Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

في هذه الورقة يوصف بروتوكول لإثراء سريع وموحد من الكريات البيض من عينات الدم كلها صغيرة. ويستند هذا الإجراء على تحلل منخفض التوتر من كريات الدم الحمراء ويمكن تطبيقها على عينات الإنسان، وكذلك للدم من مصدر غير إنساني. حجم العينة الأولي صغيرة من حوالي 50 إلى 100 ميكرولتر يجعل هذه الطريقة تنطبق على اخذ عينات من الدم المتكررة من حيوانات المختبر الصغيرة. وعلاوة على ذلك، ويتحقق تخصيب الكريات البيض في غضون دقائق ومع الجهود المواد منخفضة المتعلقة بالمواد الكيميائية والأجهزة، مما يجعل هذه الطريقة قابلة للتطبيق في بيئات المختبرات متعددة.

يتم الجمع بين تنقية موحدة من الكريات البيض مع طريقة انتقائية للغاية تلطيخ لتقييم النشاط البيروكسيديز halogenating من مستخلصات الهيم، الميلوبيروكسيديز (MPO) والبيروكسيديز الحمضات (EPO)، أي تشكيل من تحت الكلور وحمض hypobromous (HOCL وHOBr). في حين أن الخطة الرئيسية للعمليات أعرب بقوة في neut غيرrophils، والأكثر وفرة المناعي نوع من الخلايا في الدم البشري وكذلك في وحيدات، وأعرب عن انزيم ذات الصلة EPO حصرا في الحمضات. وتعالج النشاط halogenating هذه الانزيمات باستخدام فلوريسئين تقريبا HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl (APF) والبيروكسيديز الأساسي بيروكسيد الهيدروجين الركيزة. على تحليل التدفق الخلوي لاحق كل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي (العدلات، وحيدات، الحمضات) يمكن تمييزها، ويمكن كميا نشاطهم البيروكسيديز halogenating. منذ APF تلطيخ يمكن الجمع بين تطبيق علامات سطح الخلية، وهذا البروتوكول يمكن أن تمتد إلى معالجة على وجه التحديد الكريات البيض كسور الفرعية. هذه الطريقة تنطبق على كشف HOCL وHOBr إنتاج في كل من الإنسان وفي الكريات البيض القوارض.

ونظرا للدور المناعية التي نوقشت على نطاق واسع وبتنوع هذه المنتجات الأنزيمية في الأمراض الالتهابية المزمنة، قد يسهم هذا البروتوكول إلى فهم أفضل للأهمية المناعية من مستخلصات الهيم المشتقة من خلايا الدم البيضاء.

Introduction

الكريات البيض النوى (PMNs، وتسمى أيضا المحببة) وحيدات تمثل المكونات الخلوية الهامة من نظام المناعة الفطري في 1،2 الدم. لأنها تسهم في الدفاع الأول ضد الجراثيم وكذلك لتفعيل نظام المناعة المكتسبة والشروع في الاستجابة الالتهابية الجهازية 2-4. بعد خصوصا العدلات، النوع الأكثر وفرة من المحببة، وحيدات أيضا تسهم إلى حد كبير في التنظيم وإنهاء أحداث الالتهابية الحادة 5. لذلك قد تكون هذه الخلايا أيضا أن تلعب دورا هاما في الأمراض الالتهابية المزمنة مثل التهاب المفاصل الروماتويدي 6،7. في الواقع، والربو، ومرض مجرى الهواء التهابي مزمن، وتتميز الخلايا ضعاف الحمضات، والنوع الثاني الأكثر محببة في الدم 8. إلا أن موت الخلايا المبرمج للالمحببة وإزالة سريعة من قبل الضامة هما خطوتان أساسيتان أثناء إنهاء الخلويالتهاب 9-11.

في الخلايا المناعية المسماة اثنين من الانزيمات وترتبط ارتباطا وثيقا، وهي الميلوبيروكسيديز (الخطة الرئيسية للعمليات، العدلات وحيدات) والحمضية البيروكسيديز (EPO، الحمضات) ويمكن الاطلاع 12،13. وهذه بيروكسيديزات الهيم المرتبطة تقليديا إلى الاستجابة المناعية الخلطية لأنها يومين إلكترونيا أكسدة (الزائفة) هاليدات للفراش لا تسبب المقابلة (الزائفة) الأحماض halous التي هي معروفة لخصائص جراثيم من 14-16. في ظل الظروف الفسيولوجية MPO أساسا أشكال حمض تحت الكلور (HOCL) وhypothiocyanite (- OSCN)، في حين تتشكل حمض الأخير وhypobromous (HOBr) من خلال المكتب الأوروبي للبراءات 17-19. وتشير النتائج الجديدة أن هذا (الزائفة) نشاط انزيم halogenating قد تسهم أيضا في تنظيم الاستجابات الالتهابية وإنهاء التفاعلات المناعية 20،21. في الواقع، عرضت على إنتاج HOCL من الخطة الرئيسية للعمليات والمنتجات المشتقة منها لقمع تي خلية القاعدة الاستجابات المناعية التكيفية 22-24.

من أجل كسب المزيد من الضوء على دور مناعي من الكريات البيض من نظام المناعة الفطري في الأمراض الالتهابية المزمنة وتحديد مساهمة الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات لهذه الوظيفة الفسيولوجية قمنا بتطوير طريقة لإثراء بسرعة الكريات البيض من عينات دم صغيرة لأغراض محددة لاحق تقرير النشاط halogenating البيروكسيديز في هذه الخلايا. لاستنزاف كرات الدم الحمراء اخترنا طريقة موحدة بما في ذلك الخطوات تحلل ناقص التوتر اللاحقة مع اثنين من الماء المقطر، الأمر الذي يؤدي إلى تخصيب الكريات البيض سريع في تكاليف المواد منخفضة. لقرار لاحق من الخطة الرئيسية للعمليات halogenating والنشاط EPO تم استخدام HOCl- وHOBr محددة صبغ aminophenyl فلوريسئين (APF) 25-27. وعلى النقيض من تطبيق أساليب تلطيخ البيروكسيديز غير محددة 28،29، وهذا النهج يسمح للكشف انتقائي من النشاط halogenating البيروكسيديز، والتي غالبا ما تضعف في infl شديدammation 30،31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

وقد تم الحصول على جميع عينات الدم الإنسان من المتطوعين الأصحاء، وبروتوكول تخصيب الكريات البيض تطبيق يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات كلية الطب في جامعة لايبزيغ. وتمت الموافقة على التجارب مع دم الفئران من قبل اللجنة الأخلاقية المحلية المسؤولة (Landesdirektion سكسونيا، Referat 24)، وفقا للمبادئ التوجيهية الألمانية على رعاية الحيوانات واستخدامها.

1. إعداد التجريبية

ملاحظة: كما في إجراء تحلل منخفض التوتر لاستنزاف كرات الدم الحمراء من عينات الدم هو إجراء الوقت الحرج، وإعداد جميع التجهيزات الضرورية (على سبيل المثال، مخازن) لهذا الجزء من البروتوكول مقدما.

  1. تسمية واحدة 15 مل أنبوب الطرد المركزي للتحلل منخفض التوتر واحد أنبوب عينة 1.5 مل لاحق aminophenyl فلوريسئين (APF) تلطيخ في عينة الدم.
    1. إذا كان سيتم إجراء تخصيب الكريات البيض تحت ظروف معقمة، تنفيذ هذا الوسم تحت تدفقمربع.
  2. إعداد حوالي 12 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، 10 ملم) لكل عينة. اعتمادا على ما إذا كان يتم عزل الكريات البيض تحت ظروف معقمة أم لا، وإعداد برنامج تلفزيوني إما باستخدام محلول معقم جاهز من مورد أو عن طريق إذابة أقراص برنامج تلفزيوني في الماء المقطر. تحقق من قيمة الرقم الهيدروجيني، وإذا لزم الأمر، وضبط لدرجة الحموضة 7.4 باستخدام كميات صغيرة من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم الحلول.
    1. حل أقراص برنامج تلفزيوني (انظر الجدول من المواد) في 200 مل من الماء المقطر للحصول على حل العازلة غير معقمة كافية لحوالي 16 عينة. إذا رغبت في ذلك، وتعقيم هذا الحل عن طريق الترشيح العقيمة.
  3. إعداد حوالي 1 مل هانكس محلول ملحي متوازن (HBSS) تستكمل مع الكالسيوم 2+ لكل عينة.
    1. حل 970 ملغ من الملح HBSS في 100 مل (الحجم النهائي) الماء المقطر المزدوج. قبل ملء تصل إلى الحجم النهائي، والتحقق من قيمة الرقم الهيدروجيني وتعديله لدرجة الحموضة 7.4. نظرا لقدرتها عازلة منخفضة، وإعداد هذا المخزن المؤقت الطازج كل يوم لد أداء ضبط الأس الهيدروجيني مع عناية خاصة باستخدام كميات صغيرة من 0.1 M حمض الهيدروكلوريك وهيدروكسيد الصوديوم الحلول.
      ملاحظة: محلول معقم يمكن أن تستخدم، اعتمادا على التجربة. يمكن تعقيم الحل عن طريق الترشيح العقيمة.
  4. وبالاضافة الى اثنين من المخازن، والتسمية، وإعداد أنبوب (على سبيل المثال، 50 مل أنبوب الطرد المركزي) أو قارورة (على سبيل المثال، 250 مل قياس كوب) مع الماء المقطر المزدوج لإجراء تحلل منخفض التوتر مقدما. إعداد حوالي 10 مل من الماء لكل عينة.
  5. تحضير وعاء مع الثلج المجروش ل(القسم 3) تلطيخ APF، والتي تتم على الجليد.
  6. إعداد aliquots من APF في وقت مبكر يسمح إعداد سريع للحلول العمل المستخدمة خلال تلطيخ (خطوة 3.2) وتجنب مرارا تجميد والذوبان من الحل APF.
    ملاحظة: يتم الحصول على APF عادة باعتباره 5 ملغ / مل (11.81 ملم) حل الأسهم في خلات الميثيل.
    1. تجميد aliquots من 10-100 ميكرولتر في 0.5 مل أنابيب. لAPF تلطيخ نهائييستخدم تركيز الصبغة من 10 ميكرومتر (الخطوة 3.8).

2. منخفض التوتر تحلل من الكريات الحمر

ملاحظة: نفذ الخطوات تحلل ناقص التوتر (باستثناء الخطوات الطرد المركزي) تحت مقعد تدفق الصفحي لتجنب التلوث. تنفيذ الإجراء بأكمله في درجة حرارة الغرفة. كما تحلل منخفض التوتر هو عملية حاسمة الوقت، وضبط ماصات للمياه (2 مل)، وبرنامج تلفزيوني (5 مل) بالإضافة مقدما وفتح المياه وقوارير برنامج تلفزيوني قبل بدء العملية. تخزين الحل في برنامج تلفزيوني والماء المقطر في درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

  1. من كل نقل عينة الدم 100 ميكرولتر إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي المناسب.
    ملاحظة: في تجاربنا عادة ما تحتوي على عينات دم 10 U / مل من الهيبارين من أجل تجنب تجلط الدم. بعد نظرا لمصادر مختلفة من مادة العينة طبيعة وتركيز مكافحة تجلط الدم قد تختلف. وينبغي اختبار تأثيرها على تلطيخ APF التي كتبها comparجي النتائج إلى النتائج التي تم الحصول عليها من عينات الدم تستكمل مع أنواع أو تركيزات مكافحة تجلط الدم الأخرى.
  2. إضافة 2 مل من الماء المقطر وتخلط العينات باستخدام خلاط دوامة تعيين إلى مستوى متوسط. احتضان هذه العينات لمدة 60 ثانية، ثم يضاف 5 مل PBS لكل عينة وتخلط باستخدام خلاط دوامة.
    ملاحظة: ما يصل إلى حوالي 5 عينات يمكن أن تكون مستعدة بشكل متواز. الحفاظ على نموذج النظام نفسه لإضافة الماء وبرنامج تلفزيوني لتحقيق حضانة مرات مقارنة.
  3. بعد تجديد الظروف متساوي التوتر عن طريق برنامج تلفزيوني إضافة (الخطوة 2.2) بيليه خلايا سليمة المتبقية في جميع العينات بواسطة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 450 ز س.
  4. إزالة طاف بصب قبل أن تتحول إلى سلة المهملات الجدول. إزالة كسائل أكبر قدر ممكن من أنبوب للقلب الطرد المركزي والاستفادة من فتح على منشفة ورقية. تأكد من أن بيليه خلية جافة قدر الإمكان.
  5. كرر الإجراء تحلل منخفض التوتر كما هو موضح من قبل (الخطوة 2.2).
    NOTE: من حيث المبدأ هذا الإجراء تحلل منخفض التوتر (الخطوات 2،3-2،5) قد يتكرر أكثر من مرة، وهذا يتوقف على نقاء جزء الكريات البيض المختلطة التي يمكن الحصول عليها. بعد سنتين تحلل الخطوات حصة المتبقية كريات الدم الحمراء في جزء الخلية المختلطة التي تم الحصول عليها عن 25٪.
  6. بيليه خلايا سليمة المتبقية بواسطة الطرد المركزي لمدة 6 دقائق في درجة حرارة الغرفة و 450 ز س. إزالة طاف (راجع الخطوة 2.4). إضافة 500 ميكرولتر HBSS لبيليه وحل برفق حتى يتم الحصول على حل متجانسة. نقل كل عينة إلى أنبوب عينة 1.5 مل المسمى وفقا لذلك.
  7. اعتمادا على تجربة تحليل مباشرة العينات التي تم الحصول عليها (على سبيل المثال، عن طريق التدفق الخلوي) 25، وصمة عار مع الأجسام المضادة مضان المسمى (لتحديد أنواع وحيدة الخلية) 32، واحتضان مع المثيرات الخلوية (للتجارب تنشيط الخلايا) 33 أو تخزينها على الجليد واستخدام في وقت لاحق. اعتمادا على الهدف من هذه الدراسة، نفذ فورا تجارب لاحقة علىجزء الكريات البيض مختلطة منذ المحببة لديهم قصيرة نسبيا نصف عمر حوالي 20 ساعة.
    ملاحظة: هذا ينطبق أيضا على تلطيخ النشاط البيروكسيديز هو موضح أدناه.

3. Halogenating البيروكسيد آخر تلطيخ

ملاحظة: HOCl- وHOBr الإنتاج من قبل بيروكسيديزات الهيم المشتقة من الدم الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات وكميا باستخدام APF، الذي يتأكسد إلى فلوريسئين من الأحماض hypohalous اسمه. لذلك إذا تم تنفيذ وسم الخلية مع الأجسام المضادة المسماة مضان في تركيبة مع APF تلطيخ، وتجنب fluorophores التي تتداخل مع إشارة انبعاث فلوريسئين.

  1. أداء APF تلطيخ في 4 درجات مئوية على الجليد.
  2. لإعداد حل العاملة من APF ذوبان الجليد قسامة المناسبة للصباغة (على سبيل المثال، 10 ميكرولتر، 11.81 ملم) وتمييع مع HBSS بالضبط 1 ملم (على سبيل المثال، إضافة 108.1 العازلة ميكرولتر إلى ميكرولتر 10).
    1. لكل عينة (500 ميكرولتر حل الخلية) إعداد 5 μلتر من محلول العمل APF وصفها. وفقا لذلك، استخدم واحد 10 قسامة ميكرولتر من APF (11.81 ملم)، والتي ينتج 118.1 ميكرولتر حل APF العمل (1 ملم) لإعداد حوالي 20 عينة. بسبب فقدان أثناء pipetting لإعداد حوالي 10٪ أكثر APF حل العملية من حساب.
  3. من أجل التحقق من خصوصية البيروكسيديز من تلطيخ APF، وإعداد العينات التحكم مع هيدرازيد الهيم البيروكسيديز المانع 4-أمينو حمض (4 أباه) 35.
    1. إعداد محلول المخزون 1 M من 4 أباه (151.17 جم / مول) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) عن طريق تمييع 75.6 ملغ 4 أباه في 500 ميكرولتر المذيبات. وعلاوة على ذلك تمييع 4 أباه 10/01 في HBSS.
  4. لإعداد حل H 2 O 2 عمل تسمية اثنين من 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي مع "70 مم H 2 O 2" و "7 مم H 2 O 2"، على التوالي.
    1. في أنبوب المسمى "70 مم H 2 O 2"، حديثا تمييع 10 ميكرولترالحل الأسهم 30٪ (8.8 ملم) من H 2 O 2 باستخدام 990 ميكرولتر الماء المقطر للحصول على تركيز من حوالي 88 ملم. تخزين على الجليد واستخدامها داخل 4 ساعات.
      ملاحظة: H 2 O 2 يتم تسليم عادة ما 30٪ حل الأوراق المالية من قبل الموردين. عند تخزينها في 4 درجات مئوية، وأنها مستقرة لمدة 3 سنوات. أداء التخفيفات من H 2 O 2 في الماء المقطر لتجنب التحلل. ويمكن أيضا أن يكون مستعدا H 2 O 2 التخفيفات في 0.1 حل M هيدروكسيد الصوديوم.
    2. لتحديد H المحدد 2 O 2 تركيز إعداد تخفيف مزيد من 1 إلى 10 من H الأول 2 O 2 حل سهم (حوالي 88 ملم) وذلك بإضافة 100 ميكرولتر من هذا الحل إلى 900 ميكرولتر من الماء المقطر في أنبوب 1.5 مل المسمى "7 مم H 2 O 2".
    3. تسجيل الطيف في المدى القريب للأشعة فوق البنفسجية (على سبيل المثال، 200-300 نانومتر) باستخدام photospectrometer أشعة فوق البنفسجية فيس واستخدام الامتصاصية في 240 نانومتر (49؛ 240 = 34 م -1 سم -1) لتحديد H الفعلي تركيز 2 O 2 في H الثاني 2 O 2 حل الأوراق المالية 34. ضمان كفيت إشارة تحتوي على الماء فقط المقطر. لcuvettes استخدام الكوارتز قياس كما هو مسجل طائفة في نطاق الأشعة فوق البنفسجية.
    4. من هذه النتيجة، وحساب تركيزات بالضبط كل الحلول الأسهم H 2 O 2. ضبط تركيز المحلول الأول في "70 مم H 2 O 2" عينة أنبوب بالضبط 70 ملم عن طريق إضافة كمية مناسبة من الماء المقطر. تخزين حل العمل الحصول على الجليد واستخدام في غضون ساعة واحدة.
  5. إضافة 5 ميكرولتر من محلول 4 أباه العمل (100 ملم) للعينات مناسبة لتركيز النهائي من 1 ملم. احتضان هذه العينات لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة قبل APF بالإضافة.
  6. إضافة 5 ميكرولتر حل APF العمل (1 ملم) على كل500 عينة ميكرولتر للحصول على تركيز الصبغة النهائي من 10 ميكرومتر. خلط العينات بلطف (على سبيل المثال، باستخدام خلاط دوامة على الإعداد المتوسط)، واحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
  7. إضافة 5 ميكرولتر H حل العاملة 2 O 2 (70 ملم) لكل عينة ميكرولتر 500 لتركيز النهائي من 700 ميكرومتر. المزيج بلطف العينات واحتضان لهم لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. إجراء قياسات المراقبة المناسبة في نفس الوقت.
    وأظهرت قياسات تحكم أن 700 ميكرومتر H 2 O 2 ليست سامة للخلايا: ملاحظة. كما لم يلحظ أي الاستجابات الخلوية الهامة.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ تلطيخ APF بحذف إضافة H 2 O 2، اعتمادا على مسألة علمية. في غياب بيروكسيد الهيدروجين يتحدد فقط MPO الكلورة القاعدية والنشاط EPO في حين أن إضافة H 2 O 2 يسمح للكشف الأقصى HOCL وHOBr إنتاج الخلايا. تانه يعني الأخير إشارة الفلورسنت أعلى بكثير.
  8. لالتكوير الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 400 ز س. تماما إزالة طاف دون تدمير بيليه وإضافة 250 ميكرولتر HBSS إلى resuspend الخلايا.
    ملاحظة: هذه العينات هي الآن جاهزة للتحليل عن طريق التدفق الخلوي 25.
  9. تخزين العينات في الظلام حتى تحليل لتجنب التبييض. بعد الإثارة في 480-490 نانومتر كشف عن انبعاث فلوريسئين في حوالي 525 نانومتر 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

كما ذكرت سابقا الطريقة المذكورة أعلاه تبين أن تنطبق على كل من الإنسان والمواد غير البشرية 32. وعلاوة على ذلك كما هو مبين بالنسبة للفئران مع أعراض الربو قد يكون تلطيخ APF أداة مناسبة للكشف عن الاختلافات في وضع النظامية الموالية للالتهابات. لذلك في دراسة لاحقة استخدمنا هذا البروتوكول لتقييم مرارا النشاط halogenating من الخطة الرئيسية للعمليات (وايبو) في إناث فئران الظلام الأغوطي مع التهاب المفاصل الناجم عن البريستينات (PIA). ويرد مثال ممثل تخصيب الكريات البيض وتلطيخ المنجزة خلال هذه التجربة في الشكل 1. تم الحصول على معلومات عن 200 ميكرولتر من الدم الكامل من الضفيرة الوريدية خلف المقلة للحيوان تحت التخدير وheparinized. أجريت استنزاف كرات الدم الحمراء وتلطيخ APF لاحق باستخدام 100 ميكرولتر حجم العينة. بعد ذلك تم تحليل عينة من التدفق الخلوي.

her.within الصفحات = "1"> كما هو مبين من خلال التآمر حجم الخلية مقابل خلية تحبب (الشكل 1A)، استنزاف قوي من الكريات الحمراء من تحقق العينة. وعلاوة على ذلك كانت أنواع الكريات البيض مختلفة يمكن تمييزها بوضوح، التي تم تحديدها من خلال تطبيق علامات سطح الخلية مضان المسمى (لا يظهر). لفترة وجيزة في كرات الدم الحمراء (-CD235a إيجابي) / خلية منطقة الحطام تمثل سوى 22٪ من أحداث في حين تم تحديد حوالي 48٪ من أحداث كما العدلات-CD16 الإيجابية. وعلاوة على ذلك 3٪ من الأحداث تم تحديد كل منها الحمضات-CCR3 إيجابي وحيدات-CD14 إيجابي وحوالي 19٪ من الأحداث تمثل CD5 /-CD19 إيجابي B والخلايا اللمفية تي، على التوالي. توزيع كثافة مضان المستمدة APF (الشكل 1B) يسمح بوضوح للتمييز من كريات الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية البيروكسيديز السلبي في حين تصدرت وحيدات الحمضات لأكسدة APF المعتدلة وكانت العدلات بقوة الإيجابي البيروكسيديز تحت الفصلاوسين الظروف التجريبية. هذه النتائج تتماشى مع وفرة عالية من الخطة الرئيسية للعمليات في الخلايا الأخيرة بالمقارنة مع تركيز الانزيم في حيدات 20. استجابة ضعيفة نسبيا من الحمضات يمكن تفسير حقيقة، أنه لا يوجد بروميد أضيف، والتي قد دفعت تشكيل المستمدة EPO لHOBr. الدراسات الأولية على الحمضات معزولة بشكل مفاجئ لم تظهر تأثير كبير بروميد أضاف خارجيا على أكسدة APF من هذه الخلايا. ومع ذلك، أكسدة APF التي لوحظ الحمضات التي يمكن تفسيرها من خلال إدخال كميات صغيرة من الأخ - عن طريق المحاليل المستخدمة (PBS وHBSS). بدلا من ذلك EPO قد تنتج أيضا كميات صغيرة من HOCL، على الأقل في ظل الظروف الحمضية (مثل في جسيم حال بلعمي).

شكل 1
الشكل 1: تخصيب خلايا الدم البيضاء وAPF-ينحدرحصلت د مضان في الدم الصغيرة عينة من الفئران مبلغ قدره حوالي 200 ميكرولتر من الدم الكامل من الضفيرة الوريدية خلف المقلة للإناث الفئران الظلام الأغوطي. بعد تطبيق الإجراء انحلال الدم وصفها إلى 100 ميكرولتر الدم ولاحق من APF تلطيخ جزء الخلية المختلطة تم تحليلها من قبل التدفق الخلوي. كما هو مبين من قبل FSC- / SSC- قطعة أرض (A) تم استنفاد الكريات الحمراء بقوة من العينة وأنواع الكريات البيض مختلفة يمكن بسهولة المتميزة. أظهر توزيع كثافة مضان المستمدة APF (ب) بوضوح الهيم البيروكسيديز سلبية خلايا (كريات الدم الحمراء والخلايا الليمفاوية) وكذلك الكريات البيض مع المعتدلة (الحمضات والوحيدات) أو قوية (العدلات) النشاط halogenating البيروكسيديز. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

كما العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم البشري عزل الخلايا البيروكسيديز الإيجابي يركز كثير من الأحيان إلا على هذه الخلايا ويتضمن الفصل العدلات من الكريات البيض الأخرى عن طريق التدرج الكثافة الطرد المركزي 38. ولكن كما العدلات أقل وفرة في عينات دم الفئران 39 لأساليب أكثر تعقيدا الأخيرة لا بد من استخدامها 40. وعلاوة على ذلك يؤدي كلا الطريقتين أيضا إلى إزالة حيدات-البيروكسيديز إيجابي من العينات، ونظرا لحاجة كميات الدم الكبيرة (على سبيل المثال، 400 ميكرولتر 41)، لا تنطبق على العينات المجهرية التي تم الحصول عليها خلال أخذ عينات الدم المتكررة من حيوانات المختبر صغيرة 38،40. تنقية العدلات الفئران من الإفرازات البريتوني أيضا في حاجة إلى التضحية من الحيوانات وعلاوة على ذلك، لا تسفر المحببة المشتقة من الدم 38،40. طرق للحصول على أجزاء محببة عالي النقاء من BL الفئران وضعت مؤخراالعود (على سبيل المثال، تطبيق الأجسام المضادة) وغالبا ما تكون مكلفة ومعقدة وتستغرق وقتا طويلا 40،42،43 ومرة أخرى تركز فقط على تنقية واحدة نوع الكريات البيض-البيروكسيديز إيجابي.

وهكذا فإن الطريقة المعروضة هنا لديه اثنين من المزايا مقارنة مع الطرق الأخرى المطبقة لتنقية الكريات البيض-البيروكسيديز إيجابي. لأنه يقوم على عينات دم صغيرة الخلايا التي تم الحصول عليها تمثل الوضع في الدورة الدموية. نظرا لحجم العينة الأولي صغير اللازمة لبروتوكول الطريقة تنطبق على كل من الإنسان والدم غير البشرية، على الرغم من الاختلافات بين الأنواع في وفرة من العدلات. في الواقع، كنا حتى تتمكن من تطبيق الطريقة الموصوفة المبدئي كميات الدم صغيرة مثل 50 ميكرولتر (لا تظهر البيانات). العينة الدموية الصغيرة اللازمة لالأسلوب أيضا يجعلها مناسبة للانسحاب الدم المتكررة من حيوانات المختبر صغيرة أو للتطبيقات الطبية الخاصة (على سبيل المثال، تشخيص الأطفال حديثي الولادة). كما رويستند أنه تخصيب الكريات البيض على استنزاف كرات الدم الحمراء يتم تضمين كافة الخلايا البيروكسيديز الإيجابي (العدلات، الحمضات، وحيدات) في جزء الكريات البيض المختلطة التي تم الحصول عليها ويمكن تحليلها بشكل منفصل باستخدام التدفق الخلوي. فإن هذه الطريقة سريعة وموثوق بها، ومتطلبات منخفضة المتعلقة بالمواد الكيميائية والأجهزة، مما يجعل من بروتوكول مناسبة لبيئات علمية متعددة.

كما يتم بسهولة تفعيل العدلات خطوة حاسمة واحدة خلال طريقة وصفها هو التعديل الدقيق لقيمة الرقم الهيدروجيني للمحاليل تستخدم (PBS وHBSS، نرى خطوات 1.2 و 1.3 من قسم البروتوكول). وعلاوة على ذلك فترة حضانة من خلايا الدم بالماء المقطر لا ينبغي أن تكون أطول من 60 ثانية قبل استعادة الظروف normosmotic (راجع الخطوة 2.2 من قسم البروتوكول. و(تقريبا) إزالة تماما من المذيب من الخلية بيليه (الخطوة 2.4) قبل إضافة من الماء للتحلل منخفض التوتر الثاني هو خطوة حاسمة أخرى كما برتقاليسوف بقايا إيه يقلل من كفاءة عملية تحلل منخفض التوتر. يشير خطوة حاسمة أخرى لتطبيق H 2 O 2 خلال تلطيخ APF. على الرغم من أن كمية تطبيقها لا ينبغي أن يكون السامة للخلايا، يجب فحص حيوية الخلية. خلال دراستنا ونحن عادة تطبيق الصبغة 5،5 '، 6،6'-tetrachloro-1،1'، 3،3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine يوديد (JC-1) للكشف عن أحداث أفكارك المبكرة.

وعلاوة على ذلك، هناك زوجين من القيود في طريقة تخصيب الكريات البيض مبسط وصفها. في حين أن التقنية يمكن تطبيقها على عينات الدم من عدة أنواع (قد حوكموا رجل، الجرذان والفئران)، وكمية الكريات البيض التي تم الحصول عليها بعد تحلل كريات الدم الحمراء يعتمد على وفرة الأولية في الدم. هذا الأخير يختلف بالتأكيد بين الأنواع 39 و يعتمد أيضا على حالة التهابات الفرد بحثها. وعلاوة على ذلك، في حين يمكن أن يتم إجراء تحلل مع ما يصل الى واحدمئات من العينات في موازاة الخطوات الطرد المركزي المتوسطة تشكل الحد كما، اعتمادا على أجهزة الطرد المركزي المستخدمة، يمكن معالجتها فقط حتى 30 عينة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك، في حين APF يكتشف بسهولة HOCL وHOBr بحضور SCN -، ويؤثر على النشاط halogenating من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات أيضا إلى الأخير الزائفة هاليد. يتكون وهو غير قادر على أكسدة APF - hypothiocyanite بذلك (OSCN). الحد آخر يأتي من خصائص الصبغة APF المستخدمة لتحديد HOCl- وHOBr الإنتاج من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات. كما يتأكسد الصبغة لفلوريسئين، وتلطيخ لا يمكن الجمع بين الأضداد الفلورسنت مع طيف الانبعاث في نفس النطاق. بالطبع لم يتم فحص أي التداخل بين مضان المستمدة APF وإشارة من إشارات الفلورسنت إضافية ويعوض عليها في قياس التدفق الخلوي.

خلاف ذلك، إذا كان الكشف عن النشاط halogenating البيروكسيديز ليست في نطاقالدراسة، بعد تطبيق طريقة استنزاف كرات الدم الحمراء ويمكن استخدام الأساليب التحليلية الأخرى بدلا من APF. كما يؤدي هذا الإجراء تحلل منخفض التوتر وصفها إلا إلى استنزاف جزء من كريات الدم الحمراء وكما كل الكريات البيض لا تزال موجودة في جزء الخلية المختلطة التي تم الحصول عليها، وأساليب فقط والتي تسمح ينبغي تطبيق تحليل خلية واحدة. والأساليب التي تشمل تحلل الخلايا (على سبيل المثال، تحليل مؤامرة غربية) لا تسفر عن نتائج يمكن الاعتماد عليها. قد يكون حجم العينة الأولي صغير عقبة أخرى لمثل هذه الأساليب التحليلية.

فيما يتعلق بالتحقيق في الخطة الرئيسية للعمليات (وايبو) النشاط في الكريات البيض في كثير من الأحيان فقط لإنتاج أكسدة العام من قبل خلايا موجهة بدلا من تقييم تحديدا النشاط البيروكسيديز الهيم 44،45. في كثير من الأحيان وعلاوة على ذلك يتم إجراء أية محاولات للتمييز بين halogenating والنشاط البيروكسيديز من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات 46،47. الأساليب، التي تتناول على وجه التحديد النشاط MPO الكلور عن طريق تشوantifying المنتجات المشتقة HOCL مثل chlorotyrosine لا كشف الإفراط في أكسدة و / أو منتجات عملية الأيض، وبالتالي غالبا ما تؤدي إلى التقليل من الحقيقي HOCL الإنتاج 48. وعلاوة على ذلك هذه الطريقة فضلا عن الكشف عن المستمدة HOCL-2-chloroethidium أيضا مضيعة للوقت، يحتاج معدات التحليل مكلفة وتشمل تحلل الخلايا 48-50 وهناك العديد من التقارير حول الأصباغ جديدة لتحديد معين من النشاط الخطة الرئيسية للعمليات الكلورة داخل الخلايا الحيوية 44،51،52. بعد حتى الآن يتوفر تجاريا، وبالتالي تستخدم بشكل روتيني في مجال البحوث 25،33 فقط APF وhydroxyphenyl فلوريسئين في مجمع ذات الصلة (HPF).

في الواقع، عن طريق استخدام APF نحن يمكن أن تظهر أن النشاط MPO الكلور لا يمكن أن يكون كميا فقط باستخدام انزيم معزولة 53 ولكن أيضا من خلال تطبيق الصبغة على الخلايا الحية 26،33. وهكذا من خلال الجمع بين تخصيب الكريات البيض السريع من الدم عينات الصغيرة المذكورة أعلاه معن APF تلطيخ ضعنا بروتوكولا، الذي هو مناسبة لمعالجة تحديدا في وقت واحد في النشاط halogenating من الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات في كل البيروكسيديز الكريات البيض إيجابية، أي العدلات، وحيدات الحمضات 32. وعلاوة على ذلك الأسلوب لا يتطلب تحلل الخلية، والذي يسمح لمجموعة واسعة من الأساليب التحليلية، بما في ذلك التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلورسنت مبائر. وعلاوة على ذلك هذه تلوين البيروكسيداز النشاط يمكن جنبا إلى جنب مع تطبيق علامات سطح الخلية، مما يسمح للتحليل محدد من الكريات البيض كسور الفرعية، اعتمادا على المهمة العلمية. ومع ذلك لابد من النظر إلى أن الأجسام المضادة المسماة مضان التطبيقية لا تتداخل مع إشارة مضان القائم على فلوريسئين المستخدمة لقياس HOCl- والمستمدة HOBr للأكسدة APF.

وباختصار يمكن أن توفر هذه الطريقة وسيلة جديدة للحصول على المزيد من الأفكار في دور الفسيولوجية للنشاط halogenating البيروكسيديز من إعادة المناعيةبلاد الشام بيروكسيديزات المشتقة من الدم الخطة الرئيسية للعمليات والمكتب الأوروبي للبراءات، والتي لا تزال غير مفهومة جيدا 8،20،23. وعلاوة على ذلك في دراسة أجريت على الحيوانات في التهاب المفاصل الروماتويدي يمكن أن نلاحظ في الآونة الأخيرة أن هذا البروتوكول قد يؤدي إلى تقييم إنتاج HOCL المستمدة MPO-كعلامة السريرية الجديدة في الأمراض الالتهابية المزمنة (بيانات غير منشورة).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 113، إعداد الدم، والإثراء الكريات البيض، الميلوبيروكسيديز، الحمضات البيروكسيديز، النشاط الكلورة، aminophenyl فلوريسئين
تقييم سريع ومحدد من Halogenating البيروكسيد آخر في عينات الدم التخصيب خلايا الدم البيضاء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter