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Immunology and Infection

ल्युकोसैट समृद्ध रक्त के नमूनों में Halogenating peroxidase की गतिविधि के फास्ट और विशिष्ट आकलन

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

इस पत्र में छोटे पूरे रक्त के नमूनों से ल्यूकोसाइट्स का त्वरित और मानकीकृत संवर्धन के लिए एक प्रोटोकॉल में वर्णित है। यह प्रक्रिया एरिथ्रोसाइट्स की hypotonic सेल पर आधारित है और गैर मानव उत्पत्ति के रक्त के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मानव नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है। के बारे में 50 से 100 μl के छोटे प्रारंभिक नमूना मात्रा इस विधि छोटी प्रयोगशाला जानवरों से आवर्तक रक्त नमूने के लिए लागू करता है। इसके अलावा, ल्युकोसैट संवर्धन मिनट के भीतर और कम सामग्री रसायन और इंस्ट्रूमेंटेशन के बारे में प्रयासों के साथ हासिल की है, इस पद्धति कई प्रयोगशाला वातावरण में लागू कर रही है।

ल्यूकोसाइट्स के मानकीकृत शुद्धि एक अत्यधिक चयनात्मक धुंधला हो जाना, myeloperoxidase (एमपीओ) और हीम पराक्सिडेजों की halogenating peroxidase गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए विधि Eosinophil peroxidase (ईपीओ), यानी, हाइपोक्लोरस और hypobromous एसिड (HOCL और HOBr) के गठन के साथ संयुक्त है। एमपीओ जोरदार neut में व्यक्त किया है जबकिrophils, सबसे प्रचुर मात्रा में मानव रक्त में के रूप में अच्छी तरह से monocytes में प्रतिरक्षा सेल प्रकार, संबंधित एंजाइम ईपीओ विशेष रूप से eosinophils में व्यक्त किया जाता है। इन एंजाइमों के halogenating गतिविधि लगभग HOCl- और HOBr विशेष डाई aminophenyl fluorescein (APF) और प्राथमिक peroxidase सब्सट्रेट हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उपयोग करके संबोधित किया है। बाद में फ्लो का विश्लेषण करने पर सभी peroxidase पॉजिटिव कोशिकाओं (न्यूट्रोफिल, monocytes, eosinophils) साफ़ कर रहे हैं और उनके halogenating peroxidase गतिविधि मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। चूंकि APF धुंधला कोशिका की सतह मार्करों के आवेदन के साथ जोड़ा जा सकता है, इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से संबोधित करने के लिए ल्युकोसैट उप अंशों बढ़ाया जा सकता है। विधि दोनों मानव और कृंतक ल्यूकोसाइट्स में HOCL और HOBr उत्पादन का पता लगाने के लिए लागू है।

जीर्ण सूजन रोगों में इन एंजाइमी उत्पादों की व्यापक रूप से चर्चा की और diversely प्रतिरक्षात्मक भूमिका को देखते हुए, इस प्रोटोकॉल की एक बेहतर समझ के लिए योगदान कर सकते हैंल्युकोसैट व्युत्पन्न हीम पराक्सिडेजों की रोग प्रतिरोधक प्रासंगिकता।

Introduction

Polymorphonuclear ल्यूकोसाइट्स (PMNs, यह भी कहा जाता granulocytes) और monocytes रक्त 1,2 में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण सेलुलर घटकों का प्रतिनिधित्व करते हैं। वे रोगजनकों के खिलाफ के रूप में भी प्राप्त कर लिया प्रतिरक्षा प्रणाली के सक्रियण और एक प्रणालीगत भड़काऊ प्रतिक्रिया 2-4 की दीक्षा के लिए प्राथमिक रक्षा करने के लिए योगदान करते हैं। फिर भी विशेष रूप से न्यूट्रोफिल, granulocytes की सबसे प्रचुर मात्रा में प्रकार, और monocytes भी काफी विनियमन और तीव्र भड़काऊ घटनाओं 5 की समाप्ति के लिए योगदान करते हैं। इसलिए इन कोशिकाओं को भी संधिशोथ 6.7 जैसी पुरानी भड़काऊ रोगों में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं। तथ्य यह है, अस्थमा, एक जीर्ण सूजन एयरवे रोग में eosinophils का एक बिगड़ा apoptosis, रक्त 8 में दूसरा सबसे granulocyte प्रकार की विशेषता है। फिर भी granulocytes की apoptosis और मैक्रोफेज द्वारा उनके त्वरित हटाने सेलुलर समाप्ति के दौरान दो आवश्यक कदम उठाए हैंसूजन 9-11 की।

नामित प्रतिरक्षा कोशिकाओं दो निकट से संबंधित एंजाइमों, अर्थात् myeloperoxidase (एमपीओ, न्यूट्रोफिल और monocytes) और Eosinophil peroxidase (ईपीओ, eosinophils) में 12,13 पाया जा सकता है। ये हीम पराक्सिडेजों प्रतिष्ठित प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के रूप में वे दो-इलेक्ट्रॉनिक रूप से oxidize (छद्म) इसी hypo (छद्म) को halides halous एसिड होता है जो उनकी जीवाणुनाशक गुण 14-16 के लिए जाना जाता है से संबंधित हैं। शारीरिक शर्तों के तहत मुख्य रूप से एमपीओ रूपों हाइपोक्लोरस अम्ल (HOCL) और hypothiocyanite (- OSCN) जबकि दूसरा और hypobromous एसिड (HOBr) ईपीओ 17-19 से बनते हैं। नए परिणाम बताते हैं कि इस (छद्म) halogenating एंजाइम गतिविधि भी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं के नियमन के लिए और प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं 20,21 की समाप्ति के लिए योगदान कर सकते हैं। वास्तव में, HOCL उत्पादन एमपीओ और व्युत्पन्न उत्पादों के द्वारा टी सेल आधारित अनुकूली प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 22-2 को दबाने के लिए दिखाया गया है4।

आदेश में यह शारीरिक समारोह को पुरानी भड़काऊ रोगों में सहज प्रतिरक्षा प्रणाली से ल्यूकोसाइट्स की रोग प्रतिरोधक भूमिका में और अधिक जानकारी हासिल एमपीओ और ईपीओ के योगदान को निर्धारित करने के लिए हम जल्दी से बाद में एक विशेष के लिए छोटे से रक्त के नमूनों से ल्यूकोसाइट्स संतुष्ट करने के लिए एक विधि विकसित इन कोशिकाओं में halogenating peroxidase गतिविधि का निर्धारण। एरिथ्रोसाइट कमी के लिए हम आसुत जल है, जो कम माल की लागत पर एक त्वरित ल्युकोसैट संवर्धन की ओर जाता है के साथ दो-बाद के hypotonic सेल कदम सहित एक मानकीकृत विधि को चुना है। Halogenating एमपीओ के बाद के दृढ़ संकल्प और ईपीओ गतिविधि के लिए HOCl- और HOBr विशेष डाई aminophenyl fluorescein (APF) 25-27 इस्तेमाल किया गया था। Unspecific peroxidase धुंधला तरीकों 28,29 के आवेदन के विपरीत, इस दृष्टिकोण halogenating peroxidase गतिविधि के चुनिंदा पता लगाने, जो अक्सर गंभीर infl पर बिगड़ा हुआ है की अनुमति देता हैammation 30,31।

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Protocol

सभी मानव रक्त के नमूने स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त किया गया, और लागू ल्युकोसैट संवर्धन प्रोटोकॉल लीपज़िग विश्वविद्यालय के मेडिकल संकाय की नैतिकता आयोग के दिशा निर्देशों का पालन करती है। चूहे रक्त के साथ प्रयोग जानवरों की देखभाल और उपयोग पर जर्मन दिशा-निर्देशों के अनुसार, स्थानीय जिम्मेदार नैतिक समिति (Landesdirektion साचसेन, Referat 24) द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. प्रायोगिक सेटअप

नोट: रक्त के नमूनों से एरिथ्रोसाइट्स की कमी के लिए hypotonic सेल प्रक्रिया एक समय महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, अग्रिम में प्रोटोकॉल के इस भाग के लिए सभी आवश्यक उपकरण (जैसे, buffers) तैयार करें।

  1. hypotonic सेल के लिए एक 15 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब और बाद aminophenyl fluorescein (APF) खून का नमूना प्रति धुंधला के लिए एक 1.5 मिलीलीटर नमूना ट्यूब लेबल।
    1. ल्युकोसैट संवर्धन बाँझ शर्तों के तहत किया जाएगा, तो एक प्रवाह के तहत इस लेबलिंग प्रदर्शनडिब्बा।
  2. नमूना प्रति के बारे में 12 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस, 10 मिमी) तैयार करें। पर ल्यूकोसाइट्स या नहीं बाँझ शर्तों के तहत अलग-थलग किया जाएगा कि क्या निर्भर करता है, पीबीएस एक सप्लायर से बाँझ तैयार समाधान का उपयोग करके या आसुत जल में पीबीएस गोलियाँ भंग करके या तो तैयार करते हैं। पीएच मान की जाँच करें और यदि आवश्यक हो, 0.1 एम एचसीएल और NaOH समाधान की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके 7.4 पीएच को समायोजित करें।
    1. पीबीएस गोलियाँ भंग आसुत जल में 200 मिलीलीटर (सामग्री की तालिका देखें) के बारे में 16 नमूने के लिए एक गैर बाँझ बफर समाधान के लिए पर्याप्त प्राप्त करने के लिए। अगर वांछित, बाँझ निस्पंदन द्वारा इस समाधान बाँझ।
  3. के बारे में 1 मिलीलीटर हैंक्स संतुलित नमक समाधान (HBSS) सीए के साथ पूरक 2+ नमूना प्रति तैयार करें।
    1. 100 मिलीलीटर में HBSS नमक (अंतिम मात्रा) डबल आसुत जल से 970 मिलीग्राम भंग। अंतिम मात्रा को भरने से पहले, पीएच मान की जाँच करें और 7.4 पीएच को समायोजित। अपनी कम बफर क्षमता के कारण, हौसले से एक प्रत्येक दिन इस बफर तैयारघ 0.1 एम एचसीएल और NaOH समाधान की थोड़ी मात्रा का उपयोग करके विशेष देखभाल के साथ पीएच समायोजन प्रदर्शन करते हैं।
      नोट: बाँझ समाधान प्रयोग के आधार पर इस्तेमाल किया जा सकता है। समाधान बाँझ निस्पंदन द्वारा निष्फल किया जा सकता है।
  4. दो buffers, लेबल के अलावा और एक ट्यूब तैयार (जैसे, 50 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब) या कुप्पी (जैसे, 250 मिलीलीटर कप को मापने) अग्रिम hypotonic सेल प्रक्रिया के लिए डबल आसुत जल के साथ। नमूना प्रति के बारे में 10 मिलीलीटर पानी तैयार करें।
  5. APF धुंधला (धारा 3) है, जो बर्फ पर किया जाता है के लिए कुचल बर्फ के साथ एक कंटेनर तैयार करें।
  6. धुंधला के दौरान इस्तेमाल किया काम कर समाधान की जल्दी तैयार करने के लिए अनुमति देने के लिए अग्रिम में APF की aliquots तैयार (3.2 कदम) और बार बार ठंड और APF समाधान के विगलन से बचने के लिए।
    नोट: APF सामान्यतः एक 5 मिलीग्राम / एमएल (11.81 मिमी) मिथाइल एसीटेट में शेयर समाधान के रूप में प्राप्त की है।
    1. 0.5 मिलीलीटर ट्यूब में 10-100 μl की aliquots रुक। APF एक अंतिम धुंधला के लिए10 माइक्रोन की डाई एकाग्रता (3.8 चरण) का इस्तेमाल किया जाता है।

2. एरिथ्रोसाइट्स की Hypotonic Lysis

ध्यान दें: संक्रमण से बचने के लिए एक लामिना का प्रवाह बेंच के तहत hypotonic सेल कदम (centrifugation कदम को छोड़कर) को पूरा करें। कमरे के तापमान पर पूरी प्रक्रिया को पूरा करें। hypotonic सेल एक समय महत्वपूर्ण प्रक्रिया है, अग्रिम में पानी (2 मिलीलीटर) और पीबीएस (5 एमएल) के अलावा के लिए pipettes को समायोजित करने और प्रक्रिया को शुरू करने से पहले पानी और पीबीएस बोतल खोलते हैं। स्टोर उपयोग से पहले कमरे के तापमान पर पीबीएस समाधान और आसुत जल।

  1. प्रत्येक खून का नमूना हस्तांतरण से उचित 15 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब के लिए 100 μl।
    नोट: हमारे प्रयोगों में रक्त के नमूनों आमतौर पर 10 यू / हेपरिन की मिलीलीटर आदेश जमावट से बचने के लिए होते हैं। फिर भी नमूना सामग्री के विभिन्न स्रोतों के कारण प्रकृति और विरोधी कौयगुलांट की एकाग्रता अलग हो सकता है। APF धुंधला पर इसका प्रभाव compar द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिएअन्य प्रकार या विरोधी कौयगुलांट की सांद्रता के साथ पूरक रक्त के नमूनों से प्राप्त परिणामों के लिए परिणाम हैैं।
  2. 2 मिलीलीटर आसुत जल जोड़ें और एक भंवर मिक्सर एक मध्यम स्तर के लिए सेट का उपयोग करके नमूने मिश्रण। 60 सेकंड के लिए नमूने सेते हैं, तो नमूना प्रति 5 एमएल पीबीएस जोड़ने और भंवर मिक्सर का उपयोग कर मिश्रण।
    नोट: ऊपर के बारे में 5 नमूने के समानांतर में तैयार किया जा सकता है। नमूना आदेश के पानी और पीबीएस के अलावा तुलनीय ऊष्मायन बार प्राप्त करने के लिए एक ही रखें।
  3. पीबीएस अलावा (2.2 कदम) कमरे के तापमान पर 6 मिनट और 450 x जी के लिए centrifugation द्वारा सभी नमूनों में शेष बरकरार गोली कोशिकाओं द्वारा isotonic शर्तों के उत्थान के बाद।
  4. एक मेज के अपशिष्ट बिन में गिरने से सतह पर तैरनेवाला निकालें। जितना संभव हो उतना तरल centrifugation inverting ट्यूब और एक कागज तौलिया पर उद्घाटन दोहन से निकालें। सुनिश्चित करें कि सेल गोली के रूप में संभव के रूप में सूखी है।
  5. के रूप में (2.2 कदम) से पहले वर्णित hypotonic सेल प्रक्रिया को दोहराएँ।
    एनOTE: सिद्धांत रूप में इस hypotonic सेल प्रक्रिया (कदम 2.3 से 2.5) मिश्रित ल्युकोसैट अंश की शुद्धता के आधार पर प्राप्त किया जाना है, एक बार से अधिक दोहराया जा सकता है। दो सेल प्राप्त मिश्रित सेल अंश में एरिथ्रोसाइट्स शेष की हिस्सेदारी कदम के बाद के बारे में 25% है।
  6. कमरे के तापमान पर 6 मिनट और 450 x जी के लिए centrifugation द्वारा शेष बरकरार कोशिकाओं गोली। सतह पर तैरनेवाला (2.4 कदम देखें) निकालें। गोली के लिए 500 μl HBSS जोड़ें और धीरे इसे भंग जब तक एक समरूप समाधान प्राप्त की है। तदनुसार लेबल 1.5 मिलीलीटर नमूना ट्यूब के लिए प्रत्येक नमूना हस्तांतरण।
  7. प्रयोग के आधार पर सीधे प्राप्त नमूनों (जैसे, प्रवाह cytometry के माध्यम से) 25, प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी 32 (एकल कोशिका प्रकार की पहचान के लिए) के साथ दाग विश्लेषण (सेल सक्रियण प्रयोगों के लिए) सेल उत्तेजनाओं के साथ सेते 33 या बर्फ और उपयोग पर संग्रहीत बाद में। अध्ययन का उद्देश्य पर निर्भर करता है, तुरंत बाद के प्रयोगों प्रदर्शनgranulocytes के बाद से मिश्रित ल्युकोसैट अंश के बारे में 20 घंटे का एक काफी कम आधा जीवन है।
    नोट: यह भी peroxidase गतिविधि धुंधला नीचे वर्णित के लिए रखती है।

3. Halogenating Peroxidase गतिविधि धुंधला

नोट: HOCl- और रक्त प्राप्त हीम पराक्सिडेजों एमपीओ और ईपीओ द्वारा HOBr उत्पादन APF, जो नाम hypohalous एसिड से fluorescein ऑक्सीकरण हो जाता है का उपयोग करके मात्रा निर्धारित है। इसलिए अगर प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी के साथ सेल लेबलिंग APF धुंधला के साथ संयोजन में किया जाता है, fluorophores कि fluorescein के उत्सर्जन संकेत के साथ हस्तक्षेप से बचें।

  1. बर्फ पर 4 डिग्री सेल्सियस पर APF धुंधला प्रदर्शन करना।
  2. डाई का एक उचित विभाज्य पिघलना APF का एक काम समाधान तैयार करने के लिए (जैसे, 10 μl, 11.81 मिमी) और यह HBSS के साथ पतला वास्तव में 1 मिमी (जैसे, 108.1 μl बफर 10 μl में जोड़ने के लिए) के लिए।
    1. प्रत्येक नमूना (500 μl सेल समाधान) के लिए 5 μ तैयारवर्णित APF काम समाधान के एल। तदनुसार, APF (11.81 मिमी), जो 118.1 μl APF काम समाधान (1 मिमी) के बारे में 20 नमूने तैयार करने के लिए पैदावार में से एक 10 μl विभाज्य का उपयोग करें। pipetting के दौरान नुकसान के कारण के बारे में 10% अधिक APF काम कर गणना से समाधान तैयार है।
  3. आदेश, APF धुंधला की peroxidase विशिष्टता जाँच हीम peroxidase अवरोध 4 aminobenzoic एसिड hydrazide (4-Abah) 35 के साथ नियंत्रण नमूने तैयार करने के लिए।
    1. विलायक 500 μl में 75.6 मिलीग्राम 4-Abah गिराए द्वारा डाइमिथाइल sulfoxide में 4-Abah (151.17 जी / मोल) (DMSO) के एक 1 एम स्टॉक समाधान तैयार है। इसके अलावा HBSS में 4-Abah 1/10 पतला।
  4. "70 मिमी एच 2 ओ 2" और "7 मिमी एच 2 ओ 2", क्रमशः के साथ एक एच 2 ओ 2 काम समाधान लेबल दो 1.5 मिलीलीटर centrifugation ट्यूब की तैयारी के लिए।
    1. ट्यूब लेबल "70 मिमी एच 2 ओ 2" में, हौसले से 10 μl पतलाएच 2 ओ 2 आसुत जल के बारे में 88 मिमी की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए 990 μl का उपयोग करने का एक 30% शेयर समाधान (8.8 मिमी)। बर्फ पर दुकान और 4 घंटा के भीतर का उपयोग करें।
      नोट: एच 2 ओ 2 आम तौर पर आपूर्तिकर्ताओं द्वारा एक 30% शेयर समाधान के रूप में दिया जाता है। जब 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत है, इसके बारे में 3 साल के लिए स्थिर है। अपघटन से बचने के लिए आसुत जल में एच 2 ओ 2 के dilutions प्रदर्शन करना। एच 2 ओ 2 dilutions भी 0.1 एम NaOH समाधान में तैयार किया जा सकता है।
    2. सटीक एच के निर्धारण के लिए 2 ओ 2 एकाग्रता लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में आसुत जल 900 μl के लिए इस समाधान से 100 μl जोड़कर 2 ओ 2 शेयर समाधान के बारे में (88 मिमी) पहली एच से एक और 1 से 10 के कमजोर पड़ने को तैयार "7 मिमी एच 2 ओ 2"।
    3. एक यूवी विज़ photospectrometer का उपयोग करके पास यूवी रेंज (जैसे, 200-300 एनएम) में स्पेक्ट्रम रिकॉर्ड और 240 एनएम पर absorbance का उपयोग करें (49, 240 = 34 एम -1 सेमी -1) वास्तविक एच दूसरी एच 2 ओ 2 शेयर समाधान 34 में 2 ओ 2 एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए। सुनिश्चित करें कि संदर्भ क्युवेट केवल डिस्टिल्ड पानी होता है। माप का उपयोग क्वार्ट्ज cuvettes के लिए के रूप में यूवी रेंज में एक स्पेक्ट्रम दर्ज की गई है।
    4. इस परिणाम से, दोनों एच 2 ओ 2 स्टॉक समाधान की सटीक गणना सांद्रता। आसुत जल का एक उचित मात्रा जोड़कर "70 मिमी एच 2 ओ 2" नमूना ट्यूब के लिए वास्तव में 70 मिमी में पहली स्टॉक समाधान की एकाग्रता को समायोजित करें। बर्फ पर प्राप्त काम कर समाधान की दुकान और एक घंटे के भीतर का उपयोग करें।
  5. 1 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए 4-Abah काम समाधान (100 मिमी) उचित नमूनों के 5 μl जोड़ें। APF अलावा पहले इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
  6. 5 μl APF काम समाधान (1 मिमी) प्रत्येक में जोड़े500 μl नमूना 10 माइक्रोन की अंतिम डाई एकाग्रता प्राप्त करने के लिए। धीरे नमूने मिश्रण (जैसे, एक माध्यम की स्थापना पर भंवर मिक्सर का उपयोग करके) और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  7. 700 सुक्ष्ममापी के अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक 500 μl नमूना करने के लिए 5 μl एच 2 ओ 2 काम समाधान (70 मिमी) जोड़ें। धीरे नमूने मिश्रण है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 60 मिनट के लिए उन्हें सेते हैं। समानांतर में उचित नियंत्रण माप प्रदर्शन।
    नोट: नियंत्रण माप से पता चला कि 700 माइक्रोन के एच 2 ओ 2 कोशिकाओं के लिए विषाक्त नहीं कर रहे हैं। और न ही किसी भी महत्वपूर्ण सेलुलर प्रतिक्रियाओं मनाया गया।
    ध्यान दें: APF धुंधला भी, एच 2 ओ 2 के अलावा छोड़ते हुए वैज्ञानिक सवाल पर निर्भर करता है के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के अभाव में केवल बेसल क्लोरीनीकरण एमपीओ और ईपीओ गतिविधि चुना गया है, जबकि एच 2 ओ 2 के अलावा कोशिकाओं द्वारा अधिक से अधिक HOCL और HOBr उत्पादन का पता लगाने के लिए अनुमति देता है। टीवह बाद के एक काफी उच्च फ्लोरोसेंट संकेत का मतलब है।
  8. कोशिकाओं pelleting के लिए, 400 x जी के कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने और अपकेंद्रित्र। अच्छी तरह से गोली नष्ट करने के बिना सतह पर तैरनेवाला हटाने और कोशिकाओं resuspend 250 μl HBSS जोड़ें।
    नोट: नमूने अब 25 के माध्यम से प्रवाह cytometry विश्लेषण के लिए तैयार हैं।
  9. अंधेरे में नमूनों की दुकान के विश्लेषण तक विरंजन से बचने के लिए। 480-490 एनएम पर उत्तेजना के बाद के बारे में 525 एनएम 37 पर fluorescein के उत्सर्जन का पता लगाने।

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Representative Results

जैसा कि पहले बताया ऊपर वर्णित विधि निकला दोनों मानव और गैर मानव सामग्री 32 तक लागू किया जाना है। इसके अलावा के रूप में दमा के लक्षण के साथ चूहों के लिए दिखाया गया APF धुंधला प्रणालीगत समर्थक भड़काऊ स्थिति में अंतर का पता लगाने के लिए एक उपयुक्त उपकरण हो सकता है। इसलिए एक अध्ययन के बाद हम इस प्रोटोकॉल का इस्तेमाल बार बार pristane प्रेरित गठिया (पीआईए) के साथ महिला डार्क Agouti चूहों में एमपीओ (और ईपीओ) के halogenating गतिविधियों का मूल्यांकन करने के लिए। ल्युकोसैट संवर्धन और इस प्रयोग के दौरान प्रदर्शन धुंधला का एक प्रतिनिधि उदाहरण चित्र 1 में दिखाया गया है। लगभग 200 μl पूरे रक्त संज्ञाहरण के तहत पशु की पश्चनेत्रगोलकीय शिरापरक जाल से प्राप्त की और heparinized था। एरिथ्रोसाइट कमी और बाद में एक APF धुंधला 100 μl नमूना मात्रा का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया। बाद में नमूना प्रवाह cytometry द्वारा विश्लेषण किया गया था।

(चित्रा 1 ए) सेल आकार, एरिथ्रोसाइट्स के एक मजबूत कमी से नमूना हासिल की थी साजिश रचने के द्वारा दिखाया गया है। इसके अलावा विभिन्न प्रकार के ल्युकोसैट स्पष्ट रूप से नमूदार, जो प्रतिदीप्ति लेबल कोशिका की सतह मार्कर लगाने से पहचान की गई थी (नहीं दिखाया गया है)। संक्षेप में एरिथ्रोसाइट (CD235a पॉजिटिव) / सेल मलबे क्षेत्र केवल घटनाओं में से 22% के लिए जिम्मेदार है, जबकि घटनाओं के बारे में 48% CD16 पॉजिटिव न्यूट्रोफिल के रूप में पहचान की गई। इसके अलावा घटनाओं के 3% प्रत्येक CCR3 पॉजिटिव eosinophils और CD14 पॉजिटिव monocytes के रूप में पहचान की गई है और घटनाओं के बारे में 19%, क्रमशः CD5 / CD19 पॉजिटिव बी और टी lymphocytes के लिए जिम्मेदार है। APF व्युत्पन्न प्रतिदीप्ति की तीव्रता वितरण (चित्रा 1 बी) स्पष्ट रूप से peroxidase नकारात्मक एरिथ्रोसाइट्स और लिम्फोसाइटों के भेदभाव की अनुमति दी monocytes और eosinophils एक उदारवादी APF ऑक्सीकरण के लिए नेतृत्व और न्यूट्रोफिल चर्चा के तहत दृढ़ता peroxidase पॉजिटिव थे, जबकिosen प्रयोगात्मक शर्तों। इन परिणामों के monocytes 20 में एंजाइम एकाग्रता की तुलना में बाद के कक्षों में एमपीओ के उच्च बहुतायत के साथ लाइन में हैं। eosinophils की अपेक्षाकृत कमजोर प्रतिक्रिया, इस तथ्य से समझा जा सकता है कि कोई ब्रोमाइड जोड़ा गया है, HOBr की ईपीओ व्युत्पन्न गठन के लिए प्रेरित किया है हो सकता है। पृथक eosinophils पर प्रारंभिक अध्ययन में आश्चर्यजनक रूप से इन कोशिकाओं द्वारा APF ऑक्सीकरण पर बाहर से जोड़ा ब्रोमाइड का एक बड़ा प्रभाव नहीं दिखा था। फिर भी, eosinophils जो बीआर की छोटी मात्रा के लागू होने से समझाया जा सकता है मनाया गया द्वारा APF के ऑक्सीकरण - इस्तेमाल किया (पीबीएस और HBSS) बफर समाधान के माध्यम से। वैकल्पिक रूप से ईपीओ भी (phagolysosomes में जैसे,) कम से कम अम्लीय परिस्थितियों में HOCL की छोटी मात्रा में उत्पादन कर सकते हैं।

आकृति 1
चित्रा 1: ल्युकोसैट संवर्धन और APF-निकाले जाते हैंएक चूहे से एक रक्त सूक्ष्म नमूने में डी प्रतिदीप्ति। लगभग 200 μl पूरे रक्त की राशि एक महिला डार्क Agouti चूहे के पश्चनेत्रगोलकीय शिरापरक जाल से प्राप्त हुई थी। 100 μl रक्त को वर्णित hemolysis प्रक्रिया के आवेदन और बाद में एक APF मिश्रित सेल अंश धुंधला के बाद से फ्लो द्वारा विश्लेषण किया गया था। FSC- / SSC- साजिश (ए) के द्वारा दिखाया गया है एरिथ्रोसाइट्स जोरदार नमूना से समाप्त हो रहे थे और अलग अलग ल्युकोसैट प्रकार आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है। APF व्युत्पन्न प्रतिदीप्ति तीव्रता (बी) के वितरण के लिए स्पष्ट रूप से पता चला है हीम peroxidase नकारात्मक कोशिकाओं (एरिथ्रोसाइट्स और लिम्फोसाइट) के साथ ही ल्यूकोसाइट्स मध्यम (eosinophils और monocytes) या मजबूत (न्यूट्रोफिल) halogenating peroxidase गतिविधि के साथ। यहाँ एक देखने के लिए क्लिक करें यह आंकड़ा का बड़ा संस्करण।

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Discussion

न्यूट्रोफिल मानव रक्त में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स कर रहे हैं peroxidase पॉजिटिव कोशिकाओं के अलगाव अक्सर ही इन कोशिकाओं पर केंद्रित है और घनत्व ढाल centrifugation 38 अन्य ल्यूकोसाइट्स से न्यूट्रोफिल की जुदाई भी शामिल है। अभी तक के रूप न्यूट्रोफिल बहुत कम murine रक्त के नमूनों में प्रचुर मात्रा में हैं बाद में अधिक जटिल तरीकों के लिए 39 40 इस्तेमाल किया जा रहा है। इसके अलावा दोनों तरीकों में भी बड़ा रक्त की मात्रा की आवश्यकता के कारण नमूनों से peroxidase पॉजिटिव monocytes को हटाने के लिए नेतृत्व और, (उदाहरण के लिए, 400 μl 41), सूक्ष्म नमूने प्रयोगशाला छोटे जानवरों से आवर्तक रक्त नमूने के दौरान प्राप्त करने के लिए लागू नहीं कर रहे 38,40। पेरिटोनियल स्राव से murine न्यूट्रोफिल की शुद्धि भी जानवरों के बलिदान की जरूरत है और इसके अलावा, रक्त प्राप्त granulocytes 38,40 उपज नहीं है। हाल ही में विकसित murine बीएल से अत्यधिक शुद्ध granulocyte अंशों प्राप्त करने के तरीकोंOOD (जैसे, एंटीबॉडी के आवेदन) कर रहे हैं अक्सर महंगी, जटिल और समय लेने 40,42,43 और फिर केवल एक peroxidase पॉजिटिव ल्युकोसैट प्रकार की शुद्धि पर ध्यान केंद्रित।

इस प्रकार यहाँ प्रस्तुत विधि peroxidase पॉजिटिव ल्यूकोसाइट्स की शुद्धि के लिए आवेदन किया है अन्य तरीकों से अधिक लाभ की एक जोड़ी है। के रूप में यह छोटा सा खून के नमूने पर आधारित है प्राप्त कोशिकाओं के संचलन में स्थिति को दर्शाते हैं। प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक छोटे प्रारंभिक नमूना मात्रा के कारण विधि न्यूट्रोफिल की बहुतायत में प्रजाति विशेष के मतभेदों के बावजूद, दोनों मानव और गैर मानव रक्त के लिए लागू है। वास्तव में, हम भी 50 μl के रूप में छोटे रक्त की मात्रा प्रारंभिक वर्णित विधि लागू करने में सक्षम थे (डेटा) नहीं दिखाया। छोटे रक्त विधि के लिए आवश्यक नमूना भी यह छोटी सी प्रयोगशाला जानवरों से या विशेष चिकित्सा अनुप्रयोगों (जैसे, नवजात निदान) के लिए बार-बार रक्त वापसी के लिए उपयुक्त बनाता है। टी के रूप मेंवह ल्युकोसैट संवर्धन एरिथ्रोसाइट्स की कमी पर आधारित है सभी peroxidase पॉजिटिव कोशिकाओं (न्यूट्रोफिल, eosinophils, monocytes) प्राप्त मिश्रित ल्युकोसैट अंश में शामिल किए गए हैं और अलग से प्रवाह cytometry का उपयोग करके विश्लेषण किया जा सकता है। विधि, तेजी से विश्वसनीय है और रसायनों और इंस्ट्रूमेंटेशन के बारे में कम आवश्यकताओं, कई वैज्ञानिक वातावरण के लिए उपयुक्त प्रोटोकॉल बना रही है।

न्यूट्रोफिल आसानी से वर्णित विधि के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम के रूप में सक्रिय कर रहे है बफर समाधान इस्तेमाल की पीएच मान की सटीक समायोजन (पीबीएस और HBSS, कदम 1.2 और प्रोटोकॉल अनुभाग का 1.3 देखें)। इसके अलावा आसुत जल के साथ रक्त कोशिकाओं के ऊष्मायन समय बहाल normosmotic की स्थिति (प्रोटोकॉल खंड के चरण 2.2 देखने से पहले 60 सेकंड से अधिक समय नहीं होना चाहिए। (लगभग) पूरी तरह से विलायक की सेल गोली (2.4 कदम) से हटाने अलावा पहले दूसरी hypotonic सेल के लिए पानी की शौकीन के रूप में एक और महत्वपूर्ण कदम हैएर अवशेषों hypotonic सेल प्रक्रिया की दक्षता में कम होगा। एक और महत्वपूर्ण कदम APF धुंधला दौरान एच 2 ओ 2 के आवेदन करने के लिए संदर्भित करता है। हालांकि आवेदन किया राशि साइटोटोक्सिक नहीं होना चाहिए, सेल जीवन शक्ति जाँच की जानी चाहिए। हमारे अध्ययन के दौरान हम आम तौर पर डाई 5,5 लागू ', 6,6'-tetrachloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine आयोडाइड (जे.सी.-1) जल्दी apoptotic घटनाओं का पता लगाने के लिए।

इसके अलावा, वहाँ वर्णित सरलीकृत ल्युकोसैट संवर्धन विधि में सीमाओं के एक जोड़े हैं। तकनीक कई प्रजातियों (आदमी, चूहा और माउस की कोशिश की गई है) से रक्त के नमूनों के लिए लागू किया जा सकता है, ल्युकोसैट राशि एरिथ्रोसाइट्स की सेल के बाद प्राप्त रक्त में अपने शुरुआती बहुतायत पर निर्भर करता है। उत्तरार्द्ध निश्चित प्रजातियों 39 के बीच होती है और की भी जांच व्यक्ति की भड़काऊ राज्य पर निर्भर है। इसके अलावा, सेल प्रक्रिया को एक करने के लिए के साथ किया जा सकता है, जबकिसौ नमूने समानांतर में मध्यवर्ती centrifugation कदम, के रूप में एक सीमा मुद्रा इस्तेमाल किया सेंट्रीफ्यूज पर निर्भर करता है, केवल 30 नमूने समानांतर में कार्रवाई की जा सकती। इसके अलावा, जबकि APF आसानी से SCN की उपस्थिति में HOCL और HOBr का पता लगाता है -, एमपीओ और ईपीओ के halogenating गतिविधि भी बाद के छद्म halide को प्रभावित करता है। जिससे hypothiocyanite (- OSCN) का गठन किया है जो APF oxidize करने में असमर्थ है। एक और सीमा एमपीओ और ईपीओ द्वारा HOCl- के दृढ़ संकल्प और HOBr-उत्पादन के लिए इस्तेमाल APF डाई के गुणों से आता है। डाई fluorescein ऑक्सीकरण हो जाता है के रूप में, धुंधला एक ही श्रेणी में एक उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के साथ संयुक्त नहीं किया जा सकता है। बेशक APF व्युत्पन्न प्रतिदीप्ति और अतिरिक्त फ्लोरोसेंट संकेतों के संकेत के बीच किसी भी हस्तक्षेप की जाँच की जानी है और प्रवाह कोशिकामापी में लिए मुआवजा।

अन्यथा, अगर halogenating peroxidase की गतिविधि का पता लगाने की गुंजाइश नहीं हैअध्ययन, एरिथ्रोसाइट कमी विधि के आवेदन के बाद अन्य विश्लेषणात्मक तरीकों APF के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। वर्णित hypotonic सेल प्रक्रिया केवल एरिथ्रोसाइट्स की एक आंशिक कमी करने के लिए और सभी ल्युकोसैट के रूप में सुराग के रूप में अभी भी प्राप्त मिश्रित सेल अंश में मौजूद है, केवल तरीकों जो एक एकल कोशिका विश्लेषण लागू किया जाना चाहिए अनुमति देते हैं। तरीकों जो कोशिकाओं (जैसे, पश्चिमी साजिश विश्लेषण) के सेल में शामिल विश्वसनीय परिणाम नहीं निकलेगा। छोटे प्रारंभिक नमूना मात्रा ऐसे विश्लेषणात्मक तरीकों के लिए एक और बाधा हो सकती है।

अक्सर ही सामान्य ऑक्सीडेंट उत्पादन ल्यूकोसाइट्स में एमपीओ (और ईपीओ) की जांच कोशिकाओं द्वारा गतिविधि के बारे में विशेष रूप से बजाय हीम peroxidase गतिविधि 44,45 के मूल्यांकन का संबोधित किया है। इसके अलावा अक्सर कोई प्रयास halogenating और एमपीओ और ईपीओ 46,47 के peroxidase गतिविधि के बीच भेद करने के लिए बना रहे हैं। विधियों, जो विशेष रूप से qu द्वारा क्लोरीनीकरण MPO गतिविधि को संबोधितantifying chlorotyrosine तरह HOCL व्युत्पन्न उत्पादों का पता लगाने करते नहीं पर ऑक्सीकरण और / या metabolized उत्पादों और, इस प्रकार, अक्सर असली HOCL उत्पादन 48 की एक मूल्यवान समझना के लिए नेतृत्व। इसके अलावा इस विधि के साथ ही HOCL व्युत्पन्न 2-chloroethidium का पता लगाने के लिए भी समय लेने वाली है, क्लोरीनीकरण MPO गतिविधि के विशिष्ट निर्धारण के लिए नए रंगों के बारे में कई खबरें हैं महंगा विश्लेषणात्मक उपकरणों की जरूरत है और कोशिकाओं 48-50 वहाँ की सेल में शामिल कर रहे हैं महत्वपूर्ण कोशिकाओं 44,51,52 के भीतर। अभी तक तारीख को ही APF और इससे संबंधित यौगिक hydroxyphenyl fluorescein (HPF) व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और इसलिए नियमित रूप से अनुसंधान 25,33 में इस्तेमाल कर रहे हैं।

वास्तव में, APF का उपयोग करके हम दिखा सकता है कि क्लोरीनीकरण MPO गतिविधि ही अलग एंजाइम 53 का उपयोग करके लेकिन यह भी जीवित कोशिकाओं 26,33 करने के लिए डाई लगाने से मात्रा निर्धारित नहीं किया जा सकता। इस प्रकार रक्त सूक्ष्म नमूने एक साथ ऊपर कहा गया है से जल्दी ल्युकोसैट संवर्धन के संयोजन सेn APF धुंधला हम एक प्रोटोकॉल है, जो विशेष रूप से और एक साथ सभी peroxidase सकारात्मक ल्यूकोसाइट्स, यानी, न्यूट्रोफिल, monocytes और eosinophils 32 में एमपीओ और ईपीओ के halogenating गतिविधि को संबोधित करने के लिए उपयुक्त है विकसित की है। इसके अलावा विधि सेल, जो फ्लो और confocal फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी सहित विश्लेषणात्मक तरीकों की एक व्यापक विविधता की अनुमति देता है की आवश्यकता नहीं है। इसके अलावा इस peroxidase गतिविधि धुंधला कोशिका की सतह मार्करों के आवेदन, जो ल्युकोसैट उप अंशों की विशिष्ट विश्लेषण की अनुमति देता है, वैज्ञानिक कार्य के आधार पर के साथ जोड़ा जा सकता है। अभी तक यह है कि लागू प्रतिदीप्ति लेबल एंटीबॉडी fluorescein आधारित प्रतिदीप्ति HOCl- और HOBr व्युत्पन्न APF ऑक्सीकरण यों इस्तेमाल संकेत के साथ हस्तक्षेप नहीं करते पर विचार किया जाना है।

सारांश में इस विधि प्रतिरक्षात्मक फिर से halogenating peroxidase गतिविधि के शारीरिक भूमिका में और अधिक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए एक नए उपकरण प्रदान कर सकता हैलेवंत रक्त प्राप्त पराक्सिडेजों एमपीओ और ईपीओ है, जो अभी भी अच्छी तरह से समझ नहीं 8,20,23। इसके अलावा संधिशोथ पर एक जानवर अध्ययन में हमने हाल ही में है कि इस प्रोटोकॉल जीर्ण सूजन रोगों (अप्रकाशित डेटा) में एक नई नैदानिक ​​मार्कर के रूप में एमपीओ व्युत्पन्न HOCL उत्पादन का मूल्यांकन करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं का निरीक्षण कर सकता।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

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इम्यूनोलॉजी अंक 113 रक्त तैयारी ल्युकोसैट संवर्धन myeloperoxidase Eosinophil peroxidase क्लोरीनीकरण गतिविधि aminophenyl fluorescein
ल्युकोसैट समृद्ध रक्त के नमूनों में Halogenating peroxidase की गतिविधि के फास्ट और विशिष्ट आकलन
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Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

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