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Immunology and Infection

Évaluation rapide et spécifique de l'halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

Dans cet article, un protocole pour l'enrichissement rapide et homogène des leucocytes à partir de petits échantillons de sang entier est décrit. Cette procédure est basée sur la lyse hypotonique des érythrocytes et peut être appliqué à des échantillons humains, ainsi que le sang d'origine non humaine. Le petit volume d'échantillon initial d'environ 50 à 100 ul rend cette méthode applicable au prélèvement de sang périodique de petits animaux de laboratoire. En outre, l'enrichissement des leucocytes est réalisé en quelques minutes et avec des efforts matériels faibles en ce qui concerne les produits chimiques et de l'instrumentation, ce qui rend cette méthode applicable dans les environnements de laboratoire multiples.

La purification normalisée des leucocytes est combiné avec un procédé hautement sélectif de coloration pour évaluer l' activité de la peroxydase halogénation des peroxydases de l' hème, la myéloperoxydase (MPO) et éosinophile peroxydase (EPO), à savoir la formation d'hypochloreux et de l' acide hypobromeux (HOCl et HOBr). Alors que FTU est fortement exprimé dans neutrophils, immunitaire de type cellulaire le plus abondant dans le sang humain, ainsi que dans les monocytes, l'enzyme lié à l'EPO est exclusivement exprimé dans les éosinophiles. L'activité d'halogénation de ces enzymes est traitée en utilisant la fluorescéine presque HOCl- et HOBr colorant spécifique aminophényl (CSA) et le substrat de la peroxydase primaire du peroxyde d'hydrogène. Lors de l'analyse ultérieure de cytométrie de flux de toutes les cellules positives à la peroxydase (neutrophiles, les monocytes, les éosinophiles) sont distinguables et leur activité de peroxydase d'halogénation peuvent être quantifiés. Etant donné que la coloration du CSA peut être combiné avec l'application de marqueurs de surface cellulaire, ce protocole peut être étendu pour traiter spécifiquement les sous-fractions de leucocytes. Le procédé est applicable à la détection de HOCl et HOBr la production à la fois chez l'homme et dans les leucocytes de rongeurs.

Étant donné le rôle immunologique largement et diversement discuté de ces produits enzymatiques dans les maladies inflammatoires chroniques, ce protocole peut contribuer à une meilleure compréhension de lapertinence immunologique de peroxydases hème leucocytaires dérivés.

Introduction

Les leucocytes polynucléaires (PMN, également appelés granulocytes et monocytes) représentent les composants cellulaires importants du système immunitaire inné du 1,2 sanguin. Elles contribuent à la première ligne de défense contre les agents pathogènes ainsi qu'à l'activation du système immunitaire acquis , et l'initiation d'une réponse inflammatoire systémique 2-4. Pourtant , en particulier des neutrophiles, le type de granulocytes le plus abondant, et monocytes contribuent également de manière significative à la réglementation et à la fin des événements inflammatoires aigus 5. Par conséquent , ces cellules peuvent également jouer un rôle important dans les maladies inflammatoires chroniques comme la polyarthrite rhumatoïde 6,7. En effet, l' asthme, une maladie pulmonaire inflammatoire chronique, est caractérisée par une déficience de l' apoptose des eosinophiles, le deuxième type de granulocytes dans le sang 8. Pourtant, l'apoptose des granulocytes et de leur élimination rapide par les macrophages sont deux étapes essentielles pendant la terminaison cellulairede l' inflammation 11/09.

Dans les cellules immunitaires nommées deux enzymes étroitement liées, à savoir la myéloperoxydase (MPO, neutrophiles et monocytes) et peroxydase éosinophile (EPO, éosinophiles) peut être trouvé 12,13. Ces peroxydases hème sont classiquement liées à la réponse immunitaire humorale comme ils oxydent deux électroniquement (pseudo-) halogénures à l'hypo (pseudo) correspondant acides halous qui sont connus pour leurs propriétés bactéricides 14-16. Dans des conditions physiologiques FTU principalement forme de l' acide hypochloreux (HOCl) et hypothiocyanite (- RCSO) , tandis que l'acide hypobromeux celui- ci et (HOBr) sont formées par l' OEB 17-19. De nouveaux résultats suggèrent que cette (pseudo-) activité halogénation enzymatique peut également contribuer à la régulation des réponses inflammatoires et à la fin des réactions immunitaires 20,21. En effet, la production de HOCl par la MPO et de produits dérivés ont été présentés pour supprimer T à base de cellules réponses immunitaires adaptatives 22-24.

Afin d'obtenir plus d'idées sur le rôle immunologique des leucocytes du système immunitaire inné à des maladies inflammatoires chroniques et de déterminer la contribution du MPO et de l'OEB à cette fonction physiologique, nous avons développé une méthode pour enrichir rapidement les leucocytes à partir de petits échantillons de sang pour une spécifique ultérieure détermination de l'activité de peroxydase halogénation dans ces cellules. Pour érythrocytaire épuisement, nous avons choisi une méthode normalisée, y compris deux étapes ultérieures de lyse hypotonique avec de l'eau distillée, ce qui conduit à un enrichissement leucocytaire rapide à des coûts de matériaux faibles. Pour la détermination subséquente de la FTU halogénant et l' activité EPO et la HOCl- HOBr spécifique colorant aminophényl fluorescéine (CSA) a été utilisée 25-27. Contrairement à l'application de la peroxydase non spécifique des méthodes de coloration 28,29, cette approche permet la détection sélective de l'activité de peroxydase halogénation, ce qui est souvent altérée à infl sévèreammation 30,31.

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Protocol

Tous les échantillons de sang humain ont été obtenus chez des volontaires sains, et le protocole d'enrichissement leucocytaire appliqué suit les lignes directrices de l'éthique commission de la Faculté de médecine de l'Université de Leipzig. Les expériences avec le sang de rat ont été approuvés par le comité d'éthique local responsable (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), selon les directives allemandes sur le soin des animaux et l'utilisation.

1. Configuration expérimentale

NOTE: Comme la procédure de lyse hypotonique de l'épuisement des érythrocytes à partir des échantillons de sang est une procédure de temps critique, préparer tout le matériel nécessaire (par exemple, des tampons) pour cette partie du protocole à l' avance.

  1. Repérer un 15 ml tube de centrifugeuse pour la lyse hypotonique et un tube de 1,5 ml échantillon pour aminophényl ultérieure fluorescéine (APF) coloration par échantillon de sang.
    1. Si l'enrichissement leucocytaire sera effectuée dans des conditions stériles, effectuer ce marquage sous un fluxboîte.
  2. Préparer environ 12 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 10 mM) par échantillon. Selon que les leucocytes sont isolés, sous des conditions stériles ou non, de préparer du PBS, soit en utilisant une solution stérile prête à un fournisseur ou par dissolution de comprimés de PBS dans de l'eau distillée. Vérifier la valeur du pH et, si nécessaire, ajuster le pH à 7,4 en utilisant de petites quantités de HCl 0,1 M et des solutions de NaOH.
    1. Dissoudre des comprimés de PBS (voir tableau des matériaux) dans 200 ml d'eau distillée pour obtenir une solution tampon non stérile suffisante pour environ 16 échantillons. Si l'on désire stériliser cette solution par filtration stérile.
  3. Préparer environ 1 ml de solution saline équilibrée de Hanks (HBSS) additionnée de Ca 2+ par échantillon.
    1. Dissoudre 970 mg de sel HBSS dans 100 ml (volume final) de l'eau bidistillée. Avant de remplir le volume final, vérifier la valeur du pH et l'ajuster à pH 7,4. En raison de son faible pouvoir tampon, préparer ce tampon fraîchement chaque jour und effectuer l'ajustement du pH avec un soin particulier à l'aide de petites quantités de 0,1 solutions de HCl M et NaOH.
      NOTE: Solution stérile peut être utilisée, en fonction de l'expérience. La solution peut être stérilisée par filtration stérile.
  4. Outre les deux mémoires tampon, l' étiquette et la préparation d' un tube (par exemple 50 ml tube de centrifugation) ou le flacon (par exemple, 250 ml d'une tasse à mesurer) avec de l' eau bidistillée pour la procédure de lyse hypotonique à l' avance. Préparer environ 10 ml d'eau par échantillon.
  5. Préparer un récipient avec de la glace pilée pour la coloration APF (section 3), qui est effectuée sur la glace.
  6. Préparer des aliquotes de l'APF à l'avance pour permettre la préparation rapide des solutions de travail utilisées au cours de la coloration (étape 3.2) et d'éviter à plusieurs reprises congélation et la décongélation de la solution CSA.
    NOTE: APF est généralement obtenu sous forme d'un 5 mg / ml (mM 11,81) de solution mère dans de l'acétate de méthyle.
    1. Congeler aliquotes de 10-100 ul dans 0,5 ml tubes. Pour l'APF coloration finaleconcentration de colorant de 10 uM est utilisée (étape 3.8).

2. hypotonique lyse des érythrocytes

REMARQUE: Effectuez les étapes de lyse hypotonique (sauf les étapes de centrifugation) sous un banc de flux laminaire pour éviter toute contamination. Effectuez toute la procédure à la température ambiante. Comme la lyse hypotonique est un processus critique de temps, ajuster les pipettes pour l'eau (2 ml) et PBS (5 ml) plus à l'avance et ouvrir l'eau et des flacons de PBS avant de commencer la procédure. Conserver la solution PBS et l'eau distillée à la température ambiante avant utilisation.

  1. De chaque transfert d'échantillons de sang de 100 pi au tube de 15 ml de centrifugation approprié.
    REMARQUE: Dans nos expériences, des échantillons de sang contiennent habituellement de 10 U / ml d'héparine pour éviter la coagulation. Pourtant, du fait de différentes sources du matériau d'échantillon, la nature et la concentration de l'anti-coagulant peuvent être différentes. Son influence sur la coloration du CSA doit être testé par comparment les résultats aux résultats obtenus à partir d'échantillons de sang supplémentées avec d'autres types ou concentrations d'anti-coagulant.
  2. Ajouter 2 ml d'eau distillée et mélanger les échantillons en utilisant un mélangeur à vortex réglé à un niveau moyen. Incuber les échantillons pendant 60 secondes, puis ajouter 5 ml de PBS par échantillon et mélanger à l'aide du mélangeur vortex.
    REMARQUE: jusqu'à environ 5 échantillons peut être préparé en parallèle. Gardez l'ordre de même pour l'addition d'eau et PBS pour obtenir des temps d'incubation comparables échantillon.
  3. Après régénération des conditions isotoniques par addition de PBS (étape 2.2) sédimenter les cellules intactes restantes dans tous les échantillons par centrifugation pendant 6 minutes à la température ambiante et 450 x g.
  4. Retirer le surnageant en le versant dans une poubelle de table. Retirez autant de liquide que possible en inversant le tube de centrifugation et en tapant l'ouverture sur une serviette en papier. Assurez-vous que le culot cellulaire est aussi sec que possible.
  5. Répétez la procédure de lyse hypotonique comme décrit précédemment (étape 2.2).
    NOTE: En principe, cette procédure de lyse hypotonique (étapes 02/03 à 02/05) peut être répété plusieurs fois, en fonction de la pureté de la fraction leucocytaire mixte à obtenir. Après deux étapes de lyse de la part des globules rouges restant dans la fraction cellulaire obtenue est mélangée à environ 25%.
  6. Sédimenter les cellules intactes restantes par centrifugation pendant 6 minutes à la température ambiante et 450 x g. Retirer le surnageant (voir étape 2.4). Ajouter 500 ul de HBSS à la pastille et dissoudre doucement jusqu'à l'obtention d'une solution homogène. Transférer chaque échantillon à 1,5 ml tube d'échantillon étiquetés en conséquence.
  7. Selon l'expérience d' analyser directement les échantillons obtenus (par exemple, par l' intermédiaire de cytométrie de flux) 25, tache avec des anticorps marqués par fluorescence (pour l' identification des types de cellules isolées) 32, incuber avec des stimuli cellulaires (pour les expériences d'activation des cellules) 33 ou stocké sur de la glace et l' utilisation plus tard. Selon le but de l'étude, effectuer immédiatement des expériences ultérieures surla fraction leucocytaire mixte depuis granulocytes ont une demi-vie relativement courte d'environ 20 heures.
    NOTE: Cela vaut également pour la coloration de l'activité peroxydase décrite ci-dessous.

3. Activité Peroxydase halogénation Staining

NOTE: HOCl- et HOBr-production par les hème peroxydases dérivés du sang MPO et de l'OEB est quantifiée à l'aide de l'APF, qui est oxydé en fluorescéine par les acides hypohalogéneux nommés. Par conséquent, si le marquage cellulaire avec des anticorps marqués par fluorescence est réalisée en combinaison avec une coloration APF, d'éviter des fluorophores qui interfèrent avec le signal d'émission de la fluorescéine.

  1. Effectuer APF coloration à 4 ° C sur la glace.
  2. Pour la préparation d' une solution de travail de l' APF décongeler une aliquote appropriée du colorant (par exemple, 10 ul, 11,81 mM) et de le diluer avec du HBSS à 1 mM (par exemple, ajouter 108,1 ul de tampon au 10 ul) exactement.
    1. Pour chaque échantillon (500 ul de solution de cellules) préparer 5 μl de la solution de travail du CSA décrit. Par conséquent, utiliser une 10 aliquote pi de l'APF (11,81 mM), ce qui donne 118,1 solution de travail APF pi (1 mM) pour préparer environ 20 échantillons. En raison de la perte pendant le pipetage préparer environ 10% de plus que la solution de travail APF calculée.
  3. Afin de vérifier la spécificité de la peroxydase de la coloration APF, préparer des échantillons de contrôle avec l'inhibiteur de la peroxydase hème hydrazide de l' acide 4-aminobenzoïque (4-ABAH) 35.
    1. Préparer une solution mère de 4-ABAH (151.17 g / mol) dans du diméthylsulfoxyde (DMSO) 1 M en diluant 75,6 mg de 4-ABAH en solvant 500 pi. diluer 4-ABAH 1/10 dans du HBSS.
  4. Pour la préparation d'une étiquette d' une solution de H 2 O 2 de travail de 1,5 ml deux tubes de centrifugation avec "70 mM de H 2 O 2" et "7 mM de H 2 O 2», ​​respectivement.
    1. Dans le tube marqué "70 mM de H 2 O 2", fraîchement dilué 10 uld'une solution stock de 30% (8,8 mM) de H 2 O 2 en utilisant 990 ul d' eau distillée pour obtenir une concentration d'environ 88 mM. Stocker sur la glace et utiliser dans les 4 heures.
      NOTE: H 2 O 2 est généralement livré sous forme de solution stock de 30% par les fournisseurs. Lorsqu'ils sont stockés à 4 ° C, elle est stable pendant environ 3 ans. Effectuer des dilutions de H 2 O 2 dans de l' eau distillée pour éviter la décomposition. H 2 O 2 dilutions peuvent également être préparées dans une solution 0,1 M de NaOH.
    2. Pour la détermination de la H exacte concentration 2 O 2 Préparer une dilution supplémentaire de 1 à 10 à partir de la première H 2 O 2 de solution mère (environ 88 mM) , par addition de 100 ul de cette solution à 900 ul d' eau distillée dans le tube 1,5 ml étiqueté "7 mM de H 2 O 2".
    3. Enregistrer un spectre dans le proche UV (par exemple, 200-300 nm) en utilisant un photospectromètre UV-Vis et utiliser l'absorbance à 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) pour déterminer la concentration réelle H 2 O 2 dans la seconde H 2 O 2 de solution mère 34. Assurez-vous que la cuvette de référence contient de l'eau distillée. Pour la mesure de l'utilisation des cuvettes de quartz comme un spectre dans la gamme UV est enregistrée.
    4. De ce résultat, calculer les concentrations exactes des deux H 2 O 2 solutions mères. Ajuster la concentration de la première solution mère dans le "2 O 2 70 mM H" tube échantillon exactement 70 mM en ajoutant une quantité appropriée d'eau distillée. Conservez la solution de travail obtenu sur la glace et utiliser moins d'une heure.
  5. Ajouter 5 ul de la solution de travail 4 ABAH (100 mM) aux échantillons appropriés pour une concentration finale de 1 mM. Incuber les échantillons pendant 15 min à 37 ° C dans l'incubateur avant l'addition du CSA.
  6. Ajouter 5 ul de solution de travail du CSA (1 mM) à chaque500 ul de l'échantillon pour obtenir une concentration finale de colorant de 10 uM. Mélanger les échantillons doucement (par exemple, en utilisant le mélangeur vortex sur un réglage moyen) et incuber pendant 30 min à 37 ° C.
  7. Ajouter 5 ul de solution de H 2 O 2 de travail (70 mM) à chaque échantillon de 500 pi pour obtenir une concentration finale de 700 uM. Mélanger délicatement les échantillons et les incuber pendant 60 min à 37 ° C. Effectuer des mesures de contrôle appropriées en parallèle.
    REMARQUE: Les mesures de contrôle ont montré que 700 uM de H 2 O 2 ne sont pas toxiques pour les cellules. les réponses cellulaires significatives ont été observées ne.
    NOTE: La coloration APF peut également être effectuée en omettant l'addition de H 2 O 2, en fonction de la question scientifique. En l'absence de peroxyde d'hydrogène que l'FTU chlorant de base et l' activité EPO est déterminée tandis que l'addition de H 2 O 2 permet la détection du maximum de HOCl et HOBr la production par les cellules. Til signifie ce dernier un signal fluorescent significativement plus élevé.
  8. Pour la granulation des cellules, centrifuger les échantillons pendant 10 minutes à la température ambiante et 400 x g. Retirer soigneusement le surnageant sans détruire le culot et ajouter 250 ul HBSS pour remettre en suspension les cellules.
    NOTE: Les échantillons sont maintenant prêts pour l' analyse par cytométrie en flux 25.
  9. Stocker les échantillons dans l'obscurité jusqu'à ce que l'analyse afin d'éviter le blanchiment. Après excitation à 480-490 nm détecter l'émission de fluorescéine à environ 525 nm 37.

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Representative Results

Comme indiqué précédemment le procédé décrit ci - dessus avéré être applicable aussi bien aux humains et aux matières non humain 32. En outre, comme indiqué pour les souris présentant des symptômes asthmatiques la coloration APF peut être un outil approprié pour détecter des différences dans l'état pro-inflammatoire systémique. Par conséquent , dans une étude ultérieure , nous avons utilisé ce protocole pour évaluer de façon répétée l'activité d'halogénation du MPO (et EPO) chez des rats femelles foncé Agouti avec l' arthrite induite par le pristane (PIA). Un exemple représentatif d'enrichissement des leucocytes et la coloration réalisée au cours de cette expérience est présenté sur la figure 1. Environ 200 ul de sang entier a été obtenu à partir du plexus veineux rétro - orbitaires de l'animal sous anesthésie et hépariné. L'épuisement des érythrocytes et une coloration APF subséquente ont été effectuées en utilisant un volume de 100 ul échantillon. Ensuite, l'échantillon a été analysé par cytométrie de flux.

(figure 1A), une forte diminution des globules rouges de l'échantillon a été atteint. Par ailleurs les types de leucocytes différents étaient clairement perceptibles, qui ont été identifiées en appliquant des marqueurs de la surface cellulaire marqués par fluorescence (non représenté). En bref érythrocytes (CD235a-positive) / région de débris cellulaires ne représentaient que 22% des événements, tandis qu'environ 48% des événements ont été identifiés comme les neutrophiles CD16-positif. En outre 3% des événements ont chacun été identifiés comme éosinophiles CCR3 positif et monocytes CD14-positif et environ 19% des événements ont représenté CD5 / CD19-positif lymphocytes B et T, respectivement. La distribution de l' intensité de la fluorescence APF dérivés (figure 1B) clairement permis à la discrimination des érythrocytes et des lymphocytes peroxydase négative , tandis que les monocytes et les éosinophiles ont conduit à une oxydation APF modérée et neutrophiles étaient fortement peroxydase-positifs sous le chOsen conditions expérimentales. Ces résultats sont en ligne avec la forte abondance de MPO dans les dernières cellules par rapport à la concentration d'enzyme dans les monocytes 20. La réponse relativement faible des éosinophiles peut être expliqué par le fait, que personne ne le bromure a été ajouté, ce qui peut avoir incité la formation EPO dérivée de HOBr. Des études préliminaires sur les éosinophiles isolés étonnamment n'a pas montré une grande influence de bromure ajoutée à l'extérieur sur l'oxydation APF par ces cellules. Pourtant, l' oxydation du CSA par les éosinophiles a été observé que l' on peut expliquer par l'introduction de petites quantités de Br - via les solutions tampons utilisées (PBS et HBSS). En variante EPO peut également produire de petites quantités de HOCl, au moins dans des conditions acides (par exemple, en phagolysosomes).

Figure 1
Figure 1: enrichissement leucocytaire et APF-derived fluorescence dans un sang de micro-échantillon provenant d' un rat. Une quantité d'environ 200 ul de sang entier a été obtenu à partir du plexus veineux rétro - bulbaire d'une femelle de rat noir agouti. Après l'application de la procédure décrite à l'hémolyse de 100 ul de sang et un FPA coloration subséquente de la fraction cellulaire mixte a été analysée par cytométrie de flux. Comme le montre le FSC / SSC- Plot (A) les érythrocytes sont fortement appauvries de l'échantillon et les différents types de leucocytes pourraient facilement être distingués. La distribution de l'intensité de fluorescence APF dérivés (B) a clairement montré hème peroxydase négatif cellules (érythrocytes et lymphocytes), ainsi que les leucocytes avec modérés (éosinophiles et les monocytes) ou forte (neutrophiles) activité halogénation peroxydase. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une une plus grande version de ce chiffre.

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Discussion

Que les neutrophiles sont les plus abondants dans les leucocytes du sang humain l'isolement de cellules peroxydase positives concentre souvent uniquement sur ​​ces cellules et comprend une séparation des neutrophiles à partir d' autres leucocytes par centrifugation sur gradient de densité 38. Pourtant , comme les neutrophiles sont beaucoup moins abondantes dans les échantillons sanguins murins 39 pour les méthodes plus complexes ces dernières doivent être utilisées 40. Par ailleurs les deux méthodes conduisent également à l'élimination des monocytes peroxydase positives à partir des échantillons et, en raison de la nécessité de plus grands volumes de sang (par exemple, 400 ul 41) ne sont pas applicables aux micro-échantillons obtenus lors récidivante prélèvement de sang à partir de petits animaux de laboratoire 38,40. La purification de neutrophiles murins de exsudats péritonéaux ont besoin aussi le sacrifice des animaux et, en outre, ne donne pas de granulocytes dérivés du sang 38,40. Récemment mis au point des méthodes pour obtenir des fractions de granulocytes hautement purifiés à partir de bl murinood (par exemple, l'application des anticorps) sont souvent coûteux, compliqué et prend du temps 40,42,43 et à nouveau se concentrer uniquement sur ​​la purification d'un type de leucocyte Peroxydase positif.

Ainsi, la méthode présentée ici comporte plusieurs avantages par rapport aux autres méthodes utilisées pour la purification des leucocytes peroxydase positif. Comme il est basé sur de petits échantillons de sang les cellules obtenues représentent la situation de la circulation. En raison du faible volume de l'échantillon initial nécessaire pour le protocole de la méthode est applicable à la fois humaine et de sang non-humain, en dépit des différences spécifiques à l'espèce dans l'abondance des neutrophiles. En fait, nous avons même pu appliquer la méthode décrite initiale des volumes aussi petits que 50 ul de sang (données non présentées). Le petit échantillon de sang nécessaire pour la méthode permet également approprié pour répéter le retrait de sang de petits animaux de laboratoire ou pour des applications médicales spéciales (par exemple, le diagnostic du nouveau - né). Comme til enrichissement leucocytaire est basé sur l'épuisement de toutes les cellules de globules rouges peroxydase positif (neutrophiles, les eosinophiles, les monocytes) sont inclus dans la fraction leucocytaire mixte obtenue et peuvent être analysées séparément en utilisant la cytométrie de flux. La méthode est rapide, fiable et a de faibles exigences en matière de produits chimiques et de l'instrumentation, ce qui rend le protocole approprié pour les environnements scientifiques multiples.

Que les neutrophiles sont facilement activés une étape critique au cours du procédé décrit est le réglage précis de la valeur du pH des solutions tampons utilisées (PBS et HBSS, voir les étapes 1.2 et 1.3 de la section de protocole). En outre, le temps d'incubation des cellules du sang avec de l'eau distillée ne doit pas être supérieure à 60 secondes avant le rétablissement des conditions normosmotic (voir étape 2.2 de la section de protocole. Le (ou presque) complète l'élimination du solvant à partir du culot de cellules (étape 2.4) avant l'addition de l'eau pour la deuxième lyse hypotonique est une autre étape critique buffles résidus d'ER diminuer l'efficacité de la procédure de lyse hypotonique. Une autre étape importante concerne l'application de H 2 O 2 au cours de la coloration du CSA. Bien que la quantité appliquée ne doit pas être cytotoxique, la vitalité des cellules doit être vérifiée. Au cours de nos études, nous utilisons habituellement le colorant 5,5 ', 6,6'-tétrachloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-iodure dazolylcarbocyanine (JC-1) pour la détection d'événements apoptotiques précoces.

En outre, il y a quelques limitations dans le procédé d'enrichissement de leucocyte simplifiée décrite. Bien que la technique peut être appliquée à des échantillons de sang provenant de plusieurs espèces (homme, le rat et la souris ont été testées), la quantité de leucocytes obtenue après lyse des érythrocytes dépend de leur abondance initiale dans le sang. Celle - ci varie certes entre les espèces 39 et est également dépendant de l'état inflammatoire de l'individu sondé. En outre, alors que la procédure de lyse peut être effectuée jusqu'à uneCent échantillons en parallèle, les étapes de centrifugation intermédiaire constituent une limitation, en fonction de la centrifugeuse utilisée uniquement jusqu'à 30 échantillons peuvent être traités en parallèle. En outre, alors que l' APF détecte facilement HOCl et HOBr en présence du SCN -, l'activité de la MPO halogénation et l' OEB affecte aussi à cette dernière pseudo-halogénure. Ainsi hypothiocyanite (- RCSO) est formé qui est incapable de s'oxyder CSA. Une autre limitation provient des propriétés du colorant APF utilisé pour la détermination de HOCl- et HOBr production par MPO et de l'OEB. Comme le colorant est oxydé en la fluorescéine, la coloration ne peut être combiné avec des anticorps fluorescents avec un spectre d'émission dans la même gamme. Bien sûr, toutes les interférences entre la fluorescence APF dérivés et le signal de signaux fluorescents supplémentaires doivent être vérifiés et compensés dans le cytomètre de flux.

Dans le cas contraire, si la détection de l'activité de peroxydase est halogénation pas la portée de laétude, après application de la méthode d'épuisement des erythrocytes d'autres méthodes analytiques peuvent être utilisées à la place de l'APF. Comme la procédure de lyse hypotonique décrite conduit seulement à une déplétion partielle des globules rouges et comme tous leucocytaire sont encore présents dans la fraction cellulaire mixte obtenue, seules les méthodes qui permettent une analyse à une seule cellule doit être appliquée. Les méthodes qui incluent la lyse des cellules (par exemple, l' analyse de complot occidental) ne donneront pas de résultats fiables. Le petit volume d'échantillon initial peut être un obstacle pour ces méthodes analytiques.

En ce qui concerne l'enquête du MPO (et OEB) l' activité dans les leucocytes souvent que la production générale d'oxydant par les cellules est adressée au lieu d'évaluer spécifiquement l'activité de la peroxydase hème 44,45. En outre souvent pas des tentatives sont faites pour distinguer entre l'halogénation et l'activité de la peroxydase du MPO et de l' OEB 46,47. Méthodes, qui traitent spécifiquement l'activité MPO chlorer par quantifying produits HOCl dérivés comme chlorotyrosine ne détectent pas trop oxydée et / ou produits métabolisé et, par conséquent, conduisent souvent à une sous - estimation du réel HOCl-production 48. En outre , cette méthode ainsi que la détection de HOCl dérivé 2-chloroethidium sont aussi beaucoup de temps, ont besoin de matériel d' analyse coûteux et comprennent la lyse des cellules 48-50 .il sont de nombreux rapports sur les nouveaux colorants pour la détermination spécifique de l'activité de MPO chlorant au sein des cellules vitales 44,51,52. Pourtant , à ce jour que l' APF et son hydroxyphényl fluorescéine composé apparenté (HPF) sont disponibles dans le commerce et donc couramment utilisé dans la recherche 25,33.

En effet, à l'aide de l' APF nous avons pu montrer que l'activité MPO chlorant peut non seulement être quantifiée en utilisant l'enzyme isolée 53 , mais aussi par l' application du colorant sur ​​les cellules vivantes 26,33. Ainsi, en combinant l'enrichissement leucocytaire rapide du sang des micro-échantillons mentionnés ci-dessus avec unn APF coloration , nous avons développé un protocole, qui est adapté pour répondre spécifiquement et simultanément l'activité d'halogénation du MPO et de l' OEB dans toutes les peroxydase leucocytes positifs, à savoir, les neutrophiles, les monocytes et les éosinophiles 32. En outre, le procédé ne nécessite pas la lyse des cellules, ce qui permet une grande variété de méthodes analytiques, y compris la cytométrie en flux et la microscopie à fluorescence confocale. De plus, cette activité peroxydase de coloration peut être combinée avec l'application de marqueurs de surface cellulaire, ce qui permet l'analyse spécifique des sous-fractions de leucocytes, en fonction de la tâche scientifique. Pourtant, il doit être considéré que les anticorps marqués par fluorescence appliqués ne pas interférer avec le signal de fluorescence à base de fluorescéine utilisée pour quantifier la HOCl- et l'oxydation APF HOBr dérivé.

En résumé, cette méthode peut fournir un nouvel outil pour obtenir plus de connaissances sur le rôle physiologique de l'activité halogénation peroxydase de la ré immunologiqueperoxydases dérivés du sang et de l' OEB levant MPO, qui est toujours pas bien compris 8,20,23. En outre, dans une étude animale sur l'arthrite rhumatoïde, nous pourrions observer récemment que ce protocole peut conduire à l'évaluation de la production de HOCl MPO dérivés comme un nouveau marqueur clinique à des maladies inflammatoires chroniques (données non publiées).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

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Immunologie numéro 113 la préparation du sang l'enrichissement des leucocytes la myéloperoxydase peroxydase éosinophile l'activité de chloration aminophényl fluorescéine
Évaluation rapide et spécifique de l'halogénation peroxydase Activité dans les échantillons de sang enrichie en leucocytes
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Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

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