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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Avaliação rápida e específica da atividade da peroxidase de halogenação em amostras de sangue enriquecido por leucócitos

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

Neste trabalho é descrito um protocolo para o enriquecimento rápido e padronizado de leucócitos a partir de amostras de sangue total pequenos. Este procedimento baseia-se na lise hipotónica de eritrócitos e pode ser aplicado a amostras humanas, bem como com o sangue de origem não-humana. O pequeno volume da amostra inicial de cerca de 50 a 100 ul torna este método aplicável para a amostragem de sangue de repetição a partir de pequenos animais de laboratório. Além disso, o enriquecimento de leucócitos é alcançado em poucos minutos e com os esforços de baixo materiais entre os produtos químicos e de instrumentação, tornando este método aplicável em vários ambientes de laboratório.

Purificação de leucócitos Padronizada é combinado com um método altamente selectivo coloração para avaliar a actividade da peroxidase de halogenação das peroxidases heme, mieloperoxidase (MPO) e peroxidase de eosinófilo (EPO), ou seja, a formação de ácido hipocloroso e hipobromoso (HOCl e HOBr). Enquanto MPO é fortemente expressa em neutrophils, o tipo de célula mais abundante imunitário no sangue humano, assim como em monócitos, a enzima relacionada com a EPO é expresso exclusivamente em eosinófilos. A atividade de halogenação destas enzimas são os destinatários usando a fluoresceína específica HOBr-quase HOCl- e corante aminofenil (APF) e da peroxidase primário de peróxido de hidrogênio substrato. Após a análise de citometria de fluxo subsequente todas as células peroxidase-positivo (neutrófilos, monócitos, eosinófilos) são distinguíveis e a sua actividade de peroxidase de halogenação pode ser quantificada. Uma vez que a coloração APF pode ser combinado com a aplicação de marcadores de superfície celular, este protocolo pode ser estendido para abordar especificamente sub-fracções de leucócitos. O método é aplicável para a detecção de HOCl e HOBr produção tanto em humano e em leucócitos de roedores.

Dado o papel imunológico amplamente discutido e diversamente destes produtos enzimáticos em doenças inflamatórias crónicas, este protocolo pode contribuir para uma melhor compreensão dorelevância imunológica de peroxidases heme derivados de leucócitos.

Introduction

Leucócitos polimorfonucleares (PMN, também denominados granulócitos e monócitos) representam importantes componentes celulares do sistema imune inato no sangue 1,2. Eles contribuem para a defesa principal contra patogénios, assim como para a activação do sistema imune adaptativo e o início de uma resposta inflamatória sistémica 2-4. No entanto, especialmente dos neutrófilos, o tipo mais abundante de granulócitos e monócitos também contribuem significativamente para a regulação e rescisão de eventos inflamatórios agudos 5. Por conseguinte, estas células podem também desempenhar um papel importante em doenças inflamatórias crónicas como a artrite reumatóide 6,7. Na verdade, a asma, uma doença inflamatória crónica das vias aéreas, é caracterizada por uma apoptose dos eosinófilos auditivos, o segundo tipo mais de granulócitos no sangue 8. No entanto, a apoptose de granulócitos e sua rápida remoção por macrófagos são dois passos essenciais durante a terminação celularde inflamação 9-11.

Nas células imunes chamados duas enzimas intimamente relacionados, nomeadamente mieloperoxidase (MPO, neutrófilos e monócitos) e peroxidase de eosinófilo (EPO, eosinófilos) pode ser encontrado 12,13. Estas peroxidases heme são classicamente relacionada com a resposta imune humoral como eles de duas electronicamente oxidar halogenetos de (pseudo) para o hipo correspondente (pseudo) halous ácidos que são conhecidos pelas suas propriedades bactericidas 14-16. Sob condições fisiológicas MPO se forma principalmente o ácido hipocloroso (HOCl) e hypothiocyanite (- OSCN) enquanto que o ácido hipobromoso e último (HOBr) são formados por EPO 17-19. Novos resultados sugerem que esta atividade da enzima de halogenação (pseudo-) também podem contribuir para a regulação de respostas inflamatórias e ao encerramento de reações imunes 20,21. De facto, a produção de HOCl por MPO e produtos derivados foram mostrados para suprimir respostas adaptativas baseados em células imunitárias T 22-24.

A fim de obter mais insights sobre o papel imunológico de leucócitos a partir do sistema imune inato em doenças inflamatórias crónicas e para determinar a contribuição de MPO e EPO a esta função fisiológica foi desenvolvido um método para enriquecer rapidamente leucócitos a partir de pequenas amostras de sangue para uma específica subsequente determinação da atividade da peroxidase de halogenação nestas células. Para a depleção de eritrócitos nós escolhemos um método padronizado incluindo as etapas de lise hipotônica de dois subsequentes com água destilada, o que leva a um enriquecimento de leucócitos rápido em custos de material baixos. Para a determinação subsequente da MPO halogenação e da actividade EPO a HOCl- e específicos de HOBr corante aminofenil fluoresceína (APF) foi usado 25-27. Em contraste com a aplicação de métodos de coloração de peroxidase inespecífica 28,29, esta abordagem permite a detecção selectiva da actividade de peroxidase de halogenação, o qual é muitas vezes prejudicada pelo infl graveamação 30,31.

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Protocol

Todas as amostras de sangue humano foram obtidas de voluntários saudáveis, e o protocolo de enriquecimento de leucócitos aplicada segue as diretrizes da comissão de ética da Faculdade de Medicina da Universidade de Leipzig. Os experimentos com sangue de rato foram aprovados pelo comitê de ética local responsável (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), de acordo com as directrizes alemãs sobre cuidados com os animais e utilização.

1. Configuração Experimental

NOTA: Como o procedimento de lise hipotônica para o esgotamento dos eritrócitos a partir das amostras de sangue é um procedimento de tempo crítico, prepare todo o equipamento necessário (por exemplo, buffers) para esta parte do protocolo de antecedência.

  1. Rotular um 15 ml tubo de centrifugação para a lise hipotônica e um tubo de 1,5 ml da amostra para posterior fluoresceína aminofenil (APF) coloração por amostra de sangue.
    1. Se o enriquecimento de leucócitos irão ser realizada sob condições estéreis, executar esta rotulagem sob um fluxocaixa.
  2. Prepare a cerca de 12 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS, 10 mM) por amostra. Dependendo do facto de os leucócitos devem ser isolados, em condições estéreis ou não, preparar PBS, quer com a solução estéril pronta a partir de um fornecedor ou por dissolução de comprimidos de PBS em água destilada. Verificar o valor de pH e, se necessário, ajustar o pH para 7,4, utilizando pequenas quantidades de soluções de 0,1 M de HCl e de NaOH.
    1. Dissolve-se comprimidos PBS (ver tabela de materiais) em 200 ml de água destilada para obter uma solução tampão não-estéril suficiente para cerca de 16 amostras. Se desejado, esterilizar a solução por filtração estéril.
  3. Prepare a cerca de 1 ml de solução de Hanks equilibrada de sais (HBSS) suplementada com Ca 2+ por amostra.
    1. Dissolve-se 970 mg de sal de HBSS em 100 ml (volume final) de água bidestilada. Antes de preencher até ao volume final, verifique o valor de pH e ajustá-lo para pH 7,4. Devido à sua capacidade tampão baixo, preparar este tampão fresco cada dia, umd realizar o ajustamento do pH com especial cuidado, usando pequenas quantidades de soluções de HCl 0,1 M e NaOH.
      NOTA: solução estéril pode ser usado, dependendo da experiência. A solução pode ser esterilizada por filtração estéril.
  4. Além dos dois tampões, de etiquetas e preparar um tubo (por exemplo, 50 ml de tubo de centrifugação) ou recipiente de vidro (por exemplo, 250 ml de medição do copo) com água duplamente destilada para o procedimento de lise hipotónico com antecedência. Prepare cerca de 10 ml de água por amostra.
  5. Preparar um recipiente com gelo esmagado para a coloração APF (secção 3), a qual é realizada em gelo.
  6. Preparar alíquotas de APF antecedência para permitir a preparação rápida de soluções de trabalho utilizados durante a coloração (passo 3.2) e evitar repetidamente congelamento e descongelamento da solução APF.
    NOTA: APF é geralmente obtido como um 5 mg / ml (11,81 mM) solução estoque em acetato de metilo.
    1. Congelar alíquotas de 10-100 ul em tubos de 0,5 ml. Para a APF manchando uma finalconcentração de corante de 10 uM é utilizado (Passo 3.8).

2. Hypotonic lise dos eritrócitos

NOTA: Execute as etapas de lise hipotônica (exceto os passos de centrifugação) sob uma bancada de fluxo laminar para evitar a contaminação. Executar todo o processo à temperatura ambiente. À medida que a lise hipotónica é um processo crítico tempo, ajustar as pipetas para água (2 ml) e PBS (5 ml) adição com antecedência e abre a água e frascos PBS antes de iniciar o procedimento. Guardar a solução de PBS e a água destilada, à temperatura ambiente antes do uso.

  1. A partir de cada amostra de sangue de transferência 100 ul aos 15 ml tubo de centrifugação adequado.
    Nota: Nas nossas experiências amostras de sangue geralmente contêm 10 U / ml de heparina, a fim de evitar a coagulação. No entanto, devido a diferentes fontes de material de amostra a natureza e concentração do anti-coagulante podem ser diferentes. A sua influência sobre a coloração APF deverão ser testadas por Comparção dos resultados com os resultados obtidos a partir de amostras de sangue para além de outros tipos ou as concentrações de anti-coagulante.
  2. Adicionar 2 ml de água destilada e misturar as amostras usando um misturador de vórtice para definir um nível médio. Incubar as amostras durante 60 segundos, em seguida, adicionar 5 ml de PBS por amostra e misturar usando o misturador de vórtice.
    NOTA: até cerca de 5 amostras podem ser preparadas em paralelo. Manter a ordem da amostra o mesmo para a adição de água e PBS para atingir tempos de incubação comparáveis.
  3. Após regeneração das condições isotónicas através da adição de PBS (passo 2.2) sedimentar as restantes células intactas em todas as amostras por centrifugação durante 6 min à temperatura ambiente e 450 x g.
  4. Retire o sobrenadante por coloca-lo em um caixote do lixo mesa. Remover o máximo de líquido possível, invertendo o tubo de centrifugação e tocando a abertura em uma toalha de papel. Assegure-se que o pellet celular é o mais seco possível.
  5. Repetir o procedimento de lise hipotónico, tal como descrito antes (passo 2.2).
    NOTA: Em princípio este procedimento de lise hipotónico (passos 2.3 a 2.5) poderia ser repetido mais de uma vez, dependendo da pureza da fracção de leucócitos mista a ser obtido. Após dois lise passos a quota de permanecer eritrócitos na fracção celular mista obtida é cerca de 25%.
  6. Sedimentar as restantes células intactas por centrifugação durante 6 min à temperatura ambiente e 450 x g. Remover o sobrenadante (veja o passo 2.4). Adicionar 500 uL de HBSS ao sedimento e dissolvê-lo suavemente até se obter uma solução homogénea. Transferir cada amostra para o tubo de amostra de 1,5 ml em conformidade marcado.
  7. Dependendo da experiência analisar directamente amostras obtidas (por exemplo, por meio de citometria de fluxo) 25, mancha com anticorpos marcados por fluorescência (para a identificação de tipos de células individuais) 32, incubar com estímulos de células (para as experiências de activação de células) 33 ou armazenado em gelo e utilização mais tarde. Dependendo do objetivo do estudo, imediatamente realizar experimentos subsequentes sobrea fracção de leucócitos mista desde granulócitos têm uma meia-vida relativamente curto de cerca de 20 h.
    NOTA: O mesmo vale para a coloração atividade da peroxidase descrito abaixo.

3. halogenação atividade da peroxidase Coloração

NOTA: HOCl- e HOBr-produção pelas peroxidases heme derivados do sangue de MPO e EPO é quantificada usando APF, o qual é oxidado a fluoresceína pelos ácidos hypohalous nomeados. Portanto, se a rotulagem de células com anticorpos marcados com fluorescência é realizada em combinação com coloração APF, fluoróforos evitar que interferem com o sinal de emissão da fluoresceína.

  1. Realização da coloração APF a 4 ° C em gelo.
  2. Para a preparação de uma solução de trabalho de APF descongelar uma aliquota adequada do corante (por exemplo, 10 ul, 11,81 mM) e dilui-lo com HBSS a exactamente 1 mM (por exemplo, adicionar 108,1 ul de tampão para o 10 ul).
    1. Para cada amostra (solução de células ul 500) preparar 5 μl da solução de trabalho APF descrito. Por conseguinte, utilizar uma aliquota de 10 ul de APF (11,81 mm), que produz 118,1 solução ul APF de trabalho (1 mM) para preparar cerca de 20 amostras. Devido à perda durante a pipetagem preparar cerca de 10% mais solução de trabalho APF do que calculado.
  3. A fim de verificar a especificidade da peroxidase da coloração APF, preparar amostras de controlo com o inibidor de heme peroxidase de hidrazida do ácido 4-aminobenzóico (4-ABAH) 35.
    1. Prepara-se uma solução stock de 1 M de 4-ABAH (151,17 g / mol) em sulfóxido de dimetilo (DMSO) por diluição de 75,6 mg de 4-ABAH em 500 mL de solvente. Diluir 4-ABAH 1/10 em HBSS.
  4. Para a preparação de uma solução de marca H 2 O 2 trabalhando em dois tubos de 1,5 ml com centrifugação "mM H 2 O 2 70" e "H 7 mM de 2 O 2", respectivamente.
    1. No tubo rotulado "mM H 2 O 2 70", recém Diluir 10 uLde uma solução de estoque de 30% (8,8 mM) de H 2 O 2, usando 990 ul de água destilada para se obter uma concentração de cerca de 88 mM. Armazenar em gelo e usar dentro de 4 horas.
      NOTA: H 2 O 2 é normalmente fornecido como uma solução estoque de 30% pelos fornecedores. Quando armazenado a 4 ° C, é estável durante cerca de 3 anos. Efectuar diluições de H 2 O 2 em água destilada para evitar a decomposição. H 2 O 2 diluições também pode ser preparada em solução de 0,1 M de NaOH.
    2. Para a determinação da H exacta concentração 2 O 2 a preparar uma diluição adicional de 1 a 10 a partir do primeiro H 2 O 2 a solução de estoque (cerca de 88 mM) pela adição de 100 ul desta solução a 900 ul de água destilada no tubo 1,5 ml rotulados "mM H 7 2 O 2".
    3. Gravar um espectro na gama de UV próximo (por exemplo, 200-300 nm) usando um photospectrometer UV-Vis e usar a absorvância a 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) para determinar a concentração real de H 2 O 2 na segunda H 2 O 2 a solução de reserva 34. Certifique-se de que a cuba de referência contém apenas água destilada. Para as cuvetes de quartzo de medição como o uso de um espectro na gama de UV é registada.
    4. A partir deste resultado, calcular as concentrações exactas de ambas as soluções de reserva de H 2 O 2. Ajustar a concentração de a primeira solução de estoque no "mM H 2 O 2 70" de tubos de amostra para exactamente 70 mM, por adição de uma quantidade adequada de água destilada. Guardar a solução obtida trabalhando sobre gelo e utilizar no prazo de uma hora.
  5. Adicionam-se 5 ul da solução de trabalho de 4-ABAH (100 mM) às amostras adequadas para uma concentração final de 1 mM. Incubar as amostras durante 15 min a 37 ° C na incubadora antes de APF adição.
  6. Adicionar 5 uL APF solução de trabalho (1 mM) a cada500 ul de amostra para se obter uma concentração de corante final de 10 uM. Misturar suavemente as amostras (por exemplo, usando o misturador de vórtice de uma definição média) e incubar durante 30 min a 37 ° C.
  7. Adicionar 5 uL H solução de trabalho 2 O 2 (70 mM) a cada amostra de 500 ul para uma concentração final de 700 uM. Misturar suavemente as amostras e incuba-se-lhes durante 60 minutos a 37 ° C. Realizar medições adequadas de controlo em paralelo.
    NOTA: As medidas de controlo mostraram que 700 uM de H 2 O 2 não são tóxicos para as células. quaisquer respostas celulares significativas nem foram observados.
    NOTA: A coloração com APF pode também ser realizada por omitindo a adição de H 2 O 2, dependendo da questão científica. Na ausência de peróxido de hidrogénio apenas a MPO cloração basal e a actividade da EPO é determinada, enquanto a adição de H 2 O 2 permite a detecção da produção máxima de HOCl e HOBr pelas células. Tele últimos meios um sinal de fluorescência significativamente maiores.
  8. Por peletização das células, centrifugação das amostras durante 10 min a temperatura ambiente e 400 x g. Cuidadosamente remover o sobrenadante sem destruir o sedimento e adicionar 250 uL de HBSS para ressuspender as células.
    NOTA: As amostras estão agora prontos para análise através de citometria de fluxo 25.
  9. Armazenar as amostras no escuro até análise para evitar branqueamento. Após excitação a 480-490 nm detectar a emissão de fluoresceina a cerca de 525 nm de 37.

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Representative Results

Como relatado anteriormente o método descrito acima acabou por ser aplicável tanto para a saúde humana e para o material não-humano 32. Além disso, como mostrado para ratos com sintomas asmáticos a coloração APF pode ser um instrumento adequado, para detectar diferenças no estado pró-inflamatória sistémica. Portanto, em um estudo posterior utilizou-se este protocolo para avaliar repetidamente a atividade de halogenação de MPO (e EPO) em ratas escuro Agouti com artrite induzida por pristano (PIA). Um exemplo representativo de enriquecimento de leucócitos e coloração realizada durante esta experiência é mostrado na Figura 1. Cerca de 200 ul de sangue total foi obtido a partir do plexo venoso retrobulbar do animal, sob anestesia e heparinizados. O esgotamento dos eritrócitos e uma subsequente coloração APF foram realizadas com 100 ul volume de amostra. Depois a amostra foi analisada por citometria de fluxo.

(Figura 1A), um forte depleção de eritrócitos a partir da amostra foi alcançado. Além disso, diferentes tipos de leucócitos foram claramente discernível, que foram identificados mediante a aplicação de marcadores de superfície de células marcadas por fluorescência (não mostrado). Resumidamente eritrócitos (CD235a-positivo) / região detritos da célula responsáveis ​​por apenas 22% dos eventos, enquanto cerca de 48% dos eventos foram identificados como neutrófilos CD16-positivo. Além disso 3% dos eventos foram, cada um identificado como eosinófilos CCR3-positiva e monócitos CD14-positiva e cerca de 19% dos eventos responsáveis ​​por CD5 positivas a CD19 / B e linfócitos T, respectivamente. A distribuição da intensidade da fluorescência APF-derivado (Figura 1B) claramente permitiu a discriminação de eritrócitos e linfócitos peroxidase-negativos, enquanto monócitos e eosinófilos levou a uma oxidação APF moderada e neutrófilos foram fortemente peroxidase-positiva sob o chOsen condições experimentais. Estes resultados estão de acordo com a elevada abundância de MPO nas últimas células, em comparação com a concentração de enzima em monócitos 20. A resposta relativamente fraca dos eosinófilos pode ser explicado pelo facto de, que não foi adicionado o brometo, o qual pode ter levado a formação de EPO derivada de HOBr. Estudos preliminares sobre eosinófilos isolados surpreendentemente não mostrou um grande influência de brometo adicionado externamente sobre a oxidação APF por estas células. Ainda assim, a oxidação do APF pelos eosinófilos foi observada, que pode ser explicada pela introdução de pequenas quantidades de Br - através das soluções tampão utilizadas (PBS e HBSS). Alternativamente, a EPO também pode produzir pequenas quantidades de HOCl, pelo menos sob condições ácidas (por exemplo, em fagolisossomas).

figura 1
Figura 1: o enriquecimento de leucócitos e APF-derived fluorescência numa amostra de sangue de micro-a partir de um rato. Uma quantidade de cerca de 200 ul de sangue total foi obtido a partir do plexo venoso retrobulbar de uma fêmea de rato escuro Agouti. Após a aplicação do procedimento descrito para a hemólise de 100 ul de sangue e um APF de coloração subsequente da fracção celular mista foi analisada por citometria de fluxo. Como mostrado pelo FSC / SSC- Lote (A) os eritrócitos foram fortemente empobrecido a partir da amostra e os diferentes tipos de leucócitos pode ser facilmente distinguida. A distribuição da intensidade de fluorescência APF-derivado (B) mostrou claramente heme peroxidase-negativos células (eritrócitos e linfócitos), bem como os leucócitos com moderadas (eosinófilos e monócitos) ou forte (neutrófilos) actividade de halogenação peroxidase. Por favor clique aqui para visualizar um versão maior desta figura.

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Discussion

Como os neutrófilos são os leucócitos mais abundantes no sangue humano, o isolamento de células de peroxidase-positivos muitas vezes só incide sobre estas células e inclui uma separação dos neutrófilos a partir de outros leucócitos por centrifugação em gradiente de densidade de 38. No entanto, como os neutrófilos são muito menos abundante em amostras de sangue de murino 39 para os últimos métodos mais complicadas tem que ser utilizado 40. Além disso ambos os métodos também conduzem à remoção de monócitos peroxidase-positivos a partir das amostras e, devido à necessidade de os volumes de sangue maiores (por exemplo, 400 ul 41), não são aplicáveis ​​a micro-amostras obtidas durante a amostragem de sangue de repetição a partir de pequenos animais de laboratório 38,40. A purificação dos neutrófilos murino de exsudato peritoneal também precisa do sacrifício dos animais e, além disso, não produz granulócitos derivados do sangue 38,40. Recentemente desenvolveram métodos para obter fracções altamente purificadas a partir de granulócitos BL murinoood (por exemplo, a aplicação de anticorpos) são frequentemente caro, complicado e demorado 40,42,43 e novamente apenas se concentrar na purificação de um tipo de leucócitos da peroxidase-positiva.

Assim, o método aqui apresentado tem um par de vantagens sobre os outros métodos aplicados para a purificação de leucócitos da peroxidase-positiva. Como é baseado em pequenas amostras de sangue as células obtidos representam a situação na circulação. Devido ao pequeno volume da amostra inicial necessário para o protocolo, o método é aplicável tanto sangue humano e não-humano, apesar das diferenças específicas de espécies na abundância de neutrófilos. Na verdade, nós fomos capazes até mesmo de aplicar o método descrito para rubricar volumes de sangue tão pequenas quanto 50 pi (dados não mostrados). A pequena amostra de sangue necessária para o método, também o torna adequado para a retirada repetida de sangue a partir de pequenos animais de laboratório ou em aplicações médicas especiais (por exemplo, diagnóstico de recém-nascido). como tele enriquecimento de leucócitos baseia-se na depleção de todas as células de eritrócitos de peroxidase-positivo (neutrófilos, eosinófilos, monócitos) são incluídas na fracção de leucócitos mista obtido e pode ser analisada separadamente, utilizando citometria de fluxo. O método é rápido, confiável e tem baixos requisitos em matéria de produtos químicos e de instrumentação, tornando o protocolo apropriado para vários ambientes científicos.

Como neutrófilos são facilmente activado um passo crítico durante o método descrito é o ajustamento exacto do valor das soluções tampão utilizadas pH (PBS e HBSS, ver passos 1.2 e 1.3 da secção de protocolo). Além disso, o tempo de incubação das células do sangue com água destilada não deve continuar a ser de 60 segundos antes de restaurar as condições de normosmotic (ver passo 2.2 da secção de protocolo. O (quase) completamente a remoção do solvente a partir do sedimento de células (passo 2.4) antes da adição de água para a segunda lise hipotônica é mais um passo crítico como lustreresíduos de er irá diminuir a eficiência do procedimento de lise hipotónica. Outro passo importante refere-se à aplicação de H 2 O 2 durante a coloração do APF. Embora a quantidade aplicada não deve ser citotóxico, a vitalidade das células devem ser verificadas. Durante os nossos estudos que normalmente aplicar o corante de 5,5 ', 6,6'-tetracloro-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi dazolylcarbocyanine iodeto (JC-1) para a detecção de eventos apoptóticos início.

Além disso, há um par de limitações do método de enriquecimento de leucócitos simplificado descrito. Embora a técnica pode ser aplicada a amostras de sangue a partir de várias espécies (homem, rato e o rato têm sido tentadas), a quantidade de leucócitos obtido após a lise de eritrócitos depende da sua abundância no sangue inicial. Este último certamente varia entre as espécies 39 e também é dependente do estado inflamatório do indivíduo apalpada. Além disso, enquanto o procedimento de lise pode ser feito com até umcentenas de amostras em paralelo os passos de centrifugação intermediários constituem uma limitação, dependendo da centrifugadora usada, apenas até 30 amostras podem ser processadas em paralelo. Além disso, enquanto APF facilmente detecta HOCl e HOBr na presença de SCN -, a actividade de MPO de halogenação e a EPO também afecta a este último pseudo-halogeneto. Deste modo hypothiocyanite (- OSCN) é formada, que é incapaz de oxidar APF. Outra limitação vem das propriedades do corante APF utilizado para a determinação de HOCl- e HOBr-produção por MPO e EPO. Como o corante é oxidado a f luoresceina, a coloração não podem ser combinados com anticorpos fluorescentes, com um espectro de emissão na mesma gama. É claro que quaisquer interferências entre a fluorescência APF-derivado e o sinal de sinais fluorescentes adicionais têm de ser verificados e compensada no citômetro de fluxo.

Caso contrário, se a detecção da actividade de peroxidase de halogenação não é do âmbito daestudar, depois da aplicação do método de depleção dos eritrócitos podem ser utilizados outros métodos de análise, em vez de APF. À medida que o procedimento de lise hipotónica descrito leva apenas a um esgotamento parcial de eritrócitos e de leucócitos, como todos estão ainda presentes na fracção celular mista obtida, únicos métodos que permitem a análise de uma única célula deve ser aplicada. Os métodos que incluem a lise de células (por exemplo, por análise de dispersão Ocidental) não irá produzir resultados fiáveis. O pequeno volume da amostra inicial pode ser mais um obstáculo para esses métodos analíticos.

Em relação à investigação de MPO (e EPO) A atividade em leucócitos muitas vezes só a produção geral oxidante pelas células são os destinatários em vez de avaliar especificamente a atividade da peroxidase heme 44,45. Além disso, muitas vezes não são feitas tentativas para distinguir entre a halogenação e a actividade de peroxidase de MPO e EPO 46,47. Métodos, que abordam especificamente a atividade MPO cloração por quantifying produtos HOCl derivados como clorotirosina não detectar excesso de oxidado e / ou produtos metabolizado e, assim, muitas vezes, levar a uma subestimação do real HOCl-produção 48. Além disso, este método assim como a detecção de HOCl-derivado 2-chloroethidium também são demorados, necessita de equipamento caro e analítica incluem a lise de células 48-50 .não são muitos relatos sobre novos corantes para a determinação especifica da actividade de MPO de cloração dentro de células vitais 44,51,52. No entanto, até à data apenas APF e sua fluoresceína hidroxifenil composto relacionado (HPF) estão comercialmente disponíveis e, por conseguinte, utilizado rotineiramente na investigação 25,33.

De facto, usando APF podemos mostrar que a actividade de MPO cloração pode não só ser quantificada usando a enzima isolada 53, mas também através da aplicação do corante para as células vivas 26,33. Assim, combinando o enriquecimento de leucócitos rápida de micro-amostras de sangue acima referidos com umN APF de coloração desenvolveu-se um protocolo, que é adequada para tratar especificamente e, simultaneamente, a actividade de MPO de halogenação e EPO em todos os leucócitos positivos peroxidase, isto é, neutrófilos, monócitos e eosinófilos 32. Além disso, o método não requer a lise celular, o que permite que uma ampla variedade de métodos analíticos, incluindo citometria de fluxo e microscopia de fluorescência confocal. Além disso, esta coloração de actividade de peroxidase pode ser combinado com a aplicação de marcadores de superfície celular, o que permite que a análise específica da sub-fracções de leucócitos, dependendo da tarefa científica. No entanto, tem de considerar-se que os anticorpos marcados com fluorescência aplicados não interferir com o sinal de fluorescência de fluoresceína à base utilizada para quantificar a oxidação HOCl- e APF-HOBr derivado.

Em resumo, este método pode fornecer uma nova ferramenta para obter mais esclarecimentos sobre o papel fisiológico da atividade de halogenação peroxidase do re imunológicalevant peroxidases derivados do sangue MPO e EPO, que ainda não é bem compreendido 8,20,23. Além disso, em um estudo animal em que a artrite reumatóide pode observar recentemente que este protocolo pode levar à avaliação da produção de HOCl MPO-derivado como um novo marcador clínico em doenças inflamatórias crónicas (dados não publicados).

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

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Immunology edição 113 preparação de sangue o enriquecimento de leucócitos a mieloperoxidase a peroxidase de eosinófilos a actividade de cloração fluoresceína aminofenil
Avaliação rápida e específica da atividade da peroxidase de halogenação em amostras de sangue enriquecido por leucócitos
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Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

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