Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Snabb och särskild bedömning av halogene peroxidasaktiviteten i Leukocyte berikad blodprover

Published: July 28, 2016 doi: 10.3791/54484
Automatic Translation
1, 1, 2, 2, 2, 1
1Institute for Medical Physics and Biophysics, Medical Faculty, University of Leipzig, 2Fraunhofer Institute for Cell Therapy and Immunology (IZI) Leipzig

Abstract

I detta dokument ett protokoll för snabb och standardiserad anrikning av leukocyter från små helblodsprover beskrivs. Detta förfarande är baserat på hypoton lys av erytrocyter och kan appliceras på humana prover såväl som till blod av icke-humant ursprung. Den lilla initiala provvolym på omkring 50 till 100 | j, l gör denna metod tillämpas på återkommande blodprov från små försöksdjur. Dessutom är leukocyter anrikning uppnås inom några minuter och med låga materialinsatser om kemikalier och instrumentering, vilket gör denna metod som är tillämplig i flera laboratoriemiljöer.

Standardiserad rening av leukocyter är kombinerat med ett mycket selektivt färgningsmetod för att utvärdera halogenerande peroxidasaktivitet av heme peroxidaser, myeloperoxidas (MPO) och eosinofilperoxidas (EPO), det vill säga, bildandet av underklor och underbromsyrlighet (HOCl och HOBr). Medan MPO uttrycks starkt i Neutrophils, den vanligast förekommande immuncelltypen i humant blod och i monocyter, den relaterade enzym EPO uteslutande uttrycks i eosinofiler. Halogeneringsaktivitet av dessa enzymer är beaktas med den nästan HOCl- och HOBr-specifika färgämnet aminofenyl fluorescein (APF) och den primära peroxidassubstrat väteperoxid. Vid efterföljande flödescytometrianalys alla peroxidas-positiva celler (neutrofiler, monocyter, eosinofiler) kan särskiljas och deras halogene peroxidasaktivitet kan kvantifieras. Sedan APF färgning kan kombineras med tillämpningen av cellytemarkörer, kan detta protokoll utökas till specifikt behandla leukocyter underfraktioner. Metoden kan användas för att upptäcka HOCl och HOBr produktion både i människa och gnagare leukocyter.

Tanke på det breda och mångsidigt diskuteras immunologisk roll dessa enzymatiska produkter i kroniska inflammatoriska sjukdomar, kan detta protokoll bidra till en bättre förståelse avimmunologisk relevans leukocyt-härledda heme peroxidaser.

Introduction

Polymorfonukleära leukocyter (PMN: er, även kallade granulocyter) och monocyter utgör viktiga cellulära komponenterna i det medfödda immunförsvaret i blodet 1,2. De bidrar till den primära försvaret mot patogener liksom till aktiveringen av det förvärvade immunsystemet och initiering av ett systemiskt inflammatoriskt svar 2-4. Ändå speciellt neutrofiler, den vanligast förekommande typen av granulocyter och monocyter också bidra avsevärt till regleringen och uppsägning av akuta inflammatoriska händelser 5. Därför dessa celler kan också spela en viktig roll vid kroniska inflammatoriska sjukdomar som reumatoid artrit 6,7. I själva verket, astma, en kronisk inflammatorisk luftvägssjukdom, kännetecknas av en försämrad apoptos av eosinofiler, den näst mest granulocyt typ i blodet 8. Ändå apoptos av granulocyter och deras snabba avlägsnande av makrofager är två viktiga steg under den cellulära uppsägningav inflammation 9-11.

I de nämnda immunceller två närbesläktade enzymer, nämligen myeloperoxidas (MPO, neutrofiler och monocyter) och eosinofilperoxidas (EPO, eosinofiler) kan hittas 12,13. Dessa heme peroxidaser är klassiskt relaterade till det humorala immunsvaret som de två elektroniskt oxidera (pseudo) halogenider till motsvarande insulinkänning (pseudo) halous syror som är kända för sina bakteriedödande egenskaper 14-16. Under fysiologiska betingelser MPO huvudsakligen bildar klorsyrlighet (HOCl) och hypothiocyanite (- OSCN) medan den senare och underbromsyrlighet (HOBr) bildas av EPO 17-19. Nya resultat tyder på att denna (pseudo-) halogeneenzymaktivitet också kan bidra till regleringen av inflammatoriska reaktioner och uppsägning av immunreaktioner 20,21. I själva verket var den HOCl produktion av MPO och trävaruprodukter visat sig undertrycka T-cell-baserade adaptiva immunsvar 22-24.

För att få mer insikt i den immunologiska rollen av leukocyter från det medfödda immunförsvaret vid kroniska inflammatoriska sjukdomar och för att bestämma bidraget från MPO och EPO till denna fysiologiska funktion har vi utvecklat en metod för att snabbt berika leukocyter från små blodprover för en efterföljande specifik bestämning av halogenerings peroxidasaktiviteten i dessa celler. För erytrocyt utarmning har vi valt en standardiserad metod inklusive två efterföljande hypotona lys steg med destillerat vatten, vilket leder till en snabb leukocyter anrikning vid låga materialkostnader. För den efterföljande bestämningen av halogene MPO och EPO aktivitet HOCl- och HOBr-specifika färgämnet aminofenyl fluorescein (APF) användes 25-27. I motsats till tillämpningen av ospecifika peroxidas färgningsmetoder 28,29, tillåter denna metod selektiv detektion av halogene peroxidasaktivitet, som ofta försämras vid svår inflammation 30,31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla mänskliga blodprover erhölls från friska frivilliga försökspersoner, och den tillämpade leukocyter anrikning protokollet följer de riktlinjer om etik provision av den medicinska fakulteten vid universitetet i Leipzig. Experimenten med råttblod godkändes av det ansvariga lokala etiska kommittén (Landesdirektion Sachsen, Referat 24), enligt de tyska riktlinjer för djurvård och användning.

1. Försöksinställning

OBS: Som hypotonisk lys förfarandet för utarmning av erytrocyter från blodprover är en tidskritisk förfarande, förbereda all nödvändig utrustning (t.ex. buffertar) för denna del av protokollet i förväg.

  1. Märk ett 15 ml centrifugrör för hypotonisk lys och ett 1,5 ml provrör för efterföljande aminofenyl fluorescein (APF) färgning per blodprov.
    1. Om leukocyter anrikningen kommer att utföras under sterila förhållanden, utföra denna märkning enligt ett flödelåda.
  2. Förbereda ca 12 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 10 mM) per prov. Beroende på om de leukocyter skall isoleras under sterila förhållanden eller inte, förbereda PBS antingen genom att använda steril färdig lösning från en leverantör eller genom att lösa PBS tabletter i destillerat vatten. Kontrollera pH-värdet och, om nödvändigt, justera till pH 7,4 genom att använda små mängder av 0,1 M HCl och NaOH-lösningar.
    1. Lös PBS tabletter (se tabell av material) i 200 ml destillerat vatten för att erhålla en icke-steril buffertlösning tillräcklig för ca 16 prover. Om så önskas, sterilisera denna lösning genom sterilfiltrering.
  3. Förbereda ca 1 ml Hanks balanserade saltlösning (HBSS) med tillsats av Ca 2 + per prov.
    1. Lös 970 mg HBSS salt i 100 ml (slutlig volym) dubbeldestillerat vatten. Innan du fyller upp till den slutliga volymen, kontrollera pH-värdet och justera det till pH 7,4. På grund av sin låga buffertkapacitet, förbereda denna buffert nyligen varje dag end utföra pH-justering med särskild omsorg genom att använda små mängder av 0,1 M HCl och NaOH-lösningar.
      OBS: Steril lösning kan användas, beroende på experimentet. Lösningen kan steriliseras genom sterilfiltrering.
  4. Förutom de två buffertar, etikett och förbereda ett rör (t.ex. 50 ml centrifugrör) eller flaskan (t.ex. 250 ml måttkopp) med dubbeldestillerat vatten för hypotonisk lys proceduren i förväg. Förbered ca 10 ml vatten per prov.
  5. Förbereda en behållare med krossad is för APF-färgning (avsnitt 3), som utförs på is.
  6. Förbered alikvoter av APF i förväg för att göra det möjligt för snabb beredning av arbetslösningar som används under färgning (steg 3,2) och för att undvika upprepat frysning och upptining av APF lösning.
    OBS: APF vanligen erhålles som en 5 mg / ml (11,81 mM) stamlösning i metylacetat.
    1. Frysa alikvoter av 10-100 pl i 0,5 ml rör. För APF färgning av ett slutligtfärgämneskoncentration av 10 pM används (steg 3,8).

2. Hypoton Lys av erytrocyterna

OBS: Utför hypotona lys steg (utom centrifugeringsstegen) under ett laminärt flöde bänk för att undvika kontaminering. Utföra hela förfarandet vid rumstemperatur. Eftersom hypoton lys är en tidskritisk process, justera pipetter för vatten (2 ml) och PBS (5 ml) tillsats i förväg och öppna vatten och PBS kolvar innan proceduren. Lagra PBS-lösningen och destillerat vatten vid rumstemperatur före användning.

  1. Från varje blodprovs överföra 100 l till lämplig 15 ml centrifugrör.
    OBS: I våra experiment blodprov innehåller vanligtvis 10 U / ml heparin för att undvika koagulation. Ännu på grund av olika källor av provmaterialet arten och koncentrationen av anti-koaguleringsmedel kan skilja sig. Dess inflytande på APF färgning bör testas genom jäming resultaten till resultaten från blodprov kompletteras med andra typer eller koncentrationer av antikoagulant.
  2. Tillsätt 2 ml destillerat vatten och blanda proverna med användning av en virvelblandare inställd på en medelhög nivå. Inkubera proverna i 60 sek och tillsätt sedan 5 ml PBS per prov och blanda med hjälp av virvelblandaren.
    OBS: Upp till cirka 5 prover kan framställas parallellt. Håll provet för densamma för tillsats av vatten och PBS för att uppnå jämförbara inkubationstider.
  3. Efter regenerering av isotoniska betingelser genom PBS tillsats (steg 2,2) pelletering av återstående intakta cellerna i alla prover genom centrifugering under 6 minuter vid rumstemperatur och 450 x g.
  4. Avlägsna supernatanten genom att den hälldes i en tabell soptunna. Ta bort så mycket vätska som möjligt genom att vända centrifugrör och gängning öppningen på en pappershandduk. Säkerställa att cellpelleten är så torr som möjligt.
  5. Upprepa hypotonisk lys procedur som beskrivits tidigare (steg 2,2).
    NOTE: I princip är detta hypotonisk lys förfarandet (steg 2,3-2,5) kunde upprepas mer än en gång, beroende på renheten hos det blandade leukocytfraktionen som skall erhållas. Efter två lys steg andelen kvarvarande erytrocyter i den erhållna blandade cellfraktionen är omkring 25%.
  6. Pelletera de kvarvarande intakta celler genom centrifugering under 6 minuter vid rumstemperatur och 450 x g. Avlägsna supernatanten (se steg 2,4). Tillsätt 500 l HBSS till pelleten och försiktigt lösa det tills en homogen lösning erhålles. Överför varje prov till följaktligen märkt 1,5 ml provrör.
  7. Beroende på experimentet analyserar direkt erhållna prover (t.ex., via flödescytometri) 25, fläcken med fluorescensmärkta antikroppar (för identifiering av enskilda celltyper) 32, inkubera med cell stimuli (för cellaktiveringsexperiment) 33 eller lagras på is och användning senare. Beroende på syftet med studien, omedelbart utföra efterföljande experiment påden blandade leukocytfraktionen eftersom granulocyter har en ganska kort halveringstid på ca 20 timmar.
    OBS: Detta gäller även för peroxidasaktiviteten färgning som beskrivs nedan.

3. halogene peroxidasaktivitet färgning

OBS: HOCl- och HOBr-produktion genom de blodhärledda heme peroxidaser MPO och EPO kvantifieras genom att använda APF, som oxideras till fluorescein genom de namngivna hypohalous syror. Därför om cellmärkning med fluorescensmärkta antikroppar utförs i kombination med APF-färgning, undvika fluoroforer som interfererar med emissionssignalen av fluorescein.

  1. Utföra APF färgning vid 4 ° C på is.
  2. För att framställa en fungerande lösning av APF tina en lämplig alikvot av färgämnet (t ex 10 ^, 11,81 mM) och späd med HBSS till exakt 1 mm (t.ex. lägga till 108,1 l buffert till 10 l).
    1. För varje prov (500 pl cell lösning) förbereda 5 μl av den beskrivna APF arbetslösning. Följaktligen använder en 10 ul alikvot av APF (11,81 mM), vilket ger 118,1 pl APF arbetslösning (1 mM) för att framställa cirka 20 prover. På grund av förlusten under pipettering förbereda ca 10% mer APF arbetslösning än beräknat.
  3. För att kontrollera den peroxidas specificiteten hos APF-färgning, förbereda kontrollprover med heme peroxidas inhibitor 4-aminobensoesyrahydrazid (4-Abah) 35.
    1. Bered en 1 M stamlösning av 4-Abah (151,17 g / mol) i dimetylsulfoxid (DMSO) genom att späda 75,6 mg 4-Abah i 500 | j, l lösningsmedel. Ytterligare späda 4-Abah 10/01 i HBSS.
  4. För framställningen av en H 2 O 2 arbetslösn etikett två 1,5 ml centrifugrör med "70 mM H2O 2" och "7 mM H2O 2", respektive.
    1. I röret märkt "70 mM H2O 2", nyligen späda 10 plav en 30% stamlösning (8,8 mM) H2O 2 med användning av 990 | j, l destillerat vatten för att erhålla en koncentration av omkring 88 mM. Förvara på is och använd inom 4 h.
      OBS: H2O 2 typiskt levereras som en 30% stamlösning av leverantörerna. Vid förvaring vid 4 ° C, är den stabil i ca 3 år. Utföra spädningar av H2O 2 i destillerat vatten för att undvika sönderdelning. H 2 O 2 utspädningar kan också framställas i 0,1 M NaOH-lösning.
    2. För bestämning av den exakta H2O 2 koncentration förbereda en ytterligare 1-10 utspädning från den första H2O 2 förrådslösning (cirka 88 mM) genom tillsats av 100 | il från denna lösning till 900 | il destillerat vatten i 1,5 ml rör märkt "7 mM H2O 2".
    3. Spela in ett spektrum i nära UV-området (t.ex. 200-300 nm) med hjälp av en UV-Vis fotospektrometer och använda absorbansen vid 240 nm (49; 240 = 34 M -1 cm -1) för att bestämma den faktiska H2O 2-koncentrationen i den andra H2O 2 förrådslösning 34. Se till att referens kyvetten innehåller endast destillerat vatten. För mätnings användning quartzkuvetter som ett spektrum i UV-området registreras.
    4. Från detta resultat, beräkna de exakta koncentrationerna av båda H2O 2 stamlösningar. Justera koncentrationen av den första stamlösningen i "70 mM H2O 2" provröret för att exakt 70 mM genom att tillsätta en lämplig mängd destillerat vatten. Lagra den erhållna arbetslösning på is och använd inom en timme.
  5. Tillsätt 5 pl av 4-Abah arbetslösning (100 mM) till lämpliga prover för en slutlig koncentration av 1 mM. Inkubera proverna för 15 min vid 37 ° C i inkubatorn innan APF tillsats.
  6. Tillsätt 5 l APF arbetslösning (1 mM) till varje500 | j, l prov för att erhålla en slutlig färgämneskoncentration av 10 ^ M. Blanda proverna försiktigt (t.ex. genom att använda virvelblandaren på en medelinställning) och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C.
  7. Tillsätt 5 | il H2O två arbetslösning (70 mM) till varje 500 | j, l prov för en slutlig koncentration av 700 ^ M. Blanda försiktigt proverna och inkubera dem i 60 min vid 37 ° C. Genomföra lämpliga kontrollmätningar parallellt.
    OBS: Kontrollmätningar visade att 700 ^ M H2O 2 inte är toxiska för cellerna. Inte heller några väsentliga cellulära responser observerades.
    OBS: APF färgning kan också utföras genom att utelämna tillsatsen av H2O 2, beroende på den vetenskapliga fråga. I frånvaro av väteperoxid endast de basala klorerings MPO och EPO-aktivitet bestäms medan tillsatsen av H2O 2 medger detektion av den maximala HOCl och HOBr produktion av cellerna. Than senare innebär en betydligt högre fluorescenssignal.
  8. För pelletering av cellerna, centrifugera proverna i 10 min vid rumstemperatur och 400 x g. Noggrant avlägsna supernatanten utan att förstöra pelleten och tillsätt 250 l HBSS att resuspendera cellerna.
    OBS: Proverna är nu klara för analys via flödescytometri 25.
  9. Förvara proverna i mörker tills analysen för att undvika blekning. Efter excitation vid 480-490 nm upptäcka utsläpp av fluorescein vid ca 525 nm 37.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som tidigare rapporterats den metod som beskrivs ovan visade sig vara tillämpliga på både mänskliga och icke-mänskliga material 32. Dessutom, såsom visas för möss med astmatiska symtom APF färgning kan vara ett lämpligt verktyg för att detektera skillnader i den systemiska pro-inflammatorisk status. Därför i en efterföljande studie har vi använt detta protokoll för att upprepade gånger utvärdera halogene aktiviteten hos MPO (och EPO) i kvinnlig mörk Agouti råttor med pristan-inducerad artrit (PIA). Ett representativt exempel på leukocyt anrikning och infärgning som utförts under detta experiment visas i Figur 1. Cirka 200 | al helblod erhölls från retrobulbär venus plexus av djuret under anestesi och hepariniserat. Erytrocyten utarmning och en efterföljande APF-färgning utfördes med användning av 100 ^ il prowolym. Efteråt behandlades provet analyserades med flödescytometri.

(Figur 1A), en stark utarmning av erytrocyterna från provet uppnåddes. Dessutom olika leukocyttyper var tydligt urskiljbar, vilken identifierades genom att tillämpa fluorescensmärkta cellytemarkörer (ej visad). I korthet endast erytrocyter (CD235a-positiv) / celldebris stod för 22% av händelserna, medan ca 48% av händelserna identifierades som CD16-positiva neutrofiler. Vidare 3% av de händelser varje identifierad som CCR3-positiva eosinofiler och CD14-positiva monocyter och ca 19% av händelserna stod för CD5 / CD19-positiva B och T-lymfocyter, respektive. Intensitetsfördelningen av APF-härledda fluorescens (Figur 1B) klart tillät diskriminering av peroxidas-negativa erytrocyter och lymfocyter medan monocyter och eosinofiler ledde till en måttlig APF oxidation och neutrofiler var starkt peroxidas-positiv under lmosen experimentella förhållanden. Dessa resultat är i linje med den höga överflöd av MPO i de senare celler jämfört med enzymkoncentrationen i monocyter 20. Den relativt svaga responsen hos eosinofiler kan förklaras av det faktum, att ingen bromid tillsattes, vilken kan ha föranlett den EPO-deriverade bildningen av HOBr. Preliminära studier på isolerade eosinofiler överraskande inte visade ett stort inflytande av externt tillsatt bromid på APF oxidation av dessa celler. Ändå oxidation av APF av eosinofiler observerades vilket kan förklaras av införandet av små mängder av Br - via buffertlösningar som används (PBS och HBSS). Alternativt EPO kan också producera små mängder av HOCl, åtminstone under sura förhållanden (t.ex. i phagolysosomes).

Figur 1
Figur 1: Leukocyte anrikning och APF-härledad fluorescens i ett blodmikro prov från en råtta. En mängd av ca 200 | j, l helblod erhölls från retrobulbär venus plexus av en kvinnlig mörk Agouti råtta. Efter applicering av den beskrivna hemolys förfarande till 100 | il blod och en efterföljande APF färgning av blandad cell fraktion analyserades med flödescytometri. Såsom framgår av den FSC / SSC- Plot (A) erytrocyterna var starkt utarmad från provet och de olika leukocyttyper kunde lätt urskiljas. Fördelningen av APF-härledda fluorescensintensitet (B) visade tydligt hem peroxidas-negativa celler (erytrocyter och lymfocyter) samt leukocyter med måttliga (eosinofiler och monocyter) eller starka (neutrofiler) halogene peroxidasaktivitet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eftersom neutrofiler är de mest förekommande leukocyter i blod isoleringen av peroxidas-positiva celler fokuserar ofta bara på dessa celler och innefattar en separation av neutrofiler från andra leukocyter genom densitetsgradientcentrifugering 38. Men när neutrofiler är mycket mindre rikligt förekommande i murina blodprov 39 för de senare mer komplicerade metoder måste användas 40. Dessutom också båda metoderna leder till avlägsnandet av peroxidas-positiva monocyter från proverna och, på grund av behovet av större volymer blod (t.ex. 400 ul 41), inte är tillämpliga på mikro prover erhållna under återkommande blodprov från små försöksdjur 38,40. Reningen av murina neutrofiler från peritonealexudat måste också offrandet av djuren och dessutom inte ger blodbaserade granulocyter 38,40. Nyligen utvecklat metoder för att få högt renade granulocyter fraktioner från mus blood (t.ex. tillämpning av antikroppar) är ofta dyra, komplicerade och tidskrävande 40,42,43 och återigen bara fokusera på rening av en peroxidas-positiva leukocyter typ.

Sålunda den metod som presenteras här har ett par fördelar jämfört med andra metoder som används för rening av peroxidas-positiva leukocyter. Eftersom den är baserad på små blodprov de erhållna celler representerar situationen i cirkulationen. Grund av den lilla initiala provvolymen som behövs för det protokoll metoden är tillämpbar för både mänskliga och icke-humant blod, trots de artspecifika skillnader i överflödet av neutrofiler. I själva verket var vi även kunna tillämpa den beskrivna metoden initial blodvolym så liten som 50 ^ (data ej visade). Den litet blodprov som behövs för metoden gör det också lämpar sig för upprepad avlägsnande av blod från små laboratoriedjur eller för speciella medicinska tillämpningar (t.ex. nyfödda diagnos). som than leukocyt anrikning är baserad på utarmning av erytrocyterna alla peroxidas-positiva celler (neutrofiler, eosinofiler, monocyter) ingår i den erhållna blandade leukocytfraktionen och separat kan analyseras genom användning av flödescytometri. Metoden är snabb, pålitlig och har låga krav på kemikalier och instrumentering, vilket gör protokollet lämpligt för flera vetenskapliga miljöer.

Som neutrofiler lätt aktiveras ett kritiskt steg under den beskrivna metoden är den exakta justeringen av pH-värdet i buffertlösningar som används (PBS och HBSS, se steg 1.2 och 1.3 i protokollet avsnitt). Dessutom inkubationstiden av blodcellerna med destillerat vatten bör inte vara längre än 60 sekunder innan du åter normosmotic förhållanden (se steg 2,2 i protokollet sektionen. Den (nästan) helt avlägsnande av lösningsmedel från cellpelleten (steg 2,4) före tillsatsen vatten för andra hypoton lys är ett kritiskt steg som buffER-rester kommer att minska effektiviteten för hypotonisk lys förfarandet. En annan avgörande steg avser tillämpningen av H2O 2 under APF färgning. Även den applicerade mängden inte vara cytotoxiska, bör cell vitalitet kontrolleras. Under våra studier använder vi typiskt färgämnet 5,5 ', 6,6'-tetraklor-1,1', 3,3'-tetraethylbenzimi-dazolylcarbocyanine jodid (JC-1) för detektering av tidiga apoptotiska händelser.

Dessutom finns det ett par begränsningar i den beskrivna förenklade leukocyter anrikningsmetod. Medan tekniken kan tillämpas på blodprover från flera arter (människa, råtta och mus har provats), leukocyt belopp som erhålls efter lys av erytrocyter beroende på deras initiala överflöd i blodet. Den senare varierar förvisso mellan olika arter 39 och är också beroende av den inflammatoriska tillståndet i den avkända individen. Dessutom, medan den lyseringsförfarandet kan göras med upp till enhundra prover parallellt mellancentrifugeringsstegen utgör en begränsning som, beroende på centrifugen används endast upp 30 prover kan behandlas parallellt. Vidare gäller att trots APF detekterar lätt HOCl och HOBr i närvaro av SCN -, halogene aktiviteten av MPO och EPO påverkar också till den senare pseudo-halid. Därigenom hypothiocyanite (- OSCN) bildas, vilken är oförmögen att oxidera APF. En annan begränsning kommer från egenskaperna hos APF färgämne som används för bestämning av HOCl- och HOBr-produktion av MPO och EPO. Som färgämnet oxideras till fluorescein, kan färgningen inte kombineras med fluorescerande antikroppar med ett emissionsspektrum i samma intervall. Naturligtvis eventuella störningar mellan APF-härledda fluorescens och signalen ytterligare fluorescerande signaler måste kontrolleras och kompenseras för i flödescytometern.

Annars, om detekteringen av halogenerings peroxidasaktivitet är inte omfattningen av denstudera, efter applicering av erytrocyter utarmning metod andra analysmetoder kan användas i stället för APF. Som beskrivits hypotonisk lys förfarande leder endast till en partiell utarmning av erytrocyter och som alla leukocyter är fortfarande närvarande i den erhållna blandade cellfraktionen, endast metoder som tillåter en enda cell analys bör tillämpas. Metoder som innefattar lys av celler (t.ex. Western tomt analys) kommer inte att ge tillförlitliga resultat. Den lilla inledande provvolymen kan vara ett annat hinder för sådana analysmetoder.

När det gäller utredningen av MPO (och EPO) aktivitet i leukocyter ofta bara den allmänna oxidationsmedel produktion av cellerna riktar i stället för specifikt utvärdera hem peroxidasaktivitet 44,45. Dessutom ofta inga försök görs för att skilja mellan halogenerings och peroxidasaktiviteten av MPO och EPO 46,47. Metoder, som specifikt inriktade på klorering MPO aktivitet genom quantifying HOCl-framställda produkter som klortyrosin inte detektera över oxiderade och / eller metaboliseras produkter och därmed ofta leder till en underskattning av den verkliga HOCl-produktion 48. Dessutom kommer denna metod samt detektion av HOCl-derived 2-chloroethidium är också tidskrävande, behöver kostsam analysutrustning och innefattar lys av celler 48-50 .Det finns många rapporter om nya färgämnen för specifik bestämning av klorerings MPO-aktivitet inom vitala celler 44,51,52. Ändå hittills endast APF och dess närstående förening hydroxifenyl fluorescein (HPF) är kommersiellt tillgängliga och därför rutinmässigt används i forskning 25,33.

I själva verket, genom att använda APF vi kunde visa att klorering MPO-aktivitet inte bara kan kvantifieras genom att använda det isolerade enzymet 53 utan också genom att anbringa färgämnet till levande celler 26,33. Således genom att kombinera snabb leukocyter anrikningen från blodmikroprover som anges ovan med enn APF färgning vi utvecklat ett protokoll, som är lämplig för att specifikt och samtidigt ta itu med halogene aktiviteten hos MPO och EPO i alla peroxidas positiva leukocyter, dvs neutrofiler, monocyter och eosinofiler 32. Dessutom metoden inte kräver cellys, vilket möjliggör en bred variation av analytiska metoder, inklusive flödescytometri och konfokal fluorescensmikroskopi. Dessutom kommer denna peroxidasaktiviteten färgning kan kombineras med tillämpningen av cellytemarkörer, som tillåter specifik analys av leukocyt sub-fraktioner, beroende på den vetenskapliga uppgiften. Men det måste beaktas att de pålagda fluorescensmärkta antikroppar som inte interfererar med fluorescein-baserade fluorescenssignal som används för att kvantifiera HOCl- och HOBr-härledda APF oxidation.

Sammanfattningsvis denna metod kan ge ett nytt verktyg för att få mer insikt i den fysiologiska rollen av halogene peroxidasaktiviteten av den immunologiska relevant blodhärledda peroxidaser MPO och EPO, som fortfarande inte är väl förstådd 8,20,23. Dessutom i en djurstudie på reumatoid artrit vi kunde nyligen konstatera att detta protokoll kan leda till en utvärdering av MPO-härledda HOCl produktion som en ny klinisk markör vid kroniska inflammatoriska sjukdomar (opublicerade data).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials/Equipment
15 ml centrifugation tubes VWR/Corning 734-0451 -
1.5 ml sample tubes VWR/Eppendorf 211-2130DE -
Pipettes for volumes up to 5 ml Eppendorf e.g., 3120000070 We are using Eppendorf Resarch plus pipettes with adjustable volumes in the range 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl an 500-5,000 µl
laminar flow bench Thermo Electron Corperation HeraSafe -
Vortex mixer Bender & Hobein AG Vortex Genie 2 -
Tabletop centrifuge Kendro Laboratory Products Laborfuge 400R The centrifuge should be able to be used at 450 x g
Small centrifuge Eppendorf 5415D The centrifuge should be able to be used at 400 x g
Incubator Heraeus cytoperm 2 Settings: 37 °C, 95% humidity, 5% CO2 content
UV-Vis spectrophotometer Varian Cary 50 bio A spectrum between 200 and 300 nm has to be recorded. Thus quartz cuvettes have to be applied
Flow cytometer Becton, Dickinson BD Facs Calibur Any flow cytometer can be used which is equiped with a laser suitable for the excitation of fluorescein (e.g., 488 nm argon laser)
Name Company Catalog Number Comments
Chemicals
Phosphate buffered saline (PBS) amresco K812 sterile solution, ready to use
Phosphate buffered saline (PBS) Sigma-Aldrich P4417 tablets for solving in 200 ml millipore water
Hanks balanced salt solution (HBSS) with Ca2+ Sigma-Aldrich H1387 970 mg/100 ml, carefully check and adjust the pH value to 7.4
Hydrochloric acid Merck Millipore 1.09057.1000 1 M solution
Sodium hydroxide Riedel-deHaën 30620 Solid pellets. For a 1 M solution solve 4 g/100 ml Millipore water
Aminophenyl fluorescein Cayman 10157 5 mg/ml solution (11.81 mM) in methyl acetate, aliquots (e.g. 100 µl) should be prepared and stored at -20 °C
Hydrogen peroxide Sigma-Aldrich H1009 This 30% stock solution corresponds to a concentration of about 8.8 M. Further dilutions have to be freshly prepared in distilled water immediately prior to use and quantified by absorbance measurements
4-aminobenzoic acid hydrazide (4-ABAH) Sigma-Aldrich A41909 A first stock solution of 1 M should be prepared in DMSO a second one of 100 mM by 1:10 dilution in HBSS
DMSO VWR chemicals 23500.26 -

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cline, M. J. Monocytes, macrophages, and their diseases in man. J Invest Dermatol. 71 (1), 56-58 (1978).
  2. Wright, H. L., Moots, R. J., Bucknall, R. C., Edwards, S. W. Neutrophil function in inflammation and inflammatory diseases. Rheumatology. 49, 1618-1631 (2010).
  3. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
  4. Ishihara, K., Yamaguchi, Y., Okabe, K., Ogawa, M. Neutrophil elastase enhances macrophage production of chemokines in receptor-mediated reaction. Res Commun Mol Pathol Pharmacol. 103 (2), 139-147 (1999).
  5. Henson, P. M. Resolution of inflammation. A perspective. Chest. 99 (3 Suppl), 2S-6S (1991).
  6. Lefkowitz, D. L., Lefkowitz, S. S. Macrophage-neutrophil interaction: a paradigm for chronic inflammation revisited. Immunol Cell Biol. 79 (5), 502-506 (2001).
  7. Wright, H. L., Moots, R. J., Edwards, S. W. The multifactorial role of neutrophils in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (10), 593-601 (2014).
  8. Kankaanranta, H., et al. Delayed eosinophil apoptosis in asthma. J Allergy Clin Immunol. 106 (1 Pt 1), 77-83 (2000).
  9. Peng, S. L. Neutrophil apoptosis in autoimmunity. J Mol Med. 84 (2), 122-125 (2006).
  10. Simon, H. U. Neutrophil apoptosis pathways and their modifications in inflammation. Immunol Rev. 193, 101-110 (2003).
  11. Vandivier, R. W., Henson, P. M., Douglas, I. S. Burying the dead: the impact of failed apoptotic cell removal (efferocytosis) on chronic inflammatory lung disease. Chest. 129 (6), 1673-1682 (2006).
  12. Loughran, N. B., O'Connor, B., O'Fagain, C., O'Connell, M. J. The phylogeny of the mammalian heme peroxidases and the evolution of their diverse functions. BMC Evol Biol. 8, 101-115 (2008).
  13. Zámocký, M., Obinger, C. Ch. 2. Biocatalysis based on heme peroxidases. Torres, E., Ayala, E. M. , Springer. 7-35 (2010).
  14. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J Bacteriol. 95 (6), 2131-2138 (1968).
  15. Klebanoff, S. J. Myeloperoxidase: friend and foe. J Leukoc Biol. 77 (5), 598-625 (2005).
  16. Wang, J., Slungaard, A. Role of eosinophil peroxidase in host defense and disease pathology. Arch Biochem Biophys. 445 (2), 256-260 (2006).
  17. Arnhold, J., Furtmuller, P. G., Regelsberger, G., Obinger, C. Redox properties of the couple compound I/native enzyme of myeloperoxidase and eosinophil peroxidase. Eur J Biochem. 268 (19), 5142-5148 (2001).
  18. Bafort, F., Parisi, O., Perraudin, J. P., Jijakli, M. H. Mode of action of lactoperoxidase as related to its antimicrobial activity: a review. Enzyme Res. , 1-13 (2014).
  19. van Dalen, C. J., Whitehouse, M. W., Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Thiocyanate and chloride as competing substrates for myeloperoxidase. Biochem J. 327 (Pt 2), 487-492 (1997).
  20. Arnhold, J., Flemmig, J. Human myeloperoxidase in innate and acquired immunity. Arch Biochem Biophys. 500 (1), 92-106 (2010).
  21. Flemmig, J., Lessig, J., Reibetanz, U., Dautel, P., Arnhold, J. Non-vital polymorphonuclear leukocytes express myeloperoxidase on their surface. Cell Physiol Biochem. 21 (4), 287-296 (2008).
  22. Odobasic, D., Kitching, A. R., Semple, T. J., Holdsworth, S. R. Endogenous myeloperoxidase promotes neutrophil-mediated renal injury, but attenuates T cell immunity inducing crescentic glomerulonephritis. J Am Soc Nephrol. 18 (3), 760-770 (2007).
  23. Odobasic, D., et al. Neutrophil myeloperoxidase regulates T-cell-driven tissue inflammation in mice by inhibiting dendritic cell function. Blood. 121 (20), 4195-4204 (2013).
  24. Ogino, T., et al. Oxidative modification of IkappaB by monochloramine inhibits tumor necrosis factor alpha-induced NF-kappaB activation. Biochim Biophys Acta. 1746 (2), 135-142 (2005).
  25. Flemmig, J., Remmler, J., Zschaler, J., Arnhold, J. Detection of the halogenating activity of heme peroxidases in leukocytes by aminophenyl fluorescein. Free Radic Res. 49 (6), 768-776 (2015).
  26. Flemmig, J., Zschaler, J., Remmler, J., Arnhold, J. The fluorescein-derived dye aminophenyl fluorescein is a suitable tool to detect hypobromous acid (HOBr)-producing activity in eosinophils. J Biol Chem. 287 (33), 27913-27923 (2012).
  27. Setsukinai, K., Urano, Y., Kakinuma, K., Majima, H. J., Nagano, T. Development of novel fluorescence probes that can reliably detect reactive oxygen species and distinguish specific species. J Biol Chem. 278 (5), 3170-3175 (2003).
  28. Presentey, B., Szapiro, L. Heriditary deficiency of peroxidase and phospholipids in eosinophil granulocytes. Acta Haematol. 41, 359-362 (1969).
  29. Undritz, E. The Alius-Grignaschi anomaly: the hereditary constitutional peroxidase defect of the neutrophils and monocytes. Blut. 14 (3), 129-136 (1966).
  30. Kutter, D. Prevalence of myeloperoxidase deficiency: population studies using Bayer-Technicon automated hematology. J Mol Med.(Berl). 76 (10), 669-675 (1998).
  31. Lanza, F. Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J Mol Med. 76 (10), 676-681 (1998).
  32. Flemmig, J., et al. Rapid and reliable determination of the halogenating peroxidase activity in blood samples. J Immunol Methods. 415, 46-56 (2014).
  33. Flemmig, J., Remmler, J., Rohring, F., Arnhold, J. (-)-Epicatechin regenerates the chlorinating activity of myeloperoxidase in vitro and in neutrophil granulocytes. J Inorg Biochem. 130, 84-91 (2014).
  34. Beers, R. F., Sizer, I. W. A spectrophotometric method for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase. J Biol Chem. 195 (1), 133-140 (1952).
  35. Kettle, A. J., Gedye, C. A., Winterbourn, C. C. Mechanism of inactivation of myeloperoxidase by 4-aminobenzoic acid hydrazide. Biochem J. 321 (2), 503-508 (1997).
  36. Nakazato, T., et al. Myeloperoxidase is a key regulator of oxidative stress mediated apoptosis in myeloid leukemic cells. Clin Cancer Res. 13 (18), 5436-5445 (2007).
  37. Machwe, M. K. Effect of concentration on fluorescence spectrum of fluorescein. Curr Sci. 39 (18), 412-413 (1970).
  38. Hu, Y. Ch. 7. Leucocytes: Methods and Protocols. Ashman, R. B. , Methods in Molecular Biology. Springer. 101-113 (2012).
  39. Zschaler, J., Schlorke, D., Arnhold, J. Differences in innate immune response between man and mouse. Crit Rev Immunol. 34 (5), 433-454 (2014).
  40. Hasenberg, M., et al. Rapid immunomagnetic negative enrichment of neutrophil granulocytes from murine bone marrow for functional studies in vitro and in vivo. PLoS One. 6 (2), e17314 (2011).
  41. Mendez-David, I., et al. A method for biomarker measurements in peripheral blood mononuclear cells isolated from anxious and depressed mice: beta-arrestin 1 protein levels in depression and treatment. Front Pharmacol. 4 (124), 1-8 (2013).
  42. Cotter, M. J., Norman, K. E., Hellewell, P. G., Ridger, V. C. A novel method for isolation of neutrophils from murine blood using negative immunomagnetic separation. Am J Pathol. 159 (2), 473-481 (2001).
  43. Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J Leukoc Biol. 94 (1), 193-202 (2013).
  44. Freitas, M., Lima, J. L., Fernandes, E. Optical probes for detection and quantification of neutrophils' oxidative burst. A review. Anal Chim Acta. 649 (1), 8-23 (2009).
  45. Winterbourn, C. C. The challenges of using fluorescent probes to detect and quantify specific reactive oxygen species in living cells. Biochim Biophys Acta. 1840 (2), 730-738 (2014).
  46. Kusenbach, G., Rister, M. Myeloperoxidase deficiency as a cause of recurrent infections. Klin Padiatr. 197 (5), 443-445 (1985).
  47. Zipfel, M., Carmine, T. C., Gerber, C., Niethammer, D., Bruchelt, G. Evidence for the activation of myeloperoxidase by f-Meth-Leu-Phe prior to its release from neutrophil granulocytes. Biochem Biophys Res Commun. 232 (1), 209-212 (1997).
  48. Whiteman, M., Spencer, J. P. Loss of 3-chlorotyrosine by inflammatory oxidants: implications for the use of 3-chlorotyrosine as a bio-marker in vivo. Biochem Biophys Res Commun. 371 (1), 50-53 (2008).
  49. Gerber, C. E., Kuci, S., Zipfel, M., Niethammer, D., Bruchelt, G. Phagocytic activity and oxidative burst of granulocytes in persons with myeloperoxidase deficiency. Eur J Clin Chem Clin Biochem. 34 (11), 901-908 (1996).
  50. Maghzal, G. J., et al. Assessment of myeloperoxidase activity by the conversion of hydroethidine to 2-chloroethidium. J Biol Chem. 289 (9), 5580-5595 (2014).
  51. Shepherd, J., et al. A fluorescent probe for the detection of myeloperoxidase activity in atherosclerosis-associated macrophages. Chem Biol. 14 (11), 1221-1231 (2007).
  52. Sun, Z. -N., Liu, F. -Q., Chen, Y., Tam, P. K. H., Yang, D. A highly specific BODIPY-based fluorescent probe for the detection of hypochlorous acid. J Am Chem Soc. 10 (11), 2171-2174 (2008).
  53. Kirchner, T., Flemmig, J., Furtmuller, P. G., Obinger, C., Arnhold, J. (-)Epicatechin enhances the chlorinating activity of human myeloperoxidase. Arch Biochem Biophys. 495 (1), 21-27 (2010).

Tags

Immunologi förberedelse blod leukocyter anrikning myeloperoxidas eosinofilperoxidas klore aktivitet aminofenyl fluorescein
Snabb och särskild bedömning av halogene peroxidasaktiviteten i Leukocyte berikad blodprover
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Flemmig, J., Schwarz, P.,… More

Flemmig, J., Schwarz, P., Bäcker, I., Leichsenring, A., Lange, F., Arnhold, J. Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples. J. Vis. Exp. (113), e54484, doi:10.3791/54484 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter