Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

Bu yazıda küçük tam kan örneklerinden lökositlerin hızlı ve standardize zenginleştirme için bir protokol tanımlanmıştır. Bu prosedür, eritrositlerin hipotonik liziz dayalıdır ve insan olmayan kökenli kan hem de insan örnekleri uygulanabilir. yaklaşık 50 ile 100 ul az ilk örnek hacmi küçük laboratuar hayvanlarından tekrarlanan kan örneğinin, bu yöntem uygulanabilir hale getirir. Ayrıca, lökosit zenginleştirme birden laboratuvar ortamlarında bu yöntem uygulanabilir hale dakika içinde ve kimyasallar ve enstrümantasyon konusunda düşük malzeme çabaları ile elde edilir.

Lökositlerin standardize saflaştırma son derece seçici bir hema peroksidaz halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin değerlendirilmesi için boyama yöntemi, miyeloperoksidaz (MPO), eozinofil peroksidaz (EPO) örneğin, hipokloröz ve hipobromus asitinin (HOCI ve HOBr) oluşumu ile birleştirilir. MPO güçlü neut'ait olarak ifade edilirkenrophils, insan kanında olarak monositlerde en bol immün hücre tipi, ilgili enzim EPO özel eozinofil olarak ifade edilir. Bu enzimlerin halojenleme aktivitesi neredeyse HOCl- ve HOBr'nin özgü boya aminofenil fluoresein (APF) ve primer peroksidaz substrat hidrojen peroksit kullanılarak giderilir. daha sonra akım sitometrisi analizi üzerine tüm peroksidaz-pozitif hücrelerin (nötrofiller, monositler, eozinofil) ayırt edilebilir ve halojenleme peroksidaz aktivitesi belirlenebilir. APF lekeli hücre yüzeyi markerlerinin uygulama ile birlikte olabilir için, bu protokol, spesifik olarak, lökosit alt parçacığı gidermek için uzatılabilir. yöntem, insan ve kemirgen lökositleri hem HOCl ve HOBr'nin üretimi tespit etmek için de geçerlidir.

kronik inflamatuvar hastalıklarda bu enzimatik ürünlerin yaygın ve çeşitli şekillerde tartışılan immünolojik rol göz önüne alındığında, bu protokol daha iyi anlaşılmasına katkıda bulunabilirlökosit kaynaklı heme peroksidaz immünolojik alaka.

Introduction

Polimorfonükleer lökositler (PMN olarak da adlandırılır granülositler) ve monositler kan 1,2 olarak doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli hücresel bileşenleri temsil eder. Patojenlere karşı ve kazanılmış bağışıklık sistemi aktivasyonu ve sistemik enflamatuar tepki 2-4 başlatılmasından birincil savunma katkıda bulunur. Oysa özellikle nötrofiller, granülosit en bol türü ve monositler de önemli ölçüde akut inflamatuar olayların 5 düzenlenmesi ve fesih katkıda bulunur. Bu nedenle, bu hücreler aynı zamanda römatoid artrit, 6,7 gibi kronik iltihaplı hastalıklarda önemli bir rol oynayabilir. Aslında, astım, kronik enflamasyonlu hava geçiş yolu hastalığı olarak, eozinofil bozulmuş apoptoz, kan 8'de ikinci granülosit Çeşidi ile karakterize edilir. Oysa granülosit apoptoz ve makrofajlar tarafından onların hızlı çıkarma hücresel sonlandırma sırasında iki temel adımlardırinflamasyon 9-11.

Adı bağışıklık hücreleri, iki yakın ilişkili enzimler, yani miyeloperoksidaz (MPO, nötrofiller ve monositler) ve eozinofil peroksidaz (EPO, eozinofiller) 'de 12,13 bulunabilir. Bu hem peroksidazlar klasik iki-elektronik ilgili hipo (sözde) ila (sözde) halidler bakterisid özellikleri 14-16 için bilinen halojen asitleri okside olarak humoral bağışıklık tepkisi ile ilişkilidir. Fizyolojik koşullar altında MPO esas olarak form hipokloröz asit (HOCI) ve hypothiocyanite (- OSCN) ikinci ve hipobromus asit (HOBr'nin) EPO 17-19 oluşturduğu getirilmektedir. Yeni sonuçlar, bu (sözde) halojenasyon enzim aktivitesi aynı zamanda inflamatuar yanıtların düzenlenmesinde ve bağışıklık reaksiyonları 20,21 feshi katkıda bulunabileceğini düşündürmektedir. Aslında, MPO ve elde edilen ürünlerin tarafından HOCl üretimi T hücre tabanlı adaptif immün yanıtları 22-2 bastırmak gösterilmiştir4.

Bu fizyolojik fonksiyonu MPO ve EPO katkısı kronik inflamatuar hastalıklarda doğuştan gelen bağışıklık sisteminden lökositlerin immünolojik rolüne daha fazla anlayışlar kazanmak için ve belirlemek için hızla bir sonraki özgü küçük kan örneklerinden lökosit zenginleştirmek için bir yöntem geliştirdi bu hücrelerde halojenleştirici peroksidaz etkinliğinin belirlenmesi. eritrosit tükenmesi için biz düşük malzeme maliyetleri hızlı bir lökosit zenginleşmeye yol açar damıtılmış su ile iki müteakip hipotonik lizis adımları içeren bir standart yöntem seçtiniz. Sonraki halojenleme MPO belirlenmesi ve EPO faaliyeti için HOCl- ve HOBr'nin özel boya aminofenil floresein (APF) 25-27 kullanılmıştır. Spesifik olmayan peroksidaz boyama yöntemleri 28,29 uygulanması aksine olarak, bu yaklaşım, genellikle ciddi iltihaplanmaya karşı en bozulur halojenleme peroksidaz aktivitesi seçici algılama sağlar,amasyon 30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Bütün insan kan örnekleri sağlıklı gönüllülerden elde edildi ve uygulanan lökosit zenginleştirme protokolü Leipzig Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik komisyonu yönergeleri takip eder. sıçan kan deneyler, hayvan bakımı ve kullanımı ile ilgili Alman kurallarına göre, sorumlu yerel etik kurulu (Landesdirektion Sachsen, Referat 24) tarafından onaylanmıştır.

1. Deney Düzeneği

NOT: kan örneklerinden eritrositlerin tükenmesi için hipotonik parçalama prosedürü zaman kritik bir işlem olduğundan, önceden protokolün bu kısmı için gerekli tüm donanım (örneğin, tamponlar) hazırlar.

  1. hipotonik liziz için bir 15 ml santrifüj tüpüne ve kan numune başına takip eden aminofenil floresein (APF) boyama için bir 1.5 ml örnek tüp etiketleyin.
    1. Lökosit zenginleştirme, steril koşullar altında yapılacak ise, akışı altında Bu etiketlenmesikutu.
  2. örnek başına 12 ml fosfat tamponlu salin (PBS, 10 mM) hazırlanır. lökositler, steril koşullar altında izole ya da edilip edilmeyeceğine bağlı olarak, ilgili steril hazır çözelti ile ya da damıtılmış su içinde PBS çözünen tabletler yoluyla PBS hazırlar. pH değeri kontrol ve gerekirse, 0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanılarak pH 7.4'e ayarlanır.
    1. yaklaşık 16 numune için yeterli steril olmayan bir tampon çözeltisi elde etmek üzere distile su, 200 ml (Malzeme Tablo) PBS tablet içinde çözülür. Eğer arzu edilirse, steril süzme ile bu çözüm sterilize edin.
  3. Ca ile desteklenmiş 1 ml Hanks dengeli tuz çözeltisi (HBSS) 2+ numune başına hazırlayın.
    1. 100 ml HBSS tuzu (nihai hacim), iki kez damıtılmış su ile 970 mg eritin. Nihai hacme kadar doldurmadan önce, pH değerini kontrol ve pH 7.4 ayarlayın. Düşük tampon kapasitesi nedeniyle, bir her gün taze olarak bu tampon hazırlamak0.1 M HCI ve NaOH çözümler küçük miktarlarda kullanarak özel itina ile pH ayarlamasını yapmak d.
      Not: steril bir çözelti deneye bağlı olarak, kullanılabilir. Çözelti, steril filtrasyon ile sterilize edilir.
  4. İki tampon, etiket dışında ve bir tüp hazırlanması (örneğin, 50 mi santrifüj borusu) ya da bir şişe (örneğin, ölçüm kabı 250 mi) önceden hipotonik lizis prosedürü için iki kez damıtılmış su ile yıkanır. örnek başına 10 ml su hazırlayın.
  5. Buz üzerinde gerçekleştirilir APF boyama (bölüm 3) için, ezilmiş buz ile bir kap hazırlanır.
  6. boyama esnasında kullanılan çalışma çözümleri hızlı hazırlanmasını sağlamak için önceden APF hacimde hazırlayın (3.2 adım) ve donma ve APF çözümünün çözülme defalarca önlemek için.
    Not: AFP genellikle 5 mg / ml metil asetat (11.81 mM) stok çözeltisi olarak elde edilir.
    1. 0.5 ml tüpler içinde 10-100 ul alikotları dondurun. APF nihai boyama için10 uM boya konsantrasyonu (adım 3.8) kullanılmıştır.

Eritrositler 2. Hipotonik Lizis

NOT: kirlenmesini önlemek için bir laminer akış tezgah altında (santrifüj adımları hariç) hipotonik lizis adımları uygulayın. Oda sıcaklığında tüm prosedürü uygulayın. hipotonik lizis zaman kritik bir süreç olduğu için, önceden su (2 mi) ve PBS (5 mi) eklenmesi için pipetler ayarlayın ve işleme başlamadan önce su ve PBS şişeler açın. Kullanımdan önce, oda sıcaklığında PBS çözeltisi ve saf su saklayın.

  1. Her kan örneği transferi uygun 15 ml santrifüj tüpüne 100 ul.
    Not: Deneylerde kan örnekleri, genellikle pıhtılaşmayı önlemek için, heparinin 10 U / ml ihtiva etmektedir. Ancak, numune malzemenin farklı kaynaklardan anti-koagülan doğası ve konsantrasyonu farklı olabilir. APF boyaması üzerindeki etkisi karş tarafından test edilmelidirdiğer türleri veya anti-koagülan konsantrasyonları ile takviye edilmiş, kan numuneleri elde edilen sonuçlara sonuçları ing.
  2. 2 mL distile su ekleyin ve bir orta düzeyde ayarlanmış bir vorteks mikser kullanarak örnekleri karıştırın. daha sonra numune başına 5 ml PBS ilave ve vorteks karıştırıcı ile karıştırın, 60 saniye boyunca inkübe edin.
    Not: yaklaşık 5 numuneye kadar paralel hazırlanabilir. numune sipariş karşılaştırılabilir inkübasyon süreleri elde etmek için su ve PBS eklenmesi için aynı tutmak.
  3. PBS ilave (aşama 2.2), oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile tüm örneklerde kalan sağlam hücreler pelet izotonik koşulların yenilenme sonra.
  4. Bir tablo çöp kutusuna dökerek süpernatantı. santrifüj tersini tüp ve bir kağıt havlu üzerine açılış dokunarak kadar sıvı mümkün olduğunca kaldırın. Hücre topağı mümkün olduğunca kuru olduğundan emin olun.
  5. (Adım 2.2) daha önce açıklandığı gibi hipotonik lizis işlemi tekrarlayın.
    NOT: Prensip olarak, bu hipotonik lizis prosedürü elde edilecek karışık bir lökosit fraksiyonunun saflığı bağlı olarak, birden fazla kez tekrar edilebilir (2.5 2.3 adım). İki parçalama elde karışık hücre fraksiyonu içinde eritrosit kalan payı adımlar sonra yaklaşık% 25'tir.
  6. Oda sıcaklığında 6 dakika 450 x g santrifüj ile geri kalan sağlam hücreler pelet. süpernatant (adım 2.4) sökün. pelet 500 ul HBSS ekleyin ve homojen bir çözelti elde edilene kadar yavaşça çözülür. buna göre etiketlenmiş 1.5 ml numune tüpüne her örnek aktarın.
  7. Deneye bağlı olarak, doğrudan, (akış sitometrisi ile, örneğin,) elde edilen numunelerin, 25, 32 (tek hücre tiplerinin tanımlanması için) floresans etiketli antikorlar ile leke analizi (hücre aktivasyon deneyleri için) hücre uyaranlara 33 inkübe ya da buz ve Kullanım depolanan sonra. Çalışmanın amacı bağlı olarak, hemen üzerinde sonraki deneylerigranülosit yana karışık bir lökosit fraksiyonu yaklaşık 20 saat arasında oldukça kısa bir yarı ömre sahiptir.
    Not: Bu, aynı zamanda, aşağıda tarif edilen peroksidaz aktivitesi boyama için de geçerlidir.

3. Halojenleyici Peroksidaz Aktivitesi Boyama

Not: kandan alınan hema peroksidazlar MPO ve EPO tarafından HOCl- ve HOBr'nin üretim adlandırılan arasında hipohalus asitlerinin ile floresan oksidize edilir APF kullanılarak ölçülür. floresan işaretli antikorlar ile hücre etiketleme APF boyama ile bir arada gerçekleştirilen bu yüzden eğer floresan emisyon sinyali engelleyebilir florofor kaçının.

  1. buz üzerinde 4 ° C de APF boyama gerçekleştirin.
  2. APF bir çalışma çözeltisi hazırlamak için boya uygun bir kısım Çözülme (örneğin, 10 ul, 11.81 mM) ve tam 1 ​​mM (örneğin, 10 ul 108.1 ul tampon ekleyin) için HBSS ile seyreltin.
    1. Her numune (500 ul hücre çözeltisi) için 5 u hazırlamaktarif APF hazır çözeltinin l. Bu duruma göre, 118.1 ul AFP çalışma çözeltisi (1 mM) 20 numune hazırlamak için verir APF (11,81 mm), bir adet 10 ul tablet kullanımı. Nedeniyle pipetleme sırasında kaybı hesaplanmış yaklaşık% 10 daha fazla APF çalışma çözeltisi hazırlayın.
  3. , APF boyama peroksidaz özgüllük kontrol hema peroksidaz inhibitörü, 4-aminobenzoik asit hidrazid (4-ABAH) 35 ile kontrol örneklerini hazırlamak için.
    1. Çözücü, 500 ul, 75.6 mg 4-ABAH seyreltilerek, dimetil sülfoksit içinde 4-ABAH (151.17 g / mol), (DMSO) içindeki bir 1 M stok çözelti hazırlayın. Dahası HBSS 4-Abah 1/10 sulandırmak.
  4. Sırasıyla, "70 mM H2O 2" ve "7 mM H2O 2", bir H2O 2 çalışma çözeltisi etiketi iki 1.5 mi santrifüj tüpleri hazırlanması için.
    1. "70 mM H 2 O 2" etiketli tüp içinde, taze 10 ul sulandırmakyaklaşık 88 mM'lik bir konsantrasyon elde etmek için distile su 990 ul kullanılarak H2O 2,% 30'luk bir stok çözeltisi (8.8 mM). Buz üzerinde saklayın ve 4 saat içinde kullanın.
      NOT: H 2 O 2, tipik tedarikçiler tarafından% 30 stok çözelti olarak teslim edilir. 4 ° C'de depolandığında, yaklaşık 3 yıl stabildir. Bozunmadan kaçınmak için damıtılmış su içinde H2O 2 dilüsyonları gerçekleştirin. H2O 2 seyreltmeler, 0.1 M NaOH çözeltisi içinde hazırlanabilir.
    2. Tam H belirlenmesi için 2 O 2 konsantrasyonunun etiketlenmiş 1.5 ml'lik bir tüp içinde damıtılmış su 900 ul bu solüsyondan 100 ul eklenmesiyle ilk H 2 O 2 stok solüsyonu (yaklaşık 88 mm), daha da 1-10 seyreltme hazırlanması "7 mM H 2 O 2".
    3. (UV-Vis fotospektrometre kullanarak yakın UV aralığında (örneğin, 200-300 nm) spektrumunu kaydetme ve 240 nm'de absorbansı kullanın49; 240 = 34 M -1 cm -1) ikinci H 2 O 2 stok solüsyonu 34 gerçek H 2 O 2 konsantrasyonunu belirlemek için. Referans küvet sadece distile su içerdiğinden emin olun. Ölçüm kullanım kuvars küvetler UV aralığında bir spektrum kaydedilir olarak.
    4. Bu sonuçtan, hem H 2 O 2 stok çözümleri tam konsantrasyonları hesaplayın. Damıtılmış su, uygun bir miktarının ilave edilmesi ile "70 mM H2O 2" örnek tüp tam olarak 70 mM ilk ihtiyat çözeltisinin yoğunluğu ayarlayın. buz üzerinde elde edilen çalışma çözüm saklayın ve bir saat içinde kullanın.
  5. 1 mM'lik bir son konsantrasyon için, uygun örnekler 4-ABAH çalışma çözeltisi (100 mM) 5 ul ekle. APF ilave edilmeden önce bir inkübatör içerisinde 37 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe edin.
  6. Her bir 5 ul APF çalışma çözeltisi (1 mM) ilave500 ul numune 10 uM bir nihai boya konsantrasyonu elde edildi. (Orta ayara vorteks karıştırıcı kullanılarak, örneğin) yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
  7. 700 uM'lik bir son konsantrasyon için her 500 ul numune 5 ul H2O 2 çalışma çözeltisi (70 mM) eklenir. Yavaşça örnekleri karıştırın ve 37 ° C'de 60 dakika boyunca inkübe. paralel olarak uygun kontrol ölçümleri gerçekleştirmek.
    NOT: Kontrol ölçümleri 700 uM H 2 O 2 hücreleri için toksik olmadığını gösterdi. Ayrıca önemli bir hücresel tepkiler gözlenmiştir.
    NOT: APF boyama, H2O 2 ilavesi olmaksızın, bilimsel soruya bağlı olarak ile gerçekleştirilebilir. H2O 2 eklenmesi hücreleri tarafından maksimum HOCl ve HOBr'nin üretim saptanmasına izin verir ise, hidrojen peroksit yokluğunda sadece bazal klorlama MPO ve EPO aktivitesi belirlenir. TO ikinci bir anlamlı olarak daha yüksek floresan sinyal anlamına gelir.
  8. hücreler pelet için, oda sıcaklığında 10 dakika karıştırıldı ve 400 x g'de için örnekler santrifüj. İyice pelet bozmadan süpernatant kaldırmak ve hücreleri tekrar süspansiyon 250 ul HBSS ekleyin.
    NOT: Numuneler şimdi 25 flow sitometri aracılığı ile analiz için hazır.
  9. ağartma önlemek için analize kadar karanlıkta örnekleri saklayın. 480-490 nm'de eksitasyonla sonra yaklaşık 525 nm 37 ° floresan emisyonu tespit eder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Daha önce belirtildiği gibi, yukarıda tarif edilen yöntem, insan ve insan-olmayan madde 32 her ikisi de uygulanabilir olduğu ortaya çıktı. astım semptomları olan fareler için gösterilen üstelik olarak APF boyama sistemik pro-enflamatuar durum farklılıkları tespit etmek için uygun bir araç olabilir. Bu nedenle bu protokol kullanılır Takip eden bir çalışmada, art arda, pristan-kaynaklı artrit (PIA) dişi Koyu Agouti sıçanlarda MPO (EPO) ve halojenasyon etkinliğini değerlendirmek için. Lökosit zenginleştirme ve deney sırasında gerçekleştirilen boyama temsili bir örneği Şekil 1 'de gösterilmiştir. 200 ul tam kan anestezi altında hayvanın retrobulber venöz pleksus elde edilir ve heparinize edilmiş. Eritrosit tükenmesi ve daha sonraki bir APF boyama 100 ul numune hacmi ile gerçekleştirildi. Daha sonra örnek bir akış sitometrisi ile analiz edilmiştir.

(Şekil 1A) karşı hücre boyutu, örnek elde edilmiştir eritrosit güçlü bir tükenmesi çizilmesi ile gösterildiği gibi. Ayrıca, farklı lökosit tipleri floresan etiketli hücre yüzeyi işaretçileri uygulanarak tespit edilmiştir ki, pek belirgin edildi (gösterilmemiştir). Olayların yaklaşık% 48 CD16-pozitif nötrofil olarak tespit edildi ise kısaca eritrosit (CD235a-pozitif) / hücre enkaz bölgesi sadece olayların% 22 olarak gerçekleşmiştir. Ayrıca olayların% 3 her CCR3-pozitif eozinofiller ve CD14-pozitif monositler olarak tespit edildi ve olayların yaklaşık% 19'u sırasıyla CD5 / CD19-pozitif B ve T lenfositleri sorumluydu. Monositler ve eozinofiller ılımlı APF oksidasyona açtı ve nötrofiller ch altında güçlü bir peroksidaz-pozitif iken APF türetilmiş floresan yoğunluğu dağılımı (Şekil 1B) açık bir şekilde peroksidaz-negatif eritrositler ve lenfositlerin ayrımı izinosen deney koşulları. Monositler 20 enzim konsantrasyonu ile karşılaştırıldığında Bu sonuçlar, ikinci hücre MPO yüksek bolluk ile uyum içindedir. eozinofillerin, nispeten zayıf bir yanıt yok bromür hobr EPO türevi oluşmasını teşvik etmiş olabilir, ilave edildi gerçeğiyle açıklanabilir. İzole eozinofiller üzerinde ön çalışmalar şaşırtıcı bu hücreler tarafından APF oksidasyonu üzerindeki harici eklenen bromür büyük bir etkisi yoktu. Yine, Br, az miktarda katılmasıyla açıklanabilir gözlenmiştir eozinofillerin APF oksidasyonu - (PBS ve HBSS) kullanılan tampon çözeltiler ile. Alternatif olarak EPO da (fagolizozomları örneğin,), en azından, asidik koşullar altında HOCl az miktarda üretebilir.

Şekil 1
Şekil 1: Lökosit zenginleştirme ve APF-derivedBir sıçandan kan mikro-numune içinde D floresan. 200 ul tam kan bir miktar bir dişi Koyu Agouti sıçan retrobulbar venöz pleksus elde edilmiştir. karma hücre fraksiyonu boyama 100 ul kan tarif edilen hemoliz prosedürünün uygulanması ve daha sonraki bir APF sonra akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. FSC / SSc Test alanı (A) ile gösterildiği gibi eritrositler, numune tükenmiş ve farklı lökosit tipleri kolaylıkla ayırt olabilir. APF türetilmiş floresan yoğunluğu (B) dağılımı açıkça gösterdi heme peroksidaz-negatif orta (eozinofiller ve monositler) ya da kuvvetli (nötrofiller) halojenasyon peroksidaz aktivitesi ile hücreleri (eritrositler ve lenfositler) yanı sıra lökositler. Bir görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın daha büyük bir versiyonu.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Nötrofiller, insan kanından en bol lökositlerdir olarak peroksidaz-pozitif hücrelerinin elde edilmesi çoğu zaman sadece bu hücreler üzerinde odaklanır ve yoğunluk dereceli santrifüj 38 diğer lökositlerin nötrofillerin bir şekilde ayrılmasını da içerir. Nötrofiller daha az bol sıçangil kan örneklerinde henüz olarak ikinci daha karmaşık yöntemleri için 39 40 kullanılmalıdır. Ayrıca her iki yöntemde de bağlı daha büyük kan hacim ihtiyacı için, numunelerden peroksidaz pozitif monositler kaldırılmasına neden ve (örneğin, 400 ul 41), küçük laboratuar hayvanlarından tekrarlanan kan örneği elde edilen mikro-numune için geçerli değildir 38,40. Periton eksüda fare nötrofillerin arıtma da dahası, kan türevi granülositler 38,40 vermezse, hayvanların kurban gerekir ve. Son zamanlarda fare bl gelen yüksek derecede saflaştırılmış granülosit elde etmek üzere yöntemler geliştirmişlerdirood (örneğin, antikorların uygulaması) çoğu zaman pahalı, karmaşık ve zaman alıcı ve 40,42,43 yine tek peroksidaz pozitif lökosit tipi arıtma odaklanmak.

Böylece Burada sunulan yöntem, peroksidaz pozitif lökositlerin saflaştırılması için uygulanan diğer yöntemlere göre avantajları bir çift vardır. Bu az miktarda kan örnekleri dayanır de elde edilen hücreler dolaşımdaki durumu ifade eder. protokol için gereken küçük bir ilk örnek hacmi nedeniyle yöntemi nötrofillerin bolca türe özgü farklılıklara rağmen, insan ve insan-olmayan kan hem de geçerlidir. Aslında, hatta 50 ul kadar küçük kan hacmine başlangıç ​​açıklanan yöntemin kullanılması mümkün (veriler gösterilmemiştir). Yöntem için gereken küçük bir kan örneği, aynı zamanda, küçük laboratuar hayvanları ya da özel tıbbi uygulamalar (örneğin, yeni doğmuş teşhis) tekrarlanan kan çekilmesi için uygun yapar. t olarakO lökosit zenginleştirme Tüm peroksidaz-pozitif hücrelerin (nötrofiller, eozinofiller, monositler) elde karışık bir lökosit fraksiyonu dahil edilir ve ayrı akış sitometresi kullanılarak analiz edilebilir eritrositlerin tükenmesi dayanır. yöntem, hızlı, güvenilir ve çok sayıda bilimsel ortamlar için protokol uygun hale kimyasallar ve enstrümantasyon konusunda düşük gereksinimleri vardır.

Nötrofiller kolay kullanılan tampon çözeltisi pH değerinin tam ayar tarif edilen yöntem sırasında bir kritik adım aktive olduğu için (PBS ve HBSS, adım 1.2 ve protokol bölümünün 1.3). Ayrıca damıtılmış su ile kan hücrelerinin inkübasyon süresi normosmotic koşulları (protokol bölümünün adım 2.2 bkz geri yüklemeden önce 60 saniye daha uzun olmalıdır. Eklenmeden önce hücre pelet (adım 2.4) çözücü (neredeyse) tamamen kaldırılması ikinci hipotonik liziz su tutkunu olarak başka kritik bir adımdırer artıkları hipotonik lizis prosedürünün etkinliğini azaltacaktır. Diğer önemli adım APF boyama esnasında H 2 O 2 uygulama anlamına gelir. uygulanan miktar sitotoksik olmamalı rağmen, hücre canlılık kontrol edilmelidir. Çalışmalarımızda sırasında tipik haliyle boya 5,5 geçerlidir ', 6,6'-tetrakloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine iyodür (JC-1) erken apoptotik olayların saptanması için.

Ayrıca, açıklanan basitleştirilmiş lökosit zenginleştirme yöntemi sınırlamaları bir çift vardır. Teknik, birkaç tür (insan, sıçan ve fare denenmiştir) kan örnekleri uygulanabilir olsa da, eritrositlerin lizinin ardından elde edilen lökosit kanda başlangıç ​​bolluk bağlıdır. Ikinci kesinlikle türler 39 arasında değişir ve incelenen pervane bireyin inflamatuar durumuna bağlıdır. Ayrıca, parçalama prosedürü, bir ila yapılabilir iseYüz örnekleri paralel ara madde santrifüj adımları yalnızca 30 numune paralel işlenebilir, kullanılan santrifüje bağlı olarak bir sınırlama oluşturmaktadır. APF kolayca SCN huzurunda HOCl ve HOBr'nin tespit ederken Dahası, -, MPO ve EPO halojenleştirici aktivitesi ikinci yalancı halide etkiler. (- OSCN) bu suretle hypothiocyanite APF oksitleyebileceğini mümkün olan oluşturulur. Diğer bir sınırlama, MPO ve EPO tarafından HOCl- belirlenmesi ve HOBr'nin-yapının üretimi için kullanılan APF boya özellikleri gelir. Boya Floresana oksitlenir gibi, boyama aynı aralıkta yansıtıcı spektrumlu floresan antikorlar ile birleştirilemez. Tabii ki APF türetilmiş floresan ve ek floresan sinyallerin sinyal arasındaki herhangi müdahaleler kontrol ve akış sitometresi içinde telafi edilmesi gerekir.

Aksi takdirde, halojenleme peroksidaz aktivitesinin tespiti kapsamı değilseEritrosit tükenmesi yönteminin uygulanmasından sonra, diğer analitik metodlar yerine AFP kullanılabilir, çalışma. tarif edilen hipotonik lizis prosedürü yalnızca eritrositlerin kısmi tükenmesine ve lökosit olmakta gibi, yine de tek bir hücre analizi uygulanmalıdır izin olan yöntemler elde edilen karma hücre fraksiyonu mevcuttur. (Örneğin, Batı arsa analizi) hücrelerin erimesini içeren Yöntemleri güvenilir sonuçlar vermeyecektir. küçük başlangıç ​​numune hacmi gibi analitik yöntemler için bir engel olabilir.

Hücreler tarafından lökosit MPO (EPO) soruşturma aktivitesini genellikle sadece genel oksidan üretimi ile ilgili yerine özellikle heme peroksidaz aktivitesini 44,45 değerlendirilmesi ele alınmaktadır. Üstelik çoğu zaman hiçbir girişimde halojenleme ve MPO ve EPO 46,47 peroksidaz aktivitesi arasında ayrım yapılır. Özellikle qu tarafından klorlama MPO aktivitesi ele Yöntemler,chlorotyrosine gibi HOCl türevli ürünler antifying okside aşırı ve / veya ürün metabolize algılamak ve böylece genellikle gerçek HOCl üretim 48 küçümsenmesi yol açmaz. Ayrıca bu yöntem, hem de, HOCl türevi 2-chloroethidium tespiti klorlama MPO aktivitesi spesifik tayini için Yeni boyalar ile ilgili bir çok yayın vardır, aynı zamanda zaman alıcıdır maliyetli analitik ekipmanı gerektirir ve hücreler 48-50 .Orada'da erimesini içerir canlı hücrelerde 44,51,52 içinde. Ancak, bugüne kadar yalnızca APF ve ilgili bileşik, hidroksifenil floresein (HPF) ticari olarak temin edilebilen ve bu yüzden rutin araştırma 25,33 olarak kullanılmaktadır.

Aslında, APF kullanarak Bu klorlama MPO aktivitesi, sadece izole edilmiş enzim 53 ile değil, aynı zamanda canlı hücreler 26,33 boyayı uygulayarak ölçülebilir edilemez gösterebilir. Böylece yukarıda belirtilen kan mikro-örneklerinden hızlı lökosit zenginleştirme birleştirerekn APF boyama Özellikle ve aynı anda tüm peroksidaz pozitif lökositlerin, örneğin, nötrofiller, monositler ve eozinofil 32 MPO ve EPO halojenleme aktivitesi yönelik uygun olan bir protokol geliştirilmiştir. Ayrıca yöntem, akış sitometrisi ve konfokal mikroskopi flüoresan içeren analitik yöntemler, geniş bir çeşitlilik sağlar hücre lisisi, gerektirmez. Ayrıca, bu peroksidaz aktivitesi boyama bilimsel göreve bağlı olarak, lökosit alt kısımların özel analiz sağlar hücre yüzeyi markerlerinin uygulanması ile birleştirilebilir. Ancak, uygulanan floresan etiketli antikorlar HOCl- ve HOBr'nin türetilmiş APF oksidasyonu ölçmek için kullanılan flöresan bazlı floresan sinyali karışmaz olduğu göz önünde bulundurulmalıdır.

Özetle bu yöntem immünolojik yeniden halojenleştirici peroksidaz aktivitesinin fizyolojik rolüne daha fazla ayrıntılı bilgi edinmek için yeni bir araç sağlayabilirolan levant kan türevi peroksidazlar MPO ve EPO, yine de 8,20,23 anlaşılamamıştır. Ayrıca romatoid artrit bir hayvan çalışmasında son zamanlarda bu protokol kronik inflamatuar hastalıklar (yayınlanmamış veri) yeni bir klinik belirteç olarak MPO türetilmiş HOCl üretiminin değerlendirilmesine neden olabileceğini görebiliyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Tags

İmmünoloji Sayı 113 Kan hazırlama lökosit zenginleştirme miyeloperoksidaz eozinofil peroksidaz klorlama etkinliği aminofenil floresein
Lökosit zenginleştirilmiş Kan Örneklerinde Halojenleyici Peroksidaz Faaliyet Hızlı ve Özgül Değerlendirme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter