Introduction
De meeste dieren zijn sterk afhankelijk van hun chemische zintuigen te communiceren met hun omgeving. Reukzin speelt een essentiële rol voor het vinden en evalueren van voedsel, vermeden roofdieren en lokaliseren geschikt koppelen partners. In de meeste zoogdieren, het olfactorische systeem bestaat uit ten minste vier anatomisch en functioneel verschillende perifere subsystemen: het belangrijkste reukepitheel 1,2, de Grueneberg ganglion 3,4, het septum orgaan van Masera 5,6 en het vomeronasale orgaan. De VNO bestaat uit de perifere sensorische structuur van het accessoire olfactorische systeem (AOS), die een belangrijke rol bij het opsporen van chemische signalen dat de informatie over de identiteit, gender, sociale rang en seksuele staat 7-10 te brengen speelt. VNO is gelegen aan de voet van het neustussenschot recht boven het gehemelte. Bij muizen is een bilaterale-blind eindigende buis ingesloten in een kraakbeenachtige capsule 11-13. Het orgel bestaat uit zowel een halvemaanvormige mediale zintuiglijke epithelium de VSNs herbergt en een niet-sensorische gedeelte aan de zijkant. Tussen beide epithelia ligt een slijm gevulde lumen die is verbonden met de neusholte via de smalle vomeronasaal leiding 14. Een grote laterale bloedvaten in de niet-sensorische weefsel verschaft een vasculaire pompmechanisme opneming van relatief grote, niet vluchtige moleculen zoals peptiden of kleine eiwitten in het VNO lumen onderdruk 15,16 vergemakkelijken. De onderdelen van de VNO aanwezig bij de geboorte en het orgaan volwassen grootte bereikt kort voor de puberteit 17. Echter, of het knaagdier AOS is al functioneel bij jongeren is nog steeds onderwerp van discussie 18-20.
VSNs onderscheiden zich door zowel hun epitheliale locatie en het type receptor uiten ze. VSNs tonen een bipolaire morfologie met gemyeliniseerde axon en een apicale dendriet dat uitsteekt naar de lumen en eindigt in een microvilli dendritische knop. VSN bijlons fasciculate de vomeronasal zenuw die de kraakbeenvissen capsule bij de dorso-caudale schutbladen, stijgt langs het septum, passeert de zeefvormige plaat en projecten om de accessoire olfactorische bulb (AOB) 21,22 vormen. De vomeronasal sensorische epitheel bestaat uit twee lagen: het apicale laag zich dichter bij het luminale kant en havens zowel V1R- en alle behalve één type FPR-rs-expressie neuronen. Deze neuronen coexpress de G-eiwit α-subeenheid G αi2 en project aan het voorste deel van de AOB 23-25. Sensorische neuronen gelegen in de meer basale laag uitdrukkelijke V2Rs of FPR-RS1 naast G ao en sturen hun axonen naar het achterste deel van de AOB 26-28.
Vomeronasal neuronen worden waarschijnlijk geactiveerd door vrij klein feromonen 29-33 (V1Rs) of proteïneachtige verbindingen 34-38 (V2Rs) die worden uitgescheiden in verschillende lichaamsvloeistoffen zoals urine, speeksel en traanvocht 37,39-41 In situ experimenten hebben aangetoond dat VSNs ook worden geactiveerd door geformyleerde peptiden en diverse antimicrobiële / inflammatie-gekoppelde verbindingen 25,42. Bovendien heteroloog tot expressie FPR-rs eiwitten delen agonist spectra met FPRs uitgedrukt in het immuunsysteem, wat wijst op een mogelijke rol als detectoren voor ziekte in soortgenoten of bedorven voedsel bronnen 25 (zie referentie 43).
Fundamenteel belang voor het begrijpen van receptor-ligand relaties en downstream signaling cascades in specifieke VSN populaties is een gedetailleerde evaluatie van hun fundamentele biofysische kenmerken in een natuurlijke omgeving. In het verleden heeft de analyse van cellulaire signalering sterk geprofiteerd van genetisch gemodificeerde dieren met een bepaalde populatie van neuronen markeren door co-expressie van een fluorescent merkereiwit 30,44-49. In dit protocol, een transgene muis lijn die FPR-RS3 uitdrukt samen met een fluorescente marker (Fpr-RS3-i-Venus) wordt gebruikt.Deze werkwijze illustreert hoe een dergelijke genetisch gemodificeerde muizenstam gebruiken om elektrofysiologische analyse van een optisch herkenbare celpopulatie via één neuron patch-clamp acute coronale VNO weefselplakjes voeren. Een luchtdruk aangedreven multi-barrel perfusie-systeem voor zintuiglijke prikkels en farmacologische middelen zorgt voor een snelle, omkeerbare en focale neuronale stimulatie of inhibitie tijdens de opnames. Whole-cell opnames in slice voorbereidingen zorgen voor een gedetailleerde analyse van de intrinsieke eigenschappen, voltage-geactiveerde conductances, evenals actiepotentiaal ontlading patronen in de cel van de eigen omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures waren in overeenstemming met de lokale en EU-wetgeving inzake de bescherming van dieren die voor experimentele doeleinden (Richtlijn 86/609 / EEG) en met aanbevelingen van de Federation of European Laboratory Animal Science Associations (FELASA). Beide C57BL / 6 muizen en Fpr-RS3-i-Venus muizen werden gehuisvest in groepen van beide geslachten bij kamertemperatuur op een 12 uur licht / donker cyclus met voedsel en water ad libitum beschikbaar. Voor experimenten jongvolwassenen (6-20 weken) van beide geslachten werden gebruikt. Geen duidelijke geslacht afhankelijke verschillen werden waargenomen.
1. Oplossing Voorbereiding
- Bereid extracellulaire oplossing S 1: 4- (2-hydroxyethyl) piperazine-1-ethaansulfonzuur (HEPES) gebufferde extracellulaire oplossing die (in mM) 145 NaCl, 5 KCI, 1 CaCl2, 1 MgCl2, 10 HEPES; pH = 7,3 (ingesteld met NaOH); osmolariteit = 300 mOsm (ingesteld met glucose).
- Bereid extracellular oplossing S 2: carbogen-geoxygeneerde (95% O2, 5% CO2) extracellulaire oplossing die (in mM) 125 NaCl, 25 NaHCO3, 5 KCl, 1 CaCl2, 1 MgSO 4, 5 BES; pH = 7,3; osmolariteit = 300 mOsm (ingesteld met glucose).
- Bereid 4% lage geleringstemperatuur agarose oplossing (S 3) voor het weefsel inbedding: 4% lage geleringstemperatuur agarose. Los 2 g laag-gelerende agarose in 50 ml S 1 in een 100 ml glazen fles laboratorium met een magnetische roerder. Om de agarose te smelten, zet de fles in een waterbad (met deksel niet goed gesloten) bij 70 ° C gedurende ongeveer 20 minuten of totdat oplossing wordt transparant onder roeren. Afkoelen en bewaar gesmolten agarose in een tweede waterbad bij 42 ° C tot verder gebruik.
- Bereid intracellulaire oplossing S 4: Pipetteer oplossing die (in mM) 143 KCl, 2 KOH, 1 EGTA, 0,3 CaCl2 (vrij Ca2 + = 110 nM), 10 HEPES, 2 MgATP, 1 NaGTP;pH = 7,1 (ingesteld met KOH); osmolariteit = 290 mOsm.
- Wijzig / afstellen samenstelling S 1, S2 en S4 volgens de individuele proefopzet (bijvoorbeeld farmacologische blokkers bepaalde spanning geactiveerde stromen isoleren).
2. Workspace Voorbereiding
- Vul zuurstof slice opslagkamer met S 2 ten minste 30 min voorafgaand aan dissectie, plaats op het ijs voor de temperatuur en pH-aanpassing en zuurstofhoudende oplossing continu.
- Vul reservoir voor slice superfusieapparaat bij opname setup met S 2 en zuurstof continu.
- Voorafgaand aan de dissectie, vul vibratome kamer met S 2 en schik crushed ijs rond de kamer. Alternatief: breng reserveonderdelen ijskoude zuurstofrijk oplossing van zuurstof kamer in vibratome kamer en houden continu zuurstof.
- Schik chirurgische gereedschappen en materialen.
- Plaats ijs gel-pak onder ontledenmicroscoop, dek af met een papieren handdoek te voorkomen VNO weefsel van vriezen bodem van de schaal.
- Schoon scheermesje door kort spoelen met 70% ethanol en gedestilleerd water en monteren op vibratome. Vervang voor elke snijden sessie.
3. VNO Dissection and Embedding
- Sacrifice dierlijke korte blootstelling aan CO 2 en onthoofden met een scherpe chirurgische schaar. Opmerking: Als de tijd van offeren het dier brengen VNO capsule op ijs kritisch, zo kort mogelijk duurt minder dan 2 minuten. Weefsel levensvatbaarheid behouden insluiten beide volledig ontleed VNOs in agarose in minder dan 30 minuten.
- Verwijder de onderkaak met grote chirurgische schaar. Voer via de mondholte en snijd de onderkaak botten en spieren van iedere kant apart verder.
- Plaats het resterende deel van de kop ondersteboven in de grote petrischaal.
- Weg te trekken van de huid van de bovenkaak en rond de punt van de neus met medium tang om een betere toegang tot het krijgensnijtanden.
- Met been schaar weggesneden het grootste deel van de snijtanden op ~ 45 ° hoek in het rostrale richting (figuur 1A). Dit zal het verwijderen van de VNO capsule uit de neusholte verlichten.
Opmerking: niet aan de wortel van de tand gesneden om schade aan de punt van de VNO capsule voorkomen. - Pak de starre gehemelte op zijn rostrale deel met medium pincet en zorgvuldig schil terug in een stuk op een vlakke hoek (Figuur 1B).
Opmerking: Herhaaldelijk spoelen met ijskoude S 2. - Gebruik micro veer schaar om de botfusie snijden tussen het uiteinde van de vomer bot en de kaak. Plaats de schaar uiteinden van het gebogen deel van de punt naar buiten weg van het VNO voorzichtig snijd het bot in kleine stappen aan de linker- en rechterzijde lateraal van de VNO capsule.
- Om de VNO capsule verwijderen, gebruikt micro voorjaar een schaar door de vomer bot te snijden in het caudale deel en til de vomer bot uit de nasal holte met behulp van medium tang. VNO onmiddellijk over een petrischaaltje onder een stereomicroscoop op een ijs gelpack waarbij de resterende stappen van de dissectie wordt uitgevoerd.
- Spoel de VNO in een kleine hoeveelheid ijskoud S 2 om het weefsel uitdroogt.
- Scheid de kraakbeen capsules die de VNO zachte weefsels bevatten door grijpen de achterkant van de vomer bot met medium tang. Plaats de capsule voor een dorsale weergave, zodat een splitsing tussen beide VNOs zichtbaar (figuur 1D i).
- Gebruik de punt van fijne tang om zowel kraakbeen scheiden VNO capsules van de centrale bot terwijl de vomer bot vastgepind op het achterste deel.
Opmerking: Gebruik een tang alleen aan de rand van het kraakbeen capsule en heel voorzichtig zijn niet te doorboren het kraakbeen als de delicate sensorische epitheel gemakkelijk beschadigd. - Wanneer de twee VNOs gescheiden, beginnen met het verwijderen van de inkapseling van het kraakbeen sparrent VNO.
- Pak de bovenrand van de capsule met een fijn pincet en split weg het kraakbeen muur die eerder was verbonden aan de vomer bot (mediale zijde).
- Om de resterende kraakbeen draai de VNO met zijn gebogen laterale zijde naar de bodem van de schaal en veilig vastpinnen het kraakbeen aan de ene kant behulp van een tang te verwijderen. Beweeg voorzichtig de tweede fijne tang van achter op een zeer vlakke hoek tussen kraakbeen en VNO de verbinding tussen weefsel en kraakbeen los.
- Langzaam schil de VNO weg van het kraakbeen door vast te houden aan zijn staartvin tip, om te voorkomen dat schade aan de sensorische epitheel.
- Zodra de VNO is levered uit de capsule, zorg ervoor dat alle resterende kleine kraakbeen onderdelen te verwijderen als alle resterende stukjes kraakbeen zal het weefsel los te maken uit de omliggende agarose tijdens het snijden proces.
- Plaats een druppeltje ijskoude S 2 op de eerste ontleed VNO weefselschade voorkomen. Een groot bloedvat aan de laterale zijde will zichtbaar aangeven dat het orgaan nog steeds intact en werd niet beschadigd tijdens de grove dissectie (Figuur 2A ii). Indien het bloedvat beschadigd raakt, zal het nog steeds zinvol door te gaan met snijden VNO zolang de totale morfologie niet duidelijk verminderd.
- Onmiddellijk ontleden de tweede VNO.
- Om de VNOs insluiten, vult zowel kleine petrischaaltjes tot de rand met gesmolten S 3 (opgeslagen in een waterbad bij 42 ° C, zie 1.3).
- Houd het VNO aan het bredere staarteinde met fijne tang om schade aan de sensorische epitheel voorkomen.
- Dompel het VNO in de agarose en beweeg het horizontaal heen en weer meerdere malen om de film van extracellulaire oplossing en luchtbellen uit het oppervlak te verwijderen.
- Plaats de VNO verticaal met de staart punt met uitzicht op de bodem van de schaal. In plaats van het knijpen de VNO met de tang rechtstreeks, aan te passen oriëntatie door het verplaatsen van de tang tip in nauwe Proximity naar de VNO.
Opmerking: Oriëntatie tijdens de inbedding is van cruciaal belang omdat het bepaalt slice vliegtuig en de toegankelijkheid van sensorische neuronen tijdens het experiment. - Plaats de gerechten op gel ice-pack en wacht tot agarose is gestold.
Opmerking: Verander niet VNO oriëntatie nadat de agarose is begonnen stollen, omdat dit het weefsel los te maken van de omringende agarose.
4. coronale VNO Tissue Snijdende
- Gebruik maken van kleine spatel om agarose blok van de kleine schotel in de deksel van een grote petrischaal te verwijderen, draait u de agarose ondersteboven het verlaten van het caudale uiteinde van de VNO naar boven.
- Snijd het blok in een piramidale vorm met een chirurgisch scalpel (3-4 mm bij de punt, 8-10 mm onderaan). Zorg ervoor dat u de ingebed weefsel beschadigen.
- Gebruik superlijm de piramidevormige blok vast aan het midden van de vibratome specimen plaat en wacht ~ 1 min voor de lijm goed drogen.
- Transfer preparaatplateau aan het snijden cHamber en de voorbereiding van de tweede VNO dienovereenkomstig. Houd plaat met de tweede monster bij 4 ° C tot gebruik.
- Gebruik een vibreerblad microtoom met de volgende instellingen: dikte: 150-200 pm; snelheid: 3,5 au = 0,15 mm / sec; frequentie: 7.5 au = 75 Hz. Transfer plakken aan zuurstof kamer tot gebruik na een korte inspectie van slice morfologie onder de microscoop ontleden. Segmenten kunnen worden bewaard verscheidene uren.
5. Single-cell elektrofysiologische Recordings
- Voor opnamen Gebruik rechtop vaste fase microscoop met water immersie doelstellingen Dodt of infrarood differentieel storende contrast (IR-DIC) en epi-fluorescentie en een gekoelde CCD-camera. Voor data-acquisitie, gebruik maken van een patch-clamp versterker, hoofd podium, AD / DA-interface board en een PC (met inbegrip van opname-software).
- Bereid een voorraad van 10-20 patch pipetten (4-7 MQ). Pull pipetten van borosilicaatglas haarvaten (1,50 mm OD / 0,86 mm ID) usinga micropipet trekker en vuur-polijsten met een microforge.
Opmerking: Fire polijsten van de pipet tips is van cruciaal belang bij het patchen van de vrij kleine VSNs. Dit helpt voorkomen dat breken de celmembraan bij de toepassing van negatieve druk teneinde een hoge weerstand afdichting te verkrijgen. Na het polijsten van de pipet opening moet ongeveer 1 micrometer zijn. - Houd pipetten in een pipet opslag pot om schade en stofophoping tot gebruik te voorkomen.
- Bereid perfusie-systeem door het invullen oplossing reservoirs en leidingen volgens experimenteel ontwerp.
Opmerking: Verwijder luchtbellen uit een buis helemaal omdat ze sterk zullen verstoren elektrofysiologische opnames. - Bandenspanning tot ~ 3 ml / min debiet realiseren.
Opmerking: De hoge druk zal beweging van het weefsel slice, alsmede de beëindiging van elektrofysiologische opnames veroorzaken. - Transfer VNO slice om beeldvorming kamer en bevestig de slice positie met behulp van roestvrij staal anker bedraad met 0,1 mm dik synthetic vezels (Figuur 2B - C).
Opmerking: Bedek het weefsel slice met een van de synthetische vezel draden, maar de agarose rond de slice. - Transfer beeldvorming kamer om de opname setup en continu superfuse slice met zuurstofrijk S 2 bij kamertemperatuur via een bad applicatie.
- Stel de zuigkracht capillair aan het oppervlak van de oplossing tot een langzame zuig voortdurende uitwisseling van badoplossing creëren. Pas de 8-in-1 multi-barrel "perfusie pencil" boven en vlakbij de niet-sensorische deel van het VNO segment dat het bloedvat (figuur 2C, 3A) 50 bevat. Het is gunstig voor perfusie potlood en opname pipet regelen te zijn geconfronteerd met de slice vanuit tegengestelde richtingen.
- Sluit referentie-elektrode en badoplossing met een L-vormige agar brug (gevuld met 150 mM KCl).
- Vul patch pipet met pipet oplossing S 4.
- Monteer de pipet over de zilver-chloride gecoate patch elektrode aangesloten op het hoofd podium zonder afschrapen van de coating en sluit goed aan.
- Oefen lichte positieve druk (ongeveer 1 ml op een 10 ml plastic spuit) om de patch pipet voor het invoeren van het bad.
- Laat de pipet in het bad met behulp van micro manipulatoren ver genoeg om de doelstelling dompelen zonder te raken (figuur 2D).
- Monitor pipet weerstand (R pip, tussen 4-7 MQ) met behulp van elektrofysiologie software aangesloten op het hoofd podium.
Opmerking: Als R pip is <4 MQ het glas tip is gebroken. Als R pip> 10 MQ, is de punt waarschijnlijk verstopt en de pipet worden vervangen. - Visualiseer de VNO slice met een CCD-camera met behulp van infrarood-geoptimaliseerde differentieel interferentie contrast (DIC) en identificeren van FPR-RS3-i-Venus expressie brengen (of soortgelijk label neuronen) met behulp van fluorescentie-verlichtingen een geschikte filter kubus.
- Focus en doel fluorescerende of niet-fluorescerende cellen afhankelijk van experimenteel ontwerp.
- Om de cel lichaam benaderen, gebruiken de hand wielen voor maximale gevoeligheid. Als gevolg van positieve druk, een kleine deuk in de cel soma membraan wordt zichtbaar zodra de pipet tip is in de nabijheid.
- Los positieve druk en oefen lichte onderdruk voor het aanzuigen van de celmembraan om een hoge weerstand afdichting (1-20 GQ) krijgen. Toepassen korte en zachte zuigkracht aan het celmembraan verstoren en stelt de gehele celconfiguratie.
- Monitor toegang weerstand constant tijdens experiment.
Opmerking: Alleen onder andere neuronen vertonen kleine en stabiele toegang tot resistentie (≤3% van de R-ingang; verandering <20% in de loop van het experiment) in de analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om inzicht te krijgen in de biofysische en fysiologische eigenschappen van gedefinieerde celpopulaties, voeren we acute coronale plakjes weefsel van de muis VNO (Figuur 1-2). Na dissectie, kan segmenten in ijskoude geoxygeneerde extracellulaire oplossing (S 2) worden gehouden gedurende enkele uren. Bij de opname setup, een constante uitwisseling met vers zuurstofrijk-oplossing (figuur 2D) zorgt voor levensvatbaarheid van het weefsel gedurende het experiment. We hebben hier gebruik van een transgene muismodel (FPR-RS3-i-Venus). VSNs in deze stam coexpress een fluorescent merkereiwit met FPR-RS3, een prototypisch lid van de FPR-rs genfamilie (figuur 3) waarmee optische identificatie van een bepaalde populatie van sensorische neuronen. Elektrofysiologische opnames bieden de middelen voor diepgaande analyse op de single-cell niveau. Bijvoorbeeld, is de analyse van voltage-gated stromingen uitgevoerd in de voltage-clampmode (Figuur 4A - B). Voor specifieke soorten ionenstromen isoleren, worden schijfjes superfused farmacologische middelen zoals TTX om spanningsgevoelige Na + -stromen (figuur 4A) of nifedipine remmen spanningsafhankelijke L-type Ca2 + stromen (figuur 4B) blokkeren. Verder hebben we routinematig uitvoeren whole-cell-opnamen in de huidige klem configuratie om actiepotentiaal ontlading patronen (Figuur 4C) te analyseren. In aanvulling op whole-cell opnames, cel bevestigd 'loose-seal' opnames bieden een minder invasieve methode die dialyse van intracellulaire componenten (figuur 5A) voorkomt. Opname actiepotentiaal aangedreven capacitieve stromen op korte stimulustoediening biedt een gevoelige en efficiënte wijze te screenen op sensorische liganden (bijv belangrijke urinaire eiwitten; MUPS) die activeren gedefinieerde populaties van cellen 51 (Figuur 5B).
= "Jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> 
Figuur 1: Ontrafeling van het VNO. (A) Zijaanzicht van de muis kop om de positie en hoek waaronder de snijtanden worden gesneden illustreren. (B), ventraal aanzicht dat het beste punt te grijpen en schil de rug van de bovenste gehemelte (UP). (C) Ventraal aanzicht op het kraakbeen capsule (CC) dat de VNO en de vomer bot (VB) herbergt na het verwijderen van de onderkaak, snijtanden en gehemelte. (D) dorsaal aanzicht van de ontlede VNO capsule die de bilaterale lokalisatie van beide VNOs (Di). Het zijaanzicht illustreert de rand van kraakbeen op de dorsale zijde waar zowel VNOs moeten worden gescheiden (D ii). Schaal bar = 1 mm (A - D).517 / 54517fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Weefselpreparatie, opname kamer en microscooptafel Schematisch zijaanzicht op een VNO het verloop en de plaats van de grote bloedvaten (BV) in de niet-sensorische deel van het epitheel (Ai) tonen. De stippellijn geeft de coronale snijden laag. Zij mening op een VNO geschilde uit de CC toont het bloedvat (A ii). (B) agarose-ingebed weefsel coronale VNO slice onderaan de oplossing gevulde opname kamer met een roestvrij stalen anker bekabeld met 0,1 mm dikke synthetische vezels (SF) draden bevestigd. De boxed gebied toont de agarose rond het weefsel slice. (C) Schematisch aanzicht dat de positie en oriëntatie van een agarose (Ag) -Embedded coronale VNO segment tussen twee vezels. (D) Overzicht van de opname kamer geplaatst op de microscoop podium. De kamer is voorzien van een bad applicatie (BA) voor een constante superfusie met zuurstof S 2, de perfusie potlood (PP) zintuiglijke stimuli of farmacologische middelen toepassen, de opname pipet (RP) verbonden met de versterker hoofd fase, de referentie-elektrode (RE ) en de capillaire zuiging (SC) een voortdurende uitwisseling van oplossing in de kamer te handhaven. Schaal bar = 1 mm (A ii). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Coronale VNO tissue slice. (A) confocale image (maximaal projectie) van een acute coronale VNO weefsel slice 150 pm die de verdeling van fluorescerende FPR-RS3 tau-Venus + neuronen (groen) in de vomeronasaal sensorische epitheel. Bloedvat (BV), lumen (L), sensorische epitheel (SE). (B) FPR-RS3 tau-Venus + neuronen vertonen een apicale dendriet eindigt in een knobbel structuur aan de luminale grens. Whole-cell patch-clamp opnames werden uitgevoerd uit de VSN soma, patch pipet (PP). (C) Morfologie van één VSN de dendritische knop (K) aan het uiteinde van de lange en smalle dendriet (D), de cel soma (S) en de axon (A) die het soma aan de basale kant. Schaalbalken, 50 urn (A), 10 urn (B), 5 urn (C). Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 52. Klik hiervoor een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Geïsoleerde spanningsafhankelijke Na + en Ca 2 + stromen evenals spike ontlading (A) Vertegenwoordiger sporen van whole-cell patch-clamp opnames van een TTX-gevoelige fast activerende Na + stroom in FPR-RS3 + VSNs.. (A i) Spanning step opname onder controle omstandigheden (extracellulaire oplossing S 1; intracellulaire oplossing S 4) onthult een voltage-afhankelijke snelle en voorbijgaande naar binnen stroom. (A ii) TTX behandeling (1 uM) sterk vermindert de huidige. Digitaal afgetrokken trace (controle-TTX (A iii)) reveALS de TTX-gevoelige voltage-gated Na + stroom. Stroom-voltage relaties van TTX-gevoelige Na + stromen geïsoleerd van controle en FPR-RS3 + neuronen (A iv). (B) Representatieve Ca 2+ huidige sporen geïsoleerd farmacologisch (10 uM nifedipine). (C) Vertegenwoordiger stroomtang sporen tonen de- / hyperpolarisatie en treinen van (rebound) actiepotentialen gegenereerd na stapsgewijze positieve (C i) en negatieve (C iii) de huidige injectie. Let op de spontane activiteit gemeten bij 0 pA huidige injectie (C ii). (C iv) spuitfrequentie controle en FPR-RS3 + neuronen als functie van de geïnjecteerde stroom (I injecteren). De geleidelijke stijging van vuren is vergelijkbaar voor controlen FPR-RS3 + VSNs. Merk op dat VSNs zijn prachtig gevoelig voor de huidige injecties, zelfs in de lage picoamperes bereik 53-56. Merk op dat f -I curves zijn "background-gecorrigeerde" met behulp van de spontane spiking frequentie 0 pA huidige injectie. Gegevens zijn gemiddelden ± SEM. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van 52. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: extracellulaire 'loose patch' opnamen van basale VSNs (A) IR-DIC beeld van een acute VNO weefsel slice beeltenis van de opname pipet in de basale laag van de sensorische epitheel.. (B) Representatieve originele opname van basaal VSN in de cel verbonden configuratie (&# 39; loose-seal ") reageert met een korte voorbijgaande uitbarstingen van spikes aan prikkels (3 sec) met samengevoegde recombinant tot expressie belangrijke urinaire eiwitten (rMUPs) en een verhoogde kalium concentratie (50 mM, 1 sec kort), respectievelijk (B i) . Hogere vergroting van opnamen getoond in (B i) illustreert bursts van pieken in reactie op prikkels (B ii). Rode balken geven de tijd van de stimulatie, inter-stimulus interval = 30 sec, continue opname, onderbrekingen <1 sec (cut merken //). Schaal bar = 5 urn (A). Paneel (A) is gewijzigd uit referentie 38. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
VNO is een chemosensory structuur die feromonen detecteert. Tot op heden zijn de meeste receptoren vomeronasale nog worden deorphanized er maar weinig receptor-ligand paren geïdentificeerd. Van deze werd V1rb2 beschreven specifiek worden geactiveerd door de mannelijke urine feromoon 2-heptanon 30, V2rp5 worden geactiveerd door de mannelijke specifieke feromoon ESP1 57 en V2r1b en V2rf2 worden geactiveerd door de MHC peptiden SYFPEITHI 48 en SEIDLILGY 58, respectievelijk. Een voorwaarde voor het begrijpen van receptor-ligand relaties en signaaltransductie is kennis van de biofysische kenmerken van gedefinieerde VSN bevolkingsgroepen in een natuurlijke omgeving. Passieve en actieve membraan eigenschappen, spanningsafhankelijke ionische conductances en actiepotentiaal ontlading patronen bepalen de middelen en de mate waarin receptor neuronen reageren op stimuli chemosensory. Elektrofysiologische opnames in acute weefsel plakjes en in het bijzonder diele-cell patch-clamp opnamen bieden een uitstekende methode om deze eigenschappen te analyseren in detail.
Een cruciale stap voor een succesvolle en betrouwbare fysiologische opnames in het weefsel plakjes is het preparaat zelf. Om de tijdspanne om experimenten uit te voeren te maximaliseren, moet het weefsel worden gesneden en onmiddellijk na de sectie overgebracht naar ijskoude zuurstof oplossing. Daaropvolgend kan schijfjes worden gedurende verscheidene uren waardoor analyse van een groot aantal cellen per experimentele dag. Het vergt enige oefening om de tijd te ontleden en te verankeren beide VNOs van één dier in minder dan 30 minuten te verminderen. Daarna is de kans op succes voor een ervaren experimentator om meerdere intact weefsel plakjes te verkrijgen met levensvatbare cellen is ruim boven de 75%. Het uitvoeren patch-clamp opnames is een low-throughput experimentele benadering ten opzichte van Ca 2+ imaging. Toch maakt een meer gedetailleerde en veelzijdige analyse van de activiteit op de single-cell level met een veel hogere temporeleresolutie. In de hele-cel configuratie is de intracellulaire medium gedialyseerd de pipetoplossing. Terwijl de pipet oplossing de exacte cytosolische samenstelling niet zouden kunnen doen, biedt de experimentator met precieze controle over zowel de extra- en intracellulaire ionische omstandigheden. Voor een betrouwbare interpretatie van de resultaten, continue monitoring van toegang weerstand en de lekstroom is van cruciaal belang. Soms, een significante toe- of sterke wijzigingen in toegangsvoorwaarden resistentie of lekstroom leidt tot interpreteerbare resultaten en dus vraagt deze opnamen worden weggegooid. Bovendien is het belangrijk op te merken dat sommige farmacologische samenstelling binden onomkeerbaar waardoor het noodzakelijk plakken na elke opname vervangen.
Opname in de cel verbonden configuratie voorkomt dialyse van intracellulaire componenten en die geen cel membraanpotentiaal beïnvloeden. Dus deze techniek zorgt voor een minder invasief en relatief snelle manier van screening. Echter voorkomendach het algemeen beperkt tot de opname van super-drempel actie potentiaal gedreven capacitieve stromen vanaf de buitenkant van de celmembraan. Losse-patch opnames zijn geschikt gebleken voor het analyseren van het gedrag van spiking grotere aantallen sensorische neuronen in VNO plakjes 38,54 te zijn.
De transgene model hier in dienst biedt een betrouwbaar hulpmiddel om te identificeren en analyseren van de bevolking van FPR-RS3 uitdrukken VSNs. Bovendien kan de hier beschreven techniek worden uitgebreid tot andere lijnen ongeacht hun genotype. Ondanks het enorme voordeel van het onderzoek van een bepaalde celsoort, in transgene muizen beperkt experimenten om de beschikbare lijnen. Onlangs echter gericht genoom bewerken is sneller en goedkoper de CRISPR / Cas9 techniek 59 worden. Tot slot, gerichte patch-clamp opnames in acute vomeronasal weefsel plakjes zorgen voor een veelzijdige benadering van biofysische en fysiologische eigenschappen van een bepaald populat karakteriserenion van sensorische neuronen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Agarose (low-gelling temperature) | PeqLab | 35-2030 | |
| ATP (Mg-ATP) | Sigma-Aldrich | A9187 | |
| Bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic acid (BES) | Sigma-Aldrich | B9879 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C1016 | |
| Ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | E3889 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| GTP (Na-GTP) | Sigma-Aldrich | 51120 | |
| (2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 03564 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Surgical tools and consumables | |||
| Large Petri dish, 90 mm | VWR | decapitation, dissection of VNO capsule | |
| Small Petri dish, 35 mm | VWR | lid for VNO dissection, dish for embedding in agarose | |
| Sharp large surgical scissor | Fine Science Tools | decapitation, removal of lower jaw | |
| Strong bone scissors | Fine Science Tools | cutting incisors | |
| Medium forceps, Dumont tweezers #2 | Fine Science Tools | removing skin and palate | |
| Micro spring scissors, 8.5 cm, curved, 7 mm blades | Fine Science Tools | cutting out VNO | |
| Two pairs of fine forceps, Dumont tweezers #5 | Fine Science Tools | dissecting VNO out of cartilaginous capsule | |
| Small stainless steel spatula | Fine Science Tools | handling agarose block and tissue slices | |
| Surgical scalpel | cutting agarose block into pyramidal shape | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Amplifier | HEKA Elektronik | EPC-10 | |
| Borosilicate glass capillaries (1.50 mm OD/0.86 mm ID) | Science Products | ||
| CCD-camera | Leica Microsystems | DFC360FX | |
| Filter cube, excitation: BP 450-490, suppression: LP 515 | Leica Microsystems | I3 | |
| Fluorescence lamp | Leica Microsystems | EL6000 | |
| Hot plate magnetic stirrer | Snijders | 34532 | |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator Device | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| Micropipette puller, vertical two-step | Narishige | PC-10 | |
| Microscope | Leica Microsystems | CSM DM 6000 SP5 | |
| Noise eliminator 50/60 Hz (HumBug) | Quest Scientific | ||
| Objective | Leica Microsystems | HCX APO L20x/1.00 W | |
| Oscilloscope | Tektronik | TDS 1001B | |
| Osmometer | Gonotec | Osmomat 030 | |
| Perfusion system 8-in-1 | AutoMate Scientific | ||
| pH Meter five easy | Mettler Toledo | ||
| Pipette storage jar | World Precision Instruments | e212 | |
| Recording chamber | Luigs & Neumann | Slice mini chamber | |
| Razor blades | Wilkinson Sword GmbH | Wilkinson Sword Classic | |
| Oxygenating slice storage chamber; alternative commercial chambers are: e.g., BSK1 Brain Slice Keeper (Digitimer) or the Pre-chamber (BSC-PC; Warner Instruments) | custom-made | ||
| Stereo microscope | Leica Microsystems | S4E | |
| Trigger interface | HEKA Elektronik | TIB-14 S | |
| Vibratome | Leica Microsystems | VT 1000 S | |
| Water bath | Memmert | WNB 45 |
References
- Firestein, S. How the olfactory system makes sense of scents. Nature. 413 (6852), 211-218 (2001).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nat. Rev. Neurosci. 5 (4), 263-278 (2004).
- Fuss, S. H., Omura, M., Mombaerts, P. The Grueneberg ganglion of the mouse projects axons to glomeruli in the olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 22 (10), 2649-2654 (2005).
- Roppolo, D., Ribaud, V., Jungo, V. P., Lüscher, C., Rodriguez, I. Projection of the Grüneberg ganglion to the mouse olfactory bulb. Eur. J. Neurosci. 23 (11), 2887-2894 (2006).
- Adams, D. R. Fine structure of the vomeronasal and septal olfactory epithelia and of glandular structures. Microsc. Res. Tech. 23 (1), 86-97 (1992).
- Ma, M., et al. Olfactory signal transduction in the mouse septal organ. J. Neurosci. 23 (1), 317-324 (2003).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Luo, M., Katz, L. C. Encoding pheromonal signals in the mammalian vomeronasal system. Curr. Opin. Neurobiol. 14 (4), 428-434 (2004).
- Brennan, P. A., Kendrick, K. M. Mammalian social odours: attraction and individual recognition. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361 (1476), 2061-2078 (2006).
- Tirindelli, R., Dibattista, M., Pifferi, S., Menini, A.
- Jacobson, L., Trotier, D., Doving, K. B. Anatomical description of a new organ in the nose of domesticated animals by Ludvig Jacobson (1813). Chem. Senses. 23 (6), 743-754 (1998).
- Keverne, E. B.
- Breer, H., Fleischer, J., Strotmann, J. The sense of smell: multiple olfactory subsystems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1465-1475 (2006).
- Liberles, S. D.
- Meredith, M., O'Connell, R. J. Efferent control of stimulus access to the hamster vomeronasal organ. J. Physiol. 286, 301-316 (1979).
- Pankevich, D., Baum, M. J., Cherry, J. A. Removal of the superior cervical ganglia fails to block Fos induction in the accessory olfactory system of male mice after exposure to female odors. Neurosci. Lett. 345 (1), 13-16 (2003).
- Giacobini, P., Benedetto, A., Tirindelli, R., Fasolo, A. Proliferation and migration of receptor neurons in the vomeronasal organ of the adult mouse. Brain Res. Dev. Brain Res. 123 (1), 33-40 (2000).
- Coppola, D. M., O'Connell, R. J. Stimulus access to olfactory and vomeronasal receptors in utero. Neurosci. Lett. 106 (3), 241-248 (1989).
- Hovis, K. R., et al. Activity Regulates Functional Connectivity from the Vomeronasal Organ to the Accessory Olfactory Bulb. J. Neurosci. 32 (23), 7907-7916 (2012).
- Mucignat-Caretta, C. The rodent accessory olfactory system. J. Comp. Physiol. A Neuroethol. Sensory, Neural, Behav. Physiol. 196 (10), 767-777 (2010).
- Jia, C., Halpern, M. Subclasses of vomeronasal receptor neurons: differential expression of G proteins (Giα2 and G(αo)) and segregated projections to the accessory olfactory bulb. Brain Res. 719 (1-2), 117-128 (1996).
- Del Punta, K., Puche, C. A., Adams, N. C., Rodriguez, I., Mombaerts, P. A divergent pattern of sensory axonal projections is rendered convergent by second-order neurons in the accessory olfactory bulb. Neuron. 35 (6), 1057-1066 (2002).
- Belluscio, L., Koentges, G., Axel, R., Dulac, C. A map of pheromone receptor activation in the mammalian brain. Cell. 97 (2), 209-220 (1999).
- Rodriguez, I., Feinstein, P., Mombaerts, P. Variable patterns of axonal projections of sensory neurons in the mouse vomeronasal system. Cell. 97 (2), 199-208 (1999).
- Rivière, S., Challet, L., Fluegge, D., Spehr, M., Rodriguez, I. Formyl peptide receptor-like proteins are a novel family of vomeronasal chemosensors. Nature. 459 (7246), 574-577 (2009).
- Martini, S., Silvotti, L., Shirazi, A., Ryba, N. J. P., Tirindelli, R. Co-expression of putative pheromone receptors in the sensory neurons of the vomeronasal organ. J. Neurosci. 21 (3), 843-848 (2001).
- Matsuoka, M., et al. Immunocytochemical study of Gi2alpha and Goalpha on the epithelium surface of the rat vomeronasal organ. Chem. Senses. 26 (2), 161-166 (2001).
- Dulac, C., Torello, A. T. Molecular detection of pheromone signals in mammals: from genes to behaviour. Nat. Rev. Neurosci. 4 (7), 551-562 (2003).
- Leinders-Zufall, T., et al. Ultrasensitive pheromone detection by mammalian vomeronasal neurons. Nature. 405 (6788), 792-796 (2000).
- Boschat, C., et al. Pheromone detection mediated by a V1r vomeronasal receptor. Nat. Neurosci. 5 (12), 1261-1262 (2002).
- Novotny, M. V. Pheromones, binding proteins and receptor responses in rodents. Biochem. Soc. Trans. 31, 117-122 (2003).
- Nodari, F., et al. Sulfated steroids as natural ligands of mouse pheromone-sensing neurons. J. Neurosci. 28 (25), 6407-6418 (2008).
- Isogai, Y., et al.
- Leinders-Zufall, T., et al. MHC class I peptides as chemosensory signals in the vomeronasal organ. Science. 306 (5698), 1033-1037 (2004).
- Chamero, P., et al. Identification of protein pheromones that promote aggressive behaviour. Nature. 450 (7171), 899-902 (2007).
- Kimoto, H., Haga, S., Sato, K., Touhara, K. Sex-specific peptides from exocrine glands stimulate mouse vomeronasal sensory neurons. Nature. 437 (7060), 898-901 (2005).
- Ferrero, D. M., et al. A juvenile mouse pheromone inhibits sexual behaviour through the vomeronasal system. Nature. 502 (7471), 368-371 (2013).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ben-Shaul, Y., Katz, L. C., Mooney, R., Dulac, C. In vivo vomeronasal stimulation reveals sensory encoding of conspecific and allospecific cues by the mouse accessory olfactory bulb. PNAS. 107 (11), 5172-5177 (2010).
- Kimoto, H., et al. Sex- and strain-specific expression and vomeronasal activity of mouse ESP family peptides. Curr. Biol. 17 (21), 1879-1884 (2007).
- Spehr, M., et al. Parallel processing of social signals by the mammalian main and accessory olfactory systems. Cell. Mol. Life Sci. C. 63 (13), 1476-1484 (2006).
- Chamero, P., et al. G protein G{alpha}o is essential for vomeronasal function and aggressive behavior in mice. PNAS. , (2011).
- Bufe, B., Schumann, T., Zufall, F. Formyl peptide receptors from immune and vomeronasal system exhibit distinct agonist properties. J. Biol. Chem. 287 (40), 33644-33655 (2012).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. J. Neurosci. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Grosmaitre, X., Vassalli, A., Mombaerts, P., Shepherd, G. M., Ma, M. Odorant responses of olfactory sensory neurons expressing the odorant receptor MOR23: a patch clamp analysis in gene-targeted mice. PNAS. 103 (6), 1970-1975 (2006).
- Oka, Y., et al. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Ukhanov, K., Leinders-Zufall, T., Zufall, F. Patch-clamp analysis of gene-targeted vomeronasal neurons expressing a defined V1r or V2r receptor: ionic mechanisms underlying persistent firing. J. Neurophysiol. 98 (4), 2357-2369 (2007).
- Leinders-Zufall, T., Ishii, T., Mombaerts, P., Zufall, F., Boehm, T. Structural requirements for the activation of vomeronasal sensory neurons by MHC peptides. Nat. Neurosci. 12 (12), 1551-1558 (2009).
- Pacifico, R., Dewan, A., Cawley, D., Guo, C., Bozza, T. An olfactory subsystem that mediates high-sensitivity detection of volatile amines. Cell Rep. 2 (1), 76-88 (2012).
- Veitinger, S., et al. Purinergic signalling mobilizes mitochondrial Ca2+ in mouse Sertoli cells. J. Physiol. 589 (Pt 21), 5033-5055 (2011).
- Kaur, A. W., et al. Murine pheromone proteins constitute a context-dependent combinatorial code governing multiple social behaviors. Cell. 157 (3), 676-688 (2014).
- Ackels, T., von der Weid, B., Rodriguez, I., Spehr, M. Physiological characterization of formyl peptide receptor expressing cells in the mouse vomeronasal organ. Front. Neuroanat. 8, 1-13 (2014).
- Liman, E. R., Corey, D. P. Electrophysiological characterization of chemosensory neurons from the mouse vomeronasal organ. J. Neurosci. 16 (15), 4625-4637 (1996).
- Cichy, A., et al. Extracellular pH Regulates Excitability of Vomeronasal Sensory Neurons. J. Neurosci. 35 (9), 4025-4039 (2015).
- Shimazaki, R., et al. Electrophysiological properties and modeling of murine vomeronasal sensory neurons in acute slice preparations. Chem. Senses. 31 (5), 425-435 (2006).
- Hagendorf, S., Fluegge, D., Engelhardt, C., Spehr, M. Homeostatic control of sensory output in basal vomeronasal neurons: activity-dependent expression of ether-à-go-go-related gene potassium channels. J. Neurosci. 29 (1), 206-221 (2009).
- Haga, S., et al. The male mouse pheromone ESP1 enhances female sexual receptive behaviour through a specific vomeronasal receptor. Nature. 466 (7302), 118-122 (2010).
- Leinders-Zufall, T., et al. A family of nonclassical class I MHC genes contributes to ultrasensitive chemodetection by mouse vomeronasal sensory neurons. J. Neurosci. 34 (15), 5121-5133 (2014).
- Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337, 816-821 (2012).
