Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

במאמר זה פרוטוקול להעשרה המהירה ואחידה של לויקוציטים מדגימים דם קטן שלם מתואר. הליך זה מבוסס על תמוגה hypotonic של אריתרוציטים וניתן להחיל דגימות אנושיות וכן דם ממקור לא אנושי. היקף המדגם הראשוני הקטן של כ 50 עד 100 μl עושה בשיטה זו החלימה על דגימת דם חוזרת ונשנית בחיות מעבדה קטנות. יתר על כן, העשרה לויקוציטים מושג בתוך דקות ועם מאמצי חומר נמוכים לגבי כימיקלים ומיכשור, מה שהופך שיטה זו ישימה בסביבות מעבדה מרובה.

טיהור סטנדרטי של לויקוציטים הוא בשילוב עם שיטת מכתים בררנית במיוחד לשם הערכת הפעילות peroxidase halogenating של peroxidases heme, myeloperoxidase (MPO) ו peroxidase אאוזינופילים (EPO), כלומר, היווצרות של hypochlorous וחומצה hypobromous (HOCl ו HOBr). בעוד MPO לידי ביטוי בולט neutrophils, סוג תא החיסון הנפוץ ביותר בדם אנושי וכן מונוציטים, האנזים הקשור EPO מתבטא באופן בלעדי אאוזינופילים. פעילות halogenating של אנזימים אלה מופנה באמצעות כמעט HOCl- ו HOBr ספציפי וההעמסה לצבוע aminophenyl (APF) ואת מי חמצן מצע peroxidase העיקרי. לאחר ניתוח cytometry זרימת לאחר כל התאים peroxidase-חיובי (נויטרופילים, מונוציטים, אאוזינופילים) וניתן להבחין ופעילות peroxidase halogenating שלהם ניתן לכמת. מאז מכתים APF ניתן בשילוב עם יישום של סמנים פני התא, פרוטוקול זה יכול להתארך להתייחס-שברים תת לויקוציטים במיוחד. השיטה ישימה לזהות HOCl ו HOBr ייצור הוא אדם והן לויקוציטים מכרסמים.

לנוכח התפקיד החיסוני דן בהרחבה מגוונת של מוצרים האנזימטית אלה במחלות דלקתיות כרוניות, פרוטוקול זה עשוי לתרום להבנה טובה יותר שלהרלוונטיות אימונולוגיים של peroxidases heme הנגזרות לויקוציטים.

Introduction

לויקוציטים polymorphonuclear (PMNs, המכונה גם גרנולוציטים) ומונוציטים מייצגים מרכיבים תאיים חשובים של מערכת החיסון המולדת של 1,2 דם. הם לתרום להגנה העיקרית נגד פתוגנים כמו גם ההפעלה של מערכת החיסון הנרכשת ואת החניכה של תגובה סיסטמית דלקתית 2-4. זאת במיוחד נויטרופילים, הסוג הנפוץ ביותר של גרנולוציטים, מונוציטים ו גם לתרום באופן משמעותי ברגולצית סיום האירועים דלקתיים חריפים 5. לכן תאים אלה יכולים גם לשחק תפקיד חשוב במחלות דלקתיות כרוניות כמו 6,7 דלקת מפרקים שגרונית. למעשה, אסטמה, מחלה דרך נשימה דלקתית כרונית, מתאפיין אפופטוזיס לקוי של אאוזינופילים, סוג גרנולוציט השני הכי בדם 8. עם זאת, אפופטוזיס של גרנולוציטים וההסרה המהירה שלהם על ידי מקרופאגים הם שני צעדים חיוניים במהלך הסיום הסלולרשל דלקת 9-11.

בתאים בשם החיסון שני אנזימים קשורים זה לזה, כלומר myeloperoxidase (MPO, נויטרופילים ומונוציטים) ו peroxidase אאוזינופילים (EPO, אאוזינופילים) ניתן למצוא 12,13. Peroxidases heme אלה קשורים באופן קלאסי לתגובה הלחות החיסונית: הם שני-אלקטרונית לחמצן (פסאודו) הלידים אל (פסאודו) היפו המתאים חומצות halous אשר ידועים בתכונות bactericidal שלהם 14-16. בתנאים פיסיולוגיים צורות MPO בעיקר חומצת hypochlorous (HOCl) ו hypothiocyanite (- OSCN) בעוד החומצה האחרונה ו hypobromous (HOBr) נוצרת על ידי EPO 17-19. תוצאות חדשות מרמזות כי (פסאודו) זו פעילות אנזים halogenating עשויה גם לתרום הסדרת תגובות דלקתיות של סיום הכהונה של תגובות חיסוניות 20,21. למעשה, הפקת HOCl ידי MPO ומוצרי שמקורם הוצגה לדכא מבוסס תאי T תגובות אדפטיבית חיסוניות 22-24.

על מנת לקבל יותר תובנות לתוך התפקיד החיסוני של לויקוציטים ממערכת החיסון המולדת ב מחלות דלקתיות כרוניות ולקבוע את תרומת MPO ו EPO כדי תפקוד פיזיולוגי זה פיתחנו שיטה להעשיר לויקוציטים במהירות מדגימות דם קטנים למשך ספציפיים הבאים קביעת פעילות peroxidase halogenating בתאים אלה. דלדול כדורי בחרנו שיטה סטנדרטית כולל צעדי תמוגה hypotonic שני שלאחר מכן עם מים מזוקקים, מה שמוביל העשרה לויקוציטים מהיר ובעלויות חומר נמוכות. לקביעה הבאה של MPO halogenating ופעילות EPO והעמסת aminophenyl לצבוע HOCl- ו HOBr הספציפי (APF) שמשה 25-27. בניגוד יישום השיטות המכתימות peroxidase נוקב 28,29, גישה זו מאפשרת זיהוי סלקטיבי של פעילות peroxidase halogenating, אשר נפגע לעתים קרובות infl החמורהammation 30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הדגימות דם אדם התקבלו מתנדבים בריאים, ואת פרוטוקול העשרה לויקוציטים להחיל פועל בהתאם להנחיות של ועדת האתיקה של הפקולטה לרפואה של אוניברסיטת לייפציג. הניסויים עם דם עכברוש אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית האחראית (Landesdirektion Sachsen, "רפראט 24), על פי ההנחיות הגרמניות על טיפול בבעלי חיים ולשימוש.

1. התקנה ניסיונית

הערה: ככל הליך תמוגה hypotonic עבור הדלדול של אריתרוציטים מן דגימות הדם הוא הליך קריטי בזמן, להכין את כל הציוד הדרוש (למשל, מאגרים) עבור חלק זה של הפרוטוקול מראש.

  1. לייבל אחד 15 מיליליטר צינור צנטריפוגות במשך תמוגה hypotonic צינור דגימה אחת 1.5 מיליליטר עבור והעמסת aminophenyl עוקבת (APF) מכתים לדגימת דם.
    1. אם העשרה לויקוציטים יבוצע בתנאים סטריליים, לבצע תיוג זה תחת זרםקופסא.
  2. הכן על 12 מ"ל פוספט שנאגרו מלוחים (PBS, 10 מ"מ) לדגימה. תלוי אם לויקוציטים יבודד בתנאים סטריליים או לא, להכין PBS או באמצעות פתרון מוכן סטרילי מן הספק או על ידי המסת טבליות PBS במים מזוקקים. בדוק את ערך ה- pH, ובמידת הצורך, להסתגל pH 7.4 באמצעות כמויות קטנות של 0.1 M פתרונות HCl ו NaOH.
    1. ממיסים טבליות PBS (ראו טבלה של חומרים) ב 200 מ"ל מים מזוקקים כדי להשיג פתרון חיץ שאינו סטרילי מספיק לכ 16 דגימות. אם תרצה, לעקר את הפתרון הזה על ידי סינון סטרילי.
  3. הכן על 1 מיליליטר תמיסת מלח מאוזן הנקס (HBSS) השלימה עם Ca 2 + לדגימה.
    1. ממיסים 970 מ"ג מלח HBSS ב 100 מ"ל (נפח סופי) מים פעמיים מזוקקים. לפני מילוי עד נפח הסופי, לבדוק את ערך ה- pH ולהתאימו pH 7.4. בשל קיבולת החיץ הנמוכה שלה, להכין חיץ זה טרי כל יוםd לבצע את התאמת ה- pH עם טיפול מיוחד באמצעות כמויות קטנות של 0.1 M HCl ו NaOH פתרונות.
      הערה: פתרון סטרילי ניתן להשתמש, בהתאם הניסוי. הפתרון עשוי להיות מעוקר על ידי סינון סטרילי.
  4. מלבד שני מאגרים, התווית להכין צינור (למשל, 50 מ"ל צינור צנטריפוגה) או בקבוק (למשל, 250 מ"ל לכוס מידה) עם מים מזוקקים פעמיים עבור ההליך תמוגה hypotonic מראש. הכן על 10 מ"ל מים לדגימה.
  5. כן מכל עם קרח כתוש עבור מכתים APF (סעיף 3), אשר מבוצע על קרח.
  6. כן aliquots של APF מראש כדי לאפשר ההכנה המהירה של פתרונות עובדים בשימוש במהלך המכתים (שלב 3.2) וכדי למנוע מקפיא פשרה שוב ושוב של פתרון APF.
    הערה: APF מתקבל בכינויו 5 מ"ג / מ"ל ​​(11.81 מ"מ) פתרון המניות ב אצטט מתיל.
    1. להקפיא aliquots של 10-100 μl ב 0.5 מ"ל צינורות. עבור APF מכתים סופיריכוז לצבוע של 10 מיקרומטר משמש (שלב 3.8).

2. תמוגה hypotonic של אריתרוציטים

הערה: בצע את שלבי תמוגה hypotonic (למעט צעדי צנטריפוגה) תחת ספסל זרימה למינרית כדי למנוע זיהום. בצע את ההליך כולו בטמפרטורת החדר. כמו תמוגה hypotonic הוא תהליך קריטי הזמן, להתאים את טפטפות מים (2 מ"ל) ו PBS (5 מ"ל) בנוסף מראש ולפתוח המים צלוחיות PBS לפני שתתחיל בהליך. אחסן את הפתרון PBS ואת מים מזוקקים בטמפרטורת החדר לפני השימוש.

  1. מתוך כל העברת דגימת דם 100 μl אל הצינור 15 מ"ל צנטריפוגה המתאים.
    הערה: בניסויים שלנו דגימות דם בדרך כלל מכילות 10 U / ml של הפרין כדי למנוע קרישה. זאת בשל מקורות שונים של החומר מדגם האופי והריכוז של הקרישה אנטי עשויים להיות שונה. השפעתו על מכתים APF צריך להיבדק על ידי comparing התוצאות לתוצאות שהושגו מדגימות דם בתוספת סוגים או ריכוזים אחרים של קרישה אנטי.
  2. הוסף 2 מ"ל מים מזוקקים ומערבבים דגימות באמצעות מערבל מערבולת מוגדרת לרמה בינונית. דגירה דגימות עבור 60 שניות, ולאחר מכן להוסיף 5 מ"ל PBS לדגימה ומערבבים בעזרת מערבל מערבולת.
    הערה: עד כ -5 דוגמאות ניתן להכין במקביל. לשמור על הסדר המדגם זהה עבור התוספת של מי PBS להשיג פעמי דגירה דומות.
  3. לאחר ההתחדשות של תנאים איזוטוני על ידי תוספת PBS (שלב 2.2) גלולה תאים שלמים שנותרו כל הדגימות על ידי צנטריפוגה במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר ו- g x 450.
  4. הסר את supernatant על ידי שפיכה אותו לפח פסולת שולחן. להסיר כמה שיותר נוזלים ככל האפשר על ידי צינור היפוך צנטריפוגה קשה על זה שפונה אל מגבת נייר. ודא כי התא גלולה יבש ככל האפשר.
  5. חזור על תהליך תמוגה hypotonic כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.2).
    NOTE: בעיקרון זה הליך תמוגה hypotonic (שלבי 2.3 עד 2.5) יוכל לחזור על עצמו יותר מפעם אחת, תלוי הטוהר של שבר לויקוציטים מעורב כדי להתקבל. לאחר שני תמוגה צעדי חלקיו של נותרים אריתרוציטים בשבריר התא המעורב המתקבל הוא כ -25%.
  6. גלולת התאים השלמים שנותרו על ידי צנטריפוגה במשך 6 דקות בטמפרטורת החדר ו- g x 450. הסר את supernatant (ראה שלב 2.4). הוסף 500 μl HBSS כדי גלולה בעדינות לפזר אותו עד למציאת פתרון הומוגני מתקבל. העברת כל מדגם צינור 1.5 מ"ל מדגם ולסמן אותם בהתאם.
  7. בהתאם הניסוי לנתח דגימות שהתקבלו ישירות (למשל, באמצעות cytometry זרימה) 25, כתם עם נוגדנים שכותרתו פלואורסצנטי (לזיהוי סוגי תא בודדים) 32, דגירה עם גירויי תא (לניסויי הפעלת תא) 33 או מאוחסן על קרח ושימוש יותר מאוחר. בהתאם מטרת המחקר, מיד לבצע ניסויים מאוחרים יותר עליש שבר לויקוציטים מעורב מאז גרנולוציטים קצר למדי מחצית חיים של כ -20 שעות.
    הערה: זה נכון גם לגבי מכתים peroxidase הפעולה המפורט להלן.

3. Halogenating Peroxidase פעילות מכתים

הערה: HOCl- ו HOBr הייצור ידי peroxidases heme נגזר-דם MPO ו EPO היא לכמת באמצעות APF, אשר הוא מתחמצן ל והעמסת ידי חומצות hypohalous בשם. לכן אם תיוג תא עם נוגדנים שכותרתו קרינה מבוצע בשילוב עם מכתים APF, להימנע fluorophores כי להפריע לאות הפליטה וההעמסה.

  1. בצע מכתים APF ב 4 ° C על הקרח.
  2. להכנת פתרון עבודה של APF להפשיר aliquot המתאים של צבע (למשל, 10 μl, 11.81 מ"מ) ו לדלל אותו עם HBSS בדיוק 1 מ"מ (למשל, להוסיף 108.1 חיץ μl אל 10 μl).
    1. עבור כל דגימה (500 פתרון התא μl) להכין 5 μl של הפתרון עובד APF תיאר. בהתאם לכך, השתמש באחת 10 aliquot μl של APF (11.81 מ"מ), אשר מניב 118.1 הפתרון עובד APF μl (1 מ"מ) כדי להכין כ -20 דגימות. בשל אובדן במהלך pipetting להכין כ -10% יותר פתרון APF עובד מ מחושב.
  3. כדי לבדוק את הספציפיות peroxidase של מכתים APF, להכין דגימות בקרה עם hydrazide חומצה 4-aminobenzoic מעכב peroxidase heme (4-ABAH) 35.
    1. הכן פתרון מניות 1 M של 4-ABAH (151.17 g / mol) ב sulfoxide דימתיל (DMSO) על ידי דילול 75.6 מ"ג 4-ABAH ב 500 μl ממס. בהמשך לדלל 4-ABAH 1/10 ב HBSS.
  4. לעריכת תווית פתרון H 2 O 2 עבודה שני צינורות 1.5 מ"ל צנטריפוגה עם "70 מ"מ H 2 O 2" ו "7 מ"מ H 2 O 2", בהתאמה.
    1. בצינור שכותרתו "70 מ"מ H 2 O 2", לדלל טרי 10 μlשל פתרון המניות 30% (8.8 מ"מ) של H 2 O 2 באמצעות 990 μl מים מזוקקים כדי לקבל ריכוז של כ -88 מ"מ. חנות על הקרח ולהשתמש תוך 4 שעות.
      הערה: H 2 O 2 מועברת בדרך כלל כפתרון מניות 30% על ידי הספקים. כאשר מאוחסנים 4 ° C, הוא יציב במשך כ -3 שנים. בצע דילולים של H 2 O 2 במים מזוקקים כדי למנוע ריקבון. H 2 O 2 דילולים יכולים גם להיות מוכנים ב 0.1 פתרון M NaOH.
    2. לקביעת ריכוז מדויק H 2 O 2 להכין דילול 1 עד 10 עוד מפתרון המניות הראשונה H 2 O 2 (כ -88 מ"מ) על ידי הוספת 100 μl מפתרון זה ל -900 μl מים מזוקקים בצינור 1.5 מ"ל שכותרתו "7 מ"מ H 2 O 2".
    3. קלט ספקטרום בטווח UV ליד (למשל, 200-300 ננומטר) באמצעות פוטו UV-Vis ולהשתמש את הספיגה ב 240 ננומטר (49; 240 = 34 M -1 cm -1) כדי לקבוע את ריכוז בפועל H 2 O 2 בתמיסת המניות השנייה H 2 O 2 34. ודא קובט הפניה מכיל מים מזוקקים בלבד. עבור cuvettes קוורץ שימוש מדידה כמו ספקטרום בטווח UV נרשם.
    4. מתוצאה זו, לחשב את הריכוז המדויק של שני פתרונות מניות H 2 O 2. התאם את הריכוז של פתרון המניות הראשון במדגם צינור "70 מ"מ H 2 O 2" בדיוק 70 מ"מ על ידי הוספת כמות מתאימה של מים מזוקקים. אחסן את הפתרון עובד המתקבל על קרח ולהשתמש תוך שעה אחת.
  5. הוסף 5 μl של הפתרון עובד 4-ABAH (100 מ"מימ) על הדגימות המתאימות לריכוז סופי של 1 מ"מ. דגירת הדגימות במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס בחממה לפני כן APF.
  6. הוסף 5 הפתרון עובד APF μl (1 מ"מ) לכלמדגם 500 μl כדי להשיג ריכוז לצבוע סופי של 10 מיקרומטר. מערבב את הדגימות בעדינות (למשל, על ידי שימוש מערבל המערבולת על הגדרה בינונית) דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  7. הוסף 5 μl H 2 O פתרון עובד 2 (70 מ"מ) מדגם 500 μl ריכוז סופי של 700 מיקרומטר. בעדינות מערבבים את דגימות דגירה אותם במשך 60 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בצע מדידות בקרה נאותות במקביל.
    הערה: מדידות בקרה הראה כי 700 מיקרומטר H 2 O 2 אינם רעילים עבור התאים. גם לא היו כל תגובות הסלולר משמעותיות ציינו.
    הערה: מכתים APF יכול גם להתבצע על ידי השמטת התוספת של H 2 O 2, תלוי בשאלה המדעית. בהיעדר חמצן מימן MPO chlorinating הבזליים רק ופעילות EPO נקבע תוך התוספת של H 2 O 2 מאפשרת זיהוי של ייצור HOCl ו HOBr המקסימאלי על ידי התאים. Tהוא אחרון פירושו אות ניאון גבוהה משמעותי.
  8. לקבלת pelleting התאים, צנטריפוגות את הדגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר 400 x גרם. ביסודיות להסיר את supernatant מבלי להרוס את הגלולה ולהוסיף 250 μl HBSS כדי resuspend תאים.
    הערה: הדגימות מוכנות כעת לניתוח באמצעות זרימת cytometry 25.
  9. אחסן את הדגימות בחושך עד לניתוח כדי למנוע הלבנה. לאחר עירור ב 480-490 ננומטר לזהות את פליטת והעמסת בסביבות 525 37 ננומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כפי שדווח בעבר השיטה המתוארת לעיל התבררה לחול הן אדם וכדי לא אנושי חומר 32. יתר על כן, כפי שמוצג על עכברים עם סימפטומים אסתמטיים המכתים APF עשוי להיות כלי מתאים כדי לזהות הבדלים במעמד פרו-הדלקתי המערכתי. לכן במחקר שלאחר מכן השתמשנו בפרוטוקול זה שוב ושוב להעריך את פעילותו halogenating של MPO (ו EPO) בחולדות נקבות Dark agouti עם דלקת הנגרמת pristane (PIA). דוגמה מייצגת של העשרת לויקוציטים והכתים שבוצעו במהלך ניסוי זה מוצג באיור 1. כ -200 μl כולו דם התקבל מקלעת ורידית retrobulbar של החיה תחת הרדמה heparinized. הדלדול הכדורי ו המכתים בא APF בוצעו באמצעות 100 נפחי דגימת μl. לאחר מכן המדגם נותח על ידי cytometry הזרימה.

her.within-page = "1"> כפי שניתן לראות על ידי התוויית גודל תא מול גרעיניות תא (איור 1 א), דלדול חזק של אריתרוציטים מהדגימה הושגה. זאת ועוד סוגים לויקוציטים שונים ניתן היה להבחין בבירור, אשר זוהו על ידי החלת סמנים פני התא שכותרתו פלואורסצנטי (לא מוצג). בקצרה את כדורית (CD235a חיובי) / תא פסולת באזור היוו רק 22% של אירועים תוך כ -48% מהמקרים שעליהם זוהו נויטרופילים CD16 חיובי. זאת ועוד 3% מהמקרים שעליהם כל זוהו אאוזינופילים CCR3-חיובי מונוציטים חיובית-CD14 וכ -19% מהמקרים שעליהם היוו CD5 / B CD19 חיובי ו לימפוציטים מסוג T, בהתאמה. חלוקת עוצמת קרינת APF הנגזרת (האיור 1B) בבירור מותר אפלית אריתרוציטים peroxidase השלילי לימפוציטים בעוד מונוציטים ו אאוזינופילים הובילו חמצון APF מתון נויטרופילים הביעו דעה נחרצת peroxidase חיוביים תחת chתנאי הניסוי אוסן. תוצאות אלו עולות בקנה אחד עם השפע הגבוה של MPO בתאים האחרונים לעומת ריכוז האנזים מונוציטים 20. התגובה החלשה היחסי של אאוזינופילים יכולה להיות מוסברת על ידי העובדה, שאף ברומיד נוספה, שאולי מתבקשת היווצרות נגזרות EPO של HOBr. מחקרים ראשוניים על אאוזינופילים מבודדים באופן מפתיע לא הראו השפעה גדולה של ברומיד הוסיף חיצוני על חמצון APF על ידי תאים אלו. ובכל זאת, חמצון של APF ידי אאוזינופילים נצפו אשר עשוי להיות מוסבר על ידי ההקדמה של כמויות קטנות של Br - באמצעות פתרונות החיץ בשימוש (PBS ו HBSS). לחלופין EPO עשוי גם מייצרים כמויות קטנות של HOCl, לפחות בתנאים חומציים (למשל, ב phagolysosomes).

איור 1
איור 1: העשרה ליקוציט APF-לגזורהקרינה ד בתוך מיקרו-דגימת דם חולדה. סכום של כ -200 μl כולו דם התקבל מקלעת ורידית retrobulbar של עכברוש Dark agouti הנשי. לאחר יישום נוהל המוליזה תאר 100 דם μl וכן APF הבא מכתים את שבר התא המעורב נותח על ידי cytometry זרימה. כפי שמוצג על ידי FSC- / SSC- המגרש (א) אריתרוציטים היו מתרוקנים בחום מהדגימה, סוגי לויקוציטים השונים יכולים בקלות להיות מכובדים. חלוקת עוצמת הקרינה הנגזרת APF (B) הראתה בבירור heme peroxidase השלילי תאים (אריתרוציטים ו לימפוציטים) וכן לויקוציטים עם מתונה (אאוזינופילים מונוציטים) או חזקים (נויטרופילים) פעילות peroxidase halogenating. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כפי נויטרופילים הם לויקוציטים הנפוצים ביותר בדם אנושי הבידוד של תאים חיוביים peroxidase לעתים קרובות מתמקד רק תאים אלה וכולל הפרדה של נויטרופילים מ לויקוציטים אחרים על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות 38. עם זאת, כפי נויטרופילים הם הרבה פחות בשפע בדגימות דם בעכברים 39 עבור השיטות מורכבות יותר האחרונות צריכים לשמש 40. יתר על כן, בשני השיטות גם להביא להעברתם של מונוציטים חיוביים peroxidase ממדגמים ו, בשל הצורך של כרכי דם גדולים יותר (למשל, 400 μl 41), אינם ישימים מייקרו דגימות שהתקבלו במהלך דגימת דם חוזרת ונשנית בחיות מעבדה קטנות 38,40. טיהור של נויטרופילים בעכברים מ תפליט הצפק גם צריך הקרבת חיות, ויתרה מזאת, לא להיכנע גרנולוציטים דם הנגזרות 38,40. לאחרונה פיתח שיטות להשיג שברים גרנולוציט מטוהרים מן bl murineood (למשל, היישום של נוגדנים) הם בדרך כלל יקר, מסובך וגוזל זמן 40,42,43 ושוב רק להתמקד טיהור מסוג לויקוציטים peroxidase-חיובי אחד.

לכן השיטה המוצגת כאן יש כמה יתרונות על פני שיטות אחרות מועמדותן הטיהור של לויקוציטים peroxidase חיובי. כפי שהוא מבוסס על דגימות דם קטנות תאי המתקבלים מייצגים את המצב במחזור הדם. בשל היקף המדגם הראשוני הקטן הדרוש פרוטוקול השיטה ישימה הוא אדם ודם שאינו בני אדם, למרות ההבדלים ספציפי מינים בשפע של נויטרופילים. למעשה, אנחנו אפילו הצלחנו ליישם את השיטה המתוארת ראשוני כרכי דם קטנים כמו 50 μl (מידע לא מוצג). מדגם הדם הקטן הדרושים השיטה גם הופך אותו מתאים נסיגת דם חוזר ונשנית מצד בחיות מעבדה קטנות או ליישומים רפואיים מיוחדים (למשל, אבחנת יילוד). כמו tהוא העשרה לויקוציטים מבוססת על הדלדול של אריתרוציטים כל תאי peroxidase-חיובי (נויטרופילים, אאוזינופילים, מונוציטים) כלולים בשבריר לויקוציטים המעורב מתקבל ניתן לנתח בנפרד באמצעות cytometry זרימה. השיטה היא מהירה, אמינה ויש לו דרישות נמוכות לגבי כימיקלים ומיכשור, מה שהופכים את הפרוטוקול מתאים לסביבות מדעים מרובות.

כפי נויטרופילים מופעלים בקלות צעד אחד קריטי במהלך השיטה המתוארת הוא ההתאמה המדויקת של ערך ה- pH של תמיסות בופר בשימוש (PBS ו HBSS, ראה צעדים 1.2 ו -1.3 של סעיף הפרוטוקול). זאת ועוד זמן הדגירה של תאי דם עם מים מזוקקים צריך להיות לא יותר מ -60 שניות לפני שחזור תנאי normosmotic (ראו שלב 2.2 של סעיף הפרוטוקול. (כמעט) ההסרה לחלוטין ממס מן התא הגלול (שלב 2.4) לפני התוספת מים עבור תמוגה hypotonic השנייה הוא עוד שלב קריטי כמו חובבשאריות אה תקטנה את היעילות של הליך תמוגה hypotonic. עוד צעד קריטי מתייחס לבקשה של H 2 O 2 במהלך מכתים APF. למרות הסכום מיושם לא צריך להיות ציטוטוקסיות, חיוניות תא צריכות להיבדק. במהלך לימודינו אנו בדרך כלל להחיל את צבע 5,5 ', 6,6'-tetrachloro-1,1 ", 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine יודיד (JC-1) לצורך זיהוי של אירועים אפופטוטיים מוקדם.

יתר על כן, יש כמה מגבלות בשיטת העשרה לויקוציטים פשוטה תארה. בעוד הטכניקה ניתן ליישם דגימות דם מכמה מינים (בחור, חולדה ועכבר נסים), הכמות לויקוציטים שהושגה לאחר תמוגה של אריתרוציטים תלוי השפע הראשוני שלהם בדם. האחרון בהחלט משתנה בין המינים 39, והוא גם תלוי מצב דלקתי של הפרט נחקר. יתר על כן, בעוד הליך תמוגה אפשר לעשות עם עד אחדמאות דגימות במקביל הצעדים צנטריפוגה ביניים מהווים הגבלה, תלוי צנטריפוגות בשימוש, רק עד 30 דגימות יכול להיות מעובד במקביל. יתר על כן, בעוד APF בקלות מזהה HOCl ו HOBr בנוכחות SCN -, פעילות halogenating של MPO ו EPO משפיע גם על-הליד פסאודו האחרון. ובכך hypothiocyanite (- OSCN) נוצר אשר אינו מסוגל לחמצן APF. מגבלה נוספת נובעת המאפיינים של צבע APF המשמש לקביעת HOCl- ו HOBr-ייצור על ידי MPO ו EPO. כמו הצבע הוא מתחמצן ל והעמסה, המכתים לא ניתן לשלב עם נוגדני ניאון עם פליטת ספקטרום באותו הטווח. כמובן כל התערבויות שבין קרינת APF הנגזרות ואת האות של אותות ניאון נוספים להיבדק ופיצו על בזרימת cytometer.

אחרת, אם זיהוי של פעילות peroxidase halogenating אינו היקףללמוד, לאחר יישום שיטת האזילה הכדורית שיטות אנליטיות אחרות עשויות לשמש במקום APF. ככל הליך תמוגה hypotonic תאר מוביל רק דלדול חלקי של אריתרוציטים וכפי כל לויקוציטים עדיין קיים בשבריר התא מעורב שהושג, רק שיטות המאפשרות ניתוח תא בודד צריך להיות מיושם. שיטות הכוללות את תמוגה של תאים (למשל, ניתוח העלילה המערבי) לא תניב תוצאות אמינות. היקף המדגם הראשוני הקטן עשוי להיות מכשול נוסף לשיטות אנליטיות כאלה.

לגבי התחקיר של MPO (ו EPO) פעילות לויקוציטים לעתים קרובות רק את ייצור החמצון הכללי של התא מופנה במקום הערכת פעילות peroxidase heme במיוחד 44,45. יתר על כן לעתים קרובות לא נעשים ניסיונות להבחין בין halogenating ואת פעילות peroxidase של MPO ו EPO 46,47. שיטות, אשר להתייחס ספציפית פעילות MPO chlorinating ידי quantifying מוצרים שמקורם HOCl כמו chlorotyrosine אינם מזהים יתר חמצון ו / או מטבוליזם מוצרים, ולכן לעתים קרובות להוביל הערכה נמוכה מדי של 48 HOCl הייצור האמיתי. יתר על כן שיטה זו כמו גם זיהוי של HOCl נגזר 2-chloroethidium הם גם זמן רב, צריך ציוד אנליטי יקר וכוללים תמוגה של תאי 48-50 .There דיווחים רבים על צבעים חדשים עבור הקביעה הספציפית של פעילות chlorinating MPO בתוך תאים חיוניים 44,51,52. עם זאת עד כה רק APF ו והעמסת hydroxyphenyl מתחם הקשורים אליה (HPF) זמינים מסחרית ולכן בשימוש שגרתי במחקר 25,33.

למעשה, באמצעות APF נוכל להראות שפעילות MPO chlorinating לא ניתן לכמת רק באמצעות האנזים מבודד 53 אלא גם על ידי החלת צבע לתאים חיים 26,33. כך על ידי שילוב של העשרה לויקוציטים מהירה-דגימות מיקרו הדם כאמור לעיל עםn מכתים APF פתחנו פרוטוקול, אשר מתאים במיוחד ובמקביל לטפל בפעילות halogenating של MPO ו EPO בכל לויקוציטים החיובי peroxidase, כלומר, נויטרופילים, מונוציטים ו אאוזינופילים 32. יתר על כן השיטה אינה דורשת תמוגה התא, המאפשר מגוון רחב של שיטות אנליטיות, כולל cytometry זרימה מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. יתר על כן מכתים פעילות peroxidase זה יכול להיות בשילוב עם יישום של סמנים פני התא, המאפשרת ניתוח פרטני של שברים תת לויקוציטים, בהתאם למשימה מדעית. עם זאת, יש לקחת בחשבון כי נוגדני קרינה שכותרתו השימושיים לא להפריע לאות קרינה המבוססת-והעמסה בשימוש לכמת את HOCl- ו HOBr הנגזר חמצון APF.

לסיכום שיטה זו עשויה לספק כלי חדש כדי לקבל תובנות יותר לתוך התפקיד הפיזיולוגי של פעילות peroxidase halogenating של מחדש אימונולוגיתperoxidases הלבנט הנגזרות דם MPO ו EPO, אשר עדיין אינו מובן היטב 8,20,23. יתר על כן במחקר בבעלי חיים על דלקת מפרקים שגרוניות נוכל להתבונן לאחרונה כי פרוטוקול זה עשוי להוביל בהערכת ייצור HOCl MPO הנגזר כסמן קליני חדש ב מחלות דלקתיות כרוניות (נתונים שלא פורסמו).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Tags

אימונולוגיה גיליון 113 הכנת דם לויקוציטים העשרה myeloperoxidase peroxidase אאוזינופילים פעילות chlorinating והעמסת aminophenyl
הערכה מהירה וספציפית של פעילות Halogenating Peroxidase בדגימות דם ליקוציט מועשר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter