Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend Peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

In dit artikel een protocol voor de snelle en gestandaardiseerde verrijking van leukocyten uit kleine hele bloedmonsters wordt beschreven. Deze procedure is gebaseerd op de hypotonische lysis van erytrocyten en kan worden toegepast op menselijke monsters en bloed van niet-menselijke oorsprong. De aanvankelijke kleine monstervolume van ongeveer 50 tot 100 gl maakt deze methode van toepassing op periodieke bloedmonsters van kleine proefdieren. Bovendien is leukocyten verrijking bereikt binnen enkele minuten en met een laag materiaal inspanningen ten aanzien van chemische stoffen en instrumentatie, het maken van deze methode niet van toepassing in meerdere laboratorium omgevingen.

Gestandaardiseerde zuivering van leukocyten wordt gecombineerd met een zeer selectieve kleuring methode halogeneringsmiddel peroxidase activiteit van het heem peroxidasen evalueren, myeloperoxidase (MPO) en eosinofiel peroxidase (EPO), dat wil zeggen de vorming van hypochloorzuur en onderbromig zuur (HOCl en HOBr). Terwijl MPO is sterk uitgedrukt in neutrophils, het meest voorkomende celtype immuunsysteem in menselijk bloed als in monocyten, de bijbehorende enzym EPO uitsluitend tot expressie gebracht in eosinofielen. Halogeneringsmiddel activiteit van deze enzymen wordt behandeld met het bijna HOCl- en HOBr specifieke kleurstof aminofenyl fluoresceïne (APF) en de primaire peroxidase substraat waterstofperoxide. Bij daaropvolgende flowcytometrieanalyse alle peroxidase-positieve cellen (neutrofielen, monocyten, eosinofielen) zijn onderscheiden en hun halogenerend peroxidase activiteit kan worden gekwantificeerd. Aangezien APF kleuring kan worden gecombineerd met de toepassing van celoppervlak markers, kan dit protocol worden uitgebreid om meer bepaald leukocyt subfracties. De methode is toepasbaar op te sporen HOCl en HOBr productie zowel in de mens en in knaagdieren leukocyten.

Gezien het wijd en divers besproken immunologische rol van deze enzymatische produkten chronische ontstekingsziekten kan dit protocol bijdragen aan een beter begrip van deimmunologische relevantie van leukocyt afgeleide heem peroxidasen.

Introduction

Polymorfonucleaire leukocyten (PMN's, ook wel granulocyten) en monocyten vormen belangrijke cellulaire componenten van het aangeboren immuunsysteem in het bloed 1,2. Zij bijdragen aan de primaire afweer tegen ziekteverwekkers alsook de activering van het verworven immuunsysteem en het initiëren van een systemische ontstekingsreactie 2-4. Maar vooral neutrofielen, de meest voorkomende vorm van granulocyten en monocyten ook aanzienlijk bijdragen tot de regulering en de beëindiging van acute ontstekingen gebeurtenissen 5. Daarom zijn deze cellen kunnen ook een belangrijke rol bij chronische ontstekingsziekten zoals reumatoïde artritis 6,7 spelen. In feite, astma, een pathologie wordt gekenmerkt door een verminderde apoptose van eosinofielen, de tweede soort granulocyten in het bloed 8. Toch is de apoptose van granulocyten en hun snelle verwijdering door macrofagen zijn twee essentiële stappen tijdens de cellulaire beëindiging9-11 van ontsteking.

In de genoemde immuuncellen twee nauw verwante enzymen, namelijk myeloperoxidase (MPO, neutrofielen en monocyten) en eosinofiel peroxidase (EPO, eosinofielen) kan worden gevonden 12,13. Deze heem peroxidasen zijn klassiek gerelateerd aan de humorale immuunrespons mocht twee elektronisch oxideren (pseudo-) halogeniden in de overeenkomstige hypo (pseudo) halous zuren die bekend staan ​​om hun bactericide 14-16. Onder fysiologische omstandigheden MPO voornamelijk vormen hypochloorzuur (HOCl) en hypothiocyaniet (- OSCN) terwijl de laatste en onderbromig acid (HOBr) gevormd door EPO 17-19. Nieuwe resultaten suggereren dat de (pseudo-) halogeneringsmiddel enzymactiviteit kan bijdragen aan de regulering van ontstekingsreacties en de beëindiging van immuunreacties 20,21. In feite is de productie van HOCl MPO en afgeleide producten werden naar T-cellen gebaseerde adaptieve immuunreacties onderdrukken 22-24.

Om meer inzicht in de immunologische rol leukocyten profiteren van het aangeboren immuunsysteem bij chronische ontstekingsziekten en het bepalen van de bijdrage van MPO en EPO deze fysiologische functie hebben we een methode om snel te verrijken leukocyten uit kleine bloedmonsters voor een volgende specifieke bepaling van het halogeneringsmiddel peroxidase activiteit in deze cellen. Voor erytrocyt depletie kozen we een gestandaardiseerde werkwijze omvattende twee opeenvolgende hypotone lysis stappen met gedestilleerd water, wat leidt tot een snelle leukocyten verrijking tegen lage materiaalkosten. Voor de volgende bepaling van de halogenerend MPO en EPO activiteit van de HOCl- en HOBr specifieke kleurstof aminofenyl fluoresceïne (APF) werd gebruikt 25-27. In tegenstelling tot de toepassing van niet-specifieke peroxidase kleuringen 28,29, deze benadering de selectieve detectie van het halogeneringsmiddel peroxidase activiteit, die vaak ernstig is aangetast inflammation 30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle menselijke bloedmonsters werden verkregen van gezonde vrijwilligers, en de toegepaste leukocyten verrijking protocol volgt de richtlijnen van de ethische commissie van de Medische Faculteit van de Universiteit van Leipzig. De experimenten met ratten bloed werden goedgekeurd door de bevoegde lokale ethische commissie (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), volgens de Duitse richtlijnen voor de verzorging van dieren en het gebruik.

1. Experimentele Setup

OPMERKING: de hypotone lysis procedure voor de uitputting van erytrocyten uit de bloedmonsters een tijdkritische procedure bereiden alle benodigde apparatuur (bijvoorbeeld, buffers) voor dit deel van het protocol van tevoren.

  1. Label een 15 ml centrifugebuis voor hypotone lysis en een 1,5 ml monster buis voor de volgende aminofenyl fluoresceïne (APF) kleuring per bloedmonster.
    1. Als het leukocyten verrijking zal worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden, het uitvoeren van deze etikettering onder een stroomdoos.
  2. Bereid ongeveer 12 ml fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 10 mM) per monster. Naargelang de leukocyten onder steriele omstandigheden worden geïsoleerd of neen, PBS hetzij door steriele oplossing bereid van een leverancier of door oplossen PBS tabletten in gedestilleerd water. Controleer de pH en, indien nodig, op pH 7,4 met behulp van kleine hoeveelheden 0,1 M HCl en NaOH oplossingen.
    1. Ontbinden PBS tabletten (zie tabel of Materials) in 200 ml gedestilleerd water aan een niet-steriele bufferoplossing voldoende krijgen ongeveer 16 monsters. Desgewenst steriliseren oplossing steriele filtratie.
  3. Bereid ongeveer 1 ml Hanks gebalanceerde zoutoplossing (HBSS), aangevuld met Ca2 + per monster.
    1. Los op 970 mg van HBSS zout in 100 ml (uiteindelijk volume) dubbel gedestilleerd water. Voor het vullen tot het eindvolume, controleer de pH en stel deze op pH 7,4. Door zijn lage buffercapaciteit, voorbereiding van deze buffer elke dag vers van eend de pH bijzonder zorgvuldig uitvoeren met kleine hoeveelheden van 0,1 M HCl en NaOH oplossingen.
      OPMERKING: Steriele oplossing kan worden gebruikt, afhankelijk van het experiment. De oplossing kan worden gesteriliseerd door steriele filtratie.
  4. Naast de twee buffers, label en stelt een buis (bijvoorbeeld 50 ml centrifugebuis) of kolf (bijvoorbeeld 250 ml maatbeker) met tweemaal gedestilleerd water voor hypotone lysis procedure vooraf. Bereid ongeveer 10 ml water per monster.
  5. Bereid een container met crushed ijs voor de APF kleuring (deel 3), die wordt uitgevoerd op het ijs.
  6. Aliquots van APF vooraf aan de snelle bereiding van werkoplossingen die tijdens de kleuring mogelijk (stap 3,2) en herhaaldelijk voorkomen invriezen en ontdooien van de APF oplossing.
    OPMERKING: APF wordt gewoonlijk verkregen als een 5 mg / ml (11,81 mmol) voorraadoplossing in methylacetaat.
    1. Freeze hoeveelheden van 10-100 pl in 0,5 ml buizen. Voor de APF kleuring een definitiefkleurstof concentratie van 10 uM gebruikt (stap 3,8).

2. hypotone lysis van de erytrocyten

OPMERKING: Voer de hypotone lysis stappen (met uitzondering van het centrifugeren stappen) onder een laminaire stroming bankje om besmetting te voorkomen. Voer de hele procedure bij kamertemperatuur. Aangezien de hypotone lysis is een tijdkritisch proces, pas de pipetten water (2 ml) en PBS (5 ml) toevoeging van tevoren en het water en PBS flacons openen voordat de procedure. Bewaar de PBS-oplossing en gedestilleerd water op kamertemperatuur voor gebruik.

  1. Uit elk bloedmonster overdracht 100 pi aan de juiste 15 ml centrifugebuis.
    Opmerking: In onze experimenten bloedmonsters bevatten gewoonlijk 10 U / ml heparine om stolling te voorkomen. Maar als gevolg van verschillende bronnen van het monstermateriaal de aard en concentratie van de anti-coagulant kunnen verschillen. De invloed op de APF kleuring moet worden getest door comparing de resultaten met de resultaten verkregen uit bloedmonsters aangevuld met andere soorten of concentraties van anti-coagulant.
  2. Voeg 2 ml gedestilleerd water en meng de monsters met behulp van een vortex mixer ingesteld op een gemiddeld niveau. Incubeer de monsters gedurende 60 seconden, voeg dan 5 ml PBS per monster en meng met de vortex mixer.
    OPMERKING: Tot ongeveer 5 monsters worden bereid in parallel. Houd het monster volgorde hetzelfde voor de toevoeging van water en PBS om vergelijkbare incubatietijd te bereiken.
  3. Na regeneratie van isotone omstandigheden door toevoeging PBS (stap 2,2) pellet resterende intacte cellen in alle monsters door centrifugatie gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur en 450 x g.
  4. Verwijder de bovenstaande vloeistof door te gieten in een tabel afvalbak. Verwijder zoveel vloeistof als mogelijk door het omkeren van de centrifugebuis en de opening op een papieren handdoek te tikken. Controleer of de celpellet zo droog mogelijk.
  5. Herhaal de hypotone lysis procedure zoals beschreven (stap 2,2).
    NOTE: In principe dit hypotonische lysis procedure (stappen 2,3-2,5) kan meermaals worden herhaald, afhankelijk van de zuiverheid van de gemengde leukocytfractie te verkrijgen. Na twee lysis stappen het aandeel overblijvende erytrocyten in de verkregen gemengde celfractie ongeveer 25%.
  6. Pellet de resterende intacte cellen door centrifugatie gedurende 6 minuten bij kamertemperatuur en 450 x g. Verwijder de bovenstaande vloeistof (zie stap 2.4). Voeg 500 ul HBSS de pellet voorzichtig los totdat een homogene oplossing wordt verkregen. Transfer elk monster aan de dienovereenkomstig gelabeld 1,5 ml monster buis.
  7. Afhankelijk van het experiment analyseert meteen verkregen monsters (bijvoorbeeld via stroomcytometrie) 25, kleuring met fluorescentie gemerkte antilichamen (voor het identificeren van enkelvoudige celtypen) 32 incuberen met mobiele stimuli (voor celactivering experimenten) 33 of op ijs bewaard en gebruik later. Afhankelijk van het doel van het onderzoek, onmiddellijk Opeenvolgende experimentende gemengde leukocytfractie omdat granulocyten een vrij korte halfwaardetijd van ongeveer 20 uur.
    Opmerking: Dit geldt ook voor de peroxidase activiteit kleuring hieronder beschreven.

3. halogenerend Peroxidase activiteit kleuring

OPMERKING: HOCl- en HOBr-productie door de bloed afgeleide heem peroxidasen MPO en EPO gekwantificeerd door APF, die wordt geoxideerd tot fluoresceïne door de genoemde hypohalous zuren. Dus als cel labeling met fluorescentie-gelabelde antilichamen wordt uitgevoerd in combinatie met APF vlekken, vermijd fluoroforen die interfereren met de emissie signaal van de fluoresceïne.

  1. Voer APF kleuring bij 4 ° C op ijs.
  2. Voor het bereiden van een werkoplossing van APF dooi een geschikte hoeveelheid van de kleurstof (bijvoorbeeld 10 pl, 11,81 mM) en verdund met HBSS precies 1 mM (bijvoorbeeld voeg 108,1 ul buffer aan de 10 pl).
    1. Voor elk monster (500 pi cel-oplossing) voor te bereiden 5 μl van de beschreven APF werkoplossing. Dienovereenkomstig Gebruik een 10 pl aliquot van APF (11,81 mM), die resulteert 118,1 gl APF werkoplossing (1 mM) en ongeveer 20 monsters te bereiden. Door verlies tijdens pipetteren bereiden ongeveer 10% meer APF werkoplossing dan berekend.
  3. Om de specificiteit van de peroxidase kleuring APF controleren bereiden controlemonsters met heem peroxidase remmer 4-aminobenzoëzuur hydrazide (4-ABAH) 35.
    1. Bereid een 1 M voorraadoplossing van 4-ABAH (151,17 g / mol) in dimethylsulfoxide (DMSO) door verdunning van 75,6 mg 4-ABAH in 500 pi oplosmiddel. Verder verdunnen 4-ABAH 1/10 in HBSS.
  4. Voor de bereiding van een H 2 O 2 werkoplossing label twee 1,5 ml centrifugeren buizen met "70 mM H 2 O 2" en "7 mM H 2 O 2", respectievelijk.
    1. In de buis met het label "70 mM H 2 O 2", vers verdund 10 glvan een 30% voorraadoplossing (8,8 mM) H 2 O 2 via 990 gl gedestilleerd water tot een concentratie van ongeveer 88 mM te verkrijgen. Bewaar op ijs en te gebruiken binnen 4 uur.
      OPMERKING: H 2 O 2 wordt gewoonlijk geleverd als een 30% voorraadoplossing door de leveranciers. Indien bewaard bij 4 ° C, is stabiel gedurende ongeveer 3 jaar. Voer verdunningen van H 2 O 2 in gedestilleerd water om ontleding te voorkomen. H 2 O 2 verdunningen kunnen ook worden bereid in 0,1 M NaOH-oplossing.
    2. Voor de bepaling van de exacte H 2 O 2 concentratie bereiden nog 1 tot 10 verdunning van de eerste H 2 O 2 voorraadoplossing (ongeveer 88 mM) door toevoeging van 100 ul van deze oplossing tot 900 ul gedistilleerd water in 1,5 ml buis gelabeld "7 mM H 2 O 2".
    3. Neem een spectrum in het nabije UV bereik (200-300 nm) met behulp van een UV-Vis fotospectrometer en gebruik de absorptie bij 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) om te bepalen van de werkelijke H 2 O 2-concentratie in de tweede H 2 O 2 stockoplossing 34. Zorg ervoor dat de referentiecuvet bevat alleen gedestilleerd water. Voor de meting gebruik kwarts cuvetten een spectrum in het UV-gebied wordt opgenomen.
    4. Uit dit resultaat berekent de exacte concentratie van zowel H 2 O 2 voorraadoplossingen. Dient de concentratie van de eerste voorraadoplossing in de "70 mM H 2 O 2" monsterbuisje exact 70 mM door toevoeging van een geschikte hoeveelheid gedestilleerd water. Bewaar de verkregen werkoplossing op ijs en binnen een uur.
  5. Voeg 5 ul van de 4-ABAH werkoplossing (100 mM) aan de geschikte monsters voor een uiteindelijke concentratie van 1 mM. Incubeer de monsters gedurende 15 minuten bij 37 ° C in de incubator voor APF toevoeging.
  6. Voeg 5 ul APF werkoplossing (1 mM) aan elk500 pl monster tot een uiteindelijke kleurstof concentratie van 10 urn. Meng de monsters voorzichtig (bijvoorbeeld met behulp van de vortex mixer met matige) en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
  7. Voeg 5 ul H 2 O 2 werkoplossing (70 mM) aan elk 500 pl monster voor een eindconcentratie van 700 uM. Meng de monsters en incubeer ze gedurende 60 minuten bij 37 ° C. Voer geschikte controlemetingen in parallel.
    OPMERKING: Controle toonden aan dat 700 uM H 2 O 2 zijn niet toxisch voor de cellen. Ook werden geen significante cellulaire reacties waargenomen.
    OPMERKING: De APF kleuring kan ook worden uitgevoerd door het weglaten van het toevoegen van H 2 O 2, afhankelijk van de wetenschappelijke vraag. Aangezien waterstofperoxide alleen de basale chloreringsmiddel MPO en EPO activiteit wordt bepaald terwijl de toevoeging van H 2 O 2 maakt detectie mogelijk van de maximale HOCl en HOBr productie door de cellen. Thij laatste betekent een aanzienlijk hoger fluorescentiesignaal.
  8. Voor pelleteren van de cellen gecentrifugeerd met monsters gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur en 400 x g. Reinig het supernatans verwijderen zonder de pellet te vernietigen en voeg 250 ul HBSS om de cellen te resuspenderen.
    Opmerking: De monsters zijn nu klaar voor analyse via flowcytometrie 25.
  9. Bewaar de monsters in het donker totdat analyse bleken te voorkomen. Na excitatie bij 480-490 nm detecteren emissie van fluoresceïne bij ongeveer 525 nm 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zoals eerder gemeld de bovenbeschreven werkwijze bleek toepassing zowel menselijke en niet-menselijke materiaal 32. Bovendien zoals getoond voor muizen met astmatische symptomen kunnen de APF kleuring een geschikt instrument om verschillen in de systemische pro-inflammatoire toestand detecteren. Daarom wordt in een volgende studie we dit protocol dat wordt gebruikt om herhaaldelijk te evalueren de halogenerend activiteit van MPO (en EPO) in vrouwelijke Dark Agouti ratten met pristaan-geïnduceerde artritis (PIA). Een representatief voorbeeld van leukocyten verrijking en kleuring uitgevoerd tijdens dit experiment wordt getoond in figuur 1. Ongeveer 200 gl volbloed werd uit de retrobulbaire veneuze plexus van het dier onder verdoving verkregen en heparine. De erytrocyt depletie en een daaropvolgende APF kleuring werden uitgevoerd door 100 ul monstervolume. Daarna werd het monster geanalyseerd door middel van flowcytometrie.

(figuur 1A), een sterke afname van erytrocyten uit het monster werd verkregen. Verder verschillende leukocyten waren duidelijk waarneembaar, die zijn geïdentificeerd door toepassing van fluorescentie gelabelde celoppervlak markers (niet getoond). In het kort de erytrocyten (CD235a-positief) / cel puin regio alleen goed voor 22% van de gebeurtenissen, terwijl ongeveer 48% van de evenementen werden geïdentificeerd als CD16-positief neutrofielen. Bovendien 3% van het evenement elk geïdentificeerd als CCR3-positieve eosinofielen en CD14-positieve monocyten en ongeveer 19% van de gebeurtenissen goed voor CD5 / CD19-positieve T-lymfocyten en B, respectievelijk. De intensiteitsverdeling van de APF-afgeleide fluorescentie (Figuur 1B) duidelijk kon de discriminatie van peroxidase-negatieve erytrocyten en lymfocyten terwijl monocyten en eosinofielen tot een matige APF oxidatie en neutrofielen waren sterk peroxidase-positieve onder chOsen experimentele omstandigheden. Deze resultaten zijn in overeenstemming met de hoge overvloed van MPO in deze cellen in vergelijking met de enzymconcentratie in monocyten 20. De relatief zwakke reactie van de eosinofielen wordt verklaard door het feit, dat er geen bromide werd toegevoegd, waarbij de EPO-afgeleide vorming van HOBr kan hebben geleid. Voorlopige studies op geïsoleerde eosinofielen verrassend niet een grote invloed van buitenaf toegevoegd bromide op de APF oxidatie door deze cellen vertonen. Toch oxidatie van APF door de eosinofielen werd waargenomen die verklaard kunnen worden door de introductie van kleine hoeveelheden Br - via de buffer gebruikte oplossingen (PBS en HBSS). Als alternatief EPO kan ook de productie van kleine hoeveelheden HOCl, althans onder zure omstandigheden (bijvoorbeeld in phagolysosomes).

Figuur 1
Figuur 1: leukocyten verrijking en APF-ontlenend fluorescentie in bloed micro-monster van een rat. Een hoeveelheid van 200 gl totaal bloed werd verkregen van de retrobulbaire plexus venosus van een vrouwelijke Dark Agouti rat. Na toepassing van de beschreven procedure hemolyse 100 gl bloed en een daarop volgende APF kleuren van de gemengde celfractie werd geanalyseerd door flowcytometrie. Zoals blijkt uit de FSC- / SSC- Plot (A) de erytrocyten waren sterk uitgeput uit het monster en de verschillende soorten leukocyten kan gemakkelijk worden onderscheiden. De verdeling van de APF-afgeleide fluorescentie-intensiteit (B) toonde duidelijk aan heem peroxidase-negatieve cellen (erytrocyten en lymfocyten) en leukocyten met een matige (eosinofielen en monocyten) of sterke (neutrofielen) halogenerend peroxidase activiteit. Klik hier om te bekijken grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Als neutrofielen zijn de meest voorkomende leukocyten in menselijk bloed de isolatie van peroxidase-positieve cellen vaak alleen gericht op deze cellen en omvat een scheiding van neutrofielen uit andere leukocyten door dichtheidsgradiënt centrifugatie 38. Nog neutrofielen veel minder overvloedig in muizen 39 bloedmonsters voor deze ingewikkelder methoden worden gebruikt 40. Bovendien beide methoden leiden tot de verwijdering van peroxidase-positieve monocyten uit de monsters en vanwege de noodzaak van grotere hoeveelheden bloed (bijvoorbeeld 400 gl 41), niet van toepassing zijn op micro-monsters verkregen tijdens periodieke bloedmonsters van kleine proefdieren 38,40. De zuivering van muizen neutrofielen uit peritoneale afscheidingen moeten ook het offer van de dieren en, bovendien, niet op basis van bloed granulocyten 38,40 opleveren. Recent ontwikkelde methoden voor zeer zuivere fracties uit muizen granulocyten bl vindenood (bijvoorbeeld, de toepassing van antilichamen) zijn vaak duur, ingewikkeld en tijdrovend 40,42,43 en opnieuw richten zich op de zuivering van een peroxidase-positieve leukocyten type.

Dus de hier gepresenteerde methode heeft een aantal voordelen boven andere werkwijzen toegepast voor de zuivering van peroxidase-positieve leukocyten. Deze is gebaseerd op kleine bloedmonsters verkregen cellen zijn de situatie in de circulatie. Vanwege de kleine aanvankelijke monstervolume nodig voor het protocol van de methode is toepasbaar op zowel menselijke als niet-menselijke bloed, ondanks de soort-specifieke verschillen in de overvloed van neutrofielen. In feite hebben we konden zelfs de beschreven werkwijze bloedvolume van slechts 50 ul initiële toepassing (gegevens niet getoond). De kleine bloedmonster nodig zijn voor de methode maakt het ook geschikt voor herhaalde bloedafname van kleine proefdieren of voor speciale medische toepassingen (bv, pasgeboren diagnose). als tHij leukocyt verrijking is gebaseerd op de afbraak van erytrocyten alle peroxidase-positieve cellen (neutrofielen, eosinofielen, monocyten) zijn opgenomen in de verkregen gemengde leukocytfractie wel apart geanalyseerd met behulp van flow cytometrie. De methode is snel, betrouwbaar en heeft een lage eisen ten aanzien van chemische stoffen en instrumentatie, waardoor het protocol geschikt voor meerdere wetenschappelijke omgevingen.

Als neutrofielen zeker een belangrijke stap worden geactiveerd tijdens de beschreven werkwijze is de nauwkeurige instelling van de pH-waarde van de gebruikte bufferoplossingen (PBS en HBSS, zie stappen 1.2 en 1.3 van de sectie protocol). Verder is de incubatietijd van de bloedcellen met gedestilleerd water mag niet langer dan 60 seconden voordat het herstel van normosmotic voorwaarden (zie stap 2.2 van de sectie protocol. De (bijna) volledig verwijderen van het oplosmiddel uit de cel pellet (stap 2.4) voor de toevoeging van water voor de tweede hypotonische lysis is een cruciale stap als buffer resten de efficiëntie van de hypotone lysis procedure verminderen. Een andere belangrijke stap betreft de toepassing van H 2 O 2 tijdens de APF kleuring. Hoewel de toegepaste hoeveelheid niet cytotoxisch moet zijn, dient celvitaliteit worden gecontroleerd. Tijdens onze studies meestal passen we de kleurstof 5,5', 6,6'-tetrachloor-1,1 ', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine jodide (JC-1) voor de detectie van vroege apoptotische gebeurtenissen.

Bovendien zijn er een aantal beperkingen in de beschreven vereenvoudigde leukocyt werkwijze van verrijking. Hoewel de techniek kan worden toegepast op bloedmonsters van verschillende soorten (mens, rat en muis zijn geprobeerd), leukocyten bedrag verkregen na lysis van erytrocyten afhankelijk van hun aanvankelijke overvloed in het bloed. Deze laatste varieert wel tussen soorten 39 en is ook afhankelijk van de ontstekingstoestand van het getaste individu. Bovendien, terwijl de lysis procedure kan met maximaal eenhonderden monsters tegelijk de tussenliggende centrifugatiestappen vormen een beperking, afhankelijk van de gebruikte centrifuge, slechts tot 30 monsters parallel worden verwerkt. Terwijl verder APF gemakkelijk gedetecteerd HOCl en HOBr in aanwezigheid van SCN - het halogeneringsmiddel activiteit van MPO en EPO beïnvloedt ook de laatste pseudo-halogenide. Daarbij hypothiocyaniet (- OSCN) wordt gevormd dat niet kan oxideren APF. Een andere beperking komt van de eigenschappen van de APF kleurstof gebruikt voor de bepaling van HOCl- en HOBr-productie met MPO en EPO. Aangezien de kleurstof wordt geoxideerd tot fluoresceïne, kunnen de vlekken niet gecombineerd worden met fluorescente antilichamen met een emissiespectrum in hetzelfde bereik. Uiteraard is iedere interferenties tussen de APF-afgeleide fluorescentie en het signaal van extra fluorescerende signalen moeten worden gecontroleerd en gecompenseerd in de flowcytometer.

Anders, als de detectie van het halogeneringsmiddel peroxidase activiteit niet de reikwijdte van destudie, na toepassing van de erytrocyt depletie werkwijze andere analysemethoden worden gebruikt in plaats van APF. Als het beschreven hypotone lysis procedure leidt slechts tot gedeeltelijke uitputting van erytrocyten en leukocyten alle nog aanwezig in het verkregen gemengde celfractie, alleen methoden waarmee een enkele cel analyse worden toegepast. Methoden die de lysis van cellen (bijvoorbeeld, Western plot analyse) omvatten niet betrouwbare resultaten op. De kleine aanvankelijke monstervolume kan een ander obstakel voor dergelijke analytische methoden.

Bij het ​​onderzoek van MPO (en EPO) activiteit leukocyten vaak slechts de algemene oxidatiemiddel productie door de cellen is gericht in plaats van specifiek evalueren van de heem peroxidase activiteit 44,45. Bovendien is vaak geen pogingen worden gedaan om onderscheid te maken tussen de halogenerend en de peroxidase activiteit van MPO en EPO 46,47. Methoden, die specifiek ingaan op het chloreren van MPO-activiteit door Quantifying HOCl-afgeleide producten zoals chlorotyrosine niet detecteren via geoxideerde en / of gemetaboliseerd producten en dus vaak tot een onderschatting van de werkelijke HOCl productie 48. Bovendien is deze werkwijze en de detectie van HOCl-afgeleide 2-chloroethidium ook tijdrovend, hebben dure analyseapparatuur en omvatten lysis van cellen 48-50 .Er zijn veel meldingen over nieuwe kleurstoffen voor de specifieke bepaling van het chloreringsmiddel MPO activiteit binnen vitale cellen 44,51,52. Maar tot op heden slechts APF en de bijbehorende verbinding hydroxyfenyl fluoresceïne (HPF) zijn in de handel verkrijgbaar en daarom routinematig gebruikt in het onderzoek 25,33.

In feite, door APF konden aantonen dat de chloreren MPO-activiteit kan niet alleen worden gekwantificeerd door het geïsoleerde enzym 53 maar ook door het toepassen van de kleurstof aan levende cellen 26,33. Dus door het combineren van de snelle leukocyten verrijking bloed micro-monsters gezegd met eenn APF kleuring ontwikkelden we een protocol dat geschikt is om specifiek en gelijktijdig pakken halogeneringsmiddel activiteit van MPO en EPO in elke peroxidase positieve leukocyten, dwz, neutrofielen, monocyten en eosinofielen 32. Bovendien is de methode niet cellysis, die een brede verscheidenheid aan analytische methoden, waaronder flowcytometrie en confocale fluorescentiemicroscopie verleent, aanwezig zijn. Bovendien is deze peroxydase kleuring kan worden gecombineerd met de toepassing van celoppervlak markers, die de specifieke analyse van leukocyten subfracties maakt, afhankelijk van de wetenschappelijke opdracht. Toch moet worden aangenomen dat de toegepaste fluorescentie-gemerkte antilichamen niet interfereren met fluoresceïne gebaseerde fluorescentiesignaal gebruikt om de HOCl- en HOBr-afgeleide APF oxidatie kwantificeren.

Samenvattend kan deze werkwijze een nieuw hulpmiddel om meer inzicht te krijgen in de fysiologische rol van het halogeneringsmiddel peroxidase activiteit van de immunologische re biedenlevant bloed afgeleide peroxidasen MPO en EPO, die nog niet goed begrepen 8,20,23. Bovendien in een dierstudie op reumatoïde artritis konden we onlangs opmerken dat dit protocol kan leiden tot de beoordeling van de MPO-afgeleide HOCl productie als nieuwe klinische merker bij chronische ontstekingsziekten (ongepubliceerde gegevens).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Tags

Immunologie Blood voorbereiding leukocyten verrijking myeloperoxidase eosinofiel peroxidase chloreren activiteit aminofenyl fluoresceïne
Snelle en specifieke beoordeling van de halogenerend Peroxidase activiteit in leukocyten verrijkte bloedmonsters
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter