Abstract
In questo lavoro è descritto un protocollo per l'arricchimento rapido e standardizzata dei leucociti da piccoli campioni di sangue intero. Questa procedura si basa sulla lisi ipotonica degli eritrociti e può essere applicato a campioni umani nonché al sangue di origine non umana. Il piccolo volume del campione iniziale di circa 50 a 100 ml rende questo metodo applicabile a prelievo di sangue ricorrenti da piccoli animali da laboratorio. Inoltre, l'arricchimento dei leucociti è raggiunto in pochi minuti e con gli sforzi materiali bassi per quanto riguarda i prodotti chimici e strumentazione, rendendo questo metodo applicabile in molteplici ambienti di laboratorio.
Depurazione standardizzata dei leucociti è combinato con un metodo altamente selettiva colorazione per valutare l'attività perossidasica alogenante delle perossidasi eme, mieloperossidasi (MPO) e perossidasi eosinofila (EPO), cioè la formazione di ipocloroso e ipobromoso (HOCl e HOBr). Mentre MPO è fortemente espresso in neutrophils, il tipo di cellule immunitarie più abbondante nel sangue umano come in monociti, il relativo enzima EPO è espresso esclusivamente in eosinofili. L'attività alogenante di questi enzimi sono destinatari utilizzando la quasi HOCl- e HOBr-specifica fluoresceina dye amminofenil (APF) e il perossido di idrogeno substrato perossidasi primaria. Su successiva analisi di citometria di flusso tutte le cellule perossidasi-positive (neutrofili, monociti, eosinofili) sono distinguibili e la loro attività perossidasi alogenazione possono essere quantificati. Poiché APF colorazione può essere combinato con l'applicazione di marcatori di superficie cellulare, questo protocollo può essere esteso ad affrontare specificamente leucociti sotto-frazioni. Il metodo è applicabile per rilevare HOCl e HOBr produzione sia nell'uomo e nei leucociti roditori.
Dato il ruolo immunologico ampiamente e diversamente discusso di questi prodotti enzimatici in malattie infiammatorie croniche, questo protocollo può contribuire ad una migliore comprensione dellarilevanza immunologica di perossidasi eme leucociti-derivati.
Introduction
Leucociti polimorfonucleati (PMN, chiamati anche granulociti e monociti) rappresentano importanti componenti cellulari del sistema immunitario innato nel 1,2 sangue. Essi contribuiscono alla difesa primaria contro patogeni nonché l'attivazione del sistema immunitario acquisito e l'avvio di una risposta infiammatoria sistemica 2-4. Eppure, soprattutto neutrofili, il tipo più abbondante di granulociti e monociti anche contribuiscono significativamente alla regolamentazione e alla cessazione di eventi infiammatori acuti 5. Pertanto queste cellule possono anche svolgere un ruolo importante nelle malattie infiammatorie croniche come l'artrite reumatoide 6,7. Infatti, asma, una malattia infiammatoria delle vie aeree cronica, è caratterizzato da una ridotta apoptosi di eosinofili, il secondo tipo più granulociti nel sangue 8. Eppure l'apoptosi dei granulociti e la loro rapida rimozione da parte dei macrofagi sono due passaggi essenziali durante la terminazione cellularedi infiammazione 9-11.
Nelle cellule immunitarie denominate due enzimi strettamente correlati, vale a dire mieloperossidasi (MPO, neutrofili e monociti) e perossidasi eosinofila (EPO, eosinofili) possono essere trovati 12,13. Questi perossidasi eme sono classicamente legati alla risposta immunitaria umorale come si ossidano due elettronicamente (pseudo-) alogenuri alla ipo corrispondente (pseudo) acidi halous che sono noti per le loro proprietà battericide 14-16. In condizioni fisiologiche MPO principalmente forme acido ipocloroso (HOCl) e hypothiocyanite (- OSCN) mentre l'acido quest'ultima e ipobromoso (HOBr) sono formate da EPO 17-19. I nuovi risultati suggeriscono che questa (pseudo) l'attività enzimatica alogenazione può anche contribuire alla regolazione delle risposte infiammatorie e alla cessazione di reazioni immunitarie 20,21. Infatti, la produzione HOCl da MPO e suoi derivati hanno mostrato sopprimere T basati su celle risposte immunitarie adattative 22-24.
Al fine di ottenere ulteriori delucidazioni sul ruolo immunologico dei leucociti dal sistema immunitario innato a malattie infiammatorie croniche e per determinare il contributo di MPO e EPO a questa funzione fisiologica abbiamo sviluppato un metodo per arricchire rapidamente leucociti da piccoli campioni di sangue per una successiva specifica determinazione dell'attività alogenante perossidasi in queste cellule. Per deplezione degli eritrociti abbiamo scelto un metodo standardizzato compresi due successive fasi di lisi ipotonica con acqua distillata, che porta ad un arricchimento leucociti veloce a costi materiali bassi. Per la successiva determinazione del MPO alogenazione e l'attività EPO la HOCl- e HOBr specifico colorante amminofenil fluoresceina (APF) è stato utilizzato 25-27. In contrasto con l'applicazione di aspecifico perossidasi metodi di colorazione 28,29, questo approccio consente la determinazione selettiva dell'attività alogenante perossidasi, che è spesso compromessa a grave inflinfiammazione 30,31.
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Protocol
Tutti i campioni di sangue umano sono stati ottenuti da volontari sani, e il protocollo di leucociti arricchimento applicato segue le linee guida di etica commissione della Facoltà di Medicina dell'Università di Lipsia. Gli esperimenti con il sangue di ratto sono stati approvati dal responsabile comitato etico locale (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), secondo le linee guida tedesche per la cura degli animali e l'uso.
1. apparato sperimentale
NOTA: Poiché la procedura di lisi ipotonica per l'esaurimento di eritrociti da campioni di sangue è una procedura tempi critici, preparare tutte le attrezzature necessarie (ad esempio, buffer) per questa parte del protocollo in anticipo.
- Etichettare un 15 ml provetta per lisi ipotonica e uno 1,5 ml provetta per la successiva fluoresceina amminofenil (APF) colorazione per campione di sangue.
- Se l'arricchimento leucociti verrà eseguita in condizioni sterili, eseguire questa etichettatura sotto flussoscatola.
- Preparare circa 12 ml di PBS (PBS, 10 mM) per campione. A seconda che i leucociti sono isolati in condizioni sterili o no, preparare PBS sia utilizzando una soluzione pronta sterile da un fornitore o sciogliendo compresse PBS in acqua distillata. Controllare il valore pH e, se necessario, regolare a pH 7,4 utilizzando piccole quantità di 0,1 soluzioni M HCl e NaOH.
- Sciogliere compresse PBS (vedere Tabella dei materiali) in 200 ml di acqua distillata per ottenere una soluzione tampone non sterile sufficiente per circa 16 campioni. Se lo si desidera, sterilizzare questa soluzione per filtrazione sterile.
- Preparare circa 1 ml di soluzione salina bilanciata Hanks (HBSS) supplementato con Ca 2+ per campione.
- Sciogliere 970 mg di HBSS sale in 100 ml (volume finale) acqua bidistillata. Prima di riempire fino al volume finale, controllare il valore del pH e regolarlo a pH 7.4. Grazie alla sua capacità tampone basso, preparare questo buffer di fresco ogni giorno und eseguire la regolazione del pH con particolare cura, utilizzando piccole quantità di 0,1 soluzioni M HCl e NaOH.
NOTA: soluzione sterile può essere utilizzato, a seconda dell'esperimento. La soluzione può essere sterilizzata per filtrazione sterile.
- Sciogliere 970 mg di HBSS sale in 100 ml (volume finale) acqua bidistillata. Prima di riempire fino al volume finale, controllare il valore del pH e regolarlo a pH 7.4. Grazie alla sua capacità tampone basso, preparare questo buffer di fresco ogni giorno und eseguire la regolazione del pH con particolare cura, utilizzando piccole quantità di 0,1 soluzioni M HCl e NaOH.
- Oltre due buffer, etichette e preparare un tubo (ad esempio, 50 ml tubo di centrifugazione) o pallone (esempio, 250 ml misurino) con acqua bidistillata per la procedura di lisi ipotonica in anticipo. Preparare circa 10 ml di acqua per campione.
- Preparare un contenitore con ghiaccio tritato per la colorazione APF (sezione 3), che viene eseguita su ghiaccio.
- Preparare aliquote di APF in anticipo per consentire la preparazione rapida di soluzioni di lavoro utilizzati durante la colorazione (passo 3.2) e per evitare più volte il congelamento e lo scongelamento della soluzione APF.
NOTA: APF è comunemente ottenuto come 5 mg / ml (11.81 mM) soluzione di riserva in acetato di metile.- Congelare aliquote di 10-100 ml a 0,5 ml tubi. Per l'APF macchiare una finaleconcentrazione di colorante di 10 pM è utilizzato (passo 3.8).
2. ipotonica Lisi degli eritrociti
NOTA: Eseguire la procedura di lisi ipotonica (tranne le fasi di centrifugazione) sotto un banco a flusso laminare per evitare la contaminazione. Eseguire l'intera procedura a temperatura ambiente. Come la lisi ipotonica è un processo critico tempo, regolare le pipette per acqua (2 ml) e PBS (5 ml) aggiunta in anticipo e aprire l'acqua e flaconi PBS prima di avviare la procedura. Conservare la soluzione PBS e l'acqua distillata a temperatura ambiente prima dell'uso.
- Da ogni trasferimento del campione di sangue 100 ml a 15 ml di tubo di centrifugazione appropriata.
NOTA: Nei nostri esperimenti campioni di sangue di solito contengono 10 U / ml di eparina per evitare coagulazione. Eppure, a causa di diverse fonti di materiale campione della natura e della concentrazione del anti-coagulanti possono essere diversi. La sua influenza sulla colorazione APF dovrebbe essere testato da Comparzione dei risultati ai risultati ottenuti da campioni di sangue addizionato con altri tipi o concentrazioni di anticoagulante. - Aggiungere 2 ml di acqua distillata e mescolare i campioni utilizzando un miscelatore vortex impostato su un livello medio. Incubare i campioni per 60 secondi, quindi aggiungere 5 ml di PBS per campione e miscelare con il vortex.
NOTA: fino a circa 5 campioni può essere preparato in parallelo. Mantenere l'ordine del campione stesso per l'aggiunta di acqua e PBS per ottenere tempi di incubazione comparabili. - Dopo la rigenerazione delle condizioni isotoniche di PBS aggiunta (passo 2.2) agglomerare le restanti cellule intatte in tutti i campioni mediante centrifugazione per 6 minuti a temperatura ambiente e 450 x g.
- Rimuovere il surnatante versandolo in un contenitore per rifiuti tavolo. Rimuovere quanto più liquido possibile invertendo il tubo di centrifugazione e toccando l'apertura su un tovagliolo di carta. Assicurarsi che il pellet è il più asciutto possibile.
- Ripetere la procedura di lisi ipotonica come descritto in precedenza (passo 2.2).
NOTA: In linea di principio questa procedura lisi ipotonica (passi 2.3 2.5) potrebbe essere ripetuta più volte, a seconda della purezza della frazione leucocitaria mista da ottenere. Dopo due passi lisi la quota rimanente di eritrociti nella frazione cellulare mista ottenuta è di circa il 25%. - Agglomerare le cellule intatte restanti centrifugando per 6 minuti a temperatura ambiente e 450 x g. Rimuovere il surnatante (vedi punto 2.4). Aggiungere 500 microlitri HBSS al pellet e delicatamente sciogliere fino ad ottenere una soluzione omogenea. Trasferire ciascun campione alla provetta 1,5 ml di conseguenza l'etichetta.
- A seconda del esperimento analizzare direttamente i campioni ottenuti (ad esempio, tramite citometria a flusso) 25, macchia con anticorpi fluorescenza marcati (per l'identificazione di tipi di cellule singole) 32, incubare con stimoli cellulari (per gli esperimenti di attivazione delle cellule) 33 o memorizzati su ghiaccio e l'uso dopo. A seconda dello scopo dello studio, eseguire immediatamente successivi esperimenti sula frazione leucocitaria mista da granulociti hanno un abbastanza breve emivita di circa 20 ore.
NOTA: Questo vale anche per la colorazione attività perossidasica descritto di seguito.
3. alogenanti PEROSSIDASICA colorazione
NOTA: HOCl- e HOBr-produzione da parte dei perossidasi eme derivati dal sangue umano MPO e EPO è quantificato utilizzando APF, che viene ossidato a fluoresceina dagli acidi ipoalogenati nome. Quindi se l'etichettatura delle cellule con anticorpi fluorescenza marcato viene eseguito in combinazione con APF colorazione, evitare di fluorofori che interferiscono con il segnale di emissione di fluoresceina.
- Eseguire APF colorazione a 4 ° C in ghiaccio.
- Per la preparazione di una soluzione di lavoro di APF scongelare un'aliquota appropriata del colorante (ad esempio, 10 ml, 11.81 mM) e diluire con HBSS esattamente 1 mM (ad esempio, aggiungere 108,1 tampone microlitri al 10 microlitri).
- Per ogni campione (500 ml soluzione di cellule) preparare 5 μl di soluzione di lavoro APF descritta. Di conseguenza, utilizzare uno 10 ml di un'aliquota APF (11,81 mm), che produce 118,1 soluzione ul APF di lavoro (1 mm) per preparare circa 20 campioni. A causa della perdita durante il pipettaggio preparare circa il 10% in più di soluzione di lavoro APF quanto calcolato.
- Al fine di verificare la specificità perossidasi della colorazione APF, preparare campioni di controllo con l'inibitore perossidasi eme idrazide dell'acido 4-amminobenzoico (4-Abah) 35.
- Preparare una 1 M soluzione madre di 4-Abah (151.17 g / mol) in dimetilsolfossido (DMSO) diluendo 75,6 mg 4 Abah in 500 ml di solvente. Diluire ulteriormente 4 Abah 1/10 in HBSS.
- Per la preparazione di una soluzione un'etichetta H 2 O 2 di lavoro due provette da 1,5 ml di centrifugazione con "70 mM H 2 O 2" e "7 mM H 2 O 2" rispettivamente.
- Nel tubo con l'etichetta "70 mm H 2 O 2", appena diluire 10 mldi una soluzione madre al 30% (8.8 mM) di H 2 O 2 con 990 microlitri di acqua distillata per ottenere una concentrazione di circa 88 mM. Conservare su ghiaccio ed utilizzare entro 4 ore.
NOTA: H 2 O 2 è tipicamente fornito come una soluzione madre 30% dai fornitori. Se conservato a 4 ° C, è stabile per circa 3 anni. Eseguire diluizioni di H 2 O 2 in acqua distillata per evitare la decomposizione. H 2 O 2 diluizioni possono anche essere preparati in soluzione 0,1 M NaOH. - Per la determinazione della esatta H concentrazione 2 O 2 preparare una diluizione ulteriore 1 a 10 dalla prima H 2 O 2 soluzione stock (circa 88 mM) aggiungendo 100 microlitri di questa soluzione a 900 ml di acqua distillata nella provetta da 1,5 ml etichettata "7 mm H 2 O 2".
- Registrare uno spettro nel campo vicino UV (ad esempio, 200-300 nm) utilizzando un photospectrometer UV-Vis e utilizzare l'assorbanza a 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) per determinare il reale H 2 O 2 concentrazione nella seconda H 2 O 2 soluzione madre 34. Assicurarsi che la cuvetta di riferimento contiene solo acqua distillata. Per la misura cuvette uso quarzo come spettro nell'intervallo UV viene registrato.
- Da questo risultato, calcolare le concentrazioni esatte di entrambe le soluzioni madre H 2 O 2. Regolare la concentrazione della prima soluzione di riserva nel "70 mM H 2 O 2" tubo campione esattamente 70 mM aggiungendo una quantità adeguata di acqua distillata. Conservare la soluzione di lavoro ottenuta su ghiaccio e utilizzare entro un'ora.
- Nel tubo con l'etichetta "70 mm H 2 O 2", appena diluire 10 mldi una soluzione madre al 30% (8.8 mM) di H 2 O 2 con 990 microlitri di acqua distillata per ottenere una concentrazione di circa 88 mM. Conservare su ghiaccio ed utilizzare entro 4 ore.
- Aggiungere 5 ml di soluzione di lavoro 4 Abah (100 mM) per campioni appropriati per una concentrazione finale di 1 mM. Incubare i campioni per 15 min a 37 ° C in incubatore prima APF aggiunta.
- Aggiungere 5 microlitri soluzione APF lavoro (1 mM) per ciascun500 microlitri del campione per ottenere una concentrazione di colorante finale di 10 pM. Miscelare i campioni delicatamente (ad esempio, utilizzando il miscelatore a vortice in una posizione media) e incubare per 30 min a 37 ° C.
- Aggiungere 5 microlitri H soluzione di lavoro 2 O 2 (70 mM) per ogni campione microlitri 500 per una concentrazione finale di 700 mM. Mescolare delicatamente i campioni e li incubare per 60 minuti a 37 ° C. Effettuare misure di controllo adeguate in parallelo.
NOTA: misurazioni di controllo hanno mostrato che 700 mM H 2 O 2 non sono tossici per le cellule. Né tutte le risposte cellulari significative sono state osservate.
NOTA: La colorazione APF può essere eseguita anche omettendo l'aggiunta di H 2 O 2, a seconda della domanda scientifica. In assenza di perossido di idrogeno solo il MPO clorante basale e attività EPO è determinato mentre l'aggiunta di H 2 O 2 permette la rilevazione della massima HOCl e HOBr produzione da parte delle cellule. Tegli quest'ultimo si intende un segnale fluorescente significativamente più alto. - Per le cellule pellet, centrifugare i campioni per 10 min a temperatura ambiente e 400 x g. Rimuovere accuratamente il surnatante senza distruggere il pellet e aggiungere 250 microlitri HBSS per risospendere le cellule.
NOTA: I campioni sono ora pronti per l'analisi mediante citometria a flusso 25. - Conservare i campioni al buio fino al momento dell'analisi per evitare lo sbiancamento. Dopo eccitazione a 480-490 nm rilevare l'emissione di fluoresceina a circa 525 nm 37.
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Representative Results
Come riportato in precedenza il metodo sopra descritto si è rivelato essere applicabile sia ai umana e materiale non-umano 32. Inoltre come mostrato per topi con sintomi asmatici colorazione APF può essere uno strumento atto a rilevare differenze di situazione pro-infiammatoria sistemica. Pertanto, in uno studio successivo abbiamo usato questo protocollo per valutare più volte l'attività alogenazione di MPO (e EPO) in femmine ratti scuro Agouti con artrite pristano-indotta (PIA). Un esempio rappresentativo di arricchimento leucociti e colorazione eseguita durante questo esperimento è mostrato in Figura 1. Circa 200 microlitri di sangue intero è stato ottenuto dal plesso venoso retrobulbare dell'animale sotto anestesia e eparinato. La deplezione degli eritrociti ed una successiva colorazione APF sono stati eseguiti utilizzando 100 microlitri volume del campione. Successivamente il campione è stato analizzato mediante citometria di flusso.
(Figura 1A), un forte esaurimento di eritrociti da stato raggiunto campione. Inoltre diversi tipi di leucociti erano chiaramente distinguibile, identificati applicando marcatori di superficie cellulare fluorescenza-marcato (non mostrati). Brevemente il eritrociti (CD235a-positivo) / regione detriti cellulari hanno rappresentato solo il 22% degli eventi, mentre circa il 48% degli eventi sono stati identificati come i neutrofili CD16-positivo. Inoltre, il 3% degli eventi sono stati identificati come ogni eosinofili CCR3-positivi e monociti CD14-positivo e circa il 19% degli eventi rappresentato per CD5 / B CD19-positivo e linfociti T, rispettivamente. La distribuzione di intensità della fluorescenza APF-derivato (Figura 1B) permesso chiaramente la discriminazione degli eritrociti e linfociti perossidasi negativa mentre monociti e eosinofili hanno portato ad una ossidazione moderata APF e neutrofili erano fortemente perossidasi-positive sotto il chOsen condizioni sperimentali. Questi risultati sono in linea con l'alta abbondanza di MPO nelle ultime cellule rispetto alla concentrazione dell'enzima nei monociti 20. La risposta relativamente debole degli eosinofili può essere spiegata dal fatto che nessuno è stato aggiunto bromuro, che può aver indotto la formazione EPO-derivati HOBr. Studi preliminari su eosinofili isolati sorprendentemente non mostrano una grande influenza di bromuro aggiunto esternamente sull'ossidazione APF da queste cellule. Ancora, l'ossidazione delle APF da eosinofili è stato osservato che possono essere spiegati con l'introduzione di piccole quantità di Br - tramite le soluzioni tampone utilizzate (PBS e HBSS). In alternativa EPO può anche produrre piccole quantità di HOCl, almeno in condizioni acide (ad esempio, in phagolysosomes).
Figura 1: l'arricchimento dei leucociti e APF-Derived fluorescenza in un sangue micro-campione da un ratto. Una quantità di circa 200 microlitri di sangue intero è stato ottenuto dal plesso venoso retrobulbare di una femmina scuro Agouti ratto. Dopo l'applicazione della procedura di emolisi descritto a 100 microlitri di sangue e una successiva APF colorazione della frazione cellulare mista è stata analizzata mediante citometria di flusso. Come mostrato dal / SSC Plot FSC (A) gli eritrociti sono stati fortemente impoverito dal campione e le diverse tipologie di leucociti potrebbe facilmente essere distinti. La distribuzione della intensità di fluorescenza APF-derivato (B) ha mostrato chiaramente eme perossidasi-negative cellule (eritrociti e linfociti), così come i leucociti con moderati (eosinofili e monociti) o forti (neutrofili) attività alogenazione perossidasi. Cliccate qui per visualizzare un grande versione di questa figura.
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Discussion
Come neutrofili sono i leucociti più abbondanti nel sangue umano l'isolamento delle cellule perossidasi-positive concentra spesso solo su queste cellule e comprende una separazione dei neutrofili di altri leucociti dal gradiente di densità centrifugazione 38. Eppure, come neutrofili sono molto meno abbondanti in campioni di sangue murini 39 per questi ultimi metodi più complessi debbano essere impiegati 40. Inoltre entrambi i metodi portano anche alla rimozione dei monociti perossidasi-positive nei campioni e, a causa della necessità di volumi sanguigni più grandi (ad esempio, 400 ml 41), non sono applicabili alle micro-campioni ottenuti durante il prelievo di sangue ricorrenti da piccoli animali da laboratorio 38,40. La purificazione dei neutrofili murini da essudati peritoneali anche bisogno del sacrificio degli animali e, inoltre, non cede granulociti derivati dal sangue 38,40. Recentemente sviluppato metodi per ottenere frazioni granulociti altamente purificate da bl murinoood (ad esempio, l'applicazione di anticorpi) sono spesso costosi, complicato e richiede tempo 40,42,43 e ancora concentrarsi solo sulla purificazione di un tipo di leucociti perossidasi-positive.
Pertanto, il metodo qui presentato ha un paio di vantaggi rispetto ad altri metodi applicati per la purificazione di leucociti perossidasi-positive. Come è basata su piccoli campioni di sangue le cellule ottenute rappresentano la situazione nella circolazione. A causa del piccolo volume di campione iniziale necessario per il protocollo il metodo è applicabile sia sangue non umano umano e, nonostante le differenze specie-specifici in abbondanza di neutrofili. In realtà, siamo stati anche in grado di applicare il metodo descritto a siglare volumi di sangue piccoli come 50 ml (dati non riportati). Il piccolo campione di sangue necessaria per il metodo rende anche adatto per prelievo di sangue ripetute da piccoli animali da laboratorio o per applicazioni mediche speciali (per esempio, diagnosi neonato). come tha leucociti arricchimento si basa sulla deplezione degli eritrociti tutte le cellule perossidasi-positive (neutrofili, eosinofili, monociti) sono inclusi nella frazione leucocitaria mista ottenuta e possono essere analizzati separatamente utilizzando la citometria a flusso. Il metodo è veloce, affidabile e ha bassi requisiti in materia di prodotti chimici e strumentazione, rendendo il protocollo adatto a più ambienti scientifici.
Come neutrofili sono facilmente attivati un passo fondamentale durante il metodo descritto è la regolazione precisa del valore pH delle soluzioni tampone utilizzate (PBS e HBSS, vedere i punti 1.2 e 1.3 della sezione di protocollo). Inoltre, il tempo di incubazione delle cellule del sangue con acqua distillata dovrebbe essere non più di 60 secondi prima di ripristinare condizioni normosmotic (vedi passo 2.2 della sezione protocollo. Il (quasi) completamente rimozione del solvente dal pellet cellulare (passo 2.4) prima dell'aggiunta di acqua per il secondo lisi ipotonica è un altro passo critica come appassionatoresidui er diminuirà l'efficienza del procedimento di lisi ipotonica. Un altro punto critico si riferisce all'applicazione di H 2 O 2 durante la colorazione APF. Anche se la quantità applicata non dovrebbe essere citotossici, la vitalità delle cellule deve essere controllato. Durante i nostri studi abbiamo in genere applichiamo il colorante 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine ioduro (JC-1) per la rilevazione di eventi precoci apoptotici.
Inoltre, ci sono un paio di limitazioni nel metodo leucociti arricchimento semplificata. Mentre la tecnica può essere applicata a campioni di sangue da diverse specie (uomo, ratto e topo sono stati provati), la quantità di leucociti ottenuto dopo la lisi degli eritrociti dipende loro abbondanza iniziale nel sangue. Quest'ultimo varia certamente tra le specie 39 e dipende anche dallo stato infiammatorio dell'individuo sondato. Inoltre, mentre la procedura di lisi può essere fatto con un massimo di uncento campioni in parallelo le fasi di centrifugazione intermedi rappresentano una limitazione, a seconda della centrifuga usata, solo fino 30 campioni possono essere processati in parallelo. Inoltre, mentre APF rileva prontamente HOCl e HOBr in presenza di SCN -, l'attività alogenante di MPO e EPO colpisce anche a quest'ultimo pseudo-alogenuro. In tal modo hypothiocyanite (- OSCN) è formato che è in grado di ossidare APF. Un altro limite deriva dalle proprietà del colorante APF utilizzato per la determinazione di HOCl- e HOBr-produzione MPO e EPO. Poiché il colorante viene ossidato a fluoresceina, la colorazione non può essere combinato con anticorpi fluorescenti con uno spettro di emissione nello stesso intervallo. Naturalmente eventuali interferenze tra la fluorescenza APF-derivato e il segnale di segnali fluorescenti supplementari devono essere controllati e controllato nel citofluorimetro.
Altrimenti, se il rilevamento dell'attività alogenante perossidasi non è la portata delstudio, dopo l'applicazione del metodo deplezione degli eritrociti altri metodi analitici possono essere utilizzati al posto di APF. Poiché la procedura di lisi ipotonica descritta porta solo ad una deplezione parziale di eritrociti e, come tutti i leucociti sono ancora presenti nella frazione cellulare mista ottenuta soltanto i metodi che consentono dovrebbe essere applicata una singola analisi delle cellule. I metodi che comprendono la lisi delle cellule (ad esempio, analisi complotto occidentale) non produrranno risultati affidabili. Il piccolo volume di campione iniziale può essere un altro ostacolo per tali metodi analitici.
Per quanto riguarda l'indagine di MPO (e EPO) l'attività in leucociti spesso solo la produzione generale ossidante da parte delle cellule si rivolge invece di valutare specificamente l'attività perossidasi eme 44,45. Inoltre spesso non vengono fatti tentativi per distinguere tra il alogenante e della perossidasi di MPO e EPO 46,47. Metodi, che affrontano specificamente la clorazione attività MPO da quantifying prodotti HOCl-derivati come chlorotyrosine non rilevare over-ossidato e / o dei prodotti metabolizzato e, quindi, spesso portano a una sottostima del reale HOCl-produzione 48. Inoltre questo metodo, nonché l'individuazione di HOCl derivato 2-chloroethidium sono anche in termini di tempo, necessitano di attrezzature analitiche costose e comprendono lisi delle cellule 48-50 .Ci sono molte relazioni su nuovi coloranti per la determinazione specifica dell'attività MPO clorante all'interno delle cellule vitali 44,51,52. Eppure, fino ad oggi solo APF e il suo idrossifenil fluoresceina composto correlato (HPF) sono disponibili in commercio e, pertanto, regolarmente utilizzati nella ricerca 25,33.
Infatti, utilizzando APF abbiamo potuto dimostrare che l'attività MPO clorurazione non può essere quantificato solo utilizzando l'enzima isolato 53, ma anche applicando il colorante cellule viventi 26,33. Così combinando l'arricchimento leucociti pratica da micro-campioni di sangue di cui sopra con unn APF colorazione abbiamo sviluppato un protocollo, che è adatto per affrontare in modo specifico e allo stesso tempo l'attività alogenazione di MPO e EPO in tutti i leucociti positivi perossidasi, vale a dire, neutrofili, monociti e eosinofili 32. Inoltre il metodo non richiede la lisi cellulare, che permette un'ampia varietà di metodi analitici, compreso citometria di flusso e microscopia a fluorescenza confocale. Inoltre questo perossidasi attività di colorazione può essere combinato con l'applicazione di marcatori di superficie cellulare, che permette l'analisi specifica dei leucociti sotto-frazioni, a seconda dell'attività scientifica. Tuttavia è da considerare che gli anticorpi fluorescenza marcati applicati non interferiscono con il segnale di fluorescenza fluoresceina-based utilizzato per quantificare la HOCl- ed ossidazione APF HOBr-derivato.
In sintesi questo metodo può fornire un nuovo strumento per ottenere ulteriori delucidazioni sul ruolo fisiologico dell'attività alogenazione perossidasi del re immunologicaLevant perossidasi derivati dal sangue umano MPO e EPO, che non è ancora ben compreso 8,20,23. Inoltre in uno studio animale su artrite reumatoide potremmo recentemente osservare che questo protocollo può portare alla valutazione della produzione HOCl MPO-derivato come nuovo marcatore clinico malattie infiammatorie croniche (dati non pubblicati).
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials/Equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | - |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | - |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g., 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | - |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | - |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450 x g |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400 x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1 M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | - |
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