Introduction
Çoğu hayvan çevreleriyle etkileşim kimyasal duyu temeline dayanmaktadır. koku duyusu uygun çiftleşme ortakları bulma ve gıda değerlendirilmesi, yırtıcı kaçınarak ve bulmak için önemli bir rol oynar. Ana koku epiteli 1,2, Grueneberg ganglion 3,4, Masera 5,6 septal organ ve vomeronasal organı: En memelilerde, koku alma sistemi en az dört anatomik ve fonksiyonel olarak farklı çevresel alt sistemden oluşur. VNO kimlik, cinsiyet, sosyal rütbe ve cinsel devlet 7-10 hakkında bilgi veren kimyasal ipuçlarını tespit önemli bir rol oynar aksesuar koku alma sistemi (AOS), periferal duyusal yapıyı içermektedir. VNO sağ damak üzerinde burun septum dibinde yer almaktadır. Farelerde, bir kıkırdak kapsül 11-13 içine bir ikili kör bitmeyen bir borudur. Organ, bir hilal şeklinde medial duyusal epithe hem oluşurVSNs limanlar ve yan tarafında olmayan bir duyu kısmının Lium. Her iki epitel arasındaki dar vomeronasal kanalı 14 yoluyla burun boşluğuna bağlı olan bir mukus doldurulmuş lümen yer almaktadır. Olmayan duyu dokuda büyük bir yan damar negatif basınç 15,16 aracılığıyla bu VNO lümenine peptitler veya küçük proteinler gibi göreli olarak büyük, daha çok uçucu olmayan moleküllerin girişini kolaylaştırmak için, bir vasküler pompalama mekanizması sağlar. VNO yapısal bileşenler doğumda mevcut ve organ kısa bir süre ergenlik 17 önce yetişkin boyutuna ulaşır. Ancak, kemirgen AOS zaten gençler fonksiyonel olup olmadığını 18-20 tartışmaya hala tabidir.
VSNs kendi epitel konumu ve ifade reseptör tipine hem ile ayırt edilir. VSNs bir miyelinsiz akson ve lümen doğru çıkıntı ve bir microvillous dendritik topuzu ile biten bir tek apikal dendrit ile iki kutuplu bir morfoloji göstermektedir. VSN baltaons salkımlı, dorso-kaudal ucunda kıkırdaklı kapsül bırakır septum boyunca yükselir, aksesuar koku ampul (AOB) 21,22 ile kribriform plaka ve projeler geçer vomeronasal siniri oluşturur. vomeronasal duyusal epitel iki katmandan oluşur: apikal tabaka lümen yan ve limanlardan V1R- ve nöronlar FPR-R eksprese eden bir tür ise her iki yakın yer almaktadır. Bu nöronlar AOB 23-25 ön kısmına G-proteini α alt birimi G αi2 projeyi birlikte ifade. G αo yanında daha bazal tabaka ekspres V2Rs veya FPR-Rs1 bulunan Duyu nöronları ve AOB 26-28 arka bölgeye kendi aksonları gönderin.
Vomeronasal nöronlar olasılıkla idrar, tükürük gibi çeşitli vücut sıvılarının salgılanan ve sıvı gözyaşı vardır oldukça küçük yarı-kimyasallara 29-33 (V1Rs) veya proteinli bileşiklerin 34-38 (V2Rs) tarafından aktive edilir 37,39-41 Yerinde deneylerde VSNs da formilatlı peptidler ve çeşitli antimikrobik / enflamasyon bağlantılı bileşikler 25,42 ile aktive olduğunu göstermiştir. Ayrıca, heterolog FPR-rs proteinler (bkz 43 referans) conspecifics veya bozulmuş gıda kaynaklarından 25 hastalık için detektörleri gibi bir potansiyel rolü gösteren, bağışıklık sisteminde ifade FPRs ile agonist spektrumları paylaşmak dile getirdi.
Belirli VSN toplumlarda reseptör-ligand ilişkileri ve aşağı doğru sinyal kaskadlar anlamak için temel bir yerli bir ortamda temel biyofizik özellikleri ayrıntılı bir değerlendirmedir. Geçmişte, hücresel sinyal analizi, büyük ölçüde floresan işaretleyici protein 30,44-49 coexpressing tarafından nöronların tanımlanmış bir nüfusa işaret genetiği değiştirilmiş hayvanlardan faydalandı. Bu protokol, bir fluoresan işaretleyici ile birlikte FPR-RS3 eksprese eden bir transgenik fare hattı (FPR-RS3-i Venüs) kullanılır.Bu yaklaşım, akut koronal VNO doku dilimler halinde tek nöron patch-kelepçe kayıtları kullanarak optik tanımlanabilir hücre popülasyonunun elektrofizyolojik analizi gerçekleştirmek için böyle bir genetiği değiştirilmiş fare zorlanma istihdam nasıl örnekliyor. Bir hava basınç tahrikli çoklu varil perfüzyon sistemi duyusal uyaranlar ve farmakolojik ajanların kayıtları sırasında, hızlı tersinir ve fokal nöronal stimülasyon ya da önlenmesini sağlar. slice preparatlarda Tüm hücre kayıtları hücrenin doğal ortamında bir içsel özellikler, gerilim-etkin iletkenlikleri ayrıntılı analizi, hem de hareket potansiyeli boşaltım kalıpları için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan prosedürleri deneysel amaçlar için kullanılan hayvanların korunması (Direktif 86/609 / EEC) ve önerileri Avrupa Laboratuar Hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu (FELASA) tarafından ileri sürülen yerel ve Avrupa Birliği mevzuatı ile uyum içinde idi. C57BL / 6 fareleri ve Fpr-RS3-i Venus farenin Hem yiyecek ve su ad libitum ile 12 saat ışık / karanlık döngüsünde, oda sıcaklığında, her iki cinsiyet grupları barındırıldı. deneyler için cinsiyet ya genç yetişkinler (6-20 hafta) kullanıldı. Hiçbir belirgin cinsiyet bağımlı farklılıklar gözlenmiştir.
1. Solüsyon Hazırlama
- Hücre-dışı solüsyon S 1 hazırlanması: 4- (2-Hidroksi-etil) -piperazin-1-etansülfonik asit 145 NaCl, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES, (mM olarak) ihtiva eden hücre-dışı çözelti tamponlu (HEPES); pH = 7.3 (NaOH ile ayarlanır); (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm.
- ekstraselüler hazırlayınlar Çözelti 2: karbojen oksijenli (% 95 O2,% 5 CO2) CaCl2, 1 MgSO 4 125 NaCl, 25 (mM olarak) NaHCO 3, 5 KCl, 1 ihtiva eden hücre-dışı çözelti 5 BES; pH = 7.3; (Glukoz ile düzeltilmiş) ozmolarite = 300 mOsm.
- Doku yerleştirilmesi için% 4 düşük jelleşme sıcaklığına sahip bir agaroz çözeltisi (S3) hazırlayın:% 4 düşük jelleşme sıcaklığı agaroz. 2 g bir manyetik karıştırıcı ile birlikte 100 ml'lik bir cam şişe içinde laboratuar S 1 50 ml agaroz düşük jelleştirme eritin. agaroz eriyik için, yaklaşık 20 dakika boyunca ya da çözelti karıştırılırken saydam hale gelinceye kadar 70 ° C'de (kapağın sıkı bir şekilde kapatılmamış olan) bir su banyosu içinde bir şişe yerleştirin. soğutun ve sonraki kullanıma kadar 42 ° C 'de, ikinci bir su banyosu içinde eritilmiş agaroz tutun.
- Hücre-içi solüsyon s, 4 hazırlayın: Pipet çözelti 2 (serbest Ca2 + = 110 nM) 1 EGTA 143 KCI, 2 KOH, 0.3 CaCl, 10 HEPES, 2 MgATP (mM olarak), 1 NaGTP;pH = 7.1 (KOH ile ayarlanmıştır); osmolarite = 290 mOsm.
- / Değiştir S 1 kompozisyonunun ayarlanması, bireysel deneysel tasarım (örneğin, farmakolojik blokerler gerilim aktive akımları belirli türleri izole etmek) göre S 2 ve S 4.
2. Çalışma Alanı Hazırlığı
- Sıcaklık ve pH ayarlaması ve sürekli oxygenate çözüm için buz üzerinde S 2, en az 30 dakika önce diseksiyon, yer dilim depolama odasını oksijenlendirdikten doldurun.
- S 2 ile kayıt ayarları da dilim süperfüzyomu için doldurun ve sürekli oksijen.
- Diseksiyon önce S 2 ile vibratome bölmeyi doldurun ve odanın etrafında ezilmiş buz düzenlemek. Alternatif olarak, vibratome odasına odasını oksijene yedek buz oksijenli çözümü transferi ve sürekli oksijenlendirdikten tutun.
- cerrahi aletleri ve sarf düzenleyin.
- diseksiyon altında buz jel paketi yerleştirinmikroskop, çanak alt donmaya karşı VNO doku önlemek için bir kağıt havlu ile kaplayın.
- Kısaca,% 70 etanol ve distile su ile durulama ve vibratome monte temizleyin traş makinesi bıçak. Her dilimleme oturumu için değiştirin.
3. VNO Diseksiyon ve katıştırma
- CO 2 ve keskin cerrahi makas kullanarak başını kesmek için kısa maruz bırakılarak hayvan kurban. Not: kritik buz üzerinde VNO kapsülü koyarak hayvan ödün zaman olduğu gibi, en az 2 dk süreyi en aza indirmek. doku canlılığını muhafaza etmek için, en az 30 dakika içinde agaroz de tamamen Dissected VNOs yerleştirin.
- Büyük cerrahi makas ile alt çene çıkarın. Ağız boşluğu ile girmek ve ayrı ayrı her tarafında mandibula kemik ve kas kesti.
- başaşağı büyük Petri kabındaki başın kalan kısmını yerleştirin.
- üst çene ve daha rahat erişmek için orta forseps ile burun ucu çevresindeki deri çekmeyekesici dişler.
- Rostral yönde (Şekil 1A) bir ~ 45 ° 'lik açıyla kesici dişlerin en büyük kısmını kesip kemik makas kullanın. Bu burun boşluğundan VNO kapsülün çıkarılması kolaylaştıracaktır.
Not: VNO kapsülün ucu zarar görmesini önlemek için dişin köküne kesmeyin. - Orta forseps ile rostral kısmında sert üst damak tut ve dikkatli bir düz açı (Şekil 1B) geri tek parça halinde soyun.
Not: Tekrar tekrar buz gibi soğuk S 2 ile durulayın. - vomer kemik ve çene ucu arasındaki kemik füzyon kesmek için mikro yaylı makas kullanın. VNO kapsüle sol ve sağ taraf yanal hem de küçük adımlar halinde kemiğin kesilmesi dışarıya doğru VNO gelen ve dikkatli bir şekilde işaret ucunun eğri kısmı ile makas ipuçları yerleştirin.
- VNO kapsülü çıkarmak için, kaudal kısmında vomer kemiği kesmek için mikro yaylı makas kullanın ve dikkatli n dışarı vomer kemiğini kaldırınorta forseps kullanarak asal boşluğu. Hemen diseksiyon kalan adımlar gerçekleştirilir bir buz jel paketini bir stereo mikroskop altında küçük bir petri tabağına VNO aktarın.
- Kurumasını önlemek için doku buz soğukluğunda S 2. Alanın küçük bir miktarda VNO durulayın.
- orta forseps ile vomer kemiğin arka kapma VNO yumuşak dokuları ihtiva kıkırdak kapsül ayırın. Her iki VNOs arasındaki bölünmüş (Şekil 1D i) görünür hale gelmesi için dorsal görünümü için kapsül yerleştirin.
- Arka kısmında aşağı tuş vomer kemik tutarken merkez kemikten hem kıkırdak VNO kapsülleri ayırmak için ince forseps ucu kullanın.
Not: Sadece kıkırdak kapsülün RIM forseps kullanın ve narin duyusal epitel kolayca zarar olarak kıkırdak delip için çok dikkatli olun. - İki VNOs ayrılır sonra, köknar encapsulating kıkırdağı kaldırarak başlamakt VNO.
- bir ince forseps ile kapsülün üst çemberinin tut ve daha önce vomer kemik (medial tarafı) bağlı olduğu kıkırdak duvar uzak ayrıldı.
- kıkırdak çanak alt kavisli yan tarafı ile VNO çevirmek ve güvenli forseps kullanarak bir tarafta kıkırdak aşağı pin kalan kaldırmak için. Dikkatle doku ve kıkırdak arasındaki bağlantıyı gevşetmek için kıkırdak ve VNO arasında bir çok düz açıyla arka tarafında ikinci ince forseps taşıyın.
- Yavaş yavaş duyusal epitel zarar vermemek için, kendi kaudal ucunda tutarak uzak kıkırdaktan VNO soyma.
- VNO kapsülden levered sonra, dilimleme işlemi sırasında agaroz çevredeki doku ayırmak olacaktır kıkırdak kalan parçaları olarak kalan tüm küçük kıkırdak parçalarını kaldırmak için emin olun.
- Doku hasarını önlemek için ilk Dissected VNO buz-soğuk 2 küçük bir damla koyun. lateral yan Wil ilgili büyük bir kan damarıl organı hala bozulmamış ve fena halde diseksiyon (Şekil 2A ii) sırasında zarar olmadığını belirten görünür hale gelir. kan damarı hasar var bu durumda, hala sürece genel morfolojisi açıkça düşüklüğüne uğramamış gibi VNO dilimleme ile devam etmek faydalı olacaktır.
- Hemen ikinci VNO teşrih.
- VNOs yerleştirmek için, erimiş S 3 ağız hem de kültür kaplarına dolgu (42 ° C'de su banyosu içinde depolanmış, 1.3).
- duyusal epitel zarar vermemek için ince forseps ile geniş kaudal ucunda VNO tutun.
- agaroz VNO daldırın ve ekstrasellüler çözüm filmi yanı sıra yüzeyinden herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için ileri geri yatay birkaç kez hareket ettirin.
- çanak alt bakan kaudal ucu ile dikey VNO yerleştirin. Bunun yerine, doğrudan forseps ile VNO kısma ait, yakın Proximi forseps ucu hareket ettirerek yönünü ayarlamakVNO için ty.
Not: Deney sırasında duyusal nöronlar dilim uçağı ve erişilebilirlik belirler olarak gömme sırasında Oryantasyon önemlidir. - jel buz paketi üzerinde yemekleri yerleştirin ve Agaroz katılaşmış kadar bekleyin.
Not: Agaroz bu çevredeki agaroz doku ayırmak gibi katılaşan başladıktan sonra VNO yönünü değiştirmeyin.
4. Koronal VNO Doku Dilimleme
- Büyük bir Petri kabı kapağının içine küçük çanak agaroz blok kaldırmak için küçük bir spatula kullanın, baş aşağı yukarı bakacak VNO kaudal ipucu bırakarak agaroz çevirin.
- cerrahi neşter (ucunda 3-4 mm, altta 8-10 mm) kullanılarak bir piramit şekline blok kesin. Gömülü doku zarar vermemeye özen gösterin.
- vibratome numune plakasının merkezine piramit şeklindeki blok düzeltmek ve yapıştırıcı tamamen kurumasını için ~ 1 dakika beklemek zorunda süper yapıştırıcı kullanın.
- dilimleme c numune plaka aktarınhamber ve buna bağlı olarak ikinci bir VNO hazırlar. kullanılana kadar 4 ° C, ikinci örnekle plaka tutun.
- kalınlığı: Aşağıdaki ayarlara sahip bir titreşimli bıçak mikrotom kullanın 150-200 mikron; Hız: 3.5 au = 0,15 mm / sn; Frekans: = 75 Hz 7,5 au. kısaca Diseksiyon mikroskobu altında dilim morfolojisi inceledikten sonra kullanıma kadar oxygenating odasına dilim aktarın. Dilimler birkaç saat boyunca muhafaza edilebilir.
5. Tek hücreli Elektrofizyolojik Kayıtlar
- kayıtlar için, suya daldırma amaçları, Dodt ya da kızıl ötesi ayırıcı müdahale kontrast (IR DIC) ve epi-floresan gibi soğutulmuş bir CCD kamera ile donatılmış bir dikine duran aşamalı mikroskop kullanımı. veri toplama için bir yama-kelepçe amplifikatör, kafa sahne, AD / DA arayüz kartı ve (kayıt yazılımı dahil) bir PC kullanın.
- 10-20 yama pipetler (4-7 MQ) bir stok hazırlayın. borosilikat cam kılcal damarlardan çekme pipetler (1.50 mm OD / 0.86 mm ID) istimalBir Microforge ile ga mikropipet çektirmesi ve yangın lehçe.
Not: oldukça küçük VSNs yama yaparken Yangın pipet uçları parlatma önemlidir. Bu durum, yüksek dirençli bir sızdırmazlık elde etmek için negatif basınç uygulanırken, hücre zarını önlemek için yararlı olacaktır. Pipet açılışı parlatma sonra yaklaşık 1 mikron olmalıdır. - kullanana kadar hasar ve toz birikmesini önlemek için bir pipet depolama kavanoz pipetler tutun.
- çözüm rezervuarları doldurma ve deneysel tasarım göre tüp ile perfüzyon sistemi hazırlayın.
Not: güçlü elektrofizyolojik kayıtlar engel olacak şekilde tamamen tüp içindeki hava kabarcıklarını çıkarın. - ~ 3 ml / dakika akış elde etmek için basınç ayarlayın.
Not: Yüksek basınç elektrofizyolojik kayıtlar doku dilim hareketini yanı sıra fesih neden olacaktır. - görüntüleme odasına VNO dilim aktarın ve 0.1 mm kalınlığında synt ile kablolu paslanmaz çelik çapa kullanarak dilim pozisyonunu düzeltmekinfographie lifler (Şekil 2B - C).
Not: sentetik elyaf ipliklerin biri değil dilim çevreleyen agaroz ile doku dilim örtmeyin. - Banyo uygulaması aracılığıyla oda sıcaklığında oksijenli S 2 ile kurulum ve sürekli Superfuse dilim kayıt Transfer görüntüleme odası.
- Banyo çözeltisinin sürekli bir değişim için yavaş bir emme oluşturmak için çözeltinin yüzeyine emme kılcal ayarlayın. 8-in-1 çoklu varil "perfüzyon kalem" yukarıda ve kan damarı (Şekil 2C, 3A) 50 içeren VNO dilim olmayan duyusal kısmına yakın ayarlayın. Zıt yönlerde gelen dilim dönük olması perfüzyon kalem ve kayıt pipet düzenlemek için yararlı olacaktır.
- Referans elektrodu ve (150 mM KCI ile dolu), L-şeklinde bir agar köprü kullanılarak banyo çözeltisi bağlayın.
- Pipet çözüm S 4 ile yama pipet doldurun.
- kaplama kapalı kazıma olmadan kafa aşamasına bağlı gümüş klorür kaplı yama elektrot üzerinde pipet montaj ve sıkıca takın.
- hafif pozitif basınç uygulayın (yaklaşık 10 ml plastik şırınga 1 ml) banyo girmeden önce yama pipet.
- (Şekil 2B) onu vurmadan hedefi batığın edebilmek için yeterince mikro manipülatörler kullanarak banyoya pipet indirin.
- Baş aşamasına bağlı elektrofizyoloji yazılımı kullanarak (4-7 MQ arasında R pip) pipet direnci izleyin.
Not: R pip ise <4 MQ cam ucu kırıldı. R pip> 10 M? Ise, uç büyük ihtimalle tıkalı ve pipet değiştirilmesi gerekir. - Kızılötesi optimize edilmiş diferansiyel girişim kontrast (DIC) kullanarak bir CCD kamera ile VNO dilim görselleştirmek ve floresan aydınlatma kullanılarak FPR-RS3-i Venüs (benzer etiketli nöronların veya) hücreleri ifade eden tanımlamakve uygun bir filtre küpü.
- Odak ve hedef floresan veya floresan olmayan hücrelerin deneysel tasarım bağlı.
- hücre gövdesi yaklaşmak için, maksimum duyarlılık el tekerlekleri kullanın. Pipet yakın olduğunu bir kez pozitif basınç nedeniyle, hücre soma zarında küçük bir göçük görünür hale gelir.
- pozitif basınç bırakın ve yüksek direnç mühür (1-20 GΩ) elde etmek için, hücre zarındaki emmek için hafif negatif basınç uygulayın. hücre zarı bozar ve tam hücreli yapılandırmasını kurmak için kısa ve nazik vakum uygulayın.
- deney sırasında sürekli erişim direnci izleyin.
Not: Sadece küçük ve istikrarlı bir erişim direnci sergileyen nöronlar (R girişinin ≤3%; değişimi <deney boyunca% 20) analiz içine.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tanımlanmış hücre popülasyonlarının biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerine anlamak için, biz fare VNO (- 2 Şekil 1) akut koronal doku dilimleri gerçekleştirin. Diseksiyon sonra, dilimler bir kaç saat süre ile buz soğukluğunda oksijenli hücre dışı çözelti (S2) 'de muhafaza edilebilir. Kayıt kurulumda, taze oksijenli çözümü ile bir sabit döviz (Şekil 2B) deney boyunca doku canlılığını sağlar. Biz burada bir transgenik fare modeli (FPR-RS3-i Venüs) kullanır. Bu suş birlikte açığa FPR-RS3 ile floresan işaretleyici protein duyu nöronlarının tanımlanmış nüfusun optik kimlik sağlayan FPR-rs gen ailesinin (Şekil 3) bir prototip üyesi olarak VSNs. Elektrofizyolojik kayıtlar tek hücre düzeyinde derinlemesine analizi için araçlar sağlar. Örneğin, voltaj kontrollü akımların analizi voltaj kelepçe gerçekleştirilirmodu (Şekil 4A - B). Iyonik akımların belirli türleri izole etmek için, dilimler voltaj bağımlı L-tipi Ca 2 + akımları (Şekil 4B) engellemek için voltaj kapılı Na + akımları (Şekil 4A) veya nifedipin inhibe etmek gibi TTX olarak farmakolojik ajanlar ile superfused edilir. Ayrıca, rutin aksiyon potansiyeli deşarj desenleri (Şekil 4C) analiz etmek için geçerli kelepçe yapılandırmasında tüm hücre kayıtları gerçekleştirin. Bütün hücre kayıtları ek olarak, hücreye bağlı "gevşek kapatacak 'kayıtları hücre içi bileşenleri (Şekil 5A) ve diyaliz önleyen daha az invaziv bir yöntem sağlar. Hücreler 51 (Şekil 5B) popülasyonları tanımlanmış etkinleştirin; Kayıt aksiyon potansiyeli odaklı kısa uyaran başvurusu üzerine kapasitif akımları duyusal ligandların (MUPS örneğin, büyük üriner proteinler) taranması için hassas ve etkili bir yol sunar.
= Fo "jove_content": keep-together.within-page = "1"> 
Şekil 1: VNO diseksiyonu. Fare kafasındaki (A) Yandan görünüm kesici dişler kesilir hangi pozisyonu ve açısını göstermek için. (B) kapmak ve üst damak (UP) geri soymak için en iyi noktayı gösteren alttan görünüşü. Alt çene, kesici dişler ve damak çıkardıktan sonra VNO ve vomer kemik (VB) limanlar (C) kıkırdak kapsül (CC) üzerine alttan görünüşü. Her iki VNOs (D i) bilateral lokalizasyonu gösteren disseke VNO kapsülün (D) Dorsal görünümü. Yan görünüşüdür, her iki VNOs (D ii) ayrılması gerekmektedir sırt tarafında kıkırdak jant göstermektedir. Ölçek çubuğu = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Doku hazırlanması, odasını ve mikroskop sahne kayıt bir VNO üzerinde şematik yanal görünümü kursu ve epiteli (A i) olmayan duyusal bölümünde büyük kan damarı (BV) konumunu göstermek için. kesikli çizgi koronal dilimleme katmanı temsil eder. CC dışarı soyulmuş bir VNO lateral görünüm kan damarı gösteren (A ii). (B) 0.1 mm kalınlığında sentetik elyaf (SF) parçacığı ile kablolu, paslanmaz çelikten ankraj kullanan çözeltisi doldurulmuş kayıt odasının tabanına sabit koronal VNO doku dilim Agaroz konuldu. kutulu alan doku dilim çevreleyen agaroz göstermektedir. (Cı) Bir agaroz (Ag) konumunu ve yönünü gösteren şematik görünümü iki lifleri arasına yerleştirilmiş koronal VNO dilim Gömülü. (D) mikroskopa yerleştirildi kayıt odasının bakış. Kamara duyusal uyaranlar veya farmakolojik ajanlar uygulamak için oksijenli S 2, perfüzyon kalem (PP) ile sürekli süperfüzyomu için banyo uygulaması (BA), amplifikatör kafa sahnede, referans elektrot bağlanan kayıt pipet (RP) (RE ile donatılmıştır ) ve emiş kapiler (SC) oda içinde bir solüsyon sabit bir değişimi sağlamak için. Ölçek çubuğu = 1 mm (A ii). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Koronal VNO Tissue dilim. (A) Konfokal görüntü (maksimum projeksiyon) 150 mikron akut koronal VNO doku dilim vomeronasal duyusal epitelinde floresan FPR-RS3 tau-Venüs + nöronların (yeşil) dağılımını gösteren. Kan damarı (BV), lümen (L), duyusal epitel (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venüs + nöronlar lümen sınırında bir düğme benzeri bir yapıda biten tek bir apikal dendrit sergilerler. Tüm hücre patch-kelepçe kayıtları VSN soma, yama pipet (PP) yapılmıştır. Uzun ve dar bir dendrit (D) 'ucundaki dendritik topuz (K) ile tek VSN (C) morfolojileri, taban tarafındaki soma ayrılan hücre soma (S) ve akson (A). Ölçek çubukları, 50 um (A), 10 um (B), 5 um (C). Bu rakam 52'den modifiye edilmiştir. TıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 4: İzole voltaj kapılı Na + ve Ca 2+ akımları yanı sıra başak deşarj (A) FPR-RS3 + VSNs bir TTX duyarlı hızlı aktive Na + akımının tüm hücre yama-kelepçe kayıtları Temsilcisi izleri.. Kontrol koşulları altında (A i) Gerilim adım kayıt (ekstrasellüler çözüm S 1; hücre içi çözüm S 4) akım içe voltaj bağımlı hızlı ve geçici ortaya koymaktadır. (A ii) TTX tedavisi (1 uM) kuvvetle akımı azalır. Dijital çıkarılır iz (kontrol-TTX (A iii)) reveTTX duyarlı voltaj kapılı Na + akımını als. Kontrolü ve FPR-RS3 + nöronların izole TTX duyarlı Na + akımlarının akım-gerilim ilişkileri (A iv). (B) Temsilcisi Ca 2 + akım izleri (10 uM nifedipin) farmakolojik izole edilmiştir. (C) / hiperpolarizasyon ve kademeli pozitifliği (C i) ve negatif (C iii) mevcut enjeksiyon üzerine üretilen (geri tepme) aksiyon potansiyelleri trenler de- gösteren temsili akım kelepçe izleri. 0 pA akım enjeksiyon (C ii) ölçülen spontan aktivite unutmayın. (Cı IV) kontrol ve FPR-RS3 + (I enjekte) enjekte akımın bir fonksiyonu olarak nöronların ateşleme frekansıdır. ateşleme hızı kademeli artış kontrolü için benzerve FPR-RS3 + VSNs. VSNs bile düşük picoamperes mevcut enjeksiyonuna zarif duyarlı 53-56 aralığında olduğunu unutmayın. F -I eğrileri 0 pA akım enjeksiyon spontan spike frekansı kullanarak "background-düzeltilmiş" edildiğini unutmayın. Veri ortalama ± SEM vardır. Bu rakam 52'den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: bazal VSNs gelen Ekstrasellüler 'gevşek yama' kayıtları duyusal epitel bazal tabakasında kayıt pipet gösteren akut VNO doku dilim (A) IR-DIC görüntü.. (B) hücre bağlı konfigürasyonda bir bazal VSN Temsilcisi orijinal kayıt (&# 39; gevşek mühür toplanmış rekombinant olarak ifade edilen başlıca üriner proteinler (rMUPs ile uyarılmalara (3 sn)) ve yükseltilmiş bir potasyum konsantrasyonu (50 mM, 1 sn brifing sivri kısa geçici patlamaları ile yanıt ')), sırasıyla (B i) . (B i) gösterilen kayıtların yüksek büyütme uyarılara (B ii) tepki olarak ani patlamaları göstermektedir. Kırmızı çubuklar stimülasyon arası uyaran aralığı = 30 sn, sürekli kayıt, kesintiler <1 sn (kesme işaretleri //) zamanını gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mikron (A). Paneli (A) referans 38 modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VNO Semiokimyasallar tespit eden bir kimyasal-duyusal bir yapıdır. Bugüne kadar, vomeronasal reseptörlerinin çoğunluğu sadece birkaç reseptör-ligand çifti tespit edilmiş olarak deorphanized gerekmektedir. Bunlar arasında, V1rb2 erkek idrar feromon 2-heptanon 30 spesifik olarak aktive edilmesi tanımlanmıştır, V2rp5 erkek belirli feromon ESP1 57 da SYFPEITHI V2r1b ve V2rf2 MHC peptid ile aktive edilecek şekilde aktif hale 48 ve SEIDLILGY 58, sırasıyla. reseptör-ligand ilişkileri ve sinyal iletimini anlamak için bir ön koşuldur yerel ortamda tanımlanan VSN popülasyonlarının biyofiziksel özellikleri bilgidir. Pasif ve aktif membran özellikleri, voltaj kapılı iyon iletkenlikleri ve aksiyon potansiyeli deşarj desenleri reseptör nöronların uyaranlara kimyasal-duyusal tepki hangi araçları ve kapsamını tanımlar. Elektrofizyolojik akut doku dilimleri kayıtları ve özellikle, kimle-hücre patch-kelepçe kayıtları detaylı olarak bu özelliklerini analiz için mükemmel bir yöntem sağlar.
doku dilimleri başarılı ve güvenilir fizyolojik kayıtlar için kritik bir adım hazırlığı kendisidir. deneyler gerçekleştirmek için zaman aralığını en üst düzeye çıkarmak için, doku dilimlenmiş ve hemen diseksiyonu sonrası buz gibi soğuk oksijenli bir çözüm aktarılması gerekir. Bunu takiben, dilimler deneysel günde hücrelerin önemli sayıda birkaç saat izin analiz için muhafaza edilebilir. Bu teşrih ve en az 30 dakika bir hayvanın hem VNOs embed süresini azaltmak için bazı pratik alır. Bundan sonra, canlı hücreler ile birkaç sağlam doku dilimler elde etmek deneyimli bir deneyci başarı oranı iyi% 75 üzerindedir. Patch-kelepçe kayıtları gerçekleştirme Ca 2+ görüntüleme kıyasla düşük verimli deneysel bir yaklaşımdır. Ancak, bu daha yüksek bir zamansal tek-hücre seviyesinde faaliyet daha detaylı ve çok yönlü analiz edilmesine izin verirçözüm. Bütün hücre konfigürasyonunda, hücre içi ortamı pipetle çözeltisi diyaliz edilir. pipet çözüm tam sitozolik kompozisyon yansıtmak olmayabilir iken, Ekstra ve hücre içi iyonik şartlarda hem üzerinde tam kontrolü ile deneyci sağlar. Sonuçların güvenilir yorumlanması için, erişim direnci ve kaçak akım sürekli izlenmesi büyük önem taşımaktadır. Zaman zaman, önemli bir artış ya da erişim direnci güçlü değişim veya uninterpretable sonuçları geçerli yol açar sızıntı ve böylece atılır, bu kayıtlar talep eder. Ayrıca, bazı farmakolojik bileşikler geri dönüşümsüz gerekli her kayıttan sonra dilimleri yerine render bağlanabilen dikkat etmek önemlidir.
Hücre bağlı yapılandırmada kayıt hücre içi bileşenlerin diyaliz önler ve hücrenin membran potansiyelini etkilemez. Bu nedenle, bu teknik, tarama için daha az saldırgan ve nispeten hızlı bir yöntem sağlar. Bununla birlikte, bu onaylamaACH, genellikle hücre zarının dışında süper eşik aksiyon potansiyeli odaklı kapasitif akımları kayıt sınırlıdır. Gevşek yama kayıtları VNO dilimleri 38,54 duyusal nöronların büyük sayılar engelleyici davranışları analiz etmek için uygun olduğu kanıtlanmıştır.
Burada kullanılan transgenik modeli belirlemek ve VSNs ifade FPR-RS3 nüfusa analiz için güvenilir bir araç sağlar. Ayrıca, burada açıklanan teknik ne olursa olsun, genotip diğer hatlara uzatılabilir. transgenik fareler kullanılarak, tanımlanmış bir hücre tipi soruşturma muazzam avantajına rağmen mevcut hatlara deneyler sınırlar. Ancak son zamanlarda, hedeflenen genom düzenleme daha hızlı ve daha uygun fiyatlı CRISPR / Cas9 tekniği 59 ile olmuştur. Sonuç olarak, akut vomeronasal doku dilimler halinde patch-kelepçe kayıtları tanımlanmış populat biyofiziksel ve fizyolojik özelliklerini karakterize etmek için çok yönlü bir yaklaşım sağlamak hedeflenmişduyu nöronlarının iyonu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
- Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
- Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
- Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
- Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A.
- Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
- Keverne, E. B.
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
- Liberles, S. D.
- Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
- Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
- Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
- Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
- Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
- Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
- Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
- Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
- Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
- Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
- Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
- Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
- Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
- Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
- Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
- Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
- Isogai, Y., et al.
- Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
- Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
- Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
- Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
- Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
- Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
- Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
- Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
- Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
- Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
- Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
- Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
- Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
