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Immunology and Infection

चूहे में प्रेरण और प्रायोगिक बैक्टीरियल निमोनिया की phenotyping के लिए एक गैर-आक्रामक और तकनीकी तौर पर गैर-गहन विधि

doi: 10.3791/54508 Published: September 28, 2016

Summary

कई तरीकों चूहों में बैक्टीरियल निमोनिया मॉडलिंग के लिए साहित्य में वर्णित किया गया है। इस के साथ साथ, हम oropharynx में pipetted एक जीवाणु inoculum की आकांक्षा (यानी, साँस लेना) के माध्यम से निमोनिया उत्प्रेरण के लिए एक गैर इनवेसिव, सस्ती, तेजी से विधि का वर्णन है। फेफड़े के सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के मूल्यांकन के लिए डाउनस्ट्रीम तरीकों में भी विस्तृत रहे हैं।

Abstract

समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया एक प्रमुख सार्वजनिक स्वास्थ्य समस्या बनी हुई है हालांकि, बैक्टीरियल निमोनिया की murine मॉडल ने हाल ही में अंतर्निहित सेलुलर और आणविक रोगजनन की हमारी समझ में महत्वपूर्ण प्रगति के preclinical मदद की है। विवो में माउस मॉडल एकीकृत फिजियोलॉजी और में मेजबान बचाव प्रतिक्रिया के लचीलेपन पर कब्जा एक तरह से वैकल्पिक, पूर्व vivo दृष्टिकोण सरलीकृत द्वारा खुलासा नहीं किया। कई तरीकों चूहों में बैक्टीरिया की intrapulmonary टीका, aerosolization सहित intranasal वितरण, 'अंधा और कल्पना की शर्तों के तहत peroral अंतःश्वासनलीय केन्युलेशन, और ट्रांसक्यूटेनस अंतःश्वासनलीय केन्युलेशन के लिए साहित्य में वर्णित किया गया है। सभी तरीकों रिश्तेदार गुण और सीमाएं हैं। इस के साथ साथ, हम विस्तार से वर्णन बैक्टीरिया की intratracheal डिलीवरी के लिए एक गैर इनवेसिव तकनीकी रूप से गैर-गहन, सस्ती, और तेजी से विधि है कि माउस द्वारा आकांक्षा (यानी, साँस लेना) शामिल हैसामान्य संज्ञाहरण के तहत जबकि oropharynx में pipetted एक संक्रामक inoculum की। इस विधि गैर कास्टिक जैविक और रासायनिक एजेंटों की एक विस्तृत विविधता के फेफड़े के वितरण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, और यहां तक ​​कि फेफड़े के प्रक्रियाओं के साथ कम से कम पूर्व अनुभव के साथ प्रयोगशालाओं के लिए अपेक्षाकृत आसान सीखना है। आकांक्षा निमोनिया विधि का वर्णन करने के अलावा, हम भी बाद में इन विवो माउस के फेफड़े सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, विशेष रूप से परख करने की क्रिया के लिए कदम-दर-कदम प्रक्रिया प्रदान करते हैं बैक्टीरियल निकासी और संक्रमित एयरवे के सेलुलर प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया बढ़ाता के लिए तरीकों। निमोनिया आकलन करने के लिए इस एकीकृत और सरल दृष्टिकोण फेफड़े के जन्मजात प्रतिरोधक क्षमता पर आनुवांशिक और पर्यावरणीय जोड़तोड़ के प्रभाव का तेजी से और मजबूत मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

Introduction

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समुदाय का अधिग्रहण निमोनिया अमेरिका में संक्रमण से मौत का प्रमुख कारण बना हुआ है, थोड़ा समग्र और एंटीबायोटिक रणनीतियों 1,2 टीकाकरण के क्षेत्र में सुधार के बावजूद पिछले 40 वर्षों में मृत्यु दर में परिवर्तन के साथ। सार्वजनिक स्वास्थ्य के स्तर पर प्रत्यक्ष प्रगति की कमी के बावजूद, हाल के वर्षों में नाटकीय प्रगति आगे फेफड़े में संक्रमण के माउस मॉडल के उपयोग के द्वारा ही संभव बनाया इन कदमों से कई के साथ निमोनिया की आणविक और सेलुलर रोगजनन की हमारी समझ में किया गया है। माउस के आनुवंशिक शिक्षणीयता, murine और मानव प्रतिरक्षा प्रणाली, और murine-लक्षित immunologic अभिकर्मकों के विशाल सरणी है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं की समानता एक साथ क्षेत्र का तेजी से प्रगति की है।

साहित्य में वर्णित बैक्टीरियल निमोनिया के माउस मॉडल आम तौर पर रोगज़नक़ टीका के लिए चार में से एक तकनीकी मार्गों पर भरोसा है: i) aerosolization; ii) Intranasal वितरण; iii) peroral वितरण; और चतुर्थ) सर्जिकल intratracheal इंजेक्शन (यानी, ट्रेकिआटमी) 3। संक्रमण के सभी मार्गों के फायदे और नुकसान 3 लोगों की है। oronasal वनस्पति, सामान्य संज्ञाहरण के लिए आवश्यकताओं के मिश्रण के लिए ऊपरी airway के विशेष रूप से, रिश्तेदार जोखिम, क्षमता में, बाहर का फेफड़ों के लिए दिया inoculum दिया रोगाणुओं की लोबार वितरण, तकनीकी विशेषज्ञता की आवश्यकताओं, और प्रक्रियात्मक रुग्णता की परिवर्तनशीलता इन भर में व्यापक रूप से भिन्न दृष्टिकोण।

आमतौर पर इस्तेमाल किया peroral संक्रमण तकनीक अंतःश्वासनलीय (translaryngeal) के माध्यम से या तो एक 'अंधा (गैर कल्पना की) दृष्टिकोण, या सीधे laryngeal दृश्य 3-5 के तहत केन्युलेशन शामिल हैं। दोनों तरीकों, जबकि मजबूत, पर्याप्त प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है और यह भी ऊपरी airway को आघात के जोखिम ले। वर्तमान रिपोर्ट में, हम peroral संक्रमण का एक, तकनीकी रूप से गैर गहन गैर इनवेसिव, सस्ती, और तेजी से विधि का वर्णन है, wइसके द्वारा बैक्टीरिया (बशर्ते उदाहरण में क्लेबसिएला निमोनिया) एक anesthetized माउस के oropharynx आकांक्षा (यानी, साँस लेना) के माध्यम से फेफड़ों के लिए वितरित कर रहे हैं में pipetted। हम और दूसरों को आकांक्षा निमोनिया तकनीक को सफलतापूर्वक 6-9 इस्तेमाल किया है। इस बहुमुखी और आसानी से सीखा फेफड़ों-वितरण पद्धति, साइटोकिन्स और अन्य प्रोटीन, रोगज़नक़ जुड़े अणुओं (जैसे, lipopolysaccharide), कोशिकाओं (यानी, दत्तक हस्तांतरण) सहित फेफड़े, के लिए कई अतिरिक्त गैर-कास्टिक एजेंटों के वितरण के लिए बढ़ाया जा सकता है और विषाक्त पदार्थों (जैसे, bleomycin)। महत्वपूर्ण तकनीकी कारणों पर चर्चा करने के अलावा, हम भी निमोनिया करने के बाद मेजबान प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक एकीकृत, मात्रात्मक दृष्टिकोण का वर्णन, बैक्टीरियल क्लीयरेंस के बहाव के माप (यानी, कॉलोनी बनाने इकाई [CFU] फेफड़े और परिधीय अंगों में quantitation) और ल्युकोसैट सहित हवाई क्षेत्र में संचय।

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Protocol

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सभी प्रयोगों पशु की देखभाल और NIEHS का प्रयोग समिति द्वारा समीक्षा के बाद पशु कल्याण अधिनियम और अमेरिका के सार्वजनिक स्वास्थ्य सेवा नीति मानवीय देखभाल और प्रयोगशाला पशु के उपयोग पर के अनुसार में प्रदर्शन कर रहे थे।

1. लालकृष्ण की तैयारी निमोनिया संस्कृति

सावधानी: एक जैव सुरक्षा स्तर 2 (BSL2) हुड या अन्य BSL2 निर्धारित क्षेत्र में सभी चरणों को पूरा करने और प्रति संस्थान BSL2 दिशा निर्देशों अपशिष्ट त्यागें।

  1. लालकृष्ण के निलंबन के विकास के लिए निमोनिया, जीवाणुओं की एक ग्लिसरॉल स्टॉक पिघलना और लालकृष्ण के 1 मिलीलीटर के हस्तांतरण से काम कर रहे एक संस्कृति टीका लगाना एक 500 मिलीलीटर या बड़ा फ्लास्क में tryptic सोया शोरबा (टीएसबी) के 50 मिलीलीटर को निमोनिया शेयर।
  2. सुसंस्कृत लॉग चरण लालकृष्ण के 900 μl जोड़कर ग्लिसरॉल शेयरों बनाओ निमोनिया बाँझ ग्लिसरॉल के 100 μl करने के लिए और -20 डिग्री सेल्सियस या डिग्री सेल्सियस -80 में ठंड। लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस की सिफारिश की है।
  3. s से संस्कृति बैक्टीरियाकुप्पी रात भर झटकों से 1.1 TEP - 200-225 rpm.In आदेश लॉग चरण विकास को बढ़ावा देने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर (14 से 18 घंटा), एक कुप्पी सुबह 50 मिलीलीटर टीएसबी युक्त में इस रातोंरात संस्कृति के 1-5 मिलीलीटर पतला और ~ 2.5 घंटे के लिए झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर वापस जगह है।
  4. लालकृष्ण के 1 मिलीलीटर स्थानांतरण पिछले 2 मिनट के लिए 7500 XG पर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में कदम से निमोनिया संस्कृति। एक सफेद गोली दिखाई जानी चाहिए। गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला निकालें, धीरे बाँझ खारा के 1 मिलीलीटर में विंदुक के साथ बैक्टीरिया resuspend, और 2 मिनट के लिए 7500 XG पर फिर से स्पिन।
    1. , इस धोने कदम 2x प्रदर्शन करना बाँझ खारा के 1 मिलीलीटर में अंतिम, धोया गोली परवरिश।
  5. इस बधिया inoculum के लॉग-वार धारावाहिक dilutions प्रदर्शन करना। उदाहरण के लिए, क्रमानुसार एक 10 -1 -10 -9 कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाने के लिए बाँझ खारा की 3.6 मिलीलीटर में inoculum के 400 μl जोड़ें।
  6. धोया कश्मीर के 600 आयुध डिपो का निर्धारण करते हैं निमोनिया के 1 मिलीलीटर रखकर1:10 और 1: प्रयोज्य cuvettes और 600 आयुध डिपो को मापने में 100 dilutions, बाँझ खारा के साथ पहली blanking। डुप्लिकेट उपाय सटीकता सुनिश्चित करने के। 1.0 के एक आयुध डिपो के 600 मोटे तौर पर 4-7 एक्स 10 8 CFU / मिलीलीटर के बराबर है। ध्यान दें कि आयुध डिपो और CFU के बीच के रिश्ते / एमएल रेखीय नहीं हो सकता।
    1. लालकृष्ण की एकाग्रता की गणना करने के लिए dilutions से 600 आयुध डिपो का प्रयोग करें निमोनिया, आयुध डिपो आवेदन: कमजोर पड़ने में ऊपर CFU / एमएल रूपांतरण, और फैक्टरिंग।
  7. लालकृष्ण प्रयोग करें निमोनिया एकाग्रता चूहों को प्रसव के लिए एक <100 μl मात्रा में वांछित inoculum CFU खुराक तैयार करने के लिए (नीचे देखें)।
  8. इसके अलावा 10 -6 -10 -9 dilutions के 100 μl और आरटी पर अलग-अलग tryptic सोया अगर (टीएसए) प्लेटों पर बाँझ खारा के 100 μl थाली। 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते हैं और व्यवस्था की सटीक एकाग्रता है कि प्रयोग में इस्तेमाल किया गया था और प्रदूषण को नियंत्रित करने के लिए गणना करने में बैक्टीरियल कालोनियों की गणना करें।
    नोट: अंतिम inoculum के वास्तविक बैक्टीरियल एकाग्रता ± 500 CFU / एमएल कि absorbance ने भविष्यवाणी की जा सकती है। प्रयोगकर्ता आदर्श 600 आयुध डिपो की पुष्टि करनी चाहिए: चूहों में vivo में उपयोग करने से पहले पायलट अध्ययन में CFU / एमएल संबंध, अनुभव से 600 आयुध डिपो readjusting: CFU / एमएल अपने व्यक्तिगत अनुभव के आधार पर रूपांतरण।

2. Murine intratracheal (यह) लालकृष्ण की आकांक्षा oropharynx से निमोनिया

  1. कि चूहों सुनिश्चित अनोखे पूंछ निशान, टैटू, या अन्य अनुमोदित पहचानकर्ता द्वारा पहचाने जाते हैं।
  2. P200 पिपेट आदेश प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए isoflurane से चूहों को हटाने से पहले का उपयोग कर जीवाणुओं की inoculum खुराक ड्रा। यह आकांक्षा के साथ सर्वोत्तम परिणामों के लिए, बाढ़ को रोकने के लिए <100 μl की एक मात्रा का उपयोग करें। इस के साथ साथ, 2000 CFU / 50 लालकृष्ण μl का उपयोग निमोनिया।
  3. Isoflurane गैस (जैसे, 2% 1 एल / मिनट के प्रवाह की दर पर isoflurane) के साथ एक स्पष्ट कक्ष में या प्रति के रूप में Instit चूहों anesthetizeसंवैधानिक दिशानिर्देश। चूहों की संख्या एक साथ anesthetize करने के लिए प्रयोगकर्ता की सुविधा के स्तर, आम तौर पर एक समय में 1-2 से निर्धारित होता है। सांस लेने का निरीक्षण करें और संज्ञाहरण के स्तर पर इस बात की पुष्टि एक बार गहरी साँस दिखाई दे रहे हैं और 2-3 सेकंड साँस के बीच में गिना जा सकता है।
    नोट: यदि अस्थिर (साँस) anesthetics के संभव confounding प्रभाव के बारे में चिंता का विषय है, संज्ञाहरण ketamine / xylazine की intraperitoneal इंजेक्शन के साथ बजाय प्राप्त किया जा सकता है। ऊपर वर्णित विधि के साथ, गहरी संज्ञाहरण केवल कुछ मिनट तक रहता है। अधिक लंबे समय तक संज्ञाहरण प्रेरित किया जाता है, आंख मरहम नेत्र सुखाना को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।
  4. एक बार माउस anesthetized है, एक semirecumbent लापरवाह स्थिति, एक रबर बैंड से दाढ़ की कृन्तक द्वारा निलंबित में यह स्थिति (चित्रा 1) एक slanted Plexiglas बोर्ड पर खूंटे के बीच फैला।
  5. धीरे से एक P200 pipett साथ कुंद गैर-चोटी वाला संदंश की एक जोड़ी और मौखिक गुहा में जमा खुराक के साथ कंधे करने के लिए माउस जीभ खींचई। या तो जीभ या oropharynx को आघात उत्प्रेरण से बचने के लिए बड़ी सावधानी से व्यायाम करें।
  6. जीभ मुकर रखते हुए, धीरे से एक दस्ताने उंगली के साथ नाक रोक देना जब तक माउस कश लेते। नाक को कवर करने के लिए जारी रखें जब तक माउस दो या अधिक inhalations ले लिया है, और कोई तरल मौखिक गुहा में दिख रहा है। नाक को कवर सुनिश्चित करना है कि माउस फेफड़ों में बैक्टीरिया श्वास जाएगा, जैसा कि चूहों लाचार नाक सांस में हैं मदद करता है।
  7. टीका बोर्ड से माउस निकालें और, अपने पिंजरे पर लौटने अपनी पीठ पर माउस रखने जबकि माउस संज्ञाहरण से ठीक हो रहे nares अवरुद्ध से बिस्तर या मलबे को रोकने के लिए।
  8. एक बार सभी चूहों dosed किया गया है और संज्ञाहरण से awoken है, एक कक्ष / कमरे में घर के चूहों केवल चूहों युक्त कि लालकृष्ण साथ dosed कर दिया गया है निमोनिया। दैनिक चूहों पर नजर रखने, शरीर भार सहित यदि 48 घंटे के बाद संक्रमण से परे जा रहा।
  9. दैनिक मुहब्बत और / या पूरक गर्मी का प्रयोग करें अगर इजाजत दी चूहों 48 के पार जाने के लिएमानव संसाधन।

3. ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना द्रव (BALF) संग्रह और विश्लेषण

  1. संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार चूहों euthanize। इधर, 150 मिलीग्राम / किग्रा सोडियम pentobarbital या वाणिज्यिक इच्छामृत्यु समाधान exsanguination के द्वारा पीछा के बराबर खुराक की एक घातक इंजेक्शन का उपयोग के रूप में इस सीओ 2 साँस लेना और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के साथ जुड़े फेफड़ों के लिए संभव जटिलताओं से बचा जाता है।
  2. पीठ पर स्थिति माउस और विशेष रूप से छाती और गर्दन क्षेत्र में 70% इथेनॉल के साथ फर छिड़काव द्वारा माउस बाँझ।
  3. सिर्फ उरोस्थि के नीचे एक अनुदैर्ध्य काट कर, तो संदंश के साथ उरोस्थि पकड़े, निक डायाफ्राम, फेफड़ों की इजाजत दी छाती गुहा में वापस गिर करने के लिए। छाती गुहा के माध्यम से वाहिका के दोनों तरफ कट और फिर गर्दन के माध्यम से ऊपर, श्वासनली उजागर।
  4. जैसा कि श्वासनली दोनों तरफ अनुदैर्ध्य मांसपेशियों से घिरा हुआ है, ध्यान से बीच के माध्यम से कटौती और पक्षों के लिए ऊतक धक्का, के रूप मेंइस आसपास के वाहिका, जो श्वासनली में रक्त मिलवा सकता काटने से बचा जाता है। वाहिका nicked है, तो सांस की नली लुमेन तक पहुँचने से पहले धुंध के साथ आसपास के क्षेत्र को साफ।
  5. श्वासनली सिर से नीचे रास्ते के बारे में ¼ निक के लिए शल्य कैंची या एक सुई का प्रयोग करें और एक प्रवेशनी 1 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) दुमदारी श्वासनली में से 1 मिलीलीटर के साथ preloaded सिरिंज से जुड़ी डालें। चूहों का उपयोग उम्र या महिलाओं के 8 सप्ताह <हैं, तो 600-800 μl को lavaging मात्रा कम हो।
  6. धीरे-धीरे फेफड़ों में मात्रा पुश, सभी पालियों फुलाना और फिर मात्रा सिरिंज के साथ वापस बाहर खींच, 3x दोहरा करने की इजाजत दी। पीबीएस नाक से बाहर आ जाता है तो प्रवेशनी श्वासनली में काफी दूर तक धकेल दिया गया है या नहीं मुद्रास्फीति भी जल्दी से हो रहा है। वैकल्पिक रूप से, अगर फेफड़ों में अच्छी तरह से बढ़ा-चढ़ाकर नहीं कर रहे हैं, प्रवेशनी बहुत दूर में धकेल दिया गया है, तो थोड़ा वापस ले लें।
  7. बर्फ पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जमा washes लीजिए।
  8. स्पिन5 मिनट के लिए 1,200 XG पर हवाई क्षेत्र पानी से धोना तरल पदार्थ, एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करने और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर। बाद में, प्रोटीन, साइटोकिन्स, और विभिन्न अन्य जैव रासायनिक assays की माप के लिए सतह पर तैरनेवाला (यानी, BALF) का उपयोग करें। गोली ब्रोन्कोएल्वियोलर अंतरिक्ष से कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है।
  9. लाल रक्त कोशिकाओं (लाल रक्त कोशिकाओं) रंग के आधार पर सेल गोली में स्पष्ट कर रहे हैं, तो 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर के अलावा द्वारा पीछा 1 मिनट के लिए एसीके lysis बफर के 1 मिलीलीटर के साथ lyse सेल प्रतिक्रिया को रोकने और बफर कमजोर करने के लिए। हूबहू सभी नमूनों को संभाल लेना, या तो इलाज या एसीके lysis बफर के साथ नहीं।
  10. स्पिन कोशिकाओं 5 मिनट के लिए 1,200 XG पर तैरनेवाला छानना, और 1x पीबीएस के 1 मिलीलीटर में कोशिकाओं को ले आओ।
  11. कुल हवाई क्षेत्र कोशिकाओं की गणना के लिए एक hemocytometer पर भंवर और गिनती कोशिकाओं।
  12. कोशिकाओं के घनत्व के आधार पर लगभग (एक संक्रमित माउस के लिए 80 μl और ~ 150 एक भोली माउस के लिए ~) एक cytospin सेंट्रीफ्यूज पर एक स्लाइड चैम्बर के लिए 80-150 μl जोड़ें। स्पिन सेलमाइक्रोस्कोप पर सेल अंतर आबादी का निर्धारण करने के बाद धुंधला के लिए स्लाइड।
  13. कोशिकाओं रात भर स्लाइड पर सूखे की अनुमति दें। त्रिकोणीय दाग (जैसे, हेमा 3 [तालिका देखें]) दाग 2 में स्लाइड्स लगानेवाला में 7 बार, दाग 1 9 बार में, और 7 बार सूई से साथ दाग कोशिकाओं (दाग के बीच कोई rinses), और सूखे के लिए अनुमति देते हैं। दाग के बाद सूख गया है, coverslip स्लाइड और मैन्युअल माइक्रोस्कोप से भिन्नता गिनती। आम तौर पर, न्यूट्रोफिल और monocyte / मैक्रोफेज आसानी से अपने आकार और आकृति विज्ञान परमाणु द्वारा प्रतिष्ठित हैं।

4. फेफड़े और परिधि के ऊतकों में बैक्टीरियल लोड निर्धारण

  1. शुरुआत से पहले: फेफड़े और तिल्ली के लिए 1x पीबीएस के 900 μl और रक्त के लिए 1x पीबीएस के 90 μl के साथ कमजोर पड़ने ट्यूबों तैयार। बैक्टीरिया और संवर्धन के लिए कमरे के तापमान पर सेट लेबल प्लेटें; इसलिए, एक बार ऊतक एकत्र किया गया है समय homogenization और बैक्टीरिया विकास के लिए चढ़ाना के बीच कम से कम हो जाएगा।
    नोट: विषम deposi के कारणफेफड़ों कि आकांक्षा के साथ हो सकता है में बैक्टीरिया के मोर्चे, यह सिफारिश की है कि व्यक्तिगत चूहों या तो कुल एयरवे कोषमयता या कुल (द्विपक्षीय) फेफड़ों बैक्टीरियल बोझ के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा।
  2. 3.1 कदम के रूप में प्रति माउस euthanize और बाद में बाएं वेंट्रिकल से रक्त एकत्रित करते हैं, एक heparinized ट्यूब में रखकर थक्के से बचने के लिए। 1x पीबीएस के 2 मिलीलीटर में सभी फेफड़ों पालियों और 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर, तिल्ली और प्लेसमेंट को हटाने के बाद से युक्त एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में जगह निकालें। बर्फ पर ट्यूबों रखें। प्रत्येक ऊतक / माउस के बीच इथेनॉल के साथ उपकरणों को साफ करने के लिए ध्यान रखना।
  3. बर्फ पर ऊतक Homogenize, अधिमानतः डिस्पोजेबल homogenizers प्रत्येक नमूने के बीच बदला जा सकता है के साथ। डिस्पोजेबल homogenizer सुझावों के प्रयोगों के बीच पुन: उपयोग करने के लिए autoclaved जा सकता है।
  4. एक बार ऊतक homogenized किया गया है, धारावाहिक dilutions और प्लेट प्रदर्शन करते हैं। प्लास्टिक पर एक विभाजन रेखा खींचने से एक भी टीएसए थाली पर दो प्रतियों में एक दिया ऊतक / कमजोर पड़ने की प्लेट नमूने हैं। चढ़ाना और dilution सुझाव नीचे दिखाई जाती हैं (सभी मामलों में, नमूना के 10 μl थाली पर फैला हुआ है) और एक 24 घंटा के बाद संक्रमण शव-परीक्षा पर आधारित हैं। अगर 48-72 घंटा के नमूनों का विश्लेषण, dilutions की एक बड़ी संख्या को बाद में समय बिंदुओं पर वृद्धि हुई बैक्टीरियल बोझ के कारण चढ़ाया जाना पड़ सकता है।
    1. रक्त के लिए - बाँझ 1x पीबीएस के 90 μl में रक्त के 10 μl जोड़कर 01:10 पतला। प्लेट साफ और दो प्रतियों में पतला 1:10 नमूने हैं। एक बार खून चढ़ाया गया है, 9,300 XG पर अवशिष्ट रक्त स्पिन 10 मिनट साइटोकिन्स और chemokines की माप के लिए प्लाज्मा निकालने के लिए।
    2. क्रमानुसार बाँझ 1x पीबीएस के 900 μl में homogenized फेफड़ों के 100 μl जोड़कर 100: फेफड़े के लिए - 1 - 01:10 पतला। प्लेट साफ homogenate और दो प्रतियों में सभी dilutions।
    3. क्रमानुसार बाँझ 1x पीबीएस के 900 μl में homogenized तिल्ली के 100 μl जोड़कर 100: - प्लीहा के लिए पतला 1: 10-1। प्लेट साफ homogenate और दो प्रतियों में दोनों dilutions।
  5. प्रसार नमूने संक्षेप में सूखे की अनुमति दें। रात भर एक स्थिर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में टीएसए प्लेट और जगह उलटें।
  6. थाली के दोनों पक्षों से और प्रत्येक कमजोर पड़ने से बैक्टीरियल कालोनियों के औसत से बस्तियां जीवाणुओं की संख्या निर्धारित करते हैं। फेफड़ों के लिए 5 मिलीलीटर और तिल्ली के लिए 2 मिलीलीटर की प्रारंभिक dilutions में फैक्टर कुल ऊतक CFUs निर्धारित करने के लिए।

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Representative Results

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C57BL / 6 चूहों लालकृष्ण 2000 CFU से संक्रमित थे निमोनिया 43,816 (सीरोटाइप 2) फेफड़ों में oropharyngeal आकांक्षा के माध्यम से। इस खुराक में चूहे आम तौर पर नैदानिक लक्षण सुस्ती, झालरदार फर, और 5-10% (2A चित्रा) के वजन घटाने सहित 12-24 घंटा के बाद संक्रमण को दिखाने के लिए शुरू करते हैं। 48-72 घंटा के बाद संक्रमण के भीतर, चूहों के कई वह यह है कि आम तौर पर कम गतिविधि के साथ hunched आसन में 20% वजन घटाने और परिणामों की एक औसत से पहले और उत्तेजना के लिए जवाबदेही में कमी आई बीमारी और रुग्णता के लक्षण दिखाई देते हैं। एक लंबी अवधि के अध्ययन लालकृष्ण का एक कम खुराक की आवश्यकता हो सकती है निमोनिया। कश्मीर के 500 CFU के साथ संक्रमण निमोनिया मामूली बीमारी 3-5 घ के बाद संक्रमण है कि वसूली और वजन दिन 5-6 (चित्रा 2 बी) से शुरुआत के साथ 10-15% की एक वजन घटाने की विशेषता है बढ़ता जा में यह परिणाम है। शरीर का वजन अक्सर अस्तित्व की भविष्यवाणी है, दुर्लभ 20% की एक वजन घटाने के साथLy वसूली के साथ जुड़े।

मेजबान प्रतिक्रिया के अंतिम सफलता के लिए सबसे अच्छा अस्तित्व के अध्ययन, जिसमें चूहों में इस तरह के स्पर्श उत्तेजना और / या वजन घटाने के लिए कम से कम जवाबदेही के moribundity के संकेत, के लिए 10-14 दिनों के लिए निगरानी, ​​और euthanized (संस्थागत अनुमोदित दिशा निर्देशों के अनुसार) कर रहे हैं ने संकेत दिया जा सकता है > 20%। जीवन रक्षा अध्ययन अक्सर सबसे प्रभावी अगर एक एक संक्रमित inoculum कि नियंत्रण समूह (चित्रा -2) में 50% मारक (यानी, LD50 खुराक) का अनुमान लगाती है लक्ष्य कर रहे हैं। एक LD50 खुराक दोनों अपेक्षाकृत वृद्धि हुई है का पता लगाने के लिए अनुमति देता है और प्रयोगात्मक समूह में अस्तित्व में कमी आई है। विभेदक अस्तित्व inoculum पर निर्भर हो सकता है, तो कई संक्रमण खुराक कभी कभी एक बदल मेजबान बचाव phenotype पता लगाने के लिए आवश्यक हो सकता है।

लालकृष्ण साथ निचले श्वसन तंत्र के संक्रमण निमोनिया leuk का एक मजबूत बाढ़ की विशेषता हैएयरवे में ocytes। प्रतिरक्षा सेल गणन और बाल सेल गोली का धुंधला द्वारा भेदभाव 6 के बाद संक्रमण (चित्रा 3 ए) के भीतर एयरवे प्रतिरक्षा कोशिकाओं में वृद्धि को दर्शाता है। 24 घंटा से कोषमयता चोटियों, न्यूट्रोफिल एयरवे (चित्रा 3 ए-बी) में प्रमुख प्रतिरक्षा सेल होने के साथ। C57BL / 6 चूहों के दोनों लिंग लालकृष्ण के जवाब में बराबर एयरवे leukocytosis का प्रदर्शन 24 घंटा और 48 घंटा के बाद संक्रमण (आंकड़े -3 सी-डी) में निमोनिया।

बैक्टीरियल निमोनिया लाती स्थानीय (intrapulmonary) और साइटोकिन्स और chemokines सहित प्रणालीगत समर्थक भड़काऊ मध्यस्थों। स्थानीय साइटोकाइन / केमोकाइन स्तर एक पारंपरिक एलिसा के साथ BALF में या एक मल्टीप्लेक्स साइटोकाइन प्रणाली का उपयोग करके पता लगाया जा सकता है। आईएल -6, RANTES, TNFα, जी-सीएसएफ, और अन्य लोगों सहित साइटोकिन्स लालकृष्ण साथ दोनों को 24 घंटा और 48 घंटा के बाद संक्रमण पर detectible हैं निमोनिया और LUN में अंतर्दृष्टि प्रदानजी microenvironment और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के अपने भर्ती (चित्रा 4)।

फेफड़े, रक्त, और जैसे तिल्ली के रूप में परिधीय ऊतक (एस) के संग्रह रोगाणुओं के दोनों स्थानीय फेफड़े निकासी के रूप में अच्छी तरह से बैक्टीरिया के प्रसार extrapulmonary में अंतर्दृष्टि प्रदान करने, ऊतक जीवाणु लोड की quantitation के लिए अनुमति देता है। धारावाहिक कमजोर पड़ने और फेफड़ों के संवर्धन के 24 घंटा और 48 घंटा के बाद संक्रमण (चित्रा 5 ए) के बीच माइक्रोबियल बोझ के विस्तार को दर्शाता है। इसी तरह के निष्कर्ष रक्त और तिल्ली (- सी चित्रा 5 ब) में उल्लेख किया जाता है। ध्यान से, एक bimodal बैक्टीरियल बोझ 24 घंटा के बाद संक्रमण पर रक्त और तिल्ली में उल्लेख किया जा सकता है, कुछ उच्च ग्रेड बैक्टीरियल प्रसार होने चूहों, और दूसरों के साथ, यहां तक ​​कि फेफड़ों में उच्च ग्रेड बैक्टीरियल बोझ का सामना करने में, प्रदर्शित करने के लिए कोई रक्त या तिल्ली में detectable बैक्टीरिया। के.एच. C57BL / 6 चूहों में निमोनिया जीवाणु लोड Gend नहीं हैएर-विशिष्ट के रूप में पुरुषों और महिलाओं के विभिन्न ऊतकों के बाद टीका (चित्रा 5 डी-एफ) में बराबर बोझ प्रदर्शित करता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। चूहे में आकांक्षा निमोनिया के लिए प्रक्रिया बोर्ड का अध्ययन चूहों तैनात कर रहे हैं, सिर और पीठ बोर्ड (यानी, semirecumbent) के लिए, कृन्तक से निलंबित कर दिया से एक रबर बैंड बढ़ाकर बीच दो खूंटे एक Plexiglas या इसी तरह के बोर्ड के लिए मुहिम शुरू की।

चित्र 2
चित्रा 2: वजन घटाने और रुग्णता का आकलन लालकृष्ण के फेफड़े आकांक्षा के बाद निमोनिया। C57BL / 6 चूहों (एन = 10-20 शर्त के अनुसार) लालकृष्ण की आकांक्षा से संक्रमित थे निमोनिया 43,816 (सीरोटाइप 2)। (ए) दैनिक वजन, अनुक्रमित करने के लिए पूर्व संक्रमण वजन, 2000 CFU से संक्रमित चूहों से। इस अध्ययन में, कोई चूहों 150 से दिन से शुरुआत 5. (सी) जीवन रक्षा घटता CFU, 500 के साथ 500 CFU वजन बढ़ाने की दिशा में एक संक्रमण के साथ 4 दिन के बाद संक्रमण के माध्यम से दैनिक वजन घटाने में परिणाम बच पिछले दिन 6. (बी) के संक्रमण CFU, और 2000 कॉलोनी बनाने इकाई (CFU) के संक्रमण का संकेत है कि 500 ​​CFU LD50 अनुमान लगाती है। पैनल के ए और बी में डेटा मतलब ± SEM कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: लालकृष्ण साथ संक्रमण निमोनिया समय पर निर्भर श्वासनली leukocytosis में परिणाम है। C57BL / 6 चूहों लालकृष्ण 2000 CFU साथ intrapulmonary संक्रमण दिया गया निमोनियाई। (ए) विभिन्न समय में हवाई क्षेत्र तरल पदार्थ में कुल ल्यूकोसाइट्स (WBC), न्यूट्रोफिल (PMN), और मैक्रोफेज (Mφ) की गणन के बाद संक्रमण बताते हैं। (बी) धुंधला हो जाना, PMNs और मैक्रोफेज पर आसानी से cytospin क्षेत्रों में परमाणु आकृति विज्ञान और आकार के द्वारा की पहचान की और गिना जा सकता है। (सी - डी) पुरुषों और महिलाओं में संक्रमण 24 घंटा और 48 घंटा के बाद संक्रमण पर भर्ती भड़काऊ कोशिकाओं के समान संख्या में परिणाम है। डेटा शर्त के अनुसार 6-25 / चूहों से निकाले जाते हैं और मतलब ± SEM कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: साइटोकिन्स और Chemokines जीवाणु संक्रमण के जवाब में हवाई क्षेत्र में प्रेरित कर रहे हैं C57BL / 6 चूहों intrapulmon दिया गया।लालकृष्ण 2000 CFU साथ आरे संक्रमण निमोनिया। BALF साइटोकिन्स और chemokines 24 घंटा और 48 घंटा के बाद संक्रमण पर मल्टीप्लेक्स परख द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया। डेटा 5-15 चूहों / स्थिति से निकाले जाते हैं और मतलब ± SEM कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। निमोनिया C57BL दौरान फेफड़े और परिधि के ऊतकों में बैक्टीरियल बोझ के समय पर निर्भर विस्तार / 6 चूहों लालकृष्ण 2000 CFU साथ intrapulmonary संक्रमण दिया गया निमोनिया। (ए) फेफड़े parenchymal बैक्टीरियल बोझ टीएसए 24 घंटा और 48 घंटा के बाद संक्रमण पर फेफड़ों homogenate के धारावाहिक dilutions चढ़ाना द्वारा मापा गया था। (बी) के खून और (सी) प्लीहा बैक्टीरियल बोझ इसी प्रकार मात्रा गया। ( एफ) विभिन्न ऊतकों में बैक्टीरियल बोझ निमोनिया के शामिल होने के बाद नर और मादा चूहों में बराबर है। डेटा 10 चूहों / स्थिति से निकाले जाते हैं और SEM मतलब ± कर रहे हैं। पैनलों बी, सी, ई, एफ और में शून्य मानों एक लॉग पैमाने पर रेखांकन की अनुमति के लिए 0.1 का एक मूल्य सौंपा गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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बैक्टीरियल निमोनिया की murine मॉडल, जीन को निशाना बनाने के साथ और इन विवो जैविक और औषधीय उपायों में भागीदारी फेफड़े मेजबान बचाव प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है। महान अग्रिम सेल आधारित या वैकल्पिक तरीकों के विपरीत chemokines और आसंजन अणुओं है कि संक्रमित हवाई क्षेत्र 10,11 को न्यूट्रोफिल की भर्ती के शासन की हमारी समझ में विशेष रूप से बनाया गया है। निमोनिया के vivo मॉडल, भी अंत: स्रावी में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है संचार कि संक्रमित फेफड़ों और जिगर (तीव्र चरण प्रतिक्रिया) के रूप में अन्य अंगों के बीच होते हैं 12 और अधिवृक्क ग्रंथि (तनाव glucocorticoids) 13। अंत में, एक महत्वपूर्ण और चिकित्सकीय अत्यधिक प्रासंगिक मुद्दा यह है कि इन विवो निमोनिया मॉडल से पता चला है कि सफल रोगज़नक़ निकासी के मेजबान की सफलता के लिए समान नहीं है। कई मामलों में, एक overexuberant प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मेजबान की मौत का कारण हो सकता हैकारण अत्यधिक दर्शक फेफड़ों की चोट है, यहां तक सफल रोगज़नक़ क्लीयरेंस 8,14 का सामना करने के लिए। यह देखते हुए, रोगज़नक़ निकासी की और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के समानांतर माप आम तौर पर सबसे जानकारीपूर्ण रहे हैं, और अस्तित्व के अध्ययन के अंत में मेजबान के एकीकृत लचीलापन प्रकट करने के लिए आवश्यक हो सकता है।

इस के साथ साथ, हम एक सरल और गैर इनवेसिव विधि बैक्टीरिया के वितरण के लिए murine फेफड़ों के लिए आकांक्षा के माध्यम से वर्णन किया है। aerosolization की तुलना में, इस विधि अध्ययन कर्मियों की सांस तक पहुंचाने के लिए कम संभावित जोखिम वहन करती है, गहरी फेफड़ों के लिए उच्च केंद्रित inoculum प्रसव के लिए प्रदान करता है, और नेत्र और ऊपरी airway प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया द्वारा संभावित confounding से बचा जाता है। Intranasal टीका भी ऊपरी airway संक्रमण का संभावित confounding चिंता का विषय है, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र 4 के लिए स्थानीय स्तर पर आक्रामक संक्रमण की संभावना सहित वहन करती है, और यह भी फेफड़ों में अत्यधिक चर inocula में परिणाम के लिए सूचित किया गया है5। या तो peroral या ट्रांसक्यूटेनस मार्ग के माध्यम से अंतःश्वासनलीय इंटुबैषेण की तुलना में, इस विधि, कम से कम प्रशिक्षण की आवश्यकता है और अधिक तेजी से है (~ माउस प्रति 1 मिनट), और, कम से कम बाद विधि की तुलना में कम रुग्णता है। जिनमें से कुछ अन्य तरीकों से साझा कर रहे हैं - - oropharyngeal आकांक्षा विधि के संभावित नुकसान को निर्देशित करने के लिए सामान्य संज्ञाहरण की आवश्यकता है, बद की संभावना है (यानी, विषम और विषम) रोगज़नक़ वितरण, कम पालियों में 15 की प्रबल संक्रमण, और असमर्थता शामिल एक भी फेफड़ों को रोगज़नक़ एकतरफा। आकांक्षा (नहीं दिखाया डेटा) के बाद फेफड़ों में बद वितरण की वजह से - एक परिणाम है कि सभी फेफड़े में संक्रमण aerosolization 15 के अलावा अन्य तरीकों के साथ सामना करना पड़ा है - हम आम तौर पर एकतरफा फेफड़ों assays संक्रमित चूहों पर प्रदर्शन नहीं करते। दोनों फेफड़ों या तो एक साथ कर रहे हैं lavaged प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए, या जमा बैक्टीरियल क्वांट के लिए एक साथ necropsieditation और / या आणविक विश्लेषण (जैसे, जीन अभिव्यक्ति, myeloperoxidase परख, साइटोकाइन एलिसा)। प्रोटोकॉल के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण कदम कदम 1.8 600 आयुध डिपो -confirming हैं: CFU / एमएल संबंध में विवो संक्रमण से पहले और भी हर प्रयोग में चढ़ाना के माध्यम से inoculum एकाग्रता की पुष्टि; साथ ही 3.6 कदम के रूप में - सिरिंज में अच्छी मात्रा रिटर्न के साथ airway के एक गैर दर्दनाक पानी से धोना सुनिश्चित करने।

हालांकि मौखिक वनस्पति (यानी, polymicrobial निमोनिया) के साथ सह-संक्रमण एक सैद्धांतिक चिंता का विषय है, हम कश्मीर से संक्रमित चूहों के फेफड़ों homogenates में बहुरूपी बैक्टीरियल कालोनियों सामना नहीं किया है निमोनिया या एस निमोनिया। इस संभावना के बारे में चिंतित जांचकर्ताओं के लिए, हालांकि, चूहों पर नियंत्रण aspirated वाहन (यानी, बफर) को उजागर किया जा सकता है अगर वांछित। हालांकि पेट लुमेन (अवशिष्ट unaspirated बैक्टीरिया के निगलने के माध्यम से) के कुछ संदूषण संभव बुद्धि हैज विधि का वर्णन हम, हम कभी नहीं जठरांत्र नैदानिक ​​लक्षण या सकल विकृति पर परिवर्तन का सामना करना पड़ा है। इसके अलावा, इस संभावना aerosolization और intranasal तरीकों के लिए आम है, और यहां तक ​​कि intratracheal टीका विधि में खाँसी के बाद हो सकता है।

कुछ पद्धति चिंताओं सभी निमोनिया मॉडल के लिए सार्वभौमिक हैं। नियंत्रण और प्रयोगात्मक माउस समूहों उम्र से मिलान के लिए एक दूसरे के 2-3 सप्ताह के भीतर आदर्श होना चाहिए। हालांकि हम नहीं मिला है लालकृष्ण में रोगज़नक़ निकासी या airway सूजन में प्रकट लिंग भेद निमोनिया मॉडल, चूहों, लिंग-मिलान किया जाना चाहिए के रूप में सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में लिंग के बीच महत्वपूर्ण अंतर 16 सूचित किया गया है। चूहों पर नियंत्रण की उत्पत्ति के लिए सावधान ध्यान दिया जाना चाहिए। Littermate नियंत्रण आम तौर पर अधूरा backcrossing, प्रतिरक्षा सेल आबादी में Microbiome संबंधी मतभेद, और अन्य epigenet के रूप में वाणिज्यिक खरीदा नियंत्रण पर बेहतर कर रहे हैंआईसी मतभेद सभी संभव confounders कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 17,18 को प्रभावित कर सकते हैं। सावधान ध्यान विशिष्ट सीरोटाइप को दी जानी चाहिए और डाह में काफी मतभेद के रूप में संक्रमित जीवाणु के संवर्धन के इतिहास में देखा जा सकता है। लालकृष्ण साथ हमारे अनुभव के आधार पर निमोनिया, हम inocula को संक्रमित करने की एक सीमा का उपयोग प्रारंभिक पायलट अध्ययन प्रदर्शन की सिफारिश (जैसे, 500-2,000 CFU) साहित्य में रिपोर्ट विशिष्ट जीवाणु खुराक की रुग्णता / मृत्यु दर के रूप में - यहां तक कि एक ही बैक्टीरियल सीरोटाइप और माउस तनाव के साथ - अच्छी तरह से अनुवाद नहीं हो सकता एक की अपनी प्रयोगशाला, संभावना के लिए तकनीकी विसंगतियों की एक किस्म की वजह से। भड़काऊ और मेजबान बचाव परिणामों में नियंत्रण और प्रयोगात्मक चूहों के बीच अंतर-समूह मतभेद inoculum पर निर्भर हो सकता है। पशु प्रजनन और स्टाफ के साजो वास्तविकताओं के कारण, हम अक्सर प्रयोगात्मक समूह प्रति 5-6 चूहों के साथ प्रयोगों का संचालन। यह कभी कभी CF के लिए पर्याप्त सांख्यिकीय शक्ति प्रदान करता है यद्यपियू और कोशिका गिनती परिणामों, हम पाते हैं कि हम अक्सर क्रम में पर्याप्त बिजली प्राप्त करने के लिए एक या अधिक बार इस आकार के एक अध्ययन दोहराने की जरूरत है।

एक भी प्रयोग में कुछ चूहों के लिए, रक्त और तिल्ली में नहीं detectable बैक्टीरिया विकास के 24 घंटा के बाद संक्रमण (चित्रा 5) से सामना हो सकता है। हम इस व्याख्या से संकेत मिलता है कि 24 घंटा detectable extrapulmonary प्रसार के लिए गतिज सीमा के पास हो सकता है। रक्त / तिल्ली में कम / undetectable विकास मनाया जाता है, एक ही माउस से फेफड़ों CFUs हमेशा एक तकनीकी त्रुटि की संभावना को संबोधित करने के लिए जांच की जानी चाहिए (यानी, बहुत कम / undetectable फेफड़े में संक्रमण संभवतः माउस की खुराक में एक त्रुटि का संकेत है)।

समापन में, चूहों में बैक्टीरियल निमोनिया के लिए oropharyngeal आकांक्षा वितरण पद्धति एक मजबूत तकनीक के लिए एक लागत, प्रशिक्षण, उपकरण और दृष्टिकोण से प्राप्त करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है, और यहां तक ​​कि व्यापक विशेषज्ञता के बिना प्रयोगशालाओं के लिए यथार्थवादी हैफेफड़े प्रक्रियाओं में। विधि आसानी से मेजबान बचाव प्रतिक्रिया के बहाव के सूक्ष्मजीवविज्ञानी और प्रतिरक्षाविज्ञानी assays के लिए युग्मित है, और इसके अलावा गैर-कास्टिक जोखिम की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए एक फेफड़ों वितरण पद्धति के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Klebsiella pneumoniae, serotype 2 ATCC 43816
Tryptic soy broth Becton Dickenson 211825
Excel Safelet IV Catheters, 18 G x 1 1/4" Claflin Medical Equipment MEDC-031122
Hema 3 Solution 1 Fisher 23-122-937
Hema 3 Solution 2 Fisher 23-122-952
Hema 3 Fixative Fisher 23-122-929
27½ gauge tuberculin syringes Fisher 14-826-87
Lithium heparin plasma collectors Fisher 2675187
L-shaped disposable spreaders Lab Scientific DSC
1x PBS, pH 7.4 prepared in-house n/a Distilled water (5 L), NaCl (40 g), KCl (1 g), Na2HPO4 (5.75 g), KH2PO4 (1 g)   
ACK lysis buffer prepared in-house n/a NH4Cl (4.145 g), KHCO3 (0.5 g), EDTA (18.6 mg), bring up to 500 ml with distilled water and pH to 7.4

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References

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चूहे में प्रेरण और प्रायोगिक बैक्टीरियल निमोनिया की phenotyping के लिए एक गैर-आक्रामक और तकनीकी तौर पर गैर-गहन विधि
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Madenspacher, J. H., Fessler, M. B. A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54508, doi:10.3791/54508 (2016).More

Madenspacher, J. H., Fessler, M. B. A Non-invasive and Technically Non-intensive Method for Induction and Phenotyping of Experimental Bacterial Pneumonia in Mice. J. Vis. Exp. (115), e54508, doi:10.3791/54508 (2016).

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