durante unos 3 años. Realizar diluciones de H 2 O 2 en agua destilada para evitar la descomposición. H 2 O 2 diluciones también podrían prepararse en solución 0,1 M de NaOH.
    2. Para la determinación de la H exacta concentración 2 O 2 Preparar una dilución adicional 1 a 10 de la primera H 2 O 2 solución madre (aproximadamente 88 mM) mediante la adición de 100 l de esta solución a 900 l de agua destilada en el tubo de 1,5 ml etiquetados "mM H 2 O 2 7".
    3. Grabar un espectro en el rango de cerca de UV (por ejemplo, 200 a 300 nm) utilizando un fotoespectrómetro UV-Vis y utilizar la absorbancia a 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) para determinar la concentración real H 2 O 2 en el segundo H 2 O 2 solución madre 34. Asegúrese de que la cubeta de referencia contiene sólo agua destilada. Para las cubetas de cuarzo de medición uso como se registra un espectro en la gama UV.
    4. A partir de este resultado, el cálculo de las concentraciones exactas de ambos H 2 O 2 soluciones madre. Ajustar la concentración de la primera solución madre en el "mM H 70 2 O 2" tubo de muestra a exactamente 70 mM mediante la adición de una cantidad apropiada de agua destilada. Almacenar la solución de trabajo obtenida en hielo y el uso dentro de una hora.
  5. Añadir 5 l de la solución de trabajo de 4-ABAH (100 mM) a las muestras adecuadas para una concentración final de 1 mM. Se incuban las muestras durante 15 minutos a 37 ° C en la incubadora antes de la adición APF.
  6. Añadir 5 l de solución de trabajo APF (1 mM) a cada500 muestra l para obtener una concentración de colorante final de 10 mM. Mezclar suavemente las muestras (por ejemplo, mediante el uso de la mezcladora de vórtice en una posición media) y se incuba durante 30 min a 37 ° C.
  7. Añadir 5 l H solución de trabajo 2 O 2 (70 mM) a cada muestra de 500 l para una concentración final de 700 mM. Mezclar suavemente las muestras y se incuban durante 60 minutos a 37 ° C. Realizar medidas de control apropiadas en paralelo.
    NOTA: Las medidas de control mostraron que 700 mM H 2 O 2 no son tóxicos para las células. Tampoco se observaron las respuestas celulares importantes.
    NOTA: La tinción APF también puede ser realizada por la omisión de la adición de H 2 O 2, dependiendo de la pregunta científica. En ausencia de peróxido de hidrógeno sólo el MPO de cloración basal y la actividad de EPO se determina mientras que la adición de H 2 O 2 permite la detección de la máxima producción de HOCl y HOBr por las células. TEsto último significa que una señal fluorescente significativamente mayor.
  8. Para la granulación de las células, centrifugar las muestras durante 10 min a temperatura ambiente y 400 x g. Eliminar completamente el sobrenadante sin destruir el sedimento y añadir 250 l de HBSS para volver a suspender las células.
    NOTA: Las muestras están ya listos para su análisis mediante citometría de flujo 25.
  9. Almacenar las muestras en la oscuridad hasta el análisis para evitar la decoloración. Después de excitación a 480-490 nm detectar la emisión de fluoresceína en alrededor de 525 nm 37.

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Representative Results

Como se informó anteriormente el método descrito anteriormente resultó ser aplicable tanto al ser humano y a los materiales no humano 32. Por otra parte, como se muestra para los ratones con síntomas asmáticos la tinción APF puede ser una herramienta adecuada para detectar diferencias en el estado pro-inflamatoria sistémica. Por lo tanto en un estudio posterior se utilizó este protocolo para evaluar la actividad de halogenación repetidamente de MPO (y EPO) en ratas hembras Dark Agouti con artritis pristano inducida (PIA). Un ejemplo representativo de enriquecimiento de leucocitos y la tinción se realiza durante este experimento se muestra en la Figura 1. Se obtuvo todo alrededor de 200 l de sangre del plexo venoso retrobulbar del animal bajo anestesia y heparinizado. El agotamiento de eritrocitos y una posterior tinción APF se realizaron utilizando 100 l volumen de la muestra. Después, la muestra se analizó por citometría de flujo.

(Figura 1A), una fuerte disminución de los eritrocitos se logró a partir de la muestra. Además diferentes tipos de leucocitos eran claramente discernible, que fueron identificados mediante la aplicación de marcadores de superficie celular marcadas por fluorescencia (no mostrados). Brevemente los eritrocitos (CD235a-positivo) / región de los restos celulares sólo representaba el 22% de los eventos, mientras que alrededor del 48% de los eventos fueron identificados como los neutrófilos CD16-positivo. Por otra parte el 3% de los eventos fueron cada uno identificado como eosinófilos CCR3-positivas y monocitos CD14-positivas y alrededor del 19% de los eventos representó CD5 / B CD19-positivas y los linfocitos T, respectivamente. La distribución de la intensidad de la fluorescencia derivada de APF (Figura 1B) permitió claramente la discriminación de los eritrocitos y linfocitos peroxidasa negativa, mientras que los monocitos y eosinófilos condujo a una oxidación moderada APF y neutrófilos fueron fuertemente con peroxidasa positiva bajo la chOsen condiciones experimentales. Estos resultados están en línea con la gran abundancia de MPO en las últimas células en comparación con la concentración de enzima en monocitos 20. La respuesta relativamente débil de los eosinófilos puede explicarse por el hecho, que no se añadió bromuro, que pueden haber llevado a la formación de derivados de EPO de HOBr. Los estudios preliminares en los eosinófilos aislados sorprendentemente no muestran una gran influencia de bromuro añadido externamente en la oxidación APF por estas células. Aún así, la oxidación de la APF por los eosinófilos se observó lo que puede explicarse por la introducción de pequeñas cantidades de Br - a través de las soluciones tampón utilizadas (PBS y HBSS). Alternativamente EPO también puede producir pequeñas cantidades de HOCl, al menos bajo condiciones ácidas (por ejemplo, en fagolisosomas).

Figura 1
Figura 1: el enriquecimiento de leucocitos y la APF-derivad fluorescencia en un micro-muestra de sangre de una rata. Una cantidad de todo alrededor de 200 l de sangre se obtuvo de la plexo venoso retrobulbar de una hembra de rata Dark Agouti. Después de la aplicación del procedimiento de hemólisis descrito para 100 l de sangre y una posterior APF tinción de la fracción de células mixtas se analizó por citometría de flujo. Como se muestra por el / SSC- Parcela FSC (A) los eritrocitos fueron fuertemente agotado de la muestra y los diferentes tipos de leucocitos podría ser fácilmente distinguido. La distribución de la intensidad de fluorescencia derivada de la APF (B) mostró claramente hemo peroxidasa-negativos células (eritrocitos y linfocitos), así como los leucocitos con moderadas (eosinófilos y monocitos) o fuertes (neutrófilos) la actividad de halogenación peroxidasa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Como los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre humana el aislamiento de células peroxidasa positiva a menudo sólo se centra en estas células e incluye una separación de los neutrófilos de otros leucocitos por centrifugación en gradiente de densidad 38. Sin embargo, como los neutrófilos son mucho menos abundantes en las muestras de sangre murinos 39 para los últimos métodos más complicados tienen que utilizarse 40. Además ambos métodos también conducen a la eliminación de los monocitos con peroxidasa positiva de las muestras y, debido a la necesidad de volúmenes de sangre más grandes (por ejemplo, 400 l 41), no son aplicables a los micro-muestras obtenidas durante el muestreo de sangre recurrente de pequeños animales de laboratorio 38,40. La purificación de los neutrófilos murinos de exudados peritoneales también es necesario el sacrificio de los animales y, por otra parte, no cede granulocitos derivados de la sangre 38,40. Recientemente se han desarrollado métodos para obtener fracciones de granulocitos altamente purificada a partir de bl murinoood (por ejemplo, la aplicación de anticuerpos) son a menudo caro, complicado y consume tiempo 40,42,43 y otra vez sólo se centran en la purificación de un tipo de leucocitos peroxidasa positiva.

Así, el método presentado aquí tiene un par de ventajas sobre otros métodos aplicados para la purificación de los leucocitos peroxidasa positiva. Como se basa en pequeñas muestras de sangre las células obtenidas representan la situación en la circulación. Debido al pequeño volumen de muestra inicial necesario para el protocolo del método es aplicable tanto a la sangre humana y no humana, a pesar de las diferencias específicas de las especies en la abundancia de los neutrófilos. De hecho, hemos sido capaces incluso de aplicar el método descrito a sus iniciales en volúmenes de sangre tan pequeños como de 50 l (datos no mostrados). La pequeña muestra de sangre necesaria para el método también lo hace adecuado para la extracción de sangre repetidas de pequeños animales de laboratorio o para aplicaciones médicas especiales (por ejemplo, diagnóstico recién nacido). como tque el enriquecimiento de leucocitos se basa en el agotamiento de los eritrocitos todas las células peroxidasa positiva (neutrófilos, eosinófilos, monocitos) se incluyen en la fracción de leucocitos mixto obtenido y se pueden analizar por separado mediante el uso de citometría de flujo. El método es rápido, fiable y tiene bajos requerimientos con respecto a los productos químicos y la instrumentación, por lo que el protocolo adecuado para múltiples entornos científicos.

A medida que los neutrófilos se activan fácilmente un paso crítico en el método descrito es el ajuste preciso del valor del pH de las soluciones tampón utilizadas (PBS y HBSS, consulte los pasos 1.2 y 1.3 del servicio de protocolo). Además, el tiempo de incubación de las células de la sangre con agua destilada debe ser no más de 60 segundos antes de restaurar las condiciones normosmotic (véase el paso 2.2 de la sección de protocolo. El (casi) totalmente la eliminación del disolvente del sedimento celular (paso 2.4) antes de la adición de agua para la segunda lisis hipotónica es otro paso crítico como aficionadoresiduos er disminuirán la eficiencia del procedimiento de lisis hipotónica. Otro paso importante se refiere a la aplicación de H 2 O 2 durante la tinción APF. A pesar de la cantidad aplicada no debe ser citotóxica, la vitalidad celular debe ser revisado. Durante nuestros estudios que normalmente aplicamos el colorante 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine yoduro (JC-1) para la detección de los primeros eventos apoptóticos.

Por otra parte, hay un par de limitaciones en el método simplificado descrito enriquecimiento de leucocitos. Mientras que la técnica se puede aplicar a muestras de sangre de varias especies (hombre, rata y ratón se han probado), la cantidad de leucocitos obtenido después de la lisis de los eritrocitos depende de su abundancia inicial en la sangre. Este último, sin duda varía entre las especies 39 y también es dependiente del estado inflamatorio de la persona palpada. Por otra parte, mientras que el procedimiento de lisis se puede hacer con un máximo de uncien muestras en paralelo los pasos de centrifugación intermedios representan una limitación como, dependiendo de la centrífuga usada, sólo hasta 30 muestras se pueden procesar en paralelo. Además, si bien APF detecta fácilmente HOCl y HOBr en presencia de SCN -, la actividad de halogenación de MPO y EPO también afecta a este último pseudo-haluro. De este modo hipotiocianito (- OSCN) se forma que es incapaz de oxidar APF. Otra limitación proviene de las propiedades del colorante APF utilizado para la determinación de HOCl- y HOBr-producción de MPO y EPO. Como el colorante se oxida a la fluoresceína, la tinción no se puede combinar con anticuerpos fluorescentes con un espectro de emisión en el mismo rango. Por supuesto, cualquier interferencia entre la fluorescencia derivada de la APF y la señal de las señales fluorescentes adicionales tienen que ser controlados y compensado en el citómetro de flujo.

De lo contrario, si la detección de la actividad peroxidasa de halogenación no es el alcance de laestudian, después de la aplicación del método de agotamiento de eritrocitos otros métodos analíticos se pueden utilizar en lugar de la APF. Como el procedimiento de lisis hipotónica se describe sólo conduce a un agotamiento parcial de los eritrocitos y, como todos los leucocitos son todavía presente en la fracción celular mixto obtenido, únicos métodos que permiten que un único análisis de células se debe aplicar. Métodos que incluyen la lisis de las células (por ejemplo, análisis de la representación occidental) no van a dar resultados fiables. El pequeño volumen de muestra inicial puede ser otro obstáculo para este tipo de métodos analíticos.

En cuanto a la investigación de MPO (y EPO) la actividad en los leucocitos a menudo sólo la producción general oxidante por las células está dirigida en lugar de evaluar específicamente la actividad peroxidasa heme 44,45. Además a menudo no se hace ningún intento de distinguir entre la halogenación y la actividad peroxidasa de la MPO y EPO 46,47. Métodos, que se refieren específicamente a la actividad de MPO cloración por quantifying productos derivados de HOCl como clorotirosina no detectan el exceso de oxidarse y / o productos metabolizado y, por lo tanto, a menudo conducen a una subestimación de la verdadera producción de HOCl-48. Además, este método, así como la detección de derivados de HOCl 2-chloroethidium también consumen mucho tiempo, necesitan equipo analítico costoso e incluyen la lisis de las células 48-50 .Hay muchos informes acerca de nuevos colorantes para la determinación específica de la actividad de MPO de cloración dentro de las células vitales 44,51,52. Sin embargo, hasta la fecha sólo APF y su fluoresceína hidroxifenil compuesto relacionado (HPF) están disponibles comercialmente y por lo tanto se usa rutinariamente en la investigación 25,33.

De hecho, mediante el uso de APF podríamos demostrar que la actividad MPO de cloración no sólo puede ser cuantificado mediante el uso de la enzima aislada 53, sino también mediante la aplicación del tinte a las células vivas 26,33. Por lo tanto mediante la combinación de enriquecimiento de leucocitos rápida de micro-muestras de sangre indicadas anteriormente con unan APF tinción hemos desarrollado un protocolo, que es adecuado para tratar específicamente y, simultáneamente, la actividad de halogenación de MPO y EPO en todos los leucocitos positivos peroxidasa, es decir, neutrófilos, monocitos y eosinófilos 32. Además, el método no requiere la lisis celular, lo que permite una amplia variedad de métodos analíticos, incluyendo la citometría de flujo y microscopía de fluorescencia confocal. Además de esta actividad de tinción de peroxidasa se puede combinar con la aplicación de marcadores de superficie celular, lo que permite el análisis específico de leucocitos sub-fracciones, dependiendo de la tarea científica. Sin embargo, ha de considerarse que los anticuerpos marcados con fluorescencia aplicada no interfieren con la señal de fluorescencia a base de fluoresceína se utiliza para cuantificar la HOCl- y la oxidación APF derivado de HOBr.

En resumen, este método puede proporcionar una nueva herramienta para obtener más conocimientos sobre el papel fisiológico de la actividad peroxidasa de halogenación de la re inmunológicaLevant peroxidasas derivados de la sangre MPO y la EPO, que todavía no se entienden bien 8,20,23. Además, en un estudio en animales sobre la artritis reumatoide podríamos recientemente observar que este protocolo puede dar lugar a la evaluación de la producción de HOCl derivado de MPO como un nuevo marcador clínico en enfermedades inflamatorias crónicas (datos no publicados).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

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Inmunología No. 113 la preparación de la sangre el enriquecimiento de leucocitos la mieloperoxidasa la peroxidasa de eosinófilos la actividad de cloración fluoresceína aminofenil
Evaluación rápida y específica de la peroxidasa Actividad de halogenación en muestras de sangre enriquecida en leucocitos
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Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

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