Introduction
A maioria dos animais dependem muito de seus sentidos químicos para interagir com os seus arredores. O sentido do olfato desempenha um papel essencial para encontrar e avaliar alimentos, evitando predadores e localização de parceiros de acasalamento adequados. Na maior parte dos mamíferos, o sistema olfactivo consiste em, pelo menos, quatro subsistemas anatomicamente e funcionalmente distintas: periféricas do epitélio olfactivo principal de 1,2, o gânglio Grueneberg 3,4, o órgão do septo de Masera 5,6 e o órgão vomeronasal. O VNO compreende a estrutura sensorial periférica do sistema olfativo acessório (AOS), que desempenha um papel importante na detecção de sinais químicos que transmitem informações sobre a identidade, sexo, classe social e estado sexual 7-10. O VNO está localizado na base do septo nasal direita acima do palato. Em ratos, que é um tubo que termina bilateral-cego contidas numa cápsula cartilaginosa 11-13. O órgão consiste em um Epítetos sensorial medial em forma de crescentelium que abriga os VSNs e de uma parte não-sensorial no lado lateral. Entre ambos os epitélios encontra-se um lúmen cheio de muco que está ligado à cavidade nasal através da conduta 14 estreita vomeronasal. Um grande vaso sanguíneo lateral no tecido não-sensorial fornece um mecanismo de bombagem vasculares para facilitar a entrada de moléculas relativamente grandes, na sua maior parte não-voláteis, tais como péptidos ou proteínas pequenas para o lúmen através VNO pressão negativa 15,16. Os componentes estruturais da VNO estão presentes no nascimento e o órgão atinge o tamanho adulto logo antes da puberdade 17. No entanto, se a AOS roedor já é funcional em juvenis ainda está sujeito a debate 18-20.
VSNs distinguem-se por tanto a sua localização epitelial e do tipo de receptor de eles expressam. VSNs mostram uma morfologia bipolar com um axónio e não mielinizadas um único dendrite apical que se projecta para o lúmen e termina num botão dendrítica microvilosidades. ax VSNons fasciculate para formar o nervo vomeronasal, que deixa a cápsula cartilaginosa no final dorso-caudal, ascende ao longo do septo, passa a placa cribiforme e projetos para o bulbo olfativo acessório (AOB) 21,22. O epitélio sensorial vomeronasal consiste de duas camadas: a camada apical está localizada mais perto do lado luminal e portos tanto V1R- e todos menos um tipo de FPR-rs-expressando neurónios. Esses neurônios co-expressar o G αi2 à proteína G α-subunidade e projeto para a parte anterior da AOB 23-25. Neurônios sensoriais localizadas nas V2Rs expressas camada mais basal ou FPR-rs1 ao lado G αo e enviam seus axônios para a região posterior da AOB 26-28.
Vomeronasal neurónios são activados por provavelmente bastante pequenas (29-33 semioquímicos V1Rs) ou compostos proteicos (34-38 V2Rs) que são secretadas em vários fluidos corporais, tais como urina, saliva e fluido lacrimal 37,39-41 Em experiências in situ demonstraram que VSNs também são activadas por péptidos formilados e vários compostos antimicrobianos / ligada à inflamação 25,42. Além disso, de forma heteróloga expressa proteínas FPR-R partilham espectros de agonistas com FPRs expressas no sistema imunitário, indicando um potencial papel como detectores de doença em animais da mesma espécie ou de fontes de alimentos deteriorados 25 (ver referência 43).
Fundamental para a compreensão das relações receptor-ligando e cascatas de sinalização a jusante em populações específicas VSN é uma avaliação detalhada de suas características biofísicas básicas em um ambiente nativo. No passado, a análise de sinalização celular grandemente beneficiado a partir de animais geneticamente modificados que marcam uma população definida de neurónios por co-expressam uma proteína marcador fluorescente 30,44-49. Neste protocolo, uma linha de ratinhos transgénicos que expressa FPR-RS3 em conjunto com um marcador fluorescente (FPR-RS3-i-Vénus) é usado.Esta abordagem exemplifica como empregar tal estirpe de ratinhos geneticamente modificados para desempenhar análise eletrofisiológica de uma população de células opticamente identificáveis utilizando único neurônio gravações de patch-clamp em coronais fatias aguda do tecido VNO. Uma pressão-driven de ar do sistema de perfusão multi-barril para estímulos sensoriais e agentes farmacológicos permite a estimulação neuronal rápida, reversível e focal ou inibição durante as gravações. gravações de célula inteira em preparações fatia permitir uma análise detalhada das propriedades intrínsecas, conductances activado tensão, bem como padrões de descarga potencial de ação no ambiente nativo da célula.
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Protocol
Todos os procedimentos com animais estavam em conformidade com a legislação local e da União Europeia relativa à protecção dos animais utilizados para fins experimentais (Directiva 86/609 / CEE) e com as recomendações apresentadas pela Federação das Associações de Ciência Animal Laboratório Europeu (FELASA). Ambos os ratinhos C57BL / 6 e ratinhos FPR-RS3-i-Vénus foram alojados em grupos de ambos os sexos à temperatura ambiente num 12 h ciclo de luz / escuro com comida e água disponíveis ad libitum. Para as experiências foram utilizados os jovens adultos (6-20 semanas) de ambos os sexos. Não foram observadas diferenças óbvias dependente do género.
1. Preparação de Soluções
- Preparar solução extracelular S 1: 4- (2-Hidroxi-etil) -piperazina-1-ácido etanossulf único (HEPES) tamponada solução extracelular contendo (em mM) 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ajustado com NaOH); osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glucose).
- Prepare extracelluLar solução S 2: Carbogen-oxigenada (95% O2, 5% de CO 2) solução extracelular contendo (em mM) 125 de NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO4, BES 5; pH = 7,3; osmolaridade = 300 mOsm (ajustado com glucose).
- Preparar a solução de agarose 4% de baixa de gelificação (S 3) para a incorporação de tecido: 4% de agarose de baixa temperatura-gelificação. Dissolve-se 2 g de agarose de baixa de gelificação em 50 ml de S 1 em 100 ml de um frasco de vidro de laboratório em conjunto com um agitador magnético. Para derreter a agarose, colocar a garrafa num banho de água (com a tampa não hermeticamente fechado) a 70 ° C durante aproximadamente 20 min ou até a solução torna-se transparente, enquanto se agitava. Arrefecer e manter a agarose fundida em um segundo banho de água a 42 ° C até à sua utilização.
- Preparar solução intracelular S 4: Adição da solução de contendo (em mM) 143 KCl, 2 de KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (livre de Ca 2+ = 110 nM), 10 de HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ajustado com KOH); osmolaridade = 290 mOsm.
- Modificar / ajustar a composição de S 1, S 2, S e 4 de acordo com o desenho experimental individual (por exemplo, bloqueadores farmacológicos para isolar certos tipos de correntes activadas por tensão).
2. Preparação Workspace
- Preencha oxigenar câmara de fatia armazenar com S 2, pelo menos, 30 minutos antes da dissecação, colocar no gelo para ajuste de temperatura e pH e solução de oxigenar continuamente.
- Encha o reservatório de superfusão fatia na configuração de gravação com S 2 e oxigenar continuamente.
- Antes de dissecção, preencha vibratome de câmara com S 2 e organizar gelo picado ao redor da câmara. Em alternativa, transferir solução oxigenada de reposição de gelo frio de oxigenar câmara em vibratome câmara e manter a oxigenação continuamente.
- Organizar instrumentos cirúrgicos e produtos de consumo.
- Coloque pacote de gel de gelo sob dissecandomicroscópio, cubra com uma toalha de papel para evitar que o tecido VNO de congelar até a parte inferior do prato.
- lâmina limpa por lavagem brevemente em 70% de etanol e água destilada e de montagem para vibratome. Substituir para cada sessão de corte.
3. VNO Dissection and Embedding
- O sacrifício de animais por uma breve exposição ao CO 2 e decapitar usando uma tesoura cirúrgica afiadas. Observação: Como o tempo de sacrificar o animal para colocar a cápsula VNO em gelo é crítica, minimizar o tempo de menos de 2 minutos. Para manter a viabilidade do tecido, incorporar tanto VNOs totalmente dissecada em agarose em menos de 30 min.
- Remova a mandíbula inferior com grandes tesouras cirúrgicas. Entre através da cavidade bucal e cortar os ossos da mandíbula e músculos de cada lado separadamente.
- Coloque a parte restante da cabeça para baixo na placa de Petri grande.
- Se afastar da pele da maxila superior e em torno da ponta do nariz com uma pinça médias para obter um melhor acesso aoincisivos.
- Utilize uma tesoura para cortar osso a maior parte dos incisivos a um ângulo de 45 ° ~ no sentido rostral (Figura 1A). Isto irá facilitar a remoção da cápsula VNO a partir da cavidade nasal.
Nota: Não corte para a raiz do dente para evitar danos na ponta da cápsula VNO. - Pegue o palato superior rígida na sua parte rostral com uma pinça médias e cuidadosamente descascar volta em uma peça em um ângulo plano (Figura 1B).
Nota: Repetidamente lavar com gelado S 2. - Use micro tesouras para cortar a mola fusão óssea entre a ponta do osso vômer e a mandíbula. Insira as pontas de tesoura com a parte curva da ponta apontando para fora longe do VNO e cuidadosamente cortar o osso em pequenos passos, tanto da esquerda e lateral direita para a cápsula VNO.
- Para remover a cápsula VNO, usar tesoura micro mola para cortar através do osso vômer na parte caudal e levante cuidadosamente o osso vômer fora do ncavidade asal usando uma pinça médios. transferir imediatamente o VNO para um pequeno prato de petri sob um microscópio estéreo em um bloco de gel de gelo, onde as etapas restantes da dissecção será executada.
- Enxaguar o VNO em uma pequena quantidade de gelado S 2 para evitar que o tecido seque.
- Separaram-se as cápsulas que contêm os cartilaginosos tecidos moles VNO, agarrando a parte de trás do osso vômer com fórceps médias. Posicionar a cápsula para uma vista dorsal para que uma divisão entre ambos VNOs se torna visível (Figura 1D i).
- Use a ponta de uma pinça fina para separar ambos cartilagem cápsulas VNO do osso central, mantendo o osso vômer fixado para baixo na parte traseira.
Nota: Use uma pinça-se apenas com o rebordo da cápsula de cartilagem e ter muito cuidado de não perfurar a cartilagem como o epitélio sensorial delicado é facilmente danificada. - Uma vez que os dois VNOs são separados, começar a remover a cartilagem encapsulando os abetost VNO.
- Agarre a borda superior da cápsula com uma pinça fina e se separou da parede cartilagem que foi previamente ligado ao osso vômer (lado medial).
- Para remover o restante cartilagem transformar o VNO com o seu lado lateral curvado para o fundo do prato e com segurança o pino para baixo da cartilagem de um lado com a pinça. Mova cuidadosamente a segunda pinça fina do lado de trás em um ângulo muito plana entre a cartilagem e VNO para soltar a ligação entre o tecido e cartilagem.
- Lentamente descascar a VNO longe da cartilagem, segurando-o em sua ponta caudal, para evitar danificar o epitélio sensorial.
- Uma vez que o VNO é alavancado a partir da cápsula, certifique-se de remover todas as partes da cartilagem pequenas restantes como todos os pedaços de cartilagem irá separar o tecido circundante agarose durante o processo de corte.
- Colocar uma pequena gota de gelado S 2 no primeiro VNO dissecados para evitar danos nos tecidos. Um vaso sanguíneo grande no wil lateralL se tornar visível o que indica que o órgão está ainda intacto e não foi grosseiramente danificado durante a dissecção (Figura 2A II). No caso do vaso sanguíneo ficou danificado, ainda vai valer a pena continuar com cortando o VNO, desde que a morfologia geral não foi claramente prejudicada.
- dissecar imediatamente a segunda VNO.
- Para incorporar a VNOs, preencha os dois pequenos pratos de Petri até a borda com S derretida 3 (armazenado em banho de água a 42 ° C; ver 1.3).
- Segurar o VNO na extremidade caudal mais amplo com uma pinça fina para evitar danos ao epitélio sensorial.
- Mergulha-se o VNO na agarose e movê-lo horizontalmente e para trás diversas vezes para remover a película de solução extracelular, bem como quaisquer bolhas de ar a partir da sua superfície.
- Posicionar o VNO verticalmente com a ponta virada para o caudal inferior do prato. Em vez de beliscar a VNO com a pinça diretamente, ajustar a orientação, movendo a ponta fórceps em estreita proximity ao VNO.
Nota: Orientação durante a incorporação é crucial, uma vez que determina plano de corte e acessibilidade aos neurônios sensoriais durante o experimento. - Coloque pratos no bloco de gelo gel e esperar até agarose solidificou.
Nota: Não alterar a orientação VNO uma vez que a agarose começou a solidificar como isso irá separar o tecido do agarose circundante.
4. Tissue VNO Coronal Cortando
- Use pequena espátula para remover bloco de agarose do pequeno prato na tampa de uma grande placa de Petri, virar a agarose de cabeça para baixo deixando a ponta do caudal do VNO virada para cima.
- Cortar o bloco em uma forma piramidal usando um bisturi cirúrgico (3-4 mm na ponta, 8-10 mm na parte inferior). Tome cuidado para não danificar o tecido incorporado.
- Use super-cola para fixar o bloco em forma de pirâmide para o centro da placa de amostras vibratome e esperar ~ 1 min para a cola secar completamente.
- Transferir a placa de amostra para o corte cHamber e preparar a segunda VNO, em conformidade. Mantenha a placa com a segunda amostra a 4 ° C até à sua utilização.
- Use um micrótomo lâmina vibrando com as seguintes configurações: espessura: 150-200 mm; velocidade: 3.5 au = 0,15 mm / seg; frequência: 7,5 au = 75 Hz. Transfira as fatias para a câmara oxigenar até à sua utilização depois de inspecionar brevemente morfologia fatia sob o microscópio de dissecação. Fatias pode ser mantida por várias horas.
5. de uma única célula eletrofisiológicos Gravações
- Para as gravações, usar um microscópio de platina fixa vertical equipado com objectivos de imersão em água, ou Dodt diferencial interferir contraste infravermelho (IR-DIC), e de epi-fluorescência assim como uma câmara CCD arrefecida. Para aquisição de dados, use um amplificador de patch-clamp, palco cabeça, AD / DA placa de interface e um PC (incluindo software de gravação).
- Prepare um estoque de 10-20 pipetas de patch (4-7 mohms). pipetas puxar de capilares de vidro de borosilicato (1,50 mm de diâmetro externo / 0,86 mm DI) usinga extrator micropipeta e fogo-polonês com um microforge.
Nota: Fogo polir as pontas de pipeta é crucial quando remendar os bastante pequenas VSNs. Isso ajudará a impedir a ruptura da membrana celular quando a aplicação de pressão negativa, a fim de obter um selo de resistência elevada. Após o polimento da abertura da pipeta deverá ser de aproximadamente 1 uM. - Manter pipetas num frasco de armazenamento da pipeta para evitar danos e a acumulação de pó até à sua utilização.
- Prepare o sistema de perfusão por encher os reservatórios de solução e tubulação acordo com o projeto experimental.
Nota: Remova as bolhas de ar tubulação completamente como eles vão fortemente interferir com registros eletrofisiológicos. - Ajuste a pressão para alcançar ~ 3 min fluxo ml /.
Nota: As altas pressões vão fazer com que o movimento da fatia de tecido, bem como terminação de registos electrofisiolicos. - Transferir fatia VNO a câmara de imagem e corrigir a posição fatia usando âncora de aço inoxidável com fio com 0,1 mm de espessura syntfibras hetic (Figura 2B - C).
Nota: Não cubra a fatia de tecido com um dos fios de fibras sintéticas, mas sim a agarose em torno da fatia. - Câmara de imagem transferência para a gravação e configuração fatia continuamente superfuse com S oxigenado 2 à temperatura ambiente através de uma aplicação banho.
- Ajustar o capilar de sucção para a superfície da solução para criar uma sucção constante lenta para a troca de solução de banho. Ajuste o 8-em-1 multi-barrel "lápis de perfusão" acima e perto da parte não-sensorial da fatia VNO que contém o vaso sanguíneo (Figura 2C, 3A) 50. Será benéfico para providenciar lápis perfusão e pipeta de gravação para ficar voltada para a fatia a partir de direcções opostas.
- Ligue o eléctrodo de referência e uma solução de banho através de uma ponte de agar em forma de L (preenchido com KCl 150 mM).
- Preencha pipeta de remendo com uma solução de pipeta S 4.
- Monte a pipeta sobre o eléctrodo adesivo revestido de cloreto de prata ligado ao estágio cabeça sem raspar o revestimento e anexar firmemente.
- Aplicar ligeira pressão positiva (cerca de 1 ml de uma seringa de plástico de 10 ml) para a pipeta patch antes de entrar no banho.
- Abaixe a pipeta no banho usando micro manipuladores longe o suficiente para ser capaz de submergir o objetivo sem bater-lo (Figura 2D).
- Monitorar a resistência da pipeta (R pip, entre 4-7 mohms) usando software eletrofisiologia ligado ao palco cabeça.
Nota: Se R pip é <4 mohms a ponta de vidro está quebrado. Se R pip é> 10 mohms, a ponta é mais provável entupidos e da pipeta deve ser substituído. - Visualize a fatia VNO com um CCD-câmara utilizando contraste de interferência diferencial infravermelho otimizado (DIC) e identificar FPR-RS3-i-Venus células que expressam (ou semelhante neurónios marcados) usando iluminação de fluorescênciae um cubo de filtro apropriado.
- Concentre-se e fluorescentes alvo ou células não-fluorescentes, dependendo do projeto experimental.
- Para se aproximar do corpo celular, usar rodas de mão para o máximo de sensibilidade. Devido à pressão positiva, uma pequena mossa na membrana soma célula torna-se visível uma vez que a ponta da pipeta está em estreita proximidade.
- Libertar a pressão positiva e aplicar uma ligeira pressão negativa para aspirar a membrana celular a fim de obter um selo de resistência elevada (1-20 GÊ). Aplicar sucção curto e suave para romper a membrana celular e estabelecer a configuração de célula inteira.
- Monitorar a resistência acesso constante durante a experiência.
Nota: Inclua apenas os neurônios que apresentam pequena e estável resistência de acesso (≤3% de entrada R; mudança <20% ao longo do experimento) para análise.
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Representative Results
Para obter insights sobre as propriedades biofísicas e fisiológicas de populações de células definidas, realizamos fatias de tecido coronal agudas do rato VNO (Figura 1-2). Após a dissecção, as fatias podem ser mantidos em solução extracelular oxigenado gelado (S 2) por várias horas. Na configuração de gravação, uma troca constante com solução oxigenada fresca (Figura 2D) garante a viabilidade do tecido durante todo o experimento. Nós aqui empregar um modelo de rato transgénico (FPR-RS3-i-Vênus). VSNs nesta estirpe de co-expressar uma proteína marcador fluorescente com FPR-RS3, um membro prototípico do FPR-RS família de genes (Figura 3) que permite a identificação óptica de uma população definida de neurónios sensoriais. registros eletrofisiológicos fornecer os meios para análise em profundidade no nível de uma única célula. Por exemplo, a análise de correntes dependentes da voltagem é realizada na tensão-grampomodo (Figura 4A - B). Para isolar tipos específicos de correntes iónicas, as fatias são superfundidas com agentes farmacológicos tais como TTX para inibir as correntes dependentes da voltagem de Na + (Figura 4A) ou nifedipina para bloquear dependentes da voltagem tipo-L de Ca2 + correntes (Figura 4B). Além disso, nós rotineiramente gravações de células inteiras na configuração de fixação de corrente para analisar os padrões de descarga de potencial de acção (Figura 4C). Além de gravações de célula inteira, gravações ligado à célula 'solta-seal "fornecer um método menos invasivo que impede a diálise de componentes intracelulares (Figura 5A). A gravação da acção potencial orientado correntes capacitivas a pedido curta estímulo oferece uma maneira sensível e eficiente para triagem de ligantes sensoriais (por exemplo, principais proteínas urinárias; MUPS) que ativam populações de células 51 (Figura 5B) definidos.
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Figura 1: Dissecção do VNO. (A) Vista lateral na cabeça de rato para ilustrar a posição e ângulo em que os incisivos são cortadas. (B) vista ventral que descreve o melhor ponto para agarrar e descascar o palato superior (UP). (C) vista ventral na cartilagem cápsula (CC), que abriga o VNO e o osso vômer (VB) após a remoção das inferior da mandíbula, incisivos e paladar. View (D) dorsal da cápsula VNO dissecados que descreve a localização bilateral de ambos VNOs (D i). A vista lateral, ilustra o aro de cartilagem no lado dorsal, onde ambos VNOs precisa ser separada (D II). Barra de escala = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Preparação do tecido, e a gravação câmara de platina do microscópio vista lateral esquemática sobre um VNO para ilustrar o curso e a posição do vaso sanguíneo (BV) em parte não-sensorial do epitélio (A i). A linha tracejada representa a camada de corte coronal. Vista lateral em um VNO descascados fora do CC mostra o vaso sanguíneo (A ii). (B) de agarose-embedded coronal fatia de tecido VNO fixado ao fundo da câmara de gravação cheio de solução usando uma âncora de fio de aço inoxidável com 0,1 mm de espessura de fibra sintética tópicos (SF). A área de box descreve a agarose em torno da fatia de tecido. (C) Representação esquemática ilustrando a posição e orientação de um agarose (Ag) -embedded coronal fatia VNO posicionada entre duas fibras. (D) Relação da câmara de gravação colocado sobre a platina do microscópio. A câmara é equipada com aplicação no banho (BA) para superfusão constante com oxigenado S 2, o lápis de perfusão (PP) para aplicar estímulos sensoriais ou agentes farmacológicos, a pipeta de gravação (RP) ligado à fase cabeça amplificador, o eléctrodo de referência (ER ) e a sucção capilar (SC) para manter uma troca constante de solução na câmara. Barra de escala = 1 mm (A ii). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: TISS VNO coronaisfatia ue. (A) imagem confocal (projeção máxima) de uma fatia de tecido 150 um aguda coronal VNO mostrando a distribuição dos FPR-RS3 tau-Venus + neurônios fluorescentes (verde) no epitélio sensorial vomeronasal. vaso sanguíneo (BV), lúmen (L), epitélio sensorial (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venus + neurônios exibem um único dendrito apical terminando em uma estrutura de botão-like na fronteira luminal. De célula inteira gravações de patch-clamp foram realizadas a partir da soma VSN, remendo pipeta (PP). (C) Morfologia de uma única VSN com o botão dendrítica (K) na ponta do longo e estreito dendrítico (D), a soma celular (S) e o axónio (A) deixando a soma do lado basal. As barras de escala, 50 uM (A), 10 uM (B), 5 uM (C). Este valor foi modificado a partir de 52. Por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Isolado Na + e Ca2 + correntes dependentes de voltagem, bem como descarga de pico (A) traços representativos de-célula inteira gravações de patch-clamp de um jejum de ativação corrente de Na + sensíveis a TTX na FPR-RS3 + VSNs.. (A i) a gravação etapa de tensão em condições de controle (solução extracelular S 1; intracelular solução S 4) revela uma dependente de voltagem transiente rápido e interior atual. (A II) tratamento TTX (1? M) diminui fortemente a corrente. Traço subtraído digitalmente (control-TTX (A iii)) reveals da voltagem-corrente de Na + TTX-sensível. Relações corrente-tensão das correntes TTX sensíveis Na + isoladas de controlo e FPR-RS3 + neurônios (A iv). (B) Representante Ca2 + traços atuais isolado farmacologicamente (10 mM de nifedipina). (C) representativos vestígios de aperto atual mostrando de- / hiperpolarização e trens de potenciais (rebote) ação gerados mediante positiva passo a passo (C i) e negativo (C iii) injecção de corrente. Observe a atividade espontânea medida a 0 pA injeção de corrente (C ii). (Iv C) frequência de disparo de controle e FPR-RS3 + neurônios como uma função da corrente injetada (I injetar). O aumento gradual na taxa de disparo é semelhante para o controlee FPR-RS3 + VSNs. Note-se que VSNs são extremamente sensíveis às injeções atuais, mesmo nos picoamperes gama baixa 53-56. Note-se que as curvas -I f foram "background-corrigido", usando a frequência spiking espontânea em 0 pA injecção de corrente. Os dados são médias ± SEM. Este valor foi modificado a partir de 52. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: gravações extracelulares 'remendo' solta de VSNs basais (A) imagem IR-DIC de uma fatia de tecido VNO aguda que descreve a pipeta de gravação na camada basal do epitélio sensorial.. (B) representativas gravação original de um VSN basal na configuração ligado à célula (&# 39; solta-seal ") respondendo com rajadas transitórios curtos de picos para breve estímulos (3 seg) com expressos de forma recombinante principais proteínas urinárias em pool (rMUPs) e uma concentração de potássio elevado (50 mM, 1 seg), respectivamente (B i) . Maior ampliação das gravações mostrados em (B) ilustra i explosões de picos em resposta a estímulos (B II). As barras vermelhas indicam tempo de estimulação, intervalo inter-estímulos = 30 segundos, a gravação contínua, interrupções <1 seg (marcas de corte //). Barra de escala = 5 | iM (A). Painel (A) tenha sido modificado a partir da referência 38. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O VNO é uma estrutura quimio que detecta semioquímicos. Até à data, a maioria dos receptores vomeronasais continua a ser deorphanized como apenas pares receptor-ligando algumas foram identificadas. Entre aqueles, V1rb2 foi descrito para ser especificamente activada pela feromona urinária 2-heptanona macho 30, V2rp5 para ser activado pelo macho feromona específica esp1 57, bem como V2r1b e V2rf2 para ser activado pelos péptidos MHC SYFPEITHI 48 e SEIDLILGY 58, respectivamente. Um pré-requisito para a transdução de compreender as relações de ligandos de receptor de sinal e é o conhecimento das características biofísicas das populações vsn definidos num ambiente nativo. propriedades da membrana passiva e ativa, conductances iônicos dependentes de voltagem e padrões de descarga de ação potencial de definir os meios e em que medida os neurônios receptores respondem a quimio estímulos. registros eletrofisiológicos em fatias de tecido agudos e, em particular, quegravações de patch-clamp de células-le fornecer um excelente método para analisar essas propriedades em grande detalhe.
Um passo crítico para gravações fisiológicas bem sucedidos e confiáveis em fatias de tecido é da própria preparação. Para maximizar o intervalo de tempo para realizar experimentos, o tecido deve ser cortado e transferido para solução oxigenada gelada imediatamente após a dissecação. Em seguida, as fatias pode ser mantido por várias horas permitindo a análise de um número substancial de células por dia experimental. É preciso alguma prática para reduzir o tempo para dissecar e incorporar tanto VNOs de um animal em menos de 30 min. Depois disso, a taxa de sucesso por um experimentador experiente para obter várias fatias de tecido intacto com células viáveis é bem acima de 75%. Realizando gravações de patch-clamp é uma abordagem experimental de baixo rendimento em comparação à imagem Ca 2+. No entanto, ele permite uma análise mais detalhada e versátil da atividade no nível de uma única célula com um temporais muito mais elevadoresolução. Na configuração de célula inteira, a forma intracelular é dialisada por a solução da pipeta. Enquanto a solução da pipeta pode não refletir a composição citosólica exato, ele fornece o experimentador com controle exato sobre ambas as condições iônicos extra e intracelulares. Para interpretação confiável de resultados, monitorização contínua da resistência de acesso e corrente de fuga é crucial. Às vezes, um aumento significativo ou forte mudança na resistência de acesso ou vazamento de leads atuais para resultados não interpretáveis e, portanto, exige tais gravações para ser descartados. Além disso, é importante notar que alguns compostos ligam irreversivelmente farmacológicas que os torne necessário substituir as fatias após cada gravação.
Gravação na configuração ligado à célula de diálise impede de componentes intracelulares e não influencia o potencial de membrana da célula. Assim, esta técnica fornece uma maneira menos invasiva e relativamente rápido de rastreio. No entanto, este aproACH é geralmente limitado à gravação de super-limiar-driven potenciais de acção correntes capacitivas do lado de fora da membrana celular. Gravações Loose-remendo têm provado ser adequado para analisar o comportamento spiking de um maior número de neurônios sensoriais em fatias VNO 38,54.
O modelo transgénico empregada aqui fornece uma ferramenta confiável para identificar e analisar a população de FPR-RS3 expressando VSNs. Além disso, a técnica aqui descrita pode ser estendida a outras linhas, independentemente do seu genótipo. Apesar do enorme vantagem de investigar um tipo celular definido, utilizando ratinhos transgénicos limita experiências para as linhas disponíveis. Recentemente, no entanto, a edição genoma alvo tornou-se mais rápido e mais acessível com a CRISPR / técnica Cas9 59. Em conclusão, alvo gravações de patch-clamp em fatias de tecido vomeronasal agudas proporcionar uma abordagem versátil para caracterizar as propriedades biofísicas e fisiológicas de uma populat definidoion de neurônios sensoriais.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
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