Introduction
De flesta djur är starkt beroende av deras kemiska sinnen för att interagera med sin omgivning. Luktsinnet spelar en viktig roll för att hitta och utvärdera mat, undvika rovdjur och lokalisera lämpliga parningspartner. I de flesta däggdjur, består luktsystemet minst fyra anatomiskt och funktionellt distinkta perifera delsystem: huvud luktepitel 1,2, den Grueneberg ganglion 3,4, den septal organ Masera 5,6 och Vomeronasalorganet. VNO omfattar perifer sensorisk struktur tillbehöret luktsinne (AOS), som spelar en viktig roll i att upptäcka kemiska signaler som förmedlar information om identitet, kön, social rang och sexuell tillstånd 7-10. VNO är belägen vid basen av nässkiljeväggen precis ovanför gommen. I möss, är det en bilateral blinda sinande röret inneslutna i en brosk kapsel 11-13. Orgeln består av både en halvmåneformad medial sensorisk epitheLium som hyser de VSNs och är av icke-sensoriska delen på den laterala sidan. Mellan de båda epitel ligger en slemfyllda hålrum som är ansluten till näshålan via den smala vomeronasala kanalen 14. En stor lateral blodkärl i den icke-sensoriska vävnad ger en kärlpumpmekanism för att underlätta inträde av relativt stora, mestadels icke-flyktiga molekyler såsom peptider eller små proteiner i VNO lumen genom undertryck 15,16. De strukturella komponenterna i VNO är närvarande vid födseln och orgeln når vuxen storlek strax före puberteten 17. Men om gnagare AOS är redan funktionell i ungdomar är fortfarande föremål för debatt 18-20.
VSNs särskiljs genom både deras epitelial läge och den typ av receptor de uttrycker. VSNs visar en bipolär morfologi med en omyeliniserad axon och ett enda apikala dendrit som skjuter ut i riktning mot lumen och slutar i en microvillous dendritisk knopp. VSN axeons fasciculate att bilda vomeronasala nerv som lämnar brosk kapsel vid dorso-kaudala ände, stiger längs membranet, passerar cribrosa plattan och projekt till tillbehöret luktbulben (AOB) 21,22. Vomeronasala sensoriska epitel består av två skikt: den apikala lagret ligger närmare luminala sidan och hamnar både V1R- och alla utom en typ av FPR-rs-uttryckande nervceller. Dessa nervceller samtidigt uttrycka G-protein α-subenhet G αi2 och projekt till den främre delen av AOB 23-25. Sensoriska neuroner belägna i mer basal lager express V2Rs eller FPR-RS1 tillsammans G αo och skicka sina axoner till den bakre regionen av AOB 26-28.
Vomeronasala nervceller är sannolikt aktiveras av ganska små semiochemicals 29-33 (V1Rs) eller proteinartade föreningar 34-38 (V2Rs) som utsöndras i olika kroppsvätskor såsom urin, saliv och tårvätska 37,39-41 In situ experiment har visat att VSNs också aktiveras genom formyleras peptider och olika antimikrobiella / inflammation bundna föreningarna 25,42. Dessutom heterologt uttryckt FPR-rs proteiner delar agonist spektra med FPRs uttrycks i immunsystemet, vilket tyder på en potentiell roll som detektorer för sjukdom i artfränder eller förstörda matkällor 25 (se referens 43).
Grundläggande för att förstå receptor-ligand relationer och nedströms signaleringskaskader i specifika VSN populationer är en detaljerad utvärdering av deras grundläggande biofysikaliska egenskaper i en infödd miljö. I det förflutna, har analysen av cellulära signalerings kraftigt dragit nytta av genetiskt modifierade djur som markerar en definierad population av nervceller genom samuttrycker en fluorescerande markörprotein 30,44-49. I detta protokoll, en transgen mus linje som uttrycker FPR-RS3 tillsammans med en fluorescerande markör (Fpr-RS3-i-Venus) används.Detta tillvägagångssätt exemplifierar hur man använder en sådan genetiskt modifierad musstam för att utföra elektrofysiologiska analys av ett optiskt identifierbar cellpopulation med hjälp av enda neuron patch-clamp inspelningar i akut koronala VNO vävnadssnitt. En tryckluftsdriven flera fat perfusion system för sensoriska stimuli och farmakologiska medel ger snabb, reversibel och fokal neuronal stimulering eller hämning under inspelningar. Helcells-inspelningar i slice förberedelser möjliggör en detaljerad analys av inneboende egenskaper, spänningsaktiverade conductances, liksom handlings potentiella mönster urladdnings i cellens naturliga miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök var i överensstämmelse med lokala och EU: s lagstiftning om skydd av djur som används i experimentellt syfte (direktiv 86/609 / EEG) och med rekommendationer från Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Både C57BL / 6-möss och Fpr-RS3-i-Venus-möss hölls i grupper av båda könen vid rumstemperatur på en 12 h ljus / mörkercykel med mat och vatten tillgängligt ad libitum. För experiment unga vuxna (6-20 veckor) av endera kön användes. Inga uppenbara skillnader könsberoende observerades.
1. Lösning Beredning
- Förbereda extracellulär lösning S 1: 4- (2-hydroxi-etyl) piperazin-1-etansulfonsyra (HEPES) buffrad extracellulär lösning innehållande (i mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (justerat med NaOH); osmolaritet = 300 mOsm (justerat med glukos).
- förbereda extracellular lösning S 2: Carbogen-syresatt (95% O2, 5% CO2) extracellulär lösning innehållande (i mM) 125 NaCl, 25 NaHCOs 3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; osmolaritet = 300 mOsm (justerat med glukos).
- Förbered 4% låg-gelningstemperatur agaroslösningen (S 3) för vävnad inbäddning: 4% låg-gelningstemperatur agaros. Lös upp 2 g låg-gelande agaros i 50 ml S 1 i en 100 ml glaslaboratorieflaska tillsammans med en magnetisk omrörare. För smältning av agaros, lägga flaskan i ett vattenbad (med locket inte tätt försluten) vid 70 ° C i ungefär 20 minuter eller tills lösningen blir transparent under omröring. Kyl ner och hålla smält agaros i ett andra vattenbad vid 42 ° C tills vidare användning.
- Förbereda intracellulär lösning S 4: Pipettera lösning innehållande (i mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (fri Ca2 + = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, en NaGTP;pH = 7,1 (justerat med KOH); osmolaritet = 290 mOsm.
- Ändra / justera sammansättningen av S 1, S 2 och S 4 i enlighet med individuella experimentell design (t.ex. för att farmakologiska blockerare isolera vissa typer av spänningsaktiverade strömmar).
2. Arbetsyta Framställning
- Fyll syre skiva lagringskammare med S2 åtminstone 30 minuter före dissektion, plats på is för temperatur och pH-justering och syrelösning kontinuerligt.
- Fyll reservoar för skiva superfusion vid inspelning setup med S2 och syre kontinuerligt.
- Före dissektion, fylla vibratome kammare med S2 och ordna krossad is runt kammaren. Alternativt, överför reserv iskall syrelösning från syrekammaren in vibratome kammaren och hålla kontinuerlig syresättning.
- Ordna kirurgiska verktyg och förnödenheter.
- Placera is gel pack enligt dissekeramikroskop, täck med en pappershandduk för att förhindra VNO vävnad från att frysa till botten av skålen.
- Ren rakblad genom att kort sköljning i 70% etanol och destillerat vatten och montera på vibratome. Byt för varje skivsession.
3. VNO Dissection och Inbäddning
- Offra djur genom kortvarig exponering för CO2 och decapitate att använda vassa kirurgiska saxar. Obs! Allt eftersom tiden från att offra djuret att ge VNO kapseln på is är kritisk, minimera tiden till mindre än två minuter. För att upprätthålla vävnad livskraft, bädda både helt dissekerade VNOs i agaros i mindre än 30 minuter.
- Ta bort underkäken med stora kirurgiska saxar. Gå in genom munhålan och skär underkäken ben och muskler på varje sida för sig.
- Placera den återstående delen av huvudet upp och ned i den stora petriskål.
- Dra bort huden på överkäken och runt spetsen på näsan med medel pincett för att få bättre tillgång till denframtänder.
- Använda ben sax för att klippa bort den största delen av framtänderna på en ~ 45 ° vinkel i den rostrala riktningen (Figur 1A). Detta kommer att underlätta avlägsnande av VNO kapseln från näshålan.
Obs: Skär inte till roten av tanden för att förhindra skador på spetsen av VNO kapseln. - Ta den stela övre gommen vid rostralt del med medel pincett och försiktigt dra tillbaka i ett stycke i en flack vinkel (Figur 1B).
Obs: Upprepade gånger skölj med iskall S2. - Använd mikro fjäder sax för att klippa benfusion mellan spetsen på Vomer ben och käken. Sätt sax tips med den böjda delen av spetsen pekar utåt bort från VNO och försiktigt skära benet i små steg på både vänster och höger sida i sidled till VNO kapseln.
- För att ta bort VNO kapsel, använder mikro våren sax för att klippa igenom Vomer ben vid den bakre delen och lyft försiktigt Vomer ben ur nAsal kavitet med användning medel pincett. Överför omedelbart VNO till en liten petriskål under ett stereomikroskop på en is gelpackning där de återstående stegen i dissektion kommer att utföras.
- Skölj VNO i en liten mängd iskall S 2 för att förhindra att vävnaden torkar ut.
- Separera de broskartade kapslar som innehåller de VNO mjuka vävnader genom att ta tag i baksidan av Vomer ben med medel pincett. Placera kapsel för en rygg vy så att en uppdelning mellan de båda VNOs blir synlig (Figur 1D i).
- Använd spetsen av fina pincett för att separera både brosk VNO kapslar från centrala benet samtidigt som Vomer ben nålas ner på den bakre delen.
Obs: Använd pincett endast vid kanten av brosk kapseln och vara mycket noga med att inte tränga igenom brosk som den känsliga sensoriska epitel skadas lätt. - När de två VNOs separeras, börja ta bort brosk kapsla granarnat VNO.
- Greppa den övre kanten av kapseln med en fin pincett och dela bort brosket väggen som tidigare var fäst vid Vomer ben (medial sida).
- För att ta bort kvarvarande brosk vända VNO med sin krökta laterala sidan till botten av skålen och säkert hålla fast brosket på ena sidan med hjälp av pincett. Flytta försiktigt den andra fin pincett från baksidan på en mycket flack vinkel mellan brosk och VNO att lossa kopplingen mellan vävnad och brosk.
- Dra långsamt VNO bort från brosk genom att hålla den vid sin stjärtfenan spets, för att undvika skador på sensoriska epitel.
- När VNO är levered från kapseln, se till att avlägsna alla återstående små broskdelar som alla återstående bitar av brosk kommer loss vävnaden från omgivande agaros under skivprocessen.
- Placera en liten droppe iskall S 2 på första dissekerade VNO att förhindra vävnadsskada. Ett stort blodkärl på den laterala wil sidanl syns indikerar att organ är fortfarande intakt och inte grovt skadas under dissektionen (Figur 2A ii). I fall blodkärlet har skadats, kommer det fortfarande vara värt att fortsätta med skiv VNO så länge som den totala morfologin inte klart försämrad.
- Omedelbart dissekera den andra VNO.
- Att bädda in VNOs, fylla både små petriskålar till kanten med smält S 3 (lagrad i vattenbad vid 42 ° C, se 1.3).
- Håll VNO på bredare svans änden med fin pincett för att undvika skador på sensoriska epitel.
- Sänk VNO i agarosen och flytta den horisontellt fram och tillbaka flera gånger för att avlägsna filmen av extracellulärt lösning samt eventuella luftbubblor från dess yta.
- Positionera VNO vertikalt med den kaudala spets är vänd mot botten av skålen. I stället för att klämma VNO med tången direkt, justera orienteringen genom att flytta pincett spets i nära Proximity till VNO.
Obs: Orientering under inbäddning är avgörande eftersom den bestämmer skiva plan och tillgänglighet till sensoriska neuroner under experimentet. - Placera rätter på gel kylpåse och vänta tills agarosen stelnat.
Obs: Ändra inte VNO orientering när agarosen har börjat stelna eftersom detta kommer att ta bort vävnad från den omgivande agaros.
4. Coronal VNO Tissue Skivning
- Använd liten spatel för att avlägsna agaros kvarter från den lilla skålen i locket på en stor petriskål, vända agarosen uppochned lämnar svansspets VNO uppåt.
- Skär blocket i en pyramidform med hjälp av en kirurgisk skalpell (3-4 mm i spetsen, 8-10 mm längst ner). Se till att inte skada den inbäddade vävnaden.
- Använd superlim för att fixa pyramidformade block till mitten av vibratome provplattan och vänta ~ 1 min för limmet torka helt.
- Överför provplattan på skiv cHamber och förbereda andra VNO följaktligen. Hålla plattan med den andra provkroppen vid 4 ° C fram till användning.
- Använd en vibrerande blad mikrotom med följande inställningar: tjocklek: 150-200 pm; hastighet: 3,5 au = 0,15 mm / sek; frekvens: 7,5 AU = 75 Hz. Överföra skivor till syrekammaren fram till användning efter en kort inspektion skiva morfologi under dissekera mikroskop. Skivor kan förvaras flera timmar.
5. Encelliga elektrofysiologiska inspelningar
- För inspelningar, använda en upprätt fasta scenen mikroskop utrustat med nedsänkning i vatten mål, Dodt eller infraröd differential störande kontrast (IR-DIC), och epi-fluorescens samt en kyld CCD-kamera. För datainsamling, använda en patch-clamp förstärkare, huvudet scenen, AD / DA-gränssnittskortet och en dator (inklusive programvara inspelning).
- Förbered ett lager av 10-20 patch pipetter (4-7 MQ). Dra pipetter av borsilikatglas kapillärer (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) A n vändaga mikropipett avdragare och brand polera med en microforge.
Obs: Brand polering pipettspetsarna är avgörande när lappa de ganska små VSNs. Detta kommer att bidra till att förhindra bristning av cellmembranet vid tillämpning negativt tryck för att erhålla ett högt motstånd tätning. Efter polering pipetten öppningen bör vara ungefär 1 fim. - Håll pipetter i en pipett förvaringsburk för att förhindra skador och damm ansamling fram till användning.
- Förbered perfusion systemet genom att fylla lösnings reservoarer och slangar enligt experimentell design.
Obs: Ta bort luftbubblor från slangen helt, eftersom de kommer att kraftigt störa elektrofysiologiska inspelningar. - Justera trycket för att uppnå ~ 3 ml / min flöde.
Obs: högt tryck kommer att orsaka förflyttning av vävnad skiva samt uppsägning av elektrofysiologiska inspelningar. - Överför VNO skiva till avbildning kammaren och fixera skiva position med rostfritt stål ankare trådbunden med 0,1 mm tjock synthetic fibrer (Figur 2B - C).
Obs: Täck inte vävnaden skiva med en av de syntetiska fibertrådar utan agarosen omger skiva. - Överföring avbildning kammare till inspelning inställning och kontinuerligt superfuse skiva med syre S2 vid rumstemperatur via ett bad ansökan.
- Justera sug kapillär till ytan av lösningen för att skapa en långsam sugning för ständigt utbyte av badlösningen. Justera 8-i-ett multi-fat "perfusion penna" ovanför och intill den icke-sensoriska delen av VNO segment som innehåller blodkärlet (Figur 2C, 3A) 50. Det kommer att vara fördelaktigt att ordna perfusion penna och inspelning pipett vara vänd mot skiva från motsatta riktningar.
- Ansluta referenselektrod och badlösningen med användning av en L-formad agar bro (fylld med 150 mM KCl).
- Fyll patch pipett med pipett lösning S 4.
- Montera pipetten över silverklorid-belagd lappelektrod ansluten till huvudet scenen utan att skrapa bort beläggningen och fäst ordentligt.
- Anbringa ett lätt positivt tryck (ca 1 ml på en plastspruta 10 ml) och fläckpipetten innan de kommer till badet.
- Sänk pipetten i badet med hjälp av mikro manipulatorer tillräckligt långt för att kunna dränka målet utan att träffa den (figur 2D).
- Övervaka pipett motstånd (R pip, mellan 4-7 Mohm) med användning av elektrofysiologi mjukvara ansluten till huvudet scenen.
Obs: Om R pip är <4 Mohm glasspetsen är bruten. Om R pip är> 10 MQ är spetsen troligtvis igensatt och pipetten måste bytas ut. - Visualisera VNO skiva med en CCD-kamera med IR-optimerad differential interferens kontrast (DIC) och identifiera FPR-RS3-i-Venus uttryckande celler (eller liknande märkta neuroner) med hjälp av fluorescensbelysningoch ett lämpligt filter kub.
- Fokus och mål fluorescerande eller icke-fluorescerande celler beroende på experimentell design.
- Att närma sig cellkroppen, använder rattar för maximal känslighet. På grund av övertryck, blir en liten buckla i cell soma membranet synlig när pipettspetsen är i närheten.
- Frisätta positivt tryck och anbringa ett lätt negativt tryck för att suga i cellmembranet för att få ett högt motstånd tätning (1-20 GΩ). Tillämpa kort och varsam sugning för att störa cellmembranet och etablera konfigurationen whole-cell.
- Övervaka tillgång motstånd konstant under experimentet.
Obs: inkludera endast neuroner som uppvisar små och stabil tillgång motstånd (≤3% av R-ingång, förändring <20% under loppet av experimentet) i analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att få en inblick i de biofysiska och fysiologiska egenskaper hos definierade cellpopulationer, utför vi akut coronal vävnadssnitt på musen VNO (Figur 1-2). Efter dissektion, kan skivor förvaras i iskall syresatt extracellulär lösning (S 2) för flera timmar. Vid inspelningen setup, en konstant utbyte med färsk syrelösning (Figur 2D) säkerställer vävnad livskraft i hela experimentet. Vi här använder en transgen musmodell (FPR-RS3-i-Venus). VSNs i denna stam samuttrycker en fluorescerande markörprotein med FPR-RS3, en proto medlem i FPR-rs genfamiljen (Figur 3) möjliggör optisk identifiering av en definierad population av sensoriska neuroner. Elektrofysiologiska inspelningar ge möjligheter till fördjupad analys vid encelliga nivå. Till exempel är analys av spänningskänsliga strömmar utförs i spännings-clampläge (Figur 4A - B). För att isolera vissa typer av jonströmmar är skivor superfuseras med farmakologiska medel såsom TTX att hämma spänningskänsliga Na + strömmar (Figur 4A) eller nifedipin att blockera spänningskänsliga L-typ Ca2 + strömmar (Figur 4B). Dessutom utför vi rutinmässigt helcells-inspelningar i den aktuella kläm konfiguration för att analysera handlings potentiella mönster urladdnings (Figur 4C). Förutom helcells-inspelningar, cell fäst "löst säl inspelningar ger en mindre invasiv metod som förhindrar dialys av intracellulära komponenter (Figur 5A). Inspelning aktionspotentialen drivna kapacitiva strömmar på kort stimulans applikation erbjuder en känslig och effektivt sätt att screena för sensoriska ligander (t.ex. stora urinproteiner, MUPS) som aktiverar definierade populationer av celler 51 (figur 5B).
= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figur 1: Dissekering av VNO. (A) från sidan på musen huvudet för att illustrera läget och vinkeln vid vilken framtänderna skärs. (B) Ventrala vy som visar den bästa punkten att greppa och dra tillbaka den övre gommen (UP). (C) Ventral vy till brosk kapseln (CC) som hyser VNO och Vomer ben (VB) efter avlägsnande av underkäken, framtänder och gommen. (D) Dorsal vy av dissekerade VNO kapsel som avbildar det bilaterala lokalisering av både VNOs (D i). Den laterala vy illustrerar kanten på brosket på ryggsidan där både VNOs måste separeras (D ii). Skalstreck = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Vävnadsberedning, inspelningskammaren och mikroskop skede Schematisk sidovy på en VNO för att illustrera kursen och positionen för stort blodkärl (BV) i den icke-sensoriska delen av epitelet (A i). Den streckade linjen representerar den koronala skivning skiktet. Lateral utsikt över en VNO skalade av CC visar blodkärlet (A II). (B) Agaros-inbäddade koronalt VNO vävnad skiva fäst vid botten av lösningen fyllda inspelning kammare med användning av en rostfri ankare wired med 0,1 mm tjock syntetfibrer (SF) trådar. Den inramade området visar agarosen omgivande vävnaden slice. (C) Schematisk vy illustrerande positionen och orienteringen av en agaros (Ag) -embedded koronala VNO skiva placerad mellan två fibrer. (D) Översikt över inspelningen kammaren placerad på mikroskop scenen. Kammaren är utrustad med bad applikation (BA) för konstant superfusion med syresatt S 2, perfusionen penna (PP) för att tillämpa sensoriska stimuli eller farmakologiska medel, inspelnings pipett (RP) som är ansluten till förstärkaren huvudet scenen, referenselektroden (RE ) och insugnings kapillär (SC) för att upprätthålla ett konstant utbyte av lösningen i kammaren. Skalstreck = 1 mm (A II). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: frontala VNO tissue slice. (A) Confocal bild (maximal projektion) av en 150 | j, m akut koronala VNO vävnad skiva som visar fördelningen av fluorescerande FPR-RS3 tau-Venus + neuroner (grönt) i vomeronasala sensoriska epitelet. Blodkärl (BV), lumen (L), sensoriska epitel (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venus + neuroner uppvisar en enda apikal Dendrite slutar i en knopp-liknande struktur på den luminala gränsen. Helcells-patch-clamp inspelningar utfördes från VSN soma, patch pipett (PP). (C) Morfologi av en enda VSN med den dendritiska ratten (K) vid spetsen av det långa och smala dendrit (D), cellen soma (S) och axonet (A) som lämnar soma på basalsidan. Skalstrecken, 50 ^ m (A), 10 | j, m (B), 5 | j, m (C). Denna siffra har ändrats från 52. Klicka häratt se en större version av denna siffra.
Figur 4: Isolerad spänningskänsliga Na + och Ca2 + strömmar samt spik urladdning (A) Representativa spår från helcells-patch-clamp inspelningar av en TTX-känsliga snabb aktiverande Na + ström i FPR-RS3 + VSNs.. (Ai) Spänning steginspelning under kontroll förhållanden (extracellulärt lösning S 1, intracellulär lösning S 4) avslöjar en spänningsberoende snabb och övergående inåtgående ström. (A ii) TTX behandling (1 M) minskar kraftigt strömmen. Digitalt subtraheras spår (kontroll-TTX (A iii)) reveals TTX-känsliga spänningskänsliga Na + ström. Ström-spänning relationer TTX-känsliga Na + strömmar isolerade från kontroll- och FPR-RS3 + neuroner (A iv). (B) representant Ca2 + nuvarande spår isolerade farmakologiskt (10 iM nifedipin). (C) Representativa Tång spår visar de- / hyperpolarisering och tåg (rebound) aktionspotentialer som genereras vid stegvis positiv (C i) och negativa (C III) ströminjektion. Notera spontan aktivitet mäts vid 0 pA ströminjektion (C ii). (C iv) Firing frekvensen för kontroll och FPR-RS3 + neuroner som en funktion av den injicerade strömmen (I injicerar). Den gradvisa ökningen av eldhastighet är likartad för kontrolloch FPR-RS3 + VSNs. Observera att VSNs är utsökt känsliga för nuvarande injektioner även i låga picoamperes intervallet 53-56. Observera att f -I kurvor har "bakgrunds korrigeras" med spontana tillsatta frekvensen vid 0 pA ströminjektion. Data är medel ± SEM. Denna siffra har ändrats från 52. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Extracellulära "lös lapp" inspelningar från basala VSNs (A) IR-DIC bilden av en akut VNO vävnad skiva som visar inspelnings pipetten i basalskiktet av det sensoriska epiteliet.. (B) representant ursprungliga inspelningen av en basal VSN i cellen-anslutna konfiguration (&# 39; löst säl) svarar med korta övergående skurar av spikar för att informera stimuli (3 sek) med poolade rekombinant uttryckta stora urin proteiner (rMUPs) och en förhöjd kaliumkoncentration (50 mM, 1 sek) respektive (B i) . Högre förstoring av inspelningar som visas i (B i) illustrerar skurar av spikar som svar på stimuli (B II). Röda staplar indikerar tidpunkten för stimulering, inter-stimulus intervall = 30 sek, kontinuerlig inspelning, avbrott <1 sek (skurna märken //). Skalstreck = 5 ^ m (A). Panel (A) har ändrats från referens 38. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VNO är en chemosensory struktur som detekterar semiochemicals. Hittills förblir huvuddelen av vomeronasala receptorer som skall deorphanized eftersom endast några receptor-ligand par har identifierats. Bland dem var V1rb2 beskrivits specifikt aktiveras av manliga urin feromon 2-heptanon 30 till V2rp5 aktiveras av manliga specifika feromon ESP1 57 samt V2r1b och V2rf2 att aktiveras av MHC peptiderna SYFPEITHI 48 och SEIDLILGY 58, respektive. En förutsättning för att förstå receptor-ligand relationer och signaltransduktion är kunskap om biofysikaliska egenskaper definierade VSN populationer i en infödd miljö. Passiva och aktiva membranegenskaper, spänningskänsliga joniska conductances och aktionspotential urladdningsmönster definiera hur och i vilken omfattning receptor neuroner svarar på Chemosensory stimuli. Elektrofysiologiska inspelningar i akut vävnadsskivor och i synnerhet, somle-cell patch-clamp inspelningar ger en utmärkt metod för att analysera dessa egenskaper i detalj.
Ett kritiskt steg för framgångsrika och tillförlitliga fysiologiska inspelningar i vävnadssnitt är själva beredningen. För att maximera den tidsperiod för att utföra experiment, måste vävnaden skivas och överfördes till iskall syrelösning omedelbart efter dissektion. Till följd av detta, kan skivor förvaras i flera timmar möjliggör analys av ett stort antal celler per experimentell dag. Det tar lite övning för att minska tiden för att dissekera och bädda båda VNOs av ett djur i mindre än 30 minuter. Efter det är framgång för en erfaren försöksledaren att få flera intakta vävnadsskivor med levande celler väl över 75%. Utföra patch-clamp inspelningar är en låg genomströmning experimentellt förhållande i jämförelse med Ca 2 + avbildning. Ändå tillåter den en mer detaljerad och mångsidig analys av aktivitet på encelliga nivå med en mycket högre tidsmässigupplösning. Konfiguration hela celler, är den intracellulära mediet dialys av pipetten lösning. Medan pipetten lösning kanske inte exakt cytosoliska sammansättning, ger den försöks med exakt kontroll över både extra- och intracellulära joniska förhållanden. För tillförlitlig tolkning av resultat är avgörande kontinuerlig övervakning av tillgång motstånd och läckström. Ibland en betydande ökning eller stark förändring i fråga om tillgång motstånd eller läckström leder till tolkningsbara resultat och därmed kräver dessa inspelningar som skall kasseras. Dessutom är det viktigt att notera att vissa farmakologiska föreningar binder irreversibelt gör det nödvändigt att ersätta segment efter varje inspelning.
Inspelning i cellen-anslutna konfiguration förhindrar dialys av intracellulära komponenter och påverkar inte cellens membranpotentialen. Sålunda ger denna teknik en mindre invasiv och relativt snabbt sätt för screening. Men detta lämpACH är i allmänhet begränsad till inspelning av super-tröskel aktionspotentialens drivna kapacitiva strömmar från utsidan av cellmembranet. Lös-patch inspelningar har visat sig vara lämplig för att analysera spiking beteendet hos ett större antal sensoriska neuroner i VNO skivor 38,54.
Den transgena modell som används här ger ett pålitligt verktyg för att identifiera och analysera befolkningen i FPR-RS3 uttrycker VSNs. Dessutom kan den teknik som beskrivs här utökas till andra linjer oberoende av deras genotyp. Trots den enorma fördelen att utreda en definierad celltyp med hjälp av transgena möss begränsar experiment till de tillgängliga linjerna. Nyligen har dock riktat genomet redigering bli snabbare och billigare med crispr / Cas9 teknik 59. Sammanfattningsvis riktade patch-clamp inspelningar i akut vomeronasala vävnadssnitt ger en mångsidig strategi för att karakterisera biofysiska och fysiologiska egenskaper hos en definierad population av sensoriska neuroner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
- Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
- Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
- Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
- Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A. From Pheromones to Behavior. Physiol. Rev. 89, 921-956 (2009).
- Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
- Keverne, E. B. The Vomeronasal Organ. Science. 286 (5440), 716-720 (1999).
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
- Liberles, S. D. Mammalian pheromones. Annu. Rev. Physiol. 76, 151-175 (2014).
- Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
- Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
- Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
- Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
- Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
- Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
- Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
- Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
- Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
- Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
- Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
- Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
- Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
- Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
- Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
- Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
- Isogai, Y., et al. Molecular organization of vomeronasal chemoreception. Nature. 478 (7368), 241-245 (2011).
- Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
- Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
- Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
- Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
- Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
- Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
- Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
- Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
- Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
- Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
- Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
- Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
- Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
