Introduction
La maggior parte degli animali si basano molto sulla loro sensi chimici di interagire con l'ambiente circostante. L'olfatto gioca un ruolo essenziale per la ricerca e la valutazione di cibo, evitando i predatori e la localizzazione di adeguati partner di accoppiamento. Nella maggior parte dei mammiferi, il sistema olfattivo consiste di almeno quattro sottosistemi anatomicamente e funzionalmente distinte periferici: principale epitelio olfattivo 1,2, ganglio Grueneberg 3,4, l'organo settale Masera 5,6 e l'organo vomeronasale. Il VNO comprende la struttura sensoriale periferica del sistema olfattivo accessorio (AOS), che svolge un ruolo importante nel rilevare segnali chimici che trasmettono informazioni su identità, genere, classe sociale e lo stato sessuale 7-10. Il VNO si trova alla base del setto nasale proprio sopra il palato. Nei topi, è un tubo bilaterale cieco fine racchiusi in una capsula cartilaginea 11-13. L'organo è composto da un epitelio sensoriale mediale a forma di mezzalunaLium che ospita i VSNs e di una parte non sensoriale sulla parte laterale. Tra i due epiteli si trova un lume di muco pieno che è collegato alla cavità nasale attraverso la stretta vomeronasale condotto 14. Un grande vaso sanguigno laterale nel tessuto non sensoriale fornisce un meccanismo di pompaggio vascolare per facilitare l'ingresso di relativamente grandi, molecole per lo più non volatili come peptidi o piccole proteine nel lume VNO tramite pressione negativa 15,16. I componenti strutturali del VNO sono presenti alla nascita e l'organo raggiunge dimensioni degli adulti poco prima della pubertà 17. Tuttavia, se l'AOS roditore è già funzionale giovani è ancora oggetto di dibattito 18-20.
VSNs si distinguono per la loro posizione sia epiteliale e il tipo di recettore esprimono. VSNs mostrano una morfologia bipolare con un assone amieliniche e un singolo dendrite apicale che sporge verso il lume e si conclude con una noce dendritica microvilli. VSN asciaons fasciculate per formare il nervo vomeronasale che lascia la capsula cartilaginea alla fine dorso-caudale, sale lungo il setto, passa la lamina cribrosa e progetti al bulbo olfattivo accessorio (AOB) 21,22. L'epitelio sensoriale vomeronasal costituito da due strati: lo strato apicale si trova più vicino al lato luminale e porti sia V1R- e tutti tranne uno tipo di FPR-rs-esprimendo neuroni. Questi neuroni coesprimere G αi2 G-proteine α-subunità e progetto per la parte anteriore della AOB 23-25. Neuroni sensoriali situati nelle V2Rs espressi strato basale più o FPR-RS1 accanto G αo e inviano i loro assoni alla regione posteriore del AOB 26-28.
Neuroni vomeronasale sono probabilmente attivati da piuttosto piccole semiochimici 29-33 (V1Rs) o composti proteici 34-38 (V2Rs) che vengono secreti in vari fluidi corporei quali urina, saliva e strappare fluido 37,39-41 In esperimenti in situ hanno dimostrato che VSNs sono attivati anche da peptidi formylated e vari composti antimicrobici / infiammazione legata 25,42. Inoltre, eterologhi espressi FPR-rs proteine condividono spettri agonisti con FPR espressi nel sistema immunitario, che indica un potenziale ruolo come rivelatori di malattia in conspecifici o fonti di cibo avariato 25 (vedi riferimento 43).
Fondamentale per comprendere le relazioni recettore-ligando e cascate di segnalazione a valle in specifiche popolazioni di VSN è una valutazione dettagliata delle loro caratteristiche biofisiche di base in un ambiente nativo. In passato, l'analisi di segnalazione cellulare ha notevolmente beneficiato di animali geneticamente modificati che segnano una popolazione definita di neuroni da coexpressing un fluorescente proteina marcatore 30,44-49. In questo protocollo, una linea di topo transgenico che esprime FPR-RS3 insieme ad un marcatore fluorescente (FPR-RS3-i-Venere) viene utilizzato.Questo approccio esemplifica come impiegare tale ceppo di topi geneticamente modificati per effettuare le analisi elettrofisiologica di una popolazione di cellule otticamente identificabile con singolo neurone registrazioni patch-clamp in coronali fette di tessuto VNO acute. Una pressione-driven dell'aria sistema di perfusione multi-barile per stimoli sensoriali e gli agenti farmacologici consente un rapido, reversibile e focale stimolazione neuronale o inibizione durante le registrazioni. registrazioni a cellula intera in preparati fetta consentono un'analisi dettagliata delle proprietà intrinseche, conduttanze voltaggio-attivato, così come i potenziali modelli di scarica di azione in ambiente nativo della cellula.
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Protocol
Tutte le procedure di animali erano in conformità con la legislazione locale e dell'Unione europea sulla protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali (direttiva 86/609 / CEE) e con le raccomandazioni formulate dalla Federazione delle Associazioni di laboratorio animali europea della scienza (FELASA). Entrambi / 6 topi C57BL e topi Fpr-RS3-i-Venere sono stati alloggiati in gruppi di entrambi i sessi a temperatura ambiente su un / buio ciclo 12 ore di luce con cibo e acqua ad libitum. Per gli esperimenti sono stati utilizzati i giovani adulti (6-20 settimane) di entrambi i sessi. Non sono state osservate evidenti differenze di genere-dipendente.
1. Soluzione Preparazione
- Preparare extracellulare soluzione S 1: 4- (2-idrossi-etil) piperazina-1-etansolfonico acido (HEPES) soluzione tamponata extracellulare contenente (in mM) 145 NaCl, KCl 5, 1 CaCl 2, 1 MgCl 2, 10 HEPES; pH = 7.3 (regolato con NaOH); osmolarità = 300 mOsm (regolato con glucosio).
- preparare extracellular soluzione S 2: Carbogen-ossigenato (95% O 2, 5% CO 2) soluzione extracellulare contenente (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO 3, 5 KCl, CaCl 2 1, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7.3; osmolarità = 300 mOsm (regolato con glucosio).
- Preparare la soluzione di temperatura agarosio a basso gelificazione 4% (S 3) per l'incorporamento dei tessuti: 4% Temperatura agarosio a basso gelificazione. Sciogliere 2 g low-gelificazione agarosio in 50 ml di S 1 in un laboratorio bottiglia di vetro da 100 ml insieme con un agitatore magnetico. Per sciogliere l'agarosio, mettere la bottiglia in un bagno di acqua (con coperchio non ben chiuso) a 70 ° C per circa 20 minuti o fino a quando la soluzione diventa trasparente sotto agitazione. Raffreddare e mantenere agarosio fuso in un secondo bagno di acqua a 42 ° C fino all'utilizzo.
- Preparare intracellulare soluzione S 4: soluzione Pipetta contenente (in mm) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0.3 CaCl 2 (gratuito Ca 2+ = 110 Nm), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (regolata con KOH); osmolarità = 290 mOsm.
- Modificare / regolare composizione S 1, S 2 e S 4 secondo disegno sperimentale individuale (per esempio, bloccanti farmacologici per isolare alcuni tipi di correnti voltaggio-attivato).
2. Area di lavoro Preparazione
- Riempire ossigenante fetta memorizzazione da camera con S 2, almeno 30 minuti prima di dissezione, posto in ghiaccio per la regolazione della temperatura e pH e la soluzione di ossigenare continuamente.
- Riempire il serbatoio per fetta superfusione a registrare configurato con S 2 e ossigenare continuamente.
- Prima di dissezione, riempire vibratome da camera con S 2 e organizzare ghiaccio tritato intorno alla camera. In alternativa, il trasferimento soluzione ossigenata di riserva ghiaccio freddo da ossigenante camera in vibratome da camera e mantenere l'ossigenazione continuamente.
- Disporre strumenti chirurgici e materiali di consumo.
- Posizionare il gel impacco di ghiaccio sotto dissezionemicroscopio, coprire con un tovagliolo di carta per evitare che il tessuto VNO dal congelamento al fondo del piatto.
- Pulire la lama di rasoio da risciacquo brevemente in etanolo al 70% e acqua distillata e montare a vibratome. Sostituire per ogni sessione di taglio.
3. VNO Dissection and Embedding
- Il sacrificio di animali da una breve esposizione al CO 2 e decapitare con le forbici chirurgiche affilate. Nota: Mentre il tempo da sacrificare l'animale a mettere la capsula VNO su ghiaccio è critica, minimizzare il tempo di meno di 2 min. Per mantenere la vitalità del tessuto, incorporare entrambi completamente Dissected vnos in agarosio in meno di 30 minuti.
- Rimuovere la mascella inferiore con grandi forbici chirurgiche. Inserisci attraverso la cavità orale e tagliare le ossa mandibola e muscolare di ogni lato separatamente.
- Posizionare la parte restante della testa a testa in giù nel grande piatto Petri.
- Tirare via la pelle della mascella superiore ed intorno alla punta del naso con pinze medie per ottenere un migliore accesso alincisivi.
- Utilizzare forbici osso per tagliare via la maggior parte degli incisivi a ~ 45 ° nella direzione rostrale (Figura 1A). Ciò faciliterà la rimozione della capsula VNO dalla cavità nasale.
Nota: Non tagliare alla radice del dente per evitare danni alla punta della capsula VNO. - Afferra il palato superiore rigida nella sua parte rostrale con una pinza a medio e sbucciare accuratamente di nuovo in un unico pezzo con un angolo piatto (Figura 1B).
Nota: ripetutamente risciacquare con ghiacciata S 2. - Utilizzare forbici micro molla per tagliare la fusione ossea tra la punta dell'osso vomere e la mascella. Inserire le punte a forbice con la parte curva della punta rivolta verso l'esterno lontano dalla VNO e con attenzione tagliare l'osso a piccoli passi sia sulla sinistra e laterale destra per la capsula VNO.
- Per rimuovere la capsula VNO, usare le forbici micro primavera per tagliare l'osso vomere alla parte caudale e sollevare con attenzione l'osso vomere fuori dalla ncavità Asal con pinze medie. trasferire immediatamente il VNO di una piccola capsula di Petri con un microscopio stereo su un impacco di gel refrigerante in cui saranno eseguiti i passaggi rimanenti della dissezione.
- Sciacquare il VNO in una piccola quantità di ghiaccio-freddo S 2 per evitare che il tessuto si secchi.
- Separare le capsule cartilaginei che contengono i tessuti molli VNO afferrando la parte posteriore dell'osso vomere con una pinza medie. Posizionare la capsula per una vista dorsale in modo che una spaccatura tra i due vnos diventa visibile (Figura 1D i).
- Utilizzare la punta di una pinza sottile per separare sia la cartilagine VNO capsule dall'osso centrale, mantenendo l'osso vomere immobilizzato nella parte posteriore.
Nota: Utilizzare pinze solo a bordo della capsula cartilagine e stare molto attenti a non forare attraverso la cartilagine come l'epitelio sensoriale delicata è facilmente danneggiata. - Una volta che i due sono separati vnos, cominciare a rimuovere la cartilagine incapsulare gli abetit VNO.
- Afferra il bordo superiore della capsula con una pinza sottile e dividere via il muro di cartilagine che è stato precedentemente attaccato all'osso vomere (lato mediale).
- Per rimuovere restante cartilagine ruotare il VNO con il lato laterale curva al fondo del piatto e saldamente pin la cartilagine su un lato con pinze. Spostare con attenzione la seconda pinza sottile dal lato posteriore ad un angolo molto piatta tra cartilagine e VNO per allentare la connessione tra il tessuto e la cartilagine.
- Lentamente sbucciare la VNO via dalla cartilagine tenendolo sulla punta caudale, per evitare di danneggiare l'epitelio sensoriale.
- Una volta che il VNO è levered dalla capsula, assicurarsi di rimuovere tutte le piccole parti rimanenti della cartilagine come eventuali frammenti di cartilagine sarà staccare il tessuto dal circostante agarosio durante il processo di taglio.
- Mettere una piccola goccia di ghiacciata S 2 al primo Dissected VNO per prevenire danni ai tessuti. Un grande vaso sanguigno sul wil lateralel diventa visibile che indica che l'organo è ancora intatta e non è stato grossolanamente danneggiato durante la dissezione (Figura 2A ii). Nel caso il vaso sanguigno ha danneggiato, sarà ancora la pena di continuare con affettare VNO finché la morfologia complessiva non era chiaramente compromessa.
- sezionare immediatamente la seconda VNO.
- Per incorporare il vnos, riempire entrambe le piccole capsule di Petri fino all'orlo con S fusa 3 (memorizzato in bagno d'acqua a 42 ° C; vedi 1.3).
- Tenere il VNO sull'estremità caudale più ampio con una pinza sottile per evitare di danneggiare l'epitelio sensoriale.
- Immergere il VNO in agarosio e spostarlo orizzontalmente avanti e indietro più volte per rimuovere la pellicola di soluzione extracellulare nonché eventuali bolle d'aria dalla sua superficie.
- Posizionare il VNO verticalmente con la punta caudale verso il fondo del piatto. Invece di pizzicare il VNO con la pinza direttamente, regolare l'orientamento spostando la punta pinza in stretta ProximiTy al VNO.
Nota: orientamento durante incorporamento è fondamentale in quanto determina piano di sezione e l'accessibilità ai neuroni sensoriali durante l'esperimento. - Posizionare piatti impacco di ghiaccio gel e attendere che agarosio si è solidificato.
Nota: Non modificare l'orientamento VNO una volta che l'agarosio si è iniziato consolidando quanto ciò staccare il tessuto dal agarosio circostante.
4. coronale VNO Tissue affettare
- Utilizzare piccola spatola per rimuovere blocco agarosio dal piccolo piatto nel coperchio di un grande piatto di Petri, capovolgere l'agarosio a testa in giù lasciando la punta caudale del VNO rivolto verso l'alto.
- Tagliare il blocco in una forma piramidale con un bisturi chirurgico (3-4 mm alla punta, 8-10 mm in basso). Fare attenzione a non danneggiare il tessuto incorporato.
- Utilizzare colla super per fissare il blocco a forma di piramide al centro della piastra del campione vibratome ed attendere ~ 1 min per la colla si asciughi completamente.
- Trasferire il piatto esemplare per l'affettamento cHamber e preparare la seconda VNO, di conseguenza. Mantenere piastra con seconda provetta a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Utilizzare un microtomo lama vibrante con le seguenti impostazioni: Spessore: 150-200 micron; Velocità: 3,5 au = 0,15 mm / sec; Frequenza: 7.5 au = 75 Hz. Trasferimento fette di camera di ossigenazione fino al momento dell'uso dopo aver ispezionato brevemente fetta morfologia sotto il microscopio da dissezione. Fette possono essere mantenuti per diverse ore.
5. monocellulari elettrofisiologiche Recordings
- Per le registrazioni, utilizzare un microscopio stadi montante fisso dotato di obiettivi immersione in acqua, Dodt o infrarossi differenziale interferire contrasto (IR-DIC) e epi-fluorescenza, nonché una videocamera CCD raffreddata. Per l'acquisizione dei dati, utilizzare un amplificatore di patch-clamp, palcoscenico testa, AD scheda di interfaccia / DA e un PC (compreso il software di registrazione).
- Preparare uno stock di 10-20 pipette di patch (4-7 MW). pipette tirare da capillari di vetro borosilicato (1,50 mm di diametro / 0,86 millimetri ID) Usinga micropipetta estrattore e fire-lucidare con un microforge.
Nota: Fuoco lucidatura le punte delle pipette è fondamentale quando patch piuttosto piccola VSNs. Ciò contribuirà a prevenire la rottura della membrana cellulare quando si applica una pressione negativa in modo da ottenere una tenuta elevata resistenza. Dopo la lucidatura l'apertura pipetta dovrebbe essere di circa 1 micron. - Mantenere pipette in un barattolo di stoccaggio pipetta per evitare danni e l'accumulo di polvere fino al momento dell'uso.
- Preparare sistema di perfusione riempiendo i serbatoi di soluzione e tubi secondo il disegno sperimentale.
Nota: rimuovere le bolle d'aria dal tubo del tutto in quanto saranno fortemente interferire con registrazioni elettrofisiologiche. - Regolare la pressione per ottenere ~ 3 ml / min.
Nota: Alte pressioni causeranno il movimento della fetta del tessuto così come la cessazione di registrazioni elettrofisiologiche. - Trasferimento fetta VNO alla camera di imaging e fissare la posizione fetta utilizzando ancora in acciaio inox cablato con 0,1 mm di spessore syntfibre hetic (Figura 2B - C).
Nota: Non coprire la fetta di tessuto con uno dei fili di fibra sintetica, ma piuttosto l'agarosio che circonda la fetta. - Trasferimento camera di imaging per la registrazione e la configurazione fetta continuamente superfuse con ossigenato S 2 a temperatura ambiente tramite un'applicazione vasca.
- Regolare il capillare di aspirazione alla superficie della soluzione per creare un'aspirazione lento per scambio costante di soluzione del bagno. Regolare la 8-in-1 multi-barrel "matita perfusione" sopra e vicino alla parte non sensoriale della fetta VNO che contiene il vaso sanguigno (Figura 2C, 3A) 50. Sarà utile per organizzare matita perfusione e la registrazione pipetta di essere di fronte alla fetta da direzioni opposte.
- Collegare l'elettrodo di riferimento e soluzione del bagno utilizzando un ponte di agar a forma di L (riempito con 150 mM KCl).
- Riempire pipetta di patch con una soluzione di pipetta S 4.
- Montare la pipetta di argento elettrodo cerotto cloruro rivestite collegato allo stadio testa senza raschiando il rivestimento e fissare saldamente.
- Applicare una leggera pressione positiva (circa 1 ml di una siringa di plastica 10 ml) alla pipetta di patch prima di entrare nel bagno.
- Abbassare la pipetta nel bagno usando micro manipolatori abbastanza lontano da essere in grado di immergere l'obiettivo senza colpire (Figura 2D).
- Monitorare la resistenza pipetta (R pip, tra 4-7 MW) utilizzando il software elettrofisiologia collegato allo stadio testa.
Nota: Se R pip è <4 MW la punta di vetro è rotto. Se R pip è> 10 MW, la punta è più probabile intasato e la pipetta deve essere sostituito. - Visualizza la fetta VNO con un CCD-fotocamera utilizzando contrasto interferenziale differenziale a raggi infrarossi ottimizzato (DIC) e identificare FPR-RS3-i-Venere cellule che esprimono (o simile neuroni marcati) con illuminazione a fluorescenzae un cubetto di filtro appropriato.
- FOCUS e fluorescenti bersaglio o cellule non-fluorescenti a seconda del disegno sperimentale.
- Per avvicinarsi al corpo cellulare, utilizzare volantini per la massima sensibilità. A causa della pressione positiva, una piccola ammaccatura nella membrana cellulare soma diventa visibile una volta che la punta della pipetta si trova nelle immediate vicinanze.
- Rilasciare pressione positiva e applicare una leggera pressione negativa per aspirare nella membrana cellulare al fine di ottenere una tenuta elevata resistenza (1-20 GΩ). Applicare aspirazione breve e delicato per distruggere la membrana cellulare e stabilire la cellula intera configurazione.
- Monitorare resistenza accesso costante durante l'esperimento.
Nota: includere solo i neuroni espongono piccola e stabile resistenza di accesso (≤3% dell'ingresso R; variazione <20% nel corso dell'esperimento) nell'analisi.
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Representative Results
Al fine di conoscere le proprietà biofisiche e fisiologiche di popolazioni cellulari definiti, eseguiamo fette di tessuto coronale acute del mouse VNO (Figura 1 - 2). Dopo la dissezione, fette possono essere conservati in soluzione extracellulare ossigenato ghiacciata (S 2) per diverse ore. Alla messa a punto di registrazione, uno scambio costante con soluzione fresca ossigenata (Figura 2D) garantisce vitalità del tessuto per tutto l'esperimento. Siamo qui avvaliamo di un modello di topo transgenico (FPR-RS3-i-Venere). VSNs in questo ceppo coesprimere una proteina marcatore fluorescente con FPR-RS3, membro prototipo del FPR-R gene famiglia (figura 3) che consente l'identificazione ottica di una popolazione definita di neuroni sensoriali. Le registrazioni elettrofisiologiche fornire i mezzi per un'analisi approfondita a livello di singola cellula. Per esempio, l'analisi delle correnti voltaggio-dipendenti viene eseguita in voltage-clampmodalità (figura 4A - B). Per isolare specifici tipi di correnti ioniche, fette sono superfused con agenti farmacologici come TTX per inibire le correnti voltaggio-dipendenti Na + (Figura 4A) o nifedipina per bloccare voltaggio-dipendenti di tipo L Ca 2+ correnti (Figura 4B). Inoltre, abbiamo quotidianamente ad effettuare registrazioni cellule intere nella configurazione corrente pinza per analizzare i potenziali modelli di scarica azione (Figura 4C). Oltre alle registrazioni cellule intere, le registrazioni delle cellule-attached 'loose-seal' forniscono un metodo meno invasivo che impedisce la dialisi dei componenti intracellulari (Figura 5A). L'azione di registrazione potenziale-driven correnti capacitive su richiesta breve stimolo offre un modo sensibile ed efficace per lo screening per i ligandi sensoriali (ad esempio, le principali proteine urinarie; MUP) che attivare popolazioni di cellule 51 (Figura 5B) definiti.
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Figura 1: dissezione del VNO. (A) Vista laterale sulla testa del mouse per illustrare la posizione e l'angolo al quale vengono tagliati gli incisivi. (B) Vista ventrale raffigurante il punto migliore per afferrare e sbucciare indietro il palato superiore (UP). (C) Vista ventrale sulla cartilagine della capsula (CC) che ospita il VNO e l'osso vomere (VB) dopo aver tolto le mandibola, incisivi e il palato. View (D) dorsale della capsula VNO sezionato raffigurante la localizzazione bilaterale sia vnos (D i). La vista laterale illustra il bordo della cartilagine sul lato dorsale dove entrambi vnos devono essere separati (D ii). Scala bar = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Preparazione Tissue, registrando camera ed palco microscopio vista laterale schematica un VNO per illustrare il corso e la posizione della grande vaso sanguigno (BV) nella parte non-sensoriali dell'epitelio (A i). La linea tratteggiata rappresenta il livello affettatura coronale. Vista laterale su un VNO sbucciato fuori dalla CC mostra il vaso sanguigno (A ii). (B) Agarose-embedded coronale fetta tessuto VNO fissata al fondo della camera di registrazione soluzione-riempita con un ancoraggio in acciaio inox cablato con 0,1 mm di spessore fibra sintetica (SF) thread. La zona in scatola raffigura l'agarosio che circonda la fetta del tessuto. (C) Vista schematica illustrante la posizione e l'orientamento di un agarosio (Ag) -Embedded coronale fetta VNO posizionato tra due fibre. (D) Panoramica della camera di registrazione posto sul palco microscopio. La camera è dotata di applicazione vasca (BA) per costante superfusione con ossigenato S 2, la matita perfusione (PP) per applicare stimoli sensoriali o agenti farmacologici, la pipetta di registrazione (RP) collegato allo stadio testa amplificatore, l'elettrodo di riferimento (RE ) e il capillare di aspirazione (SC) per mantenere un costante scambio di soluzione nella camera. Scala bar = 1 mm (A ii). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: coronali tiss VNOfetta ue. (A) immagine confocale (massima proiezione) di una fetta del tessuto 150 micron acuta coronale VNO che mostra la distribuzione delle fluorescenti FPR-RS3 tau-Venus + neuroni (verde) nel vomeronasale dell'epitelio sensoriale. dei vasi sanguigni (BV), lumen (L), dell'epitelio sensoriale (SE). Neuroni (B) FPR-RS3 tau-Venere + mostrano un singolo dendrite apicale che termina in una struttura manopola simile al confine luminale. Whole-cell patch-clamp sono state eseguite dal soma VSN, patch di pipetta (PP). (C) Morfologia di un singolo VSN con la manopola dendritiche (K) sulla punta della lunga e stretta dendrite (D), il soma cellulare (S) e l'assone (A) in uscita dal soma sul lato basale. Barre di scala, 50 micron (A), 10 micron (B), 5 micron (C). Questa cifra è stata modificata da 52. Si prega di cliccare quiper visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Isolated voltaggio-dipendenti Na + e Ca 2+ correnti così come lo scarico picco (A) tracce rappresentativi di cellule intere registrazioni patch-clamp di una rapida attivazione Na + corrente TTX-sensibili in VSNs FPR-RS3 +.. (A i) la registrazione a passo di tensione in condizioni di controllo (soluzione extracellulare S 1; intracellulare soluzione S 4) rivela una tensione-dipendente transitori veloci e verso l'interno corrente. (A ii) trattamento TTX (1 micron) diminuisce fortemente la corrente. Trace sottratto digitale (controllo-TTX (A iii)) reveals TTX-sensibili voltaggio-dipendenti Na + corrente. Relazioni corrente-tensione delle correnti TTX-sensibili Na + isolate da neuroni di controllo e FPR-RS3 + (A iv). (B) Rappresentante Ca 2+ tracce attuali isolate farmacologicamente (10 micron nifedipina). (C) Rappresentante tracce pinza corrente che mostrano rimozione / iperpolarizzazione e treni di potenziali (rimbalzo) azioni generate sul positivo graduale (C i) e negativo (C iii) iniezione di corrente. Nota l'attività spontanea misurato a 0 pA iniezione di corrente (C ii). (C iv) frequenza di emissione controllo e FPR-rs3 + neuroni in funzione della corrente iniettata (inietto). Il progressivo aumento della frequenza di attivazione è simile per il controlloe FPR-RS3 + VSNs. Si noti che VSNs sono estremamente sensibili alle iniezioni di corrente anche in bassa picoampere gamma 53-56. Si noti che le curve -I f sono state "background-correzione" utilizzando la frequenza chiodare spontanea a 0 pA iniezione di corrente. I dati sono mezzi ± SEM. Questa cifra è stata modificata da 52. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5: registrazioni extracellulari 'di patch sciolto' dal VSNs basali (A) immagine IR-DIC di una fetta del tessuto VNO acuta raffigurante la pipetta di registrazione nello strato basale dell'epitelio sensoriale.. (B) registrazione originale Rappresentante di un VSN basale nella configurazione della cella-attached (&# 39; loose-seal ') rispondendo con brevi sequenze transitori di picchi a breve stimoli (3 sec) con un pool di importanti proteine urinarie ricombinante espresse (rMUPs) e una concentrazione di potassio elevata (50 mm, 1 sec), rispettivamente (B i) . Maggiore ingrandimento di registrazioni mostrate in (B i) illustra raffiche di picchi in risposta a stimoli (B II). Le barre rosse indicano il tempo di stimolazione, intervallo inter-stimolo = 30 sec, registrazione continua, interruzioni <1 sec (segni di taglio //). Barra di scala = 5 micron (A). Panel (A) è stato modificato dal riferimento 38. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il VNO è una struttura chemosensory che rileva semiochimici. Fino ad oggi, la maggior parte dei recettori vomeronasali resta da deorphanized come sono stati identificati solo poche coppie recettore-ligando. Tra questi, V1rb2 è stato descritto essere specificamente attivati dal maschio feromone urinario 2-eptanone 30, V2rp5 per essere attivato dal maschio specifico feromone ESP1 57 così come V2r1b e V2rf2 per essere attivati dai peptidi MHC SYFPEITHI 48 e SEIDLILGY 58, rispettivamente. Un prerequisito per la comprensione del recettore-ligando relazioni e trasduzione del segnale è la conoscenza delle caratteristiche biofisiche delle popolazioni VSN definiti in un ambiente nativo. proprietà di membrana attivi e passivi, conduttanze ioniche voltaggio-dipendenti e modelli di scaricare il potenziale d'azione definiscono i mezzi e fino a che punto i neuroni recettori rispondono a stimoli chemosensory. Le registrazioni elettrofisiologiche in fette di tessuto acute e, in particolare, cheregistrazioni di patch-clamp le-cellule forniscono un ottimo metodo per analizzare queste proprietà in grande dettaglio.
Un passaggio fondamentale per le registrazioni fisiologiche di successo e affidabili in fette di tessuto è preparato stesso. Per massimizzare l'intervallo di tempo per eseguire esperimenti, il tessuto deve essere affettato e trasferito in soluzione ossigenata ghiacciata immediatamente dopo la dissezione. In seguito, le fette possono essere conservati per vari hr consentire l'analisi di un gran numero di cellule al giorno sperimentale. Ci vuole una certa pratica per ridurre i tempi di sezionare e incorporare entrambi vnos di un animale in meno di 30 minuti. Dopo di che, il tasso di successo per uno sperimentatore con esperienza per ottenere qualche fetta tessuto intatto con le cellule vitali è ben superiore al 75%. Esecuzione di patch-clamp è un approccio sperimentale a basso rendimento in confronto a Ca 2+ imaging. Tuttavia, consente un'analisi più dettagliata e versatile di attività a livello di singola cellula con un temporale molto più elevatorisoluzione. Nella cellula intera configurazione, il mezzo intracellulare viene dializzata dalla soluzione pipetta. Mentre la soluzione pipetta potrebbe non riflettere la composizione citosolico esatta, fornisce lo sperimentatore con il controllo esatto su entrambe le condizioni ioniche extra- ed intracellulari. Per l'interpretazione dei risultati affidabili, monitoraggio continuo della resistenza di accesso e la corrente di dispersione è cruciale. A volte, un significativo aumento o una forte variazione di resistenza di accesso o di perdite di corrente porta ad risultati non interpretabili e chiede quindi queste registrazioni devono essere scartati. Inoltre, è importante notare che alcuni composti farmacologici legano irreversibilmente renda necessaria la sostituzione fette dopo ogni registrazione.
Registrazione nella configurazione cell-divisoria impedisce dialisi di componenti intracellulari e non influenza potenziale di membrana della cellula. Così, questa tecnica fornisce un modo meno invasivo e relativamente veloce di screening. Tuttavia, questo approgni è generalmente limitata alla registrazione di super-limite d'azione potenziali guidato correnti capacitive dall'esterno della membrana cellulare. Loose-registrazioni di patch hanno dimostrato di essere adatto per l'analisi del comportamento incurvamento del maggior numero di neuroni sensoriali in VNO fette 38,54.
Il modello transgenico impiegato qui fornisce uno strumento affidabile per identificare e analizzare la popolazione di FPR-RS3 che esprimono VSNs. Inoltre, la tecnica qui descritta può essere estesa ad altre linee indipendentemente dalla loro genotipo. Nonostante l'enorme vantaggio di studiare un tipo di cellula definito, utilizzando topi transgenici limita esperimenti alle linee disponibili. Recentemente, tuttavia, la modifica del genoma di mira è diventato più veloce e più conveniente con la CRISPR / tecnica Cas9 59. In conclusione, mirati registrazioni patch-clamp in fettine di tessuto vomeronasale acute forniscono un approccio versatile per caratterizzare le proprietà biofisiche e fisiologici di un populat definitoioni di neuroni sensoriali.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
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