Abstract
本稿では小さい全血サンプルから白血球の迅速かつ標準化された濃縮のためのプロトコルが記載されています。この手順は、赤血球の低張溶解に基づいており、人間のサンプルに、ならびに非ヒト由来の血液に適用することができます。約50〜100マイクロリットルの小さな初期サンプル量が実験小動物から再発採血にこの方法が適用可能になります。また、白血球の濃縮は、複数の実験室の環境では、この方法を適用すること、数分以内に、化学品及び計装に関する低い材料の努力によって達成されます。
白血球の標準化精製は、すなわち 、ヘムペルオキシダーゼ、ミエロペルオキシダーゼ（MPO）および好酸球ペルオキシダーゼ（EPO）のハロゲン化ペルオキシダーゼ活性を評価するために高度に選択的な染色法と組み合わせた次亜塩素及び次亜臭素酸（HOClのとHOBr）の形成されています。 MPOが強くNEUTで発現されているがrophils、ヒト血液中だけでなく、単球における最も豊富な免疫細胞型は、関連する酵素EPOはもっぱら好酸球で発現されます。これらの酵素のハロゲン化活性をほとんどHOCl-及びHOBr特異的色素アミノフルオレセイン（APF）および一次ペルオキシダーゼ基質過酸化水素を使用することによって対処されます。その後のフローサイトメトリー分析にすべてのペルオキシダーゼ陽性細胞（好中球、単球、好酸球）を区別し、それらのハロゲン化ペルオキシダーゼ活性を定量化することができます。 APF染色は、細胞表面マーカーの適用と組み合わせることができるので、このプロトコルは、具体的には、白血球のサブ画分に対処するために拡張することができます。方法は、ヒトおよびげっ歯類の白血球の両方のHOClとHOBr産生を検出するために適用可能です。
慢性炎症性疾患におけるこれらの酵素の製品の普及と多様に議論免疫学的役割を考えると、このプロトコルは、より良い理解に貢献するかもしれません白血球由来のヘムペルオキシダーゼの免疫学的関連性。
Introduction
多形核白血球（PMNを、とも呼ばれる顆粒球）および単球は、血液1,2における自然免疫系の重要な細胞成分を表します。彼らは、病原体に対する一次防御にだけでなく、獲得免疫系の活性化および全身性炎症反応2-4の開始に貢献しています。しかし、特に好中球、顆粒球の最も豊富な種類、および単球も大幅に急性炎症事象5の調節および終了に貢献しています。従って、これらの細胞はまた、リウマチ性関節炎6,7のような慢性炎症性疾患において重要な役割を果たし得ます。実際、喘息、慢性炎症性気道疾患において、好酸球のアポトーシス障害、血液8で2番目に顆粒型によって特徴付けられます。しかし、顆粒球のアポトーシスおよびマクロファージによるそれらの迅速な除去は、携帯終了時に2つの重要なステップであります炎症9-11の。
名前の免疫細胞密接に関連する2つの酵素、すなわち、ミエロペルオキシダーゼ（MPO、好中球および単球）と好酸球ペルオキシダーゼ（EPO、好酸球）で12,13を見つけることができます。彼らは二電子的殺菌特性14-16のために知られている対応するハイポ（擬似）halous酸に（擬似）ハロゲン化物を酸化ように、これらのヘムペルオキシダーゼは、古典的体液性免疫応答に関連しています。生理的条件下でMPO主にフォーム次亜塩素酸（HOClの）とhypothiocyanite（ - OSCN）、後者と次亜臭素酸（HOBr）は、EPO 17-19によって形成されています。新しい結果は、この（擬似）ハロゲン化酵素活性はまた、炎症反応の調節にし、免疫反応20,21の終端に寄与し得ることを示唆しています。実際には、MPOおよび派生副産物のHOCl産生は、T細胞ベースの適応免疫応答22-2を抑制することが示されました4。
慢性炎症性疾患で、自然免疫系からの白血球の免疫学的役割に多くの洞察を得るためにこの生理機能にMPOおよびEPOの寄与を決定するために、我々はすぐに後続の特定のために少量の血液サンプルから白血球を豊かにする方法を開発しましたこれらの細胞におけるハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の決意。赤血球の枯渇のために我々は低材料コストで迅速な白血球濃縮につながる蒸留水と2-その後の低張溶解工程を含む標準化された方法を選択しました。その後のハロゲン化MPOの決意とEPO活性についてHOCl-とHOBr特有の色素アミノフルオレセイン（APF）が25から27を使用しました。非特異的ペルオキシダーゼ染色法28,29のアプリケーションとは対照的に、このアプローチは、多くの場合、重度のINFLで損なわれるハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の選択的検出を可能にしますammation 30,31。
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Protocol
すべての人間の血液サンプルを、健康なボランティアから得た、と適用白血球濃縮プロトコルはライプチヒ大学の医学部の倫理委員会のガイドラインに従います。ラットの血液を用いた実験では、動物の管理と使用に関するドイツのガイドラインに従って、責任ある地域の倫理委員会（Landesdirektionザクセン、Referat 24）によって承認されました。
1.実験のセットアップ
注：血液サンプルから赤血球の枯渇のための低張溶解手順は、タイムクリティカルな手順があるので、事前にプロトコルのこの部分のために必要なすべての機器（ 例えば、バッファ）を準備します。
- 低張溶解のための1つの15ミリリットルの遠心管及び血液サンプル当たり、その後のアミノフルオレセイン（APF）染色のための1つの1.5ミリリットルのサンプルチューブにラベルを付けます。
- 白血球の濃縮は、無菌条件下で実施される場合、流下でこの標識化を行いますボックス。
- サンプルあたり約12 mlのリン酸緩衝生理食塩水（PBS、10 mm）を準備します。白血球は、無菌条件下で単離されたかしなければならないかどうかに応じて、供給業者から滅菌準備溶液を使用して、または蒸留水にPBS錠剤を溶解することによってのいずれかPBSを準備します。 pH値をチェックし、必要に応じて、0.1 MのHClおよびNaOH溶液の少量を使用してpH7.4に調整します。
- 約16個のサンプルのために十分な非滅菌緩衝溶液を得るために蒸留水200mlに（材料の表を参照）をPBS錠剤を溶解します。必要であれば、滅菌濾過することにより、このソリューションを滅菌します。
- カルシウムを補充し、約1ミリリットルハンクス平衡塩溶液（HBSS）2+サンプルあたりを準備します。
- 100ミリリットルでHBSS塩（最終容量）二回蒸留水の970 mgを溶解します。最終容量まで充填する前に、pH値をチェックして、pHを7.4に調整。その低緩衝能力のために、毎日新鮮にこのバッファを準備します0.1 MのHClおよびNaOH溶液の少量を使用して、特別なケアでpH調整を行うdは。
注：滅菌溶液は、実験に応じて、使用することができます。溶液を滅菌濾過することによって滅菌することができます。
- 100ミリリットルでHBSS塩（最終容量）二回蒸留水の970 mgを溶解します。最終容量まで充填する前に、pH値をチェックして、pHを7.4に調整。その低緩衝能力のために、毎日新鮮にこのバッファを準備します0.1 MのHClおよびNaOH溶液の少量を使用して、特別なケアでpH調整を行うdは。
- 二つのバッファ、ラベルに加えて、チューブを準備する（ 例えば、50ミリリットルの遠心分離管）またはフラスコ（ 例えば、計量カップ250ミリリットル）を予め低張溶解手順のための二重蒸留水で。サンプルあたり約10ミリリットルの水を準備します。
- 氷の上で行われるAPF染色（セクション3）、のために砕いた氷の入った容器を準備します。
- 染色（ステップ3.2）の間に使用される作業ソリューションの迅速な調製を可能にし、繰り返し凍結およびAPFソリューションの融解を避けるために事前にAPFのアリコートを準備します。
注：APFは、一般的に5mg / mlのメチルアセテート（11.81ミリモル）のストック溶液として得られます。- 0.5ミリリットルチューブに10-100μlのアリコートを凍結します。 APFは、最終的な染色について10μMの色素濃度は（ステップ3.8）に使用されます。
赤血球の2.低張性溶解
注：汚染を避けるために層流ベンチ下（遠心分離工程を除く）低張溶解手順を実行します。室温で全体の手順を実行します。低張溶解は、時間重要なプロセスであるので、事前に水（2mL）およびPBS（5ml）で添加するためのピペットを調整し、手順を開始する前に、水及びPBSフラスコを開きます。使用前に室温でPBS溶液と蒸留水を保管してください。
- 各血液サンプル移送から適切な15ミリリットルの遠心チューブに100μlの。
注：我々の実験では、血液サンプルは、通常、凝固を回避するために、ヘパリン10U / mlで含みます。まだによるサンプル材料の異なるソースに抗凝固剤の性質と濃度が異なる場合があります。 APF染色への影響は比較例によりテストする必要があります他のタイプ又は抗凝固剤の濃度を補充した血液サンプルから得られた結果に結果をる。 - 2ミリリットルを蒸留水を追加し、中レベルに設定し、ボルテックスミキサーを使用して、サンプルを混ぜます。その後、サンプル毎に5ミリリットルのPBSを加え、ボルテックスミキサーを用いて混合し、60秒間のサンプルをインキュベートします。
注：約5サンプルまでを並行して製造することができます。サンプル順序匹敵するインキュベーション時間を達成するために、水とPBSの添加と同じにしてください。 - PBSの添加（ステップ2.2）を室温で6分間450×gでの遠心分離により、すべてのサンプルの残りの無傷の細胞をペレット化することによって等張条件の再生後。
- テーブルのごみ箱にそれを注ぐことにより、上清を取り除きます。遠心チューブを反転し、ペーパータオルの上に開口部をタップすることで、できるだけ多くの液体できるだけを削除してください。細胞ペレットは、できるだけ乾燥していることを確認してください。
- （ステップ2.2）の前に説明したように低張溶解手順を繰り返します。
NOTEは：原理的にこの低張溶解手順は、得られる混合白血球画分の純度に応じて、複数回繰り返すことができる（2.5へ2.3ステップ）。 2溶解は、得られた混合細胞画分に残っている赤血球のシェアをステップした後、約25％です。 - 室温と450×gで6分間遠心分離することにより、残りの無傷の細胞をペレット化。上清を除去し（ステップ2.4を参照してください）。ペレットに500μlのHBSSを加え、穏やかに均質な溶液が得られるまでそれを溶かします。それに応じてラベルされた1.5ミリリットルのサンプルチューブに各サンプルを転送します。
- 実験に応じて、直接、（フローサイトメトリーを介して、 例えば、）得られた試料25、32（単一の細胞型の同定のための）蛍光標識抗体で染色を分析（細胞の活性化実験のために）細胞刺激と33をインキュベートまたは氷との使用に格納されています後で。研究の目的に応じて、すぐにその後の実験を行います顆粒球は、約20時間のかなり短い半減期を有するため、混合白血球画分。
注：これは、後述ペルオキシダーゼ活性染色のために保持しています。
3.ハロゲンペルオキシダーゼ活性染色
注：血液由来のヘムペルオキシダーゼMPOおよびEPOによってHOCl-及びHOBr生産名前付き次亜ハロゲン酸によりフルオレセインに酸化されたAPFを用いて定量化されます。蛍光標識抗体を用いた細胞標識は、APFの染色と組み合わせて行われる場合したがって、フルオレセインの発光信号を妨害するフルオロフォアを避けます。
- 氷の上で4℃でAPF染色を実行します。
- APFの作業溶液を調製するために、色素（ 例えば、10μlの、11.81ミリモル）の適切なアリコートを解凍し、正確に1 mMの（ 例えば、10μlに108.1μlのバッファを追加）するHBSSでそれを希釈します。
- 各サンプル（500μlの細胞溶液）の場合は5μを準備説明APFワーキング溶液のリットル。したがって、118.1μlのAPF作業溶液（1 mm）は、約20個のサンプルを準備するために生じるAPF（11.81ミリモル）、のいずれかの10μlのアリコートを使用します。計算されたよりも約10％以上APFワーキング溶液を調製ピペッティング時の損失による。
- APF染色のペルオキシダーゼ特異性を確認するために、ヘムペルオキシダーゼ阻害剤、4-アミノ安息香酸ヒドラジド（4- ABAH）35と対照試料を調製します。
- 500μlの溶媒に75.6 mgの4 - ABAHを希釈することにより、ジメチルスルホキシド（DMSO）中の4- ABAH（151.17グラム/モル）の1 Mストック溶液を準備します。また、HBSSで4-ABAH 1/10に希釈します。
- H 2 O 2使用液ラベルの製造をそれぞれ「70 mMのH 2 O 2」、「7 mMのH 2 O 2」を有する2つの1.5 mlの遠心チューブ用。
- 「70mMのH 2 O 2」と表示されたチューブでは、たて10μLを希釈します約88 mMの濃度を得るために、蒸留水990μLを用いてH 2 O 2の30％ストック溶液（8.8ミリモル）の。氷上で保存し、4時間以内に使用します。
注：H 2 O 2は、典型的には、供給者によって、30％ストック溶液として提供されます。 4℃で保存した場合、約3年間安定です。分解を避けるために、蒸留水にH 2 O 2の希釈を行います。 H 2 O 2の希釈液はまた、0.1M NaOH溶液中で調製することができます。 - 正確なHの決意2 O 2濃度は、標識された1.5mlチューブに蒸留水900μlにこの溶液の100μLを添加することにより、第1のH 2 O 2のストック溶液（約88ミリモル）から、更に1〜10の希釈液を調製します「7 mMのH 2 O 2 "。
- （UV-Visのphotospectrometerを使用して、近紫外域（ 例えば、200から300ナノメートル）でスペクトルを記録し、240 nmの吸光度を使用します49; 240 = 34 M -1 cm -1で）は、第2のH 2 O 2のストック溶液34内の実際のH 2 O 2濃度を決定します。参照キュベットは、蒸留水のみが含まれていることを確認してください。測定用石英キュベットのためのUV範囲におけるスペクトルが記録されます。
- この結果から、両方のH 2 O 2のストック溶液の正確な濃度を算出します。蒸留水を適量添加することによって、「70mMのH 2 O 2」サンプルチューブに正確に70 mMの第一のストック溶液の濃度を調整します。氷の上で得られたワーキング溶液を保存し、1時間以内に使用します。
- 「70mMのH 2 O 2」と表示されたチューブでは、たて10μLを希釈します約88 mMの濃度を得るために、蒸留水990μLを用いてH 2 O 2の30％ストック溶液（8.8ミリモル）の。氷上で保存し、4時間以内に使用します。
- 1mMの最終濃度に適したサンプルに4-ABAH作業溶液（100 mM）の5μlのを追加します。 APFの添加前のインキュベーター中で37℃で15分間、サンプルをインキュベートします。
- それぞれに5μlのAPF作業溶液（1 mm）を追加します。500μlのサンプルを、10μMの最終色素濃度を得ました。サンプルを穏やかに（ 例えば、メディア設定にボルテックスミキサーを使用して）混合し、37℃で30分間インキュベートします。
- 700μMの最終濃度のために、各500μlのサンプルに5μlのH 2 O 2作業溶液（70mMの）を追加します。穏やかにサンプルを混合し、37℃で60分間それをインキュベートします。並行して、適切な制御測定を行います。
注：コントロールの測定は、700μMH 2 O 2は、細胞に対して毒性ではないことを示しました。有意な細胞応答が観察されました。
注：APF染色はまた、科学的疑問に応じて、H 2 O 2の添加を省略することにより行うことができます。 H 2 O 2の添加は、細胞による最大のHOClとHOBr生産の検出を可能にしながら、過酸化水素の非存在下でのみ、基底塩素化MPOおよびEPOの活性を測定します。 T彼は、後者は、有意に高い蛍光シグナルを意味します。 - 細胞をペレット化するために、室温と400×gで10分間サンプルを遠心します。徹底的にペレットを破壊することなく上清を除去し、細胞を再懸濁するために250μlのHBSSを追加します。
注：サンプルは今25フローサイトメトリーを介して、分析のための準備が整いました。 - 漂白を避けるために、分析まで暗所でサンプルを保管してください。 480から490 nmで励起した後、約525ナノメートル37でフルオレセインの発光を検出します。
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Representative Results
以前に報告されたように、上述の方法は、ヒトおよび非ヒト材料32の両方に適用可能であることが判明しました。喘息の症状を有するマウスについて示さまたようAPF染色は、全身炎症促進性状態の違いを検出するのに適したツールであってもよいです。したがって、その後の研究で、我々はプリスタン誘導関節炎（PIA）でメスのダークアグーチラットで繰り返しMPO（及びEPO）のハロゲン化活性を評価するために、このプロトコルを使用していました。この実験の間に実行白血球濃縮および染色の代表例を図1に示されている。約200μlの全血を、麻酔し、ヘパリン化の下で動物の眼球後静脈叢から得ました。赤血球枯渇およびその後のAPF染色は100μlの試料体積を用いて行きました。その後、サンプルをフローサイトメトリーによって分析しました。
図1A）に対する細胞の大きさをプロットすることによって示されるように、試料からの赤血球の強力な枯渇が達成されました。さらに別の白血球のタイプは明らかに識別可能であった、蛍光標識された細胞表面マーカー（図示せず）を適用することによって同定されました。イベントの約48％がCD16陽性好中球と同定されたながら簡単に説明すると赤血球（CD235a陽性）/細胞デブリ領域はイベントのみの22％を占めました。さらに、イベントの3％は、それぞれCCR3陽性好酸球及びCD14陽性単球として同定され、イベントの約19％が、それぞれ、CD5 / CD19陽性BおよびTリンパ球を占めました。単球および好酸球が中程度のAPF酸化につながったと好中球がchの下で強くペルオキシダーゼ陽性であったAPF由来の蛍光の強度分布（ 図1B）は 、明らかに、ペルオキシダーゼ陰性赤血球やリンパ球の差別を許さ実験条件をOSEN。これらの結果は、単球20内の酵素濃度と比較して、後者の細胞中のMPOの高い豊富なラインです。好酸球の比較的弱い応答は、HOBrのEPO由来の形成を促している可能性がある、いかなる臭化物を添加しなかったという事実によって説明することができます。分離された好酸球についての予備的研究は、驚くべきことに、これらの細胞によるAPF酸化に対する外部から添加さ臭化物の大きな影響を示しませんでした。それでも、Brでの少量の導入によって説明することができる観察された好酸球によるAPFの酸化- （PBS及びHBSS）を用いて緩衝液を介し。あるいはEPOは、少なくとも（ファゴリソソーム中など）、酸性条件下でのHOClの少量を生成することができます。
図1： 白血球濃縮およびAPF-導出ラットからの血液の微小試料中のd蛍光約200μlの全血の量は、雌ダークアグーチラットの眼球後静脈叢から得ました。 100μlの血液およびその後APFに記載の溶血法の適用は、混合細胞画分を染色した後、フローサイトメトリーによって分析しました。 FSC- / SSC-プロット（A）に示すように、赤血球を強くサンプルから枯渇し、異なる白血球タイプは、容易に区別することができました。 APF由来の蛍光強度（B）の分布が明らかにペルオキシダーゼ活性をハロゲン化ヘムペルオキシダーゼ陰性細胞（赤血球やリンパ球）だけでなく、中等度（好酸球および単球）と白血球や強い（好中球）を示した。 ご覧になるにはこちらをクリックしてください。この図の拡大版。
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Discussion
好中球は、ヒト血液中で最も豊富な白血球であるとしてペルオキシダーゼ陽性細胞の単離は、多くの場合にのみ、これらの細胞に着目し、密度勾配遠心分離38によって他の白血球からの好中球の分離を含みます。好中球は、マウスの血液サンプルではるかに少ない豊富で、まだ後者より複雑な方法のための39の 40を使用しなければなりません。また、両方の方法はまた、より大きな血液容量のニーズに、試料からのペルオキシダーゼ陽性単球の除去につながると（ 例えば、400μlの41）、小実験動物から再発採血中に得られたマイクロサンプルには適用されません38,40。腹膜滲出液からのマウスの好中球の精製もまた、血液由来の顆粒球38,40が得られない、動物の犠牲を必要と。最近ネズミBLから高度に精製された顆粒球画分を得るための方法を開発OOD（ 例えば 、抗体のアプリケーション）40,42,43を消費し、多くの場合、高価な複雑で時間があり、再び一つだけのペルオキシダーゼ陽性白血球の型の精製に焦点を当てます。
したがって、ここで紹介する方法は、ペルオキシダーゼ陽性白血球の精製に適用される他の方法に勝る利点がいくつかあります。それは少量の血液サンプルに基づいているようにして得られた細胞は、循環中の状況を表します。プロトコルのために必要な小さな初期サンプル容量に起因する方法は、好中球の存在量の種特異的な違いにもかかわらず、ヒトおよび非ヒト血液の両方に適用可能です。実際に、我々はさらに50μlのような小さな血液量を当初記載された方法を適用することができた（データは示さず）。この方法のために必要な少量の血液サンプルはまた、実験小動物から繰り返し採血用や特殊な医療用途（ 例えば、新生児診断）に適しています。トンのように彼白血球の濃縮は全てペルオキシダーゼ陽性細胞（好中球、好酸球、単球）を得られた混合白血球画分に含まれており、個別にフローサイトメトリーを用いて分析することができる赤血球の枯渇に基づいています。この方法は、高速で信頼性があり、複数の科学的な環境のためのプロトコルが適して、化学物質および計装に関する低い要件があります。
好中球は簡単に使用する緩衝液のpH値の正確な調整記載の方法中に1つの重要なステップである、活性化されているように（PBS及びHBSSは、ステップ1.2およびプロトコルセクション1.3を参照してください）。さらに蒸留水で血液細胞のインキュベーション時間は、プロトコルセクションのステップ2.2を参照してください（normosmotic条件を復元する前に、もはや60秒以内とする。添加前の細胞ペレット（ステップ2.4）からの溶媒の（ほぼ）完全に除去第二の低張溶解のための水のバフなどの別の重要なステップですER残基は、低張溶解手順の効率を減少します。別の重要なステップは、APF染色中H 2 O 2の適用を指します。塗布量は、細胞毒性であってはならないが、細胞活力をチェックする必要があります。我々の研究の間、我々は通常、初期のアポトーシス事象を検出するための色素5,5 '、6,6'-テトラクロロ1,1'、3,3'- tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanineヨウ化物（JC-1）を適用します。
また、説明簡略化した白血球の濃縮方法の制限がいくつかあります。技術は、いくつかの種（男性、ラットとマウスが試みられている）から血液サンプルに適用することができるが、赤血球の溶解後に得られた白血球の量は、血液中の彼らの初期の豊富さに依存します。後者は確かに種39との間で変化し、またプローブされた個々の炎症状態に依存しています。また、溶解手順は、最大1つで行うことができるが百の試料を並行して中間の遠心分離工程は、最大30個のサンプルを並列に処理することができ、使用される遠心分離に依存して、のような制限をもたらします。 APFは容易にSCNの存在下でのHOClとHOBrを検出しながら、さらに、 - 、MPOおよびEPOのハロゲン化活性はまた、後者の擬似ハロゲン化物に影響します。これによりhypothiocyanite（ - OSCN）がAPFを酸化することができませんが形成されます。別の制限は、MPOおよびEPOによってHOCl-の決意とHOBr-生産に使用されるAPF色素の性質から来ています。色素がフルオレセインに酸化されるように、染色は、同じ範囲の発光スペクトルを有する蛍光抗体と組み合わせることができません。もちろんAPF由来の蛍光および追加の蛍光信号の信号間の任意の干渉がチェックされ、フローサイトメーターでは補償されなければなりません。
そうでなければ、ハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の検出の範囲でない場合研究は、赤血球枯渇法の他の分析方法を適用した後の代わりにAPFを用いてもよいです。説明低張溶解手順は、赤血球の部分空乏にし、すべての白血球のようにつながるとして、得られた混合細胞画分にまだ存在している単一細胞分析を可能にする唯一の方法が適用されるべきです。 （ 例えば 、ウエスタンプロット分析）細胞の溶解を含む方法は、信頼できる結果を得られません。小さな初期サンプル容量は、そのような分析方法のために別の障害となる場合があります。
白血球中のMPO（及びEPO）の調査に関する活動は、多くの場合のみ細胞による一般的な酸化剤の生産ではなく、具体的ヘムペルオキシダーゼ活性44,45を評価することで解決されています。また、多くの場合、何の試みは、ハロゲン化し、MPOおよびEPO 46,47のペルオキシダーゼ活性を区別するために行われません。特にクによって塩素MPO活性の対処方法、chlorotyrosineようなantifyingのHOCl由来製品は、酸化過剰検出および/ または代謝産物と、したがって、多くの場合、実のHOCl生産48の過小評価につながる。しませんまた、この方法だけでなく、HOClの由来2-chloroethidiumの検出は、塩素化MPO活性の特異的な決意のための新しい染料について多くの報告がされ、また時間がかかる高価な分析機器を必要とする細胞48-50 .Thereの溶解を含みます44,51,52の重要な細胞内の。しかし、現在までにのみAPFおよびその関連化合物のヒドロキシフェニルフルオレセイン（HPF）は、市販されているので、日常的に研究25,33で使用されます。
実際には、APFを用いて、我々は塩素MPO活性しか単離された酵素53を使用しても、生細胞26,33に染料を適用することにより定量化することができないことを示すことができました。このようにして上に述べた血液マイクロサンプルからの迅速な白血球濃縮を組み合わせることにより、nはAPF染色は、我々は、具体的には、同時にす べてのペルオキシダーゼ陽性の白血球、 すなわち 、好中球、単球及び好酸球32にMPOおよびEPOのハロゲン化活動に対処するのに適したプロトコルを開発しました。さらにこの方法は、フローサイトメトリーおよび共焦点蛍光顕微鏡を含む分析方法、幅広い種類のを可能にする細胞溶解を必要としません。またこのペルオキシダーゼ活性染色は、科学的なタスクに応じて、白血球サブフラクションの固有の分析を可能にする細胞表面マーカーの適用と組み合わせることができます。しかし、それは、適用された蛍光標識抗体はHOCl-とHOBr由来APF酸化を定量化するために使用されるフルオレセイン系蛍光シグナルを妨害しないことを考慮しなければなりません。
要約すると、この方法は、免疫学的再のハロゲン化ペルオキシダーゼ活性の生理的役割に多くの洞察を得るための新しいツールを提供することができますあるレバント血液由来ペルオキシダーゼMPOおよびEPOは、まだよく8,20,23を理解されていません。また、関節リウマチに関する動物実験では、我々は最近、このプロトコルは、慢性炎症性疾患（未発表データ）での新たな臨床マーカーとしてMPO由来のHOCl生産の評価につながる可能性があることを観察できました。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials/Equipment | |||
| 15 ml centrifugation tubes | VWR/Corning | 734-0451 | - |
| 1.5 ml sample tubes | VWR/Eppendorf | 211-2130DE | - |
| Pipettes for volumes up to 5 ml | Eppendorf | e.g., 3120000070 | We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl |
| laminar flow bench | Thermo Electron Corperation | HeraSafe | - |
| Vortex mixer | Bender & Hobein AG | Vortex Genie 2 | - |
| Tabletop centrifuge | Kendro Laboratory Products | Laborfuge 400R | The centrifuge should be able to be used at 450 x g |
| Small centrifuge | Eppendorf | 5415D | The centrifuge should be able to be used at 400 x g |
| Incubator | Heraeus | cytoperm 2 | Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content |
| UV-Vis spectrophotometer | Varian | Cary 50 bio | A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied |
| Flow cytometer | Becton, Dickinson | BD Facs Calibur | Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | amresco | K812 | sterile solution, ready to use |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4417 | tablets for solving in 200 ml millipore water |
| Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ | Sigma-Aldrich | H1387 | 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4 |
| Hydrochloric acid | Merck Millipore | 1.09057.1000 | 1 M solution |
| Sodium hydroxide | Riedel-deHaën | 30620 | Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water |
| Aminophenyl fluorescein | Cayman | 10157 | 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C |
| Hydrogen peroxide | Sigma-Aldrich | H1009 | This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements |
| 4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) | Sigma-Aldrich | A41909 | A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS |
| DMSO | VWR chemicals | 23500.26 | - |
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