Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

En ikke-invasiv og Teknisk Ikke-intensive Metode til induktion og fænotype for Eksperimentel bakteriel lungebetændelse i mus

doi: 10.3791/54508 Published: September 28, 2016

Summary

Adskillige fremgangsmåder er blevet beskrevet i litteraturen til modellering bakteriel lungebetændelse i mus. Heri beskriver vi en ikke-invasiv, billig, hurtig metode til induktion lungebetændelse via aspiration (dvs. inhalation) af et bakterielt podestof pipetteret ind i oropharynx. Downstream metoder til vurdering af pulmonal medfødte immunforsvar er også detaljeret.

Abstract

Selvom community-erhvervet pneumoni er fortsat et stort problem for folkesundheden, har murine modeller af bakteriel lungebetændelse nylig lettet betydelige prækliniske fremskridt i vores forståelse af den underliggende cellulære og molekylære patogenese. In vivo musemodeller fange integrerede fysiologi og modstandskraft værtens forsvar reaktion i en måde, som ikke afsløret af alternative, forenklede ex vivo metoder. Adskillige fremgangsmåder er blevet beskrevet i litteraturen til intrapulmonal inokulering af bakterier i mus, herunder aerosolisering, intranasal levering, peroral endotrachealt kanyle under 'blind' og visualiseret betingelser, og transkutan endotracheal kanyle. Alle metoder har relative fordele og begrænsninger. Heri beskriver vi detaljeret en non-invasiv, teknisk ikke-intensive, billig og hurtig fremgangsmåde til intratrakeal levering af bakterier, der involverer aspiration (dvs. inhalation) af musenaf en infektiøs inokulum pipetteret i oropharynx, mens under generel anæstesi. Denne metode kan anvendes til pulmonal fremføring af en lang række ikke-ætsende biologiske og kemiske stoffer, og det er relativt let at lære, selv for laboratorier med minimal forudgående erfaring med pulmonale procedurer. Ud over at beskrive aspirationspneumoni metode, vi også give trin-for-trin procedurer til analyse af efterfølgende in vivo pulmonal medfødte immunreaktion af musen, navnlig fremgangsmåder til kvantificering bakterieclearance og det cellulære immunrespons af den inficerede luftvej. Denne integrerede og enkel tilgang til lungebetændelse vurdering tillader hurtig og robust evaluering af effekten af ​​genetiske og miljømæssige manipulationer ved pulmonal medfødte immunitet.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Pneumoni fortsat den hyppigste dødsårsag fra infektion i USA, med lidt samlede ændring i dødelighed i løbet af de sidste 40 år på trods af forbedringer i vaccination og antibiotika strategier 1,2. På trods af den manglende mærkbare fremskridt på det offentlige sundhed niveau, i de seneste år er blevet gjort dramatiske fremskridt i vores forståelse af den molekylære og cellulære patogenese lungebetændelse, med mange af disse fremskridt gjort mulig ved brug af musemodeller af lungeinfektion. Den genetiske sporbarhed af musen, har ligheden af ​​murine og humane immunforsvar, og det enorme opbud af murine målrettet immunologiske reagenser, er blevet kommercielt tilgængelige sammen lettet hurtige fremskridt af feltet.

Musemodeller for bakteriel lungebetændelse beskrevet i litteraturen har generelt påberåbes en af ​​fire tekniske ruter for patogen podning: i) aerosolisering; ii) intranasal levering; iii) peroral levering; og iv) kirurgisk intratracheal injektion (dvs. tracheotomi) 3. Alle smitteveje har fordele og ulemper 3. Især relative eksponering af den øvre luftvej, potentiale for iblanding af oronasal flora, krav til generel anæstesi, variabilitet af inoculum leveret til den distale lunge, lobar fordeling af de leverede patogener, tekniske krav ekspertise, og proceduremæssige sygelighed varierer meget i disse tilgange.

Almindeligt anvendte perorale infektion teknikker omfatter endotracheal (translaryngeal) kanylering via enten en "blind" (ikke-visualiseret) tilgang, eller i direkte larynx visualisering 3-5. Begge metoder, mens robust, kræve betydelige uddannelse og også bære risikoen for traumer til de øvre luftveje. I nærværende rapport beskriver vi en teknisk ikke-intensive, non-invasiv, billig og hurtig metode til peroral infektion, wret bakterier (Klebsiella pneumoniae i eksemplet billede) afpipetteret i oropharynx af en bedøvet mus leveres til lungerne via aspiration (dvs. inhalation). Vi og andre har brugt aspirationspneumoni teknik held 6-9. Denne alsidige og let lært lunge-levering metode kan udvides til levering af mange yderligere ikke-ætsende midler til lungerne, herunder cytokiner og andre proteiner, patogen-associerede molekyler (fx lipopolysaccharid), celler (dvs. adoptiv overførsel), og toksiner (fx bleomycin). Ud over at drøfte vigtige tekniske overvejelser, beskriver vi også en integreret, kvantitativ tilgang til vurdering af efterfølgende vært reaktion på lungebetændelse, herunder nedstrøms måling af bakteriel clearance (dvs. kolonidannende enhed [CFU] kvantificering i lunge- og perifere organer) og leukocyt ophobning i luftrummet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med dyreværnsloven US Public Health Service Policy på Humane Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, og efter gennemgang af Animal Care og brug Udvalg NIEHS.

1. Fremstilling af K. pneumoniae Kultur

Forsigtig: Udfør alle trin i et bio-niveau 2 (BSL2) hætte eller andet BSL2 udpegede område og kassere affald pr institut BSL2 retningslinjer.

  1. For ophængning vækst af K. pneumoniae, tø en glycerol lager af bakterier og pode en arbejdskultur ved at overføre 1 ml K. pneumoniae lager til 50 ml tryptisk bouillon (TSB) i en 500 ml eller større kolbe.
  2. Gør glycerolstamopløsninger ved tilsætning 900 pi dyrket log-fase K. pneumoniae til 100 pi steril glycerol og frysning ved -20 ° C eller -80 ° C. For langtidsopbevaring, er -80 ° C anbefales.
  3. Kultur bakterier fra sTEP 1.1 ved at ryste kolben natten over (14 - 18 timer) ved 37 ° C ved 200-225 rpm.In for at fremme den logaritmiske vækstfase, fortyndes 1-5 ml af denne overnatskultur i en kolbe indeholdende 50 ml TSB om morgenen og placere tilbage ved 37 ° C under omrystning i ~ 2,5 timer.
  4. Overfør 1 ml K. pneumoniae kultur fra det sidste trin i et 1,5 ml rør og centrifugering ved 7500 xg i 2 min. En hvid pellet skal være synlig. Fjern supernatanten uden at forstyrre pellet, forsigtigt resuspenderes bakterier med pipette i 1 ml sterilt saltvand, og spin igen ved 7500 xg i 2 min.
    1. Udfør denne vask trin 2x, opdrager den endelige, vasket pellet i 1 ml sterilt saltvand.
  5. Udfør log-wise serielle fortyndinger af denne pæne inokulum. For eksempel tilsættes 400 pi af inokulum i 3,6 ml sterilt saltvand serielt at lave en 10 -1 -10 -9 fortyndingsrække.
  6. Bestem OD 600 af vaskede K. pneumoniae ved at placere 1 ml af1:10 og 1: 100 fortyndinger i engangs kuvetter og måle OD 600, afblænding først med sterilt saltvand. Mål dubletter for at sikre nøjagtigheden. En OD 600 på 1,0 svarer omtrent til 4-7 x 10 8 CFU / ml. Bemærk, at forholdet mellem OD og CFU / ml kan ikke være lineær.
    1. Brug OD600 fra fortyndingerne at beregne koncentrationen af K. pneumoniae, anvendelse af OD: CFU / ml konvertering ovenfor, og factoring i fortyndingen.
  7. Brug K. pneumoniae koncentration til fremstilling af den ønskede inokulum CFU dosis i en <100 pi volumen til levering til mus (se nedenfor).
  8. Også pladen 100 pi 10 -6 -10 -9 fortyndinger og 100 pi sterilt saltvand onto individuelle tryptisk sojaagar (TSA) plader ved stuetemperatur. Der inkuberes ved 37 ° C natten over og optælle bakteriekolonier for at beregne nøjagtige koncentration, som blev anvendt i eksperimentet og at kontrollere for forurening.
    BEMÆRK: Faktisk bakteriel koncentration af endelige inoculum kan være ± 500 CFU / ml, som forudsagt af absorbans. Eksperimentatorer bør ideelt bekræfte OD 600: CFU / ml forhold i pilotundersøgelser før anvendelse in vivo i mus, empirisk justering OD 600: CFU / ml konvertering baseret på deres personlige erfaringer.

2. Murint Intratracheal (det) Aspiration af K. pneumoniae fra oropharynx

  1. Sørg for, at musene er unikt identificeret ved hale mærke, tatovering, eller en anden godkendt identifikator.
  2. Udarbejde dosering inokulum af bakterier ved hjælp af P200 pipette før fjerne mus fra isofluran for at fremskynde proceduren. For de bedste resultater med det aspiration, bruge et volumen på <100 pi for at forhindre overløb. Heri bruge 2000 CFU / 50 pi K. pneumoniae.
  3. Bedøve musene i en klar kammer med isofluran gas (f.eks, 2% isofluran ved strømningshastighed på 1 l / min) eller som pr Institutional retningslinjer. Antallet af mus at bedøve sammen bestemmes af komfort niveau af forsøgslederen, typisk 1-2 ad gangen. Overhold vejrtrækning og bekræft niveau af anæstesi, når dybe vejrtrækninger er synlige og 2-3 sek kan tælles mellem vejrtrækninger.
    BEMÆRK: Hvis der er bekymring om mulige forstyrrende effekter af flygtige (inhaleret) bedøvelsesmidler, kan anæstesi i stedet opnås med intraperitoneal injektion af ketamin / xylazin. Med den ovenfor beskrevne fremgangsmåde, dyb anæstesi varer kun et par min. Hvis mere langvarig anæstesi induceres, bør øjensalve anvendes til at forhindre okulær udtørring.
  4. Når musen er bedøvet, placere den i en semirecumbent liggende stilling, suspenderet af maxillære fortænder fra en elastik spændt ud mellem pinde på en skrå plexiglas bord (figur 1).
  5. Træk forsigtigt muse tungen til siden med et par stumpe ikke-ridged pincet og deponering dosis i mundhulen med en P200 pipette. Udvis stor forsigtighed for at undgå at fremkalde traumer til enten tungen eller oropharynx.
  6. Mens du holder tungen tilbagetrukket, forsigtigt okkludere næsen med en behandsket finger, indtil musen inhalerer. Fortsæt med at dække næsen indtil musen har taget to eller flere inhalationer, og ingen væske er synlig i mundhulen. Dækker næsen med til at sikre, at musen vil indånde bakterier i lungerne, som mus er obligate næse breathers.
  7. Fjern musen fra inokulation bord og vende tilbage til sit bur, at placere musen på ryggen for at forhindre strøelse eller snavs i at blokere næseborene, mens musen er i bedring efter anæstesi.
  8. Når alle mus er blevet doseret, og har vækket fra anæstesi, hus mus i et aflukke / værelse, der kun indeholder mus, der er blevet doseret med K. pneumoniae. Monitor mus dagligt, herunder kropsvægt hvis der går ud over 48 timer efter infektion.
  9. Brug daglige mask og / eller supplerende varme, hvis lade mus til at gå ud over 48time.

3. bronkoalveolærvaskevæsken (BALF) Indsamling og analyse

  1. Afliv mus per institutionelle retningslinier. Her, brug en dødelig injektion af 150 mg / kg natriumpentobarbital eller ækvivalent dosis af kommerciel eutanasi opløsning efterfulgt af forblødning, da dette undgår mulige komplikationer i lungerne forbundet med CO2 inhalation og cervikal dislokation.
  2. Position musen på ryggen, og der steriliseres mus ved sprøjtning pels med 70% ethanol især over brystet og halsområdet.
  3. Foretag en langsgående snit lige under brystbenet, derefter holde brystbenet med pincet, nick membranen, hvilket tillader lunge til at falde tilbage i brysthulen. Skær op gennem brysthulen på hver side af vaskulaturen og derefter op gennem halsen, og udsætter luftrøret.
  4. Som luftrøret er omgivet af langsgående muskler på hver side, omhyggeligt skåret igennem på midten og skubbe væv til siderne, somderved undgår at skære den omgivende vaskulatur, som kunne indføre blod ind i luftrøret. Hvis vaskulaturen er hakker, rense det omkringliggende område med gaze før adgang til luftrør lumen.
  5. Brug kirurgiske saks eller en nål til nick luftrøret omkring ¼ af vejen ned fra hovedet og indsætte en kanyle fastgjort til en 1 ml sprøjte indlæst med 1 ml 1x phosphatpufret saltvand (PBS) kaudalt i trachea. Hvis der anvender mus <8 uger eller hunner, reducere lavaging volumen til 600-800 pi.
  6. Skub volumen i lungerne langsomt, så alle lapper til at puste og træk derefter lydstyrken tilbage ud med sprøjten, gentage 3x. Hvis PBS kommer ud af næseborene kanylen ikke er blevet skubbet tilstrækkeligt langt ind i trachea eller inflation sker for hurtigt. Alternativt, hvis lungerne ikke er oppumpning godt, kanylen er blevet skubbet for langt ind, så trække lidt.
  7. Indsamle blandet vask i et 15 ml rør på is.
  8. Spinluftrummet udskylningsvæske ved 1200 xg i 5 min, indsamle supernatanten i et 1,5 ml rør og nedfryses ved -80 ° C. Efterfølgende bruge supernatanten (dvs. BALF) til måling af protein, cytokiner, og til forskellige andre biokemiske assays. Pelleten repræsenterer celler fra bronchoalveolær plads.
  9. Hvis røde blodlegemer (RBC) er tydelige i cellepelleten baseret på farve, til lysering med 1 ml ACK-lysepuffer i 1 min efterfulgt af tilsætning af 5 ml 1 x PBS standse lysis reaktion og fortynde bufferen. Håndter alle prøver identisk, enten behandlet eller ikke med ACK lysisbuffer.
  10. Spin celler ved 1200 xg i 5 min, dekanter supernatanten, og bringe cellerne op i 1 ml 1x PBS.
  11. Vortex og tæller celler på et hæmocytometer til tælling af totale luftrummet celler.
  12. Baseret på tætheden af ​​celler tilføje ca. 80-150 pi (~ 80 pi for en inficeret mus og ~ 150 for en naiv mus) til et dias kammer på en cytospin centrifuge. Spin celles på objektglas til efterfølgende farvning til bestemmelse differential celle populationer.
  13. Tillad celler til tørre på objektglas natten over. Stain celler med tri-plet (f.eks Hema 3 [se tabel]) ved at dyppe slides 7 gange i fiksativ, 9 gange i pletten 1, og 7 gange i plet 2 (ingen skylninger mellem pletter), og lad den tørre. Efter pletten er tørret, dækglas dias og manuelt tælle differentialer med mikroskop. Generelt er neutrofiler og monocytter / makrofager let skelnes ved deres størrelse og nuklear morfologi.

4. Bestemmelse bakterier i Lunge og perifere væv

  1. Før begyndelsen: forberede udvanding rør med 900 pi 1x PBS til lunge og milt og 90 pi 1x PBS til blod. Label plader til dyrkning bakterier og sat ved stuetemperatur; derfor vil når væv er blevet indsamlet tid minimeres mellem homogenisering og plettering for bakteriel vækst.
    Bemærk: På grund af den heterogene depositiontion af bakterier i lungerne, der kan opstå med aspiration, anbefales det, at individuelle mus anvendes til analyse af enten total luftveje cellularitet eller total (bilateral) lunge bakteriel byrde.
  2. Aflive musen som pr trin 3.1 og efterfølgende opsamle blod fra den venstre ventrikel, anbringelse i et hepariniseret rør for at undgå koagulation. Fjern alle lungelapperne og anbringes i en 15 ml rør indeholdende 5 ml 1 x PBS, efterfulgt af fjernelse af milten og anbringes i 2 ml 1x PBS. Rørene anbringes på is. Vær omhyggelig med at rengøre instrumenter med ethanol mellem hver væv / mus.
  3. Homogenisere vævet på is, fortrinsvis med engangs homogenisatorer, der kan ændres mellem hver prøve. Engangs homogenisator tips kan autoklaveres til genbrug mellem eksperimenter.
  4. Når væv er blevet homogeniseret, udføre serielle fortyndinger og plade. Plate prøver af et givet væv / fortynding i to eksemplarer på en enkelt TSA plade ved at tegne en skillelinje på plastik. Plating og diløsningsstrate- forslag er vist nedenfor (i alle tilfælde er 10 pi prøve spredt på plade) og er baseret på en 24 timer efter infektion obduktion. Hvis der analyseres 48-72 timers prøver, kan være nødvendigt at udpladet på grund af øget bakteriel byrde på senere tidspunkter et større antal fortyndinger.
    1. For Blood - fortynde 1:10 ved at tilføje 10 pi af blod i 90 ul sterilt 1x PBS. Plate pæn og 1:10 fortyndede prøver i to eksemplarer. Når blod er blevet belagt, spinde overskydende blod ved 9.300 xg i 10 min for at ekstrahere plasma til måling af cytokiner og chemokiner.
    2. For Lung - fortyndes 1:10 - 1: 100 ved tilsætning af 100 pi homogeniseret lunge i 900 pi sterilt 1 x PBS serielt. Plate pæn homogenat og alle fortyndinger i to eksemplarer.
    3. For Spleen - fortyndes 1: 10-1: 100 ved tilsætning af 100 pi homogeniseret milt i 900 pi sterilt 1 x PBS serielt. Plade pæn homogenat og begge fortyndinger in duplo.
  5. Tillad spread prøver at tørre kortvarigt. Inverter TSA plader og sted i en statisk 37 ° C inkubator natten over.
  6. Bestemme antallet af koloniserende bakterier ved midling af bakteriekolonier fra begge sider af pladen og fra hver fortynding. Faktor i de indledende fortyndinger af 5 ml for lunge- og 2 ml for milt til bestemmelse af samlet væv CFUer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

C57BL / 6-mus blev inficeret med 2000 CFU af K. pneumoniae 43816 (serotype 2) via svælg optagelse i lungerne. Ved denne dosis mus typisk begynder at vise kliniske symptomer 12-24 timer efter infektion, herunder sløvhed, pjusket pels, og vægttab på 5-10% (figur 2A). Inden 48-72 timer efter infektion, mange af de mus viser symptomer på sygdom og sygelighed, der typisk indledes med et gennemsnit på 20% vægttab og resulterer i hunched stillinger med nedsat aktivitet og nedsat modtagelighed for stimulering. Studier af længere varighed kan kræve en lavere dosis af K. pneumoniae. Infektion med 500 CFU af K. pneumoniae resulterer i mildere sygdom toppede 3-5 d post-infektion, der er karakteriseret ved et vægttab på 10-15% med genvinding og vægtøgning begynder på dag 5-6 (figur 2B). Kropsvægt er ofte prædiktive for overlevelse, med et vægttab på 20% sjældnely forbundet med inddrivelsen.

Den ultimative succes af værtens respons kan bedst angivet med overlevelse undersøgelser, hvor mus overvåges i 10-14 dage, og aflivet (per institutionelt godkendte retningslinjer) for tegn på hendøen, såsom minimal lydhørhed over for taktil stimulation og / eller vægttab > 20%. Overlevelse undersøgelser er ofte mest effektiv, hvis man målrettet mod et inficerende inokulum, der tilnærmer 50% letalitet (dvs. LD50 dosis) i kontrolgruppen (figur 2C). En LD50 dosis muligt at afsløre både relativt forøget og nedsat overlevelse i forsøgsgruppen. Differential overlevelse kan være inoculum-afhængig, så flere infektion doser kan undertiden være nødvendigt at detektere en ændret værtsforsvar fænotype.

Lavere luftvejsinfektion med K. pneumoniae er kendetegnet ved en robust tilstrømning af leukocytes ind i luftvejene. Immun celle optælling og differentiering af farvning af BAL cellepellet demonstrerer en stigning i luftvejs immunceller inden 6 timer efter infektion (figur 3A). Cellularitet toppe efter 24 timer, med neutrofiler er den fremherskende immuncelle i luftvejene (figur 3A-B). Begge køn af C57BL / 6-mus have tilsvarende luftvej leukocytose som reaktion på K. pneumoniae ved 24 timer og 48 timer efter infektion (figur 3C-D).

Bakteriel lungebetændelse inducerer lokal (intrapulmonær) og systemiske proinflammatoriske mediatorer, herunder cytokiner og chemokiner. Lokale cytokin / kemokinniveauer kan detekteres i BALF med en konventionel ELISA eller ved hjælp af en multiplex cytokin system. Cytokiner, herunder IL-6, RANTES, TNFa, G-CSF, og andre er påviseligt ved både 24 timer og 48 timer efter infektion med K. pneumoniae og give indsigt i lung mikromiljø og dets rekruttering af immunceller (figur 4).

Indsamling af lunge, blod og perifere væv (r), såsom milt tillader kvantificering af væv bakteriel belastning, der giver indsigt i både lokale pulmonær clearance af mikrober samt ekstrapulmonal udbredelse af bakterier. Seriefortynding og dyrkning af lungen demonstrerer udvidelse af mikrobiel belastning mellem 24 timer og 48 timer efter infektion (figur 5A). Lignende resultater er anført i blodet og milt (figur 5B - C). Af note, kan en bimodal bakteriebyrden bemærkes i blodet og milt ved 24 timer efter infektion, med nogle mus, der har høj kvalitet bakteriel udbredelse, og andre, selv i lyset af high-grade bakteriebyrden i lungen, viser ingen detekterbare bakterier i blodet eller milten. K. pneumoniae bakterier i C57BL / 6-mus er ikke Gender-specifikke som hanner og hunner have tilsvarende byrde i forskellige væv efter podning (figur 5D-F).

figur 1
Figur 1:. Procedure Board for aspirationspneumoni i mus Undersøgelse mus er placeret, hovedet op og tilbage til bord (dvs. semirecumbent), suspenderet af fortænderne fra en elastik udspændt mellem to pinde monteret på en plexiglas eller lignende plader.

Figur 2
Figur 2: Vurdering af vægttab og sygelighed Efter aspiration af K. pneumoniae. C57BL / 6 mus (N = 10-20 pr betingelse) smittet af aspiration af K. pneumoniae 43816 (serotype 2). (A) Daglige vægte, indekseret til at pre-infektion vægt, fra mus inficeret med 2000 CFU. I denne undersøgelse, ingen mus overlevede forbi dag 6. (B) Infektion med 500 CFU resultater i daglige vægttab gennem dag 4 efter infektion med en overgang til vægtforøgelse begynder ved dag 5. (C) Overlevelseskurver fra 150 CFU, 500 CFU, og 2000 kolonidannende enhed (CFU) infektioner, hvilket indikerer, at 500 CFU tilnærmer LD50. Data i panel A og B er gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3: Infektion med K. pneumoniae Resultater i Time-afhængige Airway Leukocytose. C57BL / 6 mus fik intrapulmonal infektion med 2000 CFU af K. lungebetændelsee. (A) Tælling af totale leukocytter (WBC), neutrofiler (PMN) og makrofager (MO) i luftrummet fluid på forskellige tidspunkter efter infektion. (B) Ved farvning, PMN'er og makrofager kan let identificeres af nukleare morfologi og størrelse i cytospin felter og tælles. (C - D) Infektion hos mænd og kvinder resulterer i et tilsvarende antal rekrutterede inflammatoriske celler ved 24 timer og 48 timer efter infektion. Dataene stammer 6-25 / mus pr stand og er gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Cytokiner og chemokiner induceres i luftrummet i Reaktion på bakteriel infektion C57BL / 6 mus fik intrapulmon.Ary infektion med 2000 CFU af K. pneumoniae. BALF cytokiner og chemokiner blev kvantificeret ved multiplex assay ved 24 timer og 48 timer efter infektion. Dataene stammer 5-15 mus / tilstand og er gennemsnit ± SEM. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5:. Time-afhængige Udvidelse af bakteriel Burden i Lunge og perifere væv under Lungebetændelse C57BL / 6 mus fik intrapulmonal infektion med 2000 CFU af K. pneumoniae. (A) Lung parenkymatisk bakteriebyrden blev målt ved at udplade seriefortyndinger af lungehomogenat på TSA 24 timer og 48 timer efter infektion. (B) blodbanen og (C) milten bakteriebyrden blev ligeledes kvantificeret. ( F) Bakteriel byrde i forskellige væv er ækvivalent i mandlige og kvindelige mus efter induktion af lungebetændelse. Dataene stammer fra 10 mus / tilstand og er gennemsnit ± SEM. Nul-værdier i paneler B, C, E, og F blev tildelt en værdi på 0,1 for at tillade graftegning på en logaritmisk skala. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Murine modeller af bakteriel lungebetændelse, indgået et samarbejde med gen-targeting og in vivo biologiske og farmakologiske interventioner, har givet kritiske indsigt i pulmonal vært forsvar reaktion. Store fremskridt er blevet gjort især i vores forståelse af de kemokiner og adhæsionsmolekyler, der styrer rekruttering af neutrofiler til den inficerede luftrum 10,11. In vivo modeller af lungebetændelse, i modsætning til cellebaserede eller alternative tilgange, også har givet vigtige indsigter i endokrine kommunikation, der opstår mellem den inficerede lunge og andre organer, såsom leveren (akutte fase respons) 12 og binyrerne (stress glukokortikoider) 13. Endelig en kritisk og klinisk meget relevant punkt, der er afsløret ved in vivo lungebetændelse modeller er, at en vellykket patogen clearance er ikke ensbetydende med succes værten. I mange tilfælde kan en overexuberant immunreaktion føre til døden af ​​værtenpå grund af overdreven bystander lungeskader, selv i lyset af vellykket patogen clearance 8,14. Givet dette, parallelle målinger af patogen clearance og af immunresponset er generelt mest informative, og overlevelse undersøgelser kan i sidste ende være nødvendigt at afsløre den integrerede elasticitet værten.

Heri, har vi beskrevet en enkel og ikke-invasiv metode til afgivelse af bakterier til den murine lunge via aspiration. Sammenlignet med aerosolisering, denne fremgangsmåde indebærer lavere potentiel risiko for respiratorisk eksponering af Forsøgsmedarbejderne, tilvejebringer højere koncentreret inokulum levering til den dybe lunge, og undgår potentiel forvirrende ved okulære og øvre luftvejs immunresponser. Intranasal inokulering også bærer potentielt confounding bekymring øvre luftvejsinfektion, herunder muligheden for lokalt invasiv infektion af centralnervesystemet 4, og er også blevet rapporteret at resultere i stærkt varierende inokula i lungen5. Sammenlignet med endotracheal intubation via enten peroral eller transkutan rute kræver denne fremgangsmåde minimal træning, er hurtigere (~ 1 min pr mus), og, i det mindste i forhold til den sidstnævnte metode, har lavere morbiditet. Potentielle ulemper ved den oropharyngeale aspiration metode - hvoraf nogle er delt af andre metoder - såsom behovet for generel anæstesi, sandsynligheden for pletvist (dvs. asymmetrisk og heterogen) patogen levering, fremherskende infektion i de nedre flige 15, og manglende evne til at dirigere patogenet ensidigt til en enkelt lunge. På grund af pletvis fordeling i lungerne efter aspiration (data ikke vist) - et resultat, der er stødt på med alle andre end aerosolisering 15 lungeinfektion metoder - vi generelt ikke udfører ensidige lunge-analyser på inficerede mus. Begge lunger er enten udskyllet sammen for at vurdere immunresponset, eller obduceret sammen for pooled bakteriel kvantgrænsning og / eller molekylær analyse (f.eks genekspression, myeloperoxidase assay cytokin ELISA). Særligt kritiske trin ved protokollen er trin 1.8 -confirming OD 600: CFU / mL forhold forud for in vivo-infektion og også bekræfter inokulumkoncentration gennem plating i hvert eksperiment; samt trin 3.6 - sikrer en ikke-traumatisk udskylning af luftvejen med god volumen vender tilbage i sprøjten.

Selvom co-infektion med oral flora (dvs. polymikrobielle lungebetændelse) er en teoretisk bekymring, har vi ikke stødt polymorfe bakteriekolonier i lungehomogenater af mus inficeret med K. pneumoniae eller S. pneumoniae. For berørte om denne mulighed efterforskere dog kontrol mus kan blive udsat for indsugning køretøj (dvs. buffer), hvis det ønskes. Selv om nogle forurening af maven lumen (gennem sluger resterende indsugning bakterier) er mulig with fremgangsmåden beskriver vi, har vi aldrig fundet gastrointestinale kliniske tegn eller ændringer på makroskopisk patologi. Desuden er denne mulighed er fælles for aerosoliseringskanalerne og intranasale metoder, og kan endda forekomme efter hoste i intratracheal podningsmetode.

Nogle metodiske problemer er universelle for alle lungebetændelse modeller. Kontrol- og eksperimentel mus grupper bør være alders-matchede ideelt inden for 2-3 uger fra hinanden. Selvom vi ikke har fundet åbenlyse kønsforskelle i patogen clearance eller betændelse i luftvejene i K. pneumoniae model, skal mus være kønsmatchet, som signifikante forskelle mellem kønnene i det medfødte immunforsvar er blevet rapporteret 16. skal nøje overvejet oprindelsen af ​​kontrol mus. Kuld kontroller generelt er foretrukket i forhold kommercielt indkøbte kontrol som ufuldstændig tilbagekrydsning, microbiome-relaterede forskelle i immuncellepopulationer, og andre epigenetic forskelle er alle mulige konfoundere, som kan påvirke immunresponset 17,18. bør gives Omhyggelig opmærksomhed til den specifikke serotype og dyrkning historie den inficerende bakterie som væsentlige forskelle i virulens kan ses. Baseret på vores erfaring med K. pneumoniae, anbefaler vi udfører indledende pilotundersøgelser anvendelse af en række inficere inokula (f.eks 500-2000 CFU) den sygelighed / dødelighed af specifikke bakterielle doser rapporteret i litteraturen - selv med den samme bakterielle serotype og musestamme - måske ikke oversætte godt til ens eget laboratorium, sandsynligvis på grund af en række tekniske uoverensstemmelser. Inter-gruppe forskelle mellem kontrol og eksperimenterende mus i inflammatoriske og værtsforsvarsceller resultater kan være inokulum-afhængig. På grund af de logistiske realiteter husdyravl og bemanding, vi ofte udføre eksperimenter med 5-6 mus pr forsøgsgruppe. Selv om dette lejlighedsvis giver tilstrækkelig statistisk styrke til CFU og celletal resultater, finder vi, at vi ofte nødt til at gentage en undersøgelse af denne størrelse en eller flere gange for at opnå tilstrækkelig effekt.

For nogle mus i et givet forsøg, kan ingen påviselig bakterievækst i blod og milt forekomme 24 timer efter infektion (figur 5). Vi tolker dette til at angive, at 24 timer kan være nær den kinetiske tærskel for påviselig ekstrapulmonal formidling. Hvis der observeres lav / målbart vækst i blod / milt, bør lunge CFU'er fra samme mus altid undersøges for at behandle mulighederne for en teknisk fejl (dvs. meget lav / målbart lungeinfektion muligvis indikerer en fejl i dosering af musen).

I afsluttende, det svælg aspiration leveringsmetode for bakteriel lungebetændelse i mus er en robust teknik, der er forholdsvis let at anskaffe fra en omkostning, træning og udstyr synspunkt, og er realistisk selv for laboratorier uden omfattende ekspertisei pulmonale procedurer. Fremgangsmåden er let koblet til downstream mikrobiologiske og immunologiske assays af værtens forsvar reaktion, og kan desuden anvendes som en lunge leveringsmetode for en lang række ikke-ætsende engagementer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2 ATCC 43816
Tryptic soy broth Becton Dickenson 211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4" Claflin Medical Equipment MEDC-031122
Hema 3 Solution 1 Fisher 23-122-937
Hema 3 Solution 2 Fisher 23-122-952
Hema 3 Fixative Fisher 23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes Fisher 14-826-87
Lithium heparin plasma collectors Fisher 2675187
L-shaped disposable spreaders Lab Scientific DSC
1x PBS, pH 7.4 prepared in-house n/a Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)   
ACK lysis buffer prepared in-house n/a NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mizgerd, J. P. Acute lower respiratory tract infection. N Engl J Med. 358, (7), 716-727 (2008).
  2. Waterer, G. W., Rello, J., Wunderink, R. G. Management of community-acquired pneumonia in adults. Am J Respir Crit Care Med. 183, (2), 157-164 (2011).
  3. Mizgerd, J. P., Skerrett, S. J. Animal models of human pneumonia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294, (3), L387-L398 (2008).
  4. Revelli, D. A., Boylan, J. A., Gherardini, F. C. A non-invasive intratracheal inoculation method for the study of pulmonary melioidosis. Front Cell Infect Microbiol. 2, 164 (2012).
  5. Morales-Nebreda, L., et al. Intratracheal administration of influenza virus is superior to intranasal administration as a model of acute lung injury. J Virol Methods. 209, 116-120 (2014).
  6. Aujla, S. J., et al. IL-22 mediates mucosal host defense against Gram-negative bacterial pneumonia. Nat Med. 14, (3), 275-281 (2008).
  7. Chen, K., et al. Th17 cells mediate clade-specific, serotype-independent mucosal immunity. Immunity. 35, (6), 997-1009 (2011).
  8. Draper, D. W., et al. ATP-binding cassette transporter G1 deficiency dysregulates host defense in the lung. Am J Respir Crit Care Med. 182, (3), 404-412 (2010).
  9. Robinson, K. M., et al. Influenza A exacerbates Staphylococcus aureus pneumonia by attenuating IL-1beta production in mice. J Immunol. 191, (10), 5153-5159 (2013).
  10. Mizgerd, J. P. Molecular mechanisms of neutrophil recruitment elicited by bacteria in the lungs. Semin Immunol. 14, (2), 123-132 (2002).
  11. Balamayooran, G., Batra, S., Fessler, M. B., Happel, K. I., Jeyaseelan, S. Mechanisms of neutrophil accumulation in the lungs against bacteria. Am J Respir Cell Mol Biol. 43, (1), 5-16 (2010).
  12. Quinton, L. J., et al. Hepatocyte-specific mutation of both NF-kappaB RelA and STAT3 abrogates the acute phase response in mice. J Clin Invest. 122, (5), 1758-1763 (2012).
  13. Gowdy, K. M., et al. Key role for scavenger receptor B-I in the integrative physiology of host defense during bacterial pneumonia. Mucosal Immunol. 8, (3), 559-571 (2015).
  14. Madenspacher, J. H., et al. p53 Integrates host defense and cell fate during bacterial pneumonia. J Exp Med. 210, (5), 891-904 (2013).
  15. Brain, J. D., Knudson, D. E., Sorokin, S. P., Davis, M. A. Pulmonary distribution of particles given by intratracheal instillation or by aerosol inhalation. Environ Res. 11, (1), 13-33 (1976).
  16. Card, J. W., et al. Gender differences in murine airway responsiveness and lipopolysaccharide-induced inflammation. J Immunol. 177, (1), 621-630 (2006).
  17. Ivanov, I. I., et al. Induction of intestinal Th17 cells by segmented filamentous bacteria. Cell. 139, (3), 485-498 (2009).
  18. Hooper, L. V., Littman, D. R., Macpherson, A. J. Interactions between the microbiota and the immune system. Science. 336, (6086), 1268-1273 (2012).
En ikke-invasiv og Teknisk Ikke-intensive Metode til induktion og fænotype for Eksperimentel bakteriel lungebetændelse i mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Madenspacher, J. H., Fessler, M. B. A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54508, doi:10.3791/54508 (2016).More

Madenspacher, J. H., Fessler, M. B. A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54508, doi:10.3791/54508 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter