Summary

Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

Published: September 28, 2016
doi:

Summary

Varios métodos han sido descritos en la literatura para el modelado de la neumonía bacteriana en ratones. En este documento, se describe un método no invasivo, de bajo costo, rápida para inducir neumonía a través de aspiración (es decir, inhalación) de un inóculo bacteriano pipeteó en la orofaringe. métodos aguas abajo para la evaluación de la respuesta inmune innata pulmonar también se detallan.

Abstract

Aunque la neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo un problema importante de salud pública, los modelos murinos de neumonía bacteriana han facilitado recientemente importantes avances preclínicos en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular subyacente. En vivo modelos de ratón capturan la fisiología integrada y capacidad de recuperación de la respuesta de defensa del huésped en de una manera no reveló por enfoques alternativos, simplificados ex vivo. Varios métodos han sido descritos en la literatura para la inoculación intrapulmonar de bacterias en ratones, incluyendo la aerosolización, la administración intranasal, la canulación endotraqueal peroral en condiciones "ciego" y visualizados, y la canulación endotraqueal transcutánea. Todos los métodos tienen ventajas relativas y limitaciones. En este documento, se describe en detalle un método no invasivo, técnicamente no intensiva, barato y rápido para la entrega intratraqueal de bacterias que consiste en la aspiración (es decir, inhalación) por el ratónde un inóculo infeccioso pipeteó en la orofaringe, mientras que bajo anestesia general. Este método se puede utilizar para la administración pulmonar de una amplia variedad de agentes biológicos y químicos no cáusticos, y es relativamente fácil de aprender, incluso para los laboratorios con experiencia previa mínima con procedimientos pulmonares. Además de describir el método de la neumonía por aspiración, también ofrecemos procedimientos paso a paso para ensayar la posterior in vivo la respuesta inmune innata pulmonar del ratón, en particular, los métodos para cuantificar la eliminación de bacterias y la respuesta inmune celular de las vías respiratorias infectadas. Este enfoque integrado y sencillo de evaluación neumonía permite la evaluación rápida y robusta de los efectos de las manipulaciones genéticas y ambientales en la inmunidad innata pulmonar.

Introduction

Neumonía adquirida en la comunidad sigue siendo la causa principal de muerte por infección en los EE.UU., con poco cambio en las tasas de mortalidad en los últimos 40 años a pesar de las mejoras en la vacunación y estrategias de antibióticos 1,2. A pesar de la falta de progresos importantes en el ámbito de la salud pública, en los últimos años dramáticos avances se han hecho en nuestra comprensión de la patogénesis molecular y celular de la neumonía, con muchos de estos avances hechos posibles por el uso de modelos de ratón de infección pulmonar. La trazabilidad genética del ratón, la similitud de la murina y el sistema inmunológico humano, y la gran variedad de reactivos inmunológicos murinos-dirigida que se han convertido en disponible en el mercado en su conjunto han facilitado el rápido progreso del campo.

Los modelos de ratón de la neumonía bacteriana descrita en la literatura en general, se han basado en una de las cuatro rutas técnicas para la inoculación de patógenos: i) aerosolización; ii) intrAnasal entrega; iii) la entrega por vía oral; y iv) la inyección intratraqueal quirúrgico (es decir, traqueotomía) 3. Todas las vías de infección tienen ventajas y desventajas 3. En particular, la exposición, relativa de la vía aérea superior, el potencial para la mezcla de la flora oronasales, los requisitos para la anestesia general, la variabilidad del inóculo entregado al pulmón distal, distribución lobular de los patógenos entregados, los requisitos de pericia técnica, y la morbilidad de procedimiento varían ampliamente entre éstos enfoques.

Comúnmente usadas técnicas de infección perorales incluyen endotraqueal canulación (translaríngea), ya sea a través de un enfoque "a ciegas" (no visualizado), o bajo visualización directa de la laringe 3-5. Ambos métodos, mientras robusto, requieren una formación sustancial y también conllevan un riesgo de traumatismo en la vía aérea superior. En el presente informe se describe un método técnicamente no intensiva, no invasiva, barata y rápida de la infección por vía oral, wdeclara bacterias (Klebsiella pneumoniae en el ejemplo proporcionado) pipetearon en la orofaringe de un ratón anestesiado se entregan a los pulmones a través de aspiración (es decir, la inhalación). Nosotros y otros han utilizado la técnica de la neumonía por aspiración con éxito 6-9. Este método de pulmón de entrega versátil y fácil de aprender puede extenderse a la entrega de muchos agentes no cáusticos adicionales a los pulmones, incluyendo citoquinas y otras proteínas, moléculas asociados a patógenos (por ejemplo, lipopolisacáridos), células (es decir, la transferencia adoptiva), y toxinas (por ejemplo, bleomicina). Además de discutir las consideraciones técnicas importantes, como la descripción de un enfoque integrado, cuantitativo para evaluar la respuesta del huésped después de la neumonía, incluyendo la medición aguas abajo de la eliminación de bacterias (es decir, unidades formadoras de colonias [UFC] cuantificación de los órganos pulmonares y periféricos) y leucocitos acumulación en el espacio aéreo.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y la Política de Servicio de Salud Pública de Estados Unidos sobre la Integridad Personal Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio después de la revisión por el Cuidado de Animales y el empleo del NIEHS. 1. Preparación de K. pneumoniae Cultura Precaución: Realizar todos los pasos del 2 campana (BSL2) nivel de bioseguridad u otra área designada BSL2 y desechar los…

Representative Results

C57BL / 6 ratones fueron infectados con 2000 UFC de K. pneumoniae 43816 (serotipo 2) a través de la aspiración orofaríngea en los pulmones. A esta dosis, los ratones normalmente comienzan a mostrar síntomas clínicos 12-24 horas después de la infección, incluyendo letargo, pelo erizado, y la pérdida de peso del 5-10% (Figura 2). Dentro de 48-72 horas después de la infección, muchos de los ratones muestran síntomas de la enfermedad y la morbilidad que p…

Discussion

Los modelos murinos de neumonía bacteriana, se asociaron con la orientación de genes y en las intervenciones biológicas y farmacológicas in vivo, han proporcionado una perspectiva crítica en la respuesta de defensa del huésped pulmonar. Grandes avances se han hecho en particular en nuestra comprensión de las quimiocinas y moléculas de adhesión que rigen el reclutamiento de neutrófilos al espacio aéreo infectada 10,11. En modelos in vivo de neumonía, a diferencia…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported in part by the Intramural Research Program of the National Institutes of Health, National Institute of Environmental Health Sciences (Z01 ES102005).

Materials

Klebsiella pneumoniae, serotype 2 ATCC 43816
Tryptic soy broth Becton Dickenson 211825
Excel Safelet IV Catheters, 18G x 1 1/4" Claflin Medical Equipment MEDC-031122
Hema 3 Solution 1 Fisher 23-122-937
Hema 3 Solution 2 Fisher 23-122-952
Hema 3 Fixative Fisher 23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes Fisher 14-826-87
Lithium heparin plasma collectors Fisher 2675187
L-shaped disposable spreaders Lab Scientific DSC
1x PBS, pH 7.4 prepared in-house n/a Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)   
ACK lysis buffer prepared in-house n/a NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4

References

  1. Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358 (7), 716-727 (2008).
  2. Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183 (2), 157-164 (2011).
  3. Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (3), L387-L398 (2008).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
  6. Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14 (3), 275-281 (2008).
  7. Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35 (6), 997-1009 (2011).
  8. Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182 (3), 404-412 (2010).
  9. Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191 (10), 5153-5159 (2013).
  10. Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14 (2), 123-132 (2002).
  11. Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43 (1), 5-16 (2010).
  12. Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122 (5), 1758-1763 (2012).
  13. Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8 (3), 559-571 (2015).
  14. Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210 (5), 891-904 (2013).
  15. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11 (1), 13-33 (1976).
  16. Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177 (1), 621-630 (2006).
  17. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139 (3), 485-498 (2009).
  18. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336 (6086), 1268-1273 (2012).

Play Video

Cite This Article
Madenspacher, J. H., Fessler, M. B. A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54508, doi:10.3791/54508 (2016).

View Video