Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled

Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54518
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

نحن هنا وصف البروتوكولات لتعطيل خلايا الثدييات من قبل الطحن الحالة الصلبة في درجة حرارة المبردة، إنتاج استخراج الخلايا من مسحوق الخلية الناتجة عن ذلك، وعزل بروتين المجمعات الاهتمام من جانب القبض على تقارب على الخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة ميكرون الحجم.

Abstract

القبض على التقارب هو أسلوب فعال لعزل بروتين المجمعات الذاتية لمزيد من الدراسة. عندما تستخدم بالاقتران مع الأجسام المضادة، وأيضا كثيرا ما يشار إلى هذه التقنية كما مناعي. القبض على التقارب يمكن تطبيقها في نطاق مقاعد البدلاء وفي سياق الإنتاجية العالية. عندما يقترن مع مطياف الكتلة بروتين، وقد ثبت القبض على تقارب أن تكون العمود الفقري لتحليل interactome. على الرغم من أن هناك طرق العديد من المحتمل لتنفيذ الخطوات العديدة المعنية، البروتوكولات التالية تنفيذ الطرق المفضلة لدينا. اثنين من الميزات المميزة: استخدام مسحوق خلية cryomilled لإنتاج مقتطفات الخلية، والخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة كوسيلة تقارب. في كثير من الحالات، لقد حصلنا على نتائج متفوقة لتلك التي حصلت مع المزيد من الممارسات القبض على تقارب التقليدية. Cryomilling يتجنب العديد من المشاكل المرتبطة مع أشكال أخرى من الكسر الخلية. ويوفر الكسر الفعال للمادة، مع تجنب ديناتقضايا uration المرتبطة التدفئة أو الرغوة. فإنه يحتفظ البروتين الأصلي تركيز تصل إلى نقطة الاستخراج، والتخفيف من التفكك الجزيئات. أنه يقلل من الوقت البروتينات المستخرجة تنفق في حل، والحد من الأنشطة الإنزيمية الضارة، وأنه قد يقلل من امتصاص غير محدد من البروتينات عن طريق وسيلة تقارب. أصبحت وسائل الإعلام تقارب المغناطيسي ميكرون على نطاق أكثر شيوعا على مدى السنوات القليلة الماضية، لتحل محل متزايد agarose- التقليدية وسائل الإعلام على أساس سيفاروز. وتشمل المزايا الرئيسية لوسائط مغناطيسية أقل عادة امتصاص البروتين غير محددة. لا حدود حجم الاستبعاد بسبب بروتين معقد ملزمة يحدث على سطح حبة بدلا من داخل المسام. وسهولة التلاعب والتعامل مع استخدام المغناطيس.

Introduction

تطبيق نموذجي للإجراءات قدم هو لتحقيق الاستقرار والحصول على عائد مرتفع ونقاء مجمعات البروتين الذاتية من الفائدة لتوصيف interactomic 1. ومن المعلوم أن شبكات ديناميكية من كلا المجمعات الجزيئات المرتبطة مستقر وعابر، تتألف أساسا من البروتينات، تنسق العمليات الخلوية 2،3. في حين أن هناك العديد من الطرق التجريبية لتحديد تفاعلات البروتين البروتين، القبض على تقارب من بين الطرق الأكثر استخداما على نطاق واسع لعزل وتشريح مجمعات البروتين الفسيولوجية 4-6. وعلاوة على ذلك، فإن هذا الأسلوب له ميزة العائد المجمعات الجزيئات كما كيانات مادية، وليس مجرد نقاط البيانات في قراءة التدريجي؛ مفيد، وبالتالي يمكن استخدام المجمعات التي تم الحصول عليها في مجموعة من البيوكيميائية إضافية المصب، الأنزيمية، والمقايسات الهيكلية 7-9. تم تطوير البروتوكولات المعروضة في استجابة للحاجة إلى تعيين proteiشبكات التفاعل ن البروتين وتميز المجمعات الجزيئات في أدوارها كما الجزيئات المستجيب للبيولوجيا الخلية. وهي مفصلة فيما يتعلق تطبيقها على خلايا الثدييات نمت في زراعة الأنسجة، ولكن هل ينطبق أيضا على مجموعة واسعة من العينات البيولوجية نظرا بتعديل الخاصة بالنظام المناسبة.

تاريخ التقاط تقارب يمتد تاريخه إلى أوائل القرن العشرين مع أول التجارب immunoaffinity اللوني - تشبه ما يشار اليه عادة في هذه الأيام كما مناعي (IP) - تظهر في الكتابات عن 1950s في وقت مبكر. استخدام التيار تقنية تطويرها من خلال مطلع هذا القرن الحالي 10-13. وقد استخدمت الخلايا المتنوعة والدراسات البيولوجية الجزيئية الكسر الميكانيكية من الخلايا عن طريق طحن في درجات الحرارة المبردة على الأقل خلال الأربعين سنة الماضية 14-19. وفصل الجزيئات باستخدام (سوبر) الخرز ممغطس لها BECلى بعد شائعة بشكل متزايد على مدى العقدين الماضيين 20. الجمع بين هذه التقنيات المختلفة قد عملت على تحسين تآزر النتائج التي يمكن الحصول عليها في التجارب بروتين معقد القبض على تقارب 1، كما يتضح من مجموعة واسعة من العمل التي تنتجها أنفسنا والمجتمع توسيع نطاق البحث 7،9،11،18،19،21 -23. يتم عرض النتائج تدعم في الشكل 1.

مجموعة من المحاذير والاعتبارات التي تنطبق على تنفيذ التجارب فعالية التقاط تقارب يمكن العثور عليها في المرجع 1. عادة هذا النهج هو الأنسب ل: (I) فهرسة interactors من البروتين من الفائدة، أي استخدام البروتين مطياف الكتلة (MS) لتحديد البروتينات copurifying غير معروف حتى الآن (تحليل استكشافية)؛ (II) فحص لوجود شريك المتفاعل معين، أي استخدام MS أو لطخة غربية إلى الكشف عن بروتين معين أو مجموعة محدودة من البروتينات يشتبه فييتآثران interact فيؤديان مع البروتين من الفائدة (اختبار الفرضيات)؛ أو (الثالث) إعداد مجمعات البروتين تجميعها التطور الطبيعي الذي يحتوي على البروتين من الفائدة لمزيد من الدراسة من خلال تقنيات إضافية (workup إعدادي). قبل الشروع في نظام تجريبي القبض على تقارب فمن الضروري للغاية أن يكون هناك تقارب كاشف عالية الجودة التي تربط لبروتين الهدف، وعادة جسم مضاد-IP المختصة ضد البروتين الهدف الأصلي من مصلحة أو ضد علامة إلحاق البروتين الانصهار. ومن الأهمية بمكان أيضا أن أساليب مناسبة للقراءات تجريبية في مكان: تلطيخ بروتين العام (مثل Coomassie الأزرق، Sypro روبي، أو الفضة، بعد SDS-PAGE)، النشاف الغربي، والبروتين MS كلها تستخدم عادة بالتزامن مع القبض على تقارب 1. البروتوكولات المعروضة تستخدم الأجسام المضادة الخرز المغناطيسي مترافق باعتبارها وسيلة تقارب. في حين أن وظيفة من وسيلة تقارب يمكن في البداية يمكن التحقق من صحة في الاختبارات التي تستخدم بعض المعلمات التجريبية، لالحصول على أفضل النتائج كل تجربة يجب أن يكون الأمثل تجريبيا 1،11،24. يتم فصل البروتوكولات إلى ثلاث مراحل متميزة: (1) إعداد المواد الخلايا المجمدة. (2) الكسر الخلية عن طريق طحن الحالة الصلبة في درجة حرارة المبردة. و (3) استخراج البروتين والقبض على تقارب باستخدام الخرز ممغطس يقترن الأجسام المضادة.

Protocol

1. حصاد خلية والتجميد

  1. تنمو 1-8 غرام من مادة الخلية باستخدام الظروف زراعة المناسبة للخط الخلوي من الفائدة 25،26. هو الأمثل هذا البروتوكول لمدة تصل إلى 8 غرامات من الخلايا (~ 10 9 خلايا)، المعدلة من المراجع 19،27،28. عادة، ~ ويمكن الحصول على 5 غرام من خلايا كلوة-293 أو هيلا من ثماني لوحات 500 سم 2 ثقافة نمت ل~ 90٪ confluency.
    تنبيه: هذه البروتوكولات تستخدم النيتروجين السائل (LN 2)، قادرة على التسبب في حروق شديدة المبردة. ملابس واقية دون وممارسة التمارين الرياضية المناسبة احتياطات التعامل معها.
  2. تخلصي من متوسط ​​النمو (النفايات) في دورق كبير.
  3. مكان الطبق الثقافة على الجليد في عموم كبير الجليد مستطيلة.
  4. إضافة 20 مل من الجليد الباردة 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) إلى صحن الثقافة والافراج عن الخلايا من الطبق باستخدام مكشطة الخلية الكبيرة؛ نقل الخلايا إلى أنبوب 50 مل، قبل المبردة على الجليد. عقد أنبوب على الجليد.
    ملاحظة: للحصول على كل خلية تستخدم التعامل خطوات مجموعة الكهربائية pipettor إلى "منخفض" و 25 مل الماصات لتجنب القص المفرط للخلايا خلال التلاعب نقل. ترتيب 50 مل أنابيب جمع وبرنامج تلفزيوني 1X في دلو الجليد قبل الشروع في الإجراء.
  5. إضافة 10 مل إضافية من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X إلى نفس الطبق. جمع الخلايا المتبقية ونقلها إلى أنبوب 50 مل.
  6. كرر لكل طبق. تعليق خلية من أطباق مختلفة يمكن الجمع بين للحد من عدد العينة والمخلفات البلاستيكية.
    ملاحظة: لأنه لن الخلايا نفسها لا تشكل نسبة كبيرة من حجم تعليق، ثلاث لوحات تستحق التعليق الخلية يمكن دمج اثنين من 50 مل أنابيب. لأن 50 مل أنابيب عقد في الواقع أكثر من حجم الاسمي، ثمانية لوحات وعادة ما يمكن أن تنتشر عبر خمسة من هذه الأنابيب.
  7. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 1000 x ج، 4 درجات مئوية.
  8. صب بعناية قبالة طاف. resuspend كل بيليه في 10 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. تعزيز دورة الفتشوبالكريات سبينديد، يصل إلى 5 في 50 مل أنبوب، للحد من عدد العينة.
  9. الطرد المركزي 5 دقائق في 1000 x ج، 4 درجات مئوية.
  10. صب بعناية قبالة طاف. Resuspend وبيليه في 10 مل الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X
  11. إزالة المكبس من حقنة 20 مل وضعه جانبا. تتويج فوهة حقنة ونقل تعليق خلية لذلك.
  12. وضع حقنة داخل أنبوب 50 مل وأجهزة الطرد المركزي 5 دقائق في 1000 x ج، 4 درجات مئوية.
  13. نضح طاف مع ماصة غرامة لتولي نظام فخ الفراغ حتى مجرد الطبقة العليا من خلايا يبدأ في أن امتص. وهذا يؤدي إلى بيليه الخلية الرطب.
  14. إرفع قبعة الحقنة، إدراج المكبس وتقطر الخلايا مباشرة في كوب كبير من البلاستيك مليئة LN 2، الذي عقد في حمام LN 2 في مربع الستايروفوم. قسرا يغرق الخلايا المتبقية من الحقنة.
  15. نقل الخلايا المجمدة إلى 50 مل أنابيب بصب. تتويج فضفاضة الأنابيب للسماح الزائد LN 2 لتتبخر. عقد تبين عشية وضحاها تنحنح في -80 درجة مئوية. تشديد قبعات تماما في اليوم التالي. قد يتم تخزين الخلايا المجمدة في هذا الطريق في -80 درجة مئوية حتى cryomilling.
    ملاحظة: لا تغلق بإحكام الأنابيب قبل كل LN 2 تبخرت بشكل واضح، وإلا قد يسبب الضغط المفرط أنبوب لتنفجر. لا إغلاق الأنابيب بعد أن تبدد LN 2 قد يؤدي إلى تراكم الصقيع على مواد الخلايا، مضيفا الوزن الزائد المياه والحد من فعالية تركيز البروتين على الطحن.

2. تعطيل المبردة من خلايا مجمدة

ملاحظة: يجب أن تكون جميع أدوات لطحن والتلاعب قبل تبريده مع LN 2. سوف تكون هناك حاجة لالمصفق صغيرة لإضافة LN 2 داخل جرة وللصب LN 2 على الجزء العلوي من جرة الطحن مغلقة. ويرد أداة محلية الصنع في اشارة 19. وستكون هناك حاجة قفازات المبردة للتعامل مع LN 2 تبريد جهاز الطحن. طحنالأغطية جرة المستخدمة هنا (انظر الجدول المواد) السفينة عادة مع المطاط طوقا المثبتة؛ هذا سوف تحتاج إلى استبداله مع متوفرة تجاريا غطاء طوقا تفلون لتنفيذ موثوق البروتوكول التالي. وعلاوة على ذلك، لأن الضغط من N الغازي 2 يمكن أن تتراكم إلى مستويات عالية داخل جرة أثناء الطحن، ونحن نوصي تركيب المتاحة تجاريا 5 بار / 500 كيلو باسكال صمام الضغط كاجراء احترازي الإفراج سلامة 28.

  1. إزالة حبات خلية من -80 ° C التخزين وعقد في حامل أنبوب 50 مل في حمام LN 2.
  2. قبل تبريد جرة 50 مل، واثنين من 20 كرات ملم، وغطاء في دلو الجليد مستطيلة نظيفة تحتوي على LN 2. قبل تبريد تترافلوروإيثيلين (PTFE) عازل في حالة استخدام واحد؛ إما مجموعة من كرات الصولجان (أنظر المرجع 27)، أو جلبة، وعفريت (انظر الشكل 2). ما قبل التبريد اكتمال عند الغليان العنيف للLN 2 يهدئ.
  3. تعيين موازنة المناسبة علىمطحنة.
    ملاحظة: هذا سيكون مساويا لكتلة جرة، جرة غطاء، وكرات الطحن المستخدمة، وكمية من الخلايا التي يمكن ان تضاف إلى الجرة. في حالة استخدام أي العوازل السليكوون، وينبغي أيضا إدراج كتلتها. نقترح عليك تسجيل جماهير جرة، غطاء، وكرات (وكتلتها مجتمعة، بما في ذلك أي عازل المستخدمة) في وقت مبكر وتسجيلها على ورقة إعلامية تخزينها بالقرب من مطحنة.
  4. باستخدام ملقط، ضع اثنين تبرد قبل 20 كرات مم الطحن والخلايا المجمدة داخل جرة طحن تبريد مسبقا.
    ملاحظة: نظرا لخسائر صغيرة من المواد في جرة والكرة الأسطح أثناء الطحن، والنسبة المئوية للزيادة المواد المستخلصة باسم كتلة من الخلايا المضروب الزيادات. من خلال طريقة وصفها، خسائر مادية متواضعة جدا، ويجري بناء على أمر من ~ 0.3 غرام من وزن الخلية الرطب (WCW). وتشير المبادئ التوجيهية الشركة المصنعة الحد الأقصى لحجم العينة تحميل يجب أن يكون ~ 1/3 من حجم جرة. 29 يجب أن يكون الحجم الكلي للكرات ~ 1/3 و remaining ~ 1/3 مساحة حرة لحرية الحركة من الكرات.
  5. إضافة LN 2 إلى الجرة تصل إلى ~ ½ بالكامل، ووضع غطاء على الجرة ونقل التجميع إلى طاحونة.
    ملاحظة: أولا تثبيت عازل اختيار في حالة استخدام واحد.
  6. المشبك التجمع في مكان وتنفيذ ثلاث دورات من الطحن باستخدام برنامج التالي: 400 دورة في الدقيقة، 3 دقائق، عكس دوران كل دقيقة، لا كسر الفاصل. تبريد جرة طحن مع LN 2 بين كل دورة.
    ملاحظة: أثناء الطحن يتم إنشاء الضوضاء clunking متميزة كما تصطدم الكرات داخل جرة في حركة الكواكب. إذا لم تسمع هذه الأصوات، والطحن لا يحدث. إنهاء دورة الطحن، لا تعول هذه الدورة، نقل التجمع جرة إلى LN 2 و فحص محتويات الجرة. ضمان عدم وجود الجليد شكلت وإذا كان لديه، رقاقة بعيدا عن الجدران جرة مع ملعقة تبريد مسبقا. إبدأ من جديد من الخطوة 2.5.
    في حالة استخدام أي عازل أو عازل كرات الصولجان، نقل التجمع جرة إلى LN 2 إلى ~ ½ الكامل في كل مرة. وLN 2 اضاف أن تتبخر داخل جرة حيث إن درجة حرارة الزيادات جرة أثناء الطحن. وهذا يؤدي إلى تراكم الضغط داخل الجرة. لذلك، عندما فك الارتباط بين جرة من المصنع، والإفراج عن المشبك ببطء شديد. إذا تم تحرير المشبك بسرعة، ومسحوق الخلية قد يهرب مع تخفيض الضغط السريع. بيان بطء المشبك يسمح للضغط للهروب من جرة في طيف الأزياء، التي تسيطر عليها، ويمنع فقدان المواد الخلية. هروب لطيف من N الغازي 2 يمكن في كثير من الأحيان أن تسمع الهسهسة كما يتم الافراج عن المشبك ببطء - وهذا أمر طبيعي.
    في حالة استخدام عازل الأكمام وعفريت، والتجمع جرة يمكن أن تترك في مطحنة وLN 2 تضاف إلى التجمع عازل / جرة في الموقع.
  7. نقل جرة إلى LN 2، وترك الباقي للحظات لتبرد. في حالة استخدام عازل الأكمام وعفريت، جرة يمكن إزالتها من الأكمام ثإيث المعونة من اثنين ملاعق، وتوفير ضغط على أي من الجانبين. مرة واحدة في جرة يستريح في LN 2، إزالة الغطاء بعناية، وإزالة الكرات باستخدام ملقط، ونقل مسحوق لأنبوب 50 مل تبرد قبل باستخدام ملعقة تبريد مسبقا. يمكن إضافة القليل من LN 2 إلى جرة فتح / مسحوق يساعد على طرد مسحوق الذي يعلوه على الكرات، قبل إزالتها.
    ملاحظة: مرة واحدة تم فتح جرة، إضافة كمية صغيرة من LN 2 لأنه قبل إزالة الكرات. وهذا سوف يساعد على استعادة مسحوق يعلوه على السطوح. وينبغي أن تعقد مسحوق خلية في -80 درجة مئوية أو أقل حتى الاستخدام. في تجربتنا، مسحوق خلية يمكن تخزينها في هذا الطريق، وذلك أساسا إلى أجل غير مسمى، دون التأثير على الأداء.

3. تقارب القبض على البروتين المجمعات من خلية مقتطفات

ملاحظة: بروتوكول التالي تنفذ سائل الإعلام تقارب تتألف من يجند تقارب، والطعم، أو الأجسام المضادة التي تتفاعل مع بروتين من الفائدة، وشاركupled إلى ميكرون على نطاق والخرز ممغطس. هذه يمكن أن تكون على استعداد في المنزل 19،30، وذلك باستخدام مجموعات المتاحة تجاريا، أو شراء مثل الكواشف الجاهزة.

  1. إعداد استخراج الخلايا
    ملاحظة: عند التعامل مع مسحوق الخلية، وتذكر أن استخدام الأواني والأنابيب قبل تبريده مع LN 2. وينبغي دائما أن تعقد الأنابيب التي تحتوي على مسحوق الخلية في LN 2 عندما لا تكون في -80 درجة مئوية. وضع أنبوب 50 مل (ق) التي تحتوي على مسحوق الخلية في أنبوب رف، في وعاء الستايروفوم مع LN 2.
    1. تزن من 100 ملغ من مسحوق الخلية في أنبوب microfuge 1.5 أو 2 مل.
      ملاحظة: وقد لاحظنا أن هذه الكمية من الخلايا هي نقطة انطلاق جيدة من شأنها أن عادة ينتج البروتين المستهدف في عشرات ومئات من نانوجرام تتراوح بعد القبض على تقارب لبروتين أعرب باعتدال (~ 50 كيلو دالتون كتلة، الحاضرة في آلاف النسخ في خلية)، على افتراض استخراج والقبض على الكفاءة الهدف هي ≳70٪. وتوفر هذه العوائد لvisualiz المباشرأوجه الكسر تنقيته بواسطة SDS-PAGE وتلطيخ البروتين.
    2. الميزان التحليلي الفارغة مع microfuge أنبوب فارغ. الاستغناء عن مسحوق الخلية في أنبوب باستخدام LN 2 تبريد ملعقة أو ملعقة. تحقق كتلة مسحوق الاستغناء داخل أنبوب على الميزان التحليلي.
      ملاحظة: لتخفيف وزنها من مساحيق خلية، يمكن استخدام صغيرة ملاعق القياس الحجمي. وقد وجدت هذه لتعطي نتائج استنساخه (أنظر المرجع 19). لقد وجدنا أفضل النتائج باستخدام المسمار الحد الأقصى أو "آمن للانغلاق" أنابيب microcentrifuge. الضغط من التبخر LN 2 الذي قد يدخل الأنابيب يمكن أن يسبب أنابيب microcentrifuge القياسية لموسيقى البوب مفتوحة أثناء ارتفاع درجات الحرارة لاحق فقط قبل إضافة محلول استخراج - يحتمل أن يسفر عن خسائر في العينة.
    3. فتح أنبوب (أو تخفيف المسمار الحد الأقصى) مع مسحوق الخلية واسمحوا الوقوف على RT لمدة 1 دقيقة. هذا وسوف الافراج عن الضغط داخل الأنبوب ومنع تجميد فوري للاستخراجالحل عندما تضاف إلى مسحوق. يتم احترام أي الذوبان خلال هذه الحضانة 1 دقيقة.
    4. إضافة 400 ميكرولتر من مستخلصة تستكمل مع مثبطات الأنزيم البروتيني ودوامة لفترة وجيزة، ثم اضغط على الجليد حين الشروع في خطوة 3.1.5. ينبغي أن تعقد عينات على الجليد بين كافة المعالجات اللاحقة حتى شطف.
      ملاحظة: إن أفضل تركيبة مستخلصة تعتمد على بروتين معقد (عناوين) أن تنقيته. وتقدم بعض التوجيهات العامة في الجدول 1 والمراجع الداعمة.
    5. استخدام ultrasonicator microtip لإعطاء عينة نبضة الطاقة المنخفضة وجيزة لتفريق أي الركام. (الترا) يصوتن مع 4 البقول (2 ثانية لكل منهما، 2 A؛ حوالي 15-20 J من إجمالي الطاقة).
      ملاحظة: vortexing ليوزع مسحوق خلية في مستخلصة، ولكن تبعا لطبيعة الحل، يمكن ملاحظة بعض المجاميع. لقد وجدنا أن نشر هذه المجاميع ينص على أفضل عائد خلال القبض على تقارب لاحق. وmicrotip موجز سونيالموجبة يشتت بسهولة هذه المجاميع. يجب أن يظهر الحل شبه شفاف ولكن متجانسة، دون المجاميع واضحة. sonicators حمام الماء تميل إلى أن تكون طاقة منخفضة جدا لتفريق كفاءة هذه المجاميع دون أطول بشكل ملحوظ مرات معالجة عينة، ولكن قد تكون مناسبة مع الإعدادات المناسبة.
    6. توضيح استخراج بواسطة الطرد المركزي (على سبيل المثال، 20000 x ج، 10 دقيقة، 4 درجات مئوية).
      ملاحظة: قسامة من استخراج الخلايا أوضحت قد يتم حفظ للمقارنة لمحتويات بيليه، وبعد تقارب التقاط طاف، والكسور التي تم الحصول عليها بعد شطف من وسيلة تقارب لتحديد كفاءة الاستخراج والقبض على البروتين المستهدف ، على سبيل المثال، لطخة الغربية (انظر مناقشة).
    7. إزالة طاف (استخراج توضيح)، والشروع في الاستيلاء تقارب.
      ملاحظة: بيليه يجوز إعادة استخراج في SDS-PAGE العازلة تحميل عينة على 70 درجة مئوية إلى تحديد درجة الافراج عن البروتين المستهدف دأورينغ استخراج غير تغيير طبيعة-الأولي من خلال المقارنة لاستخراج حصلت عليه في الخطوة 3.1.6.
  2. القبض على التقارب
    1. Prewash وسيلة تقارب المغناطيسي. ويمكن القيام بذلك في حين يتم طرد مقتطفات الخلية.
    2. وضع أنبوب (ق) على المغناطيس. سوف حبات تتراكم على جانب الأنبوب في غضون ثوان، والسماح لحلول التخزين المراد إزالتها.
    3. إضافة 500 ميكرولتر من محلول الاستخلاص إلى الخرز. باختصار مزيج دوامة على سرعة متوسطة (تكفي ل resuspend). نبض تدور الأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لجمع كل المحتويات إلى أسفل. بذلك يضمن الحد الأدنى للالمرحل من الحلول. وضع أنابيب على المغناطيس ونضح الحل.
      ملاحظة: هي وسائل الإعلام المغناطيسي مع الخصائص المميزة المتاحة من مجموعة واسعة من الموردين التجاريين. قد تختلف النتائج اعتمادا على هذه الخصائص، بما في ذلك حجم حبة، التوحيد، طلاء السطح، والكيمياء الأجسام المضادة اقتران. جنبا إلى الاشتراكيةينصح المحاكمات دي في التطبيق الخاص بك قبل أن يستقر على كاشف الاختيار.
    4. بدء التقاط تقارب عن طريق نقل استخراج الخلايا أوضح لأنبوب 1،5-2،0 مل تحتوي على ما قبل غسلها تقارب المتوسطة ودوامة لفترة وجيزة ل resuspend.
    5. احتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية مع الخلط المستمر لطيف على عجلة محور دوار. يجب أن تظل حبات علقت في جميع أنحاء الحضانة.
    6. نبض تدور الأنابيب في جهاز طرد مركزي صغير لجمع كل محتويات إلى أسفل الأنبوب. نضح طاف وتغسل حبات ثلاث مرات مع 1 مل من محلول الاستخلاص البارد كما هو موضح في الخطوة 3.2.3. وضع أنابيب على مغناطيس. إزالة الحل. انتقل إلى إضافة محلول المقبل، وتكرار. أثناء غسل الثانية 2، ونقل الخرز ومحلول الغسيل معا لأنبوب microfuge جديدة من قبل pipetting. وهذا يقلل من تلوث العينة، عند نقطة شطف، من البروتينات عشوائية كثف على جدران الأنبوب المستخدمة في الحضانة مع رانه الخلية استخراج. بعد غسل 3 الثالثة، وينبغي أن تكون حبات نسج النبض لفترة وجيزة في الطرد المركزي مصغرة لجمع كل المحتويات إلى أسفل. وضع أنبوب مرة أخرى على المغناطيس، وإزالة أي السائل المتبقي. هذا يسمح إزالة ميكرولتر القليلة الماضية من حل قبل أن يبلغ حجمه، وضمان عينات مزال سيكون لها أحجام موحدة. كما أنه يضمن وشطف يكون فعال، كما لن تضعف حل شطف من قبل غسل المتبقية. يمكن لمثل هذه المخلفات أن يسهم أيضا في آثار الملح ويغير من الهجرة من البروتينات في SDS-PAGE (أنظر أدناه).
      ملاحظة: قسامة من طاف ملزم آخر قد يتم حفظ للمقارنة لاستخراج أوضح ولدت في 3.1.6. لطخة الغربية. وستكون النتيجة تشير إلى درجة استنزاف البروتين الهدف من استخراج الخلايا.
    7. أزل إما بطريقة الأم أو تغيير طبيعة. النظر في استراتيجية أفضل لتطبيق المصب 1.
      ملاحظة: تفاصيل في استراتيجية شطف الأمالصورة سيعتمد على بطاقة تقارب المستخدمة (انظر مناقشة). بالنسبة لمعظم المستخدمين، تغيير طبيعة شطف مع العازلة عينة SDS-PAGE تليها تحليل العينة بواسطة SDS-PAGE مع بروتين تلوين 31، وسيكون النهج الأولي الأكثر عملية.
      ملاحظة: تكوين عينة العازلة سوف تعتمد على النظام الكهربائي المستخدمة. ألقت العديد من المعامل والمواد الهلامية تريس، جليكاين الخاصة بها، والاستفادة من الكهربائي متقطع ونظام المخزن Laemmli 32-34. وصفة عينة العازلة المشتركة (1X) ما يلي: 10٪ (ث / ت) السكروز، 50 ملي DTT، 2٪ (ث / ت) SDS، 62.5 ملي تريس الكلورين الرقم الهيدروجيني 8.8، 0.0004٪ (ث / ت) برموفينول الأزرق 31 . نقترح إعداد الأوراق المالية 1.1x أن يغفل DTT. 1/10 عشر حجم 500 ملي DTT ينبغي أن يضاف إلى العينة قبل SDS-PAGE (أنظر أدناه). العديد من أنظمة SDS-PAGE المتاحة تجاريا وتتوفر أيضا. ويمكن أن تشمل هذه المخازن العينة الخاصة بالنظام.
    8. إضافة العازلة عينة SDS-PAGE دون الحد من وكيل (للتخفيف من إطلاقسلاسل الضد من الخرز)، واحتضان لمدة 5-10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الإثارة.
      ملاحظة: هذا يتعارض مع معظم التفاعلات القائمة على تقارب، والإفراج عن البروتينات التي تم التقاطها في طاف. تفاعلات أكثر المستمرة يمكن أن تستفيد من درجة حرارة مرتفعة لإطلاق (عادة 70 درجة مئوية يكفي).
    9. جمع وحفظ طاف. قد يتم تجميد العينات عند -20 درجة مئوية لمدة التخزين وجيزة (بضعة أيام) أو -80 درجة مئوية لمدة التخزين الموسعة حتى هو المطلوب للتحليل.
    10. إخضاع العينات إلى SDS-PAGE تليها تلطيخ البروتين باستخدام التقنيات القياسية 31. MS يمكن استخدامها لوصف تكوين عينة 1. قد يستأصل العصابات البروتين الفردية لتحديد أو يمكن وصفها العينة بأكملها في تحليل واحد عن طريق electrophoresing عينة فقط لفترة وجيزة (4-6 ملم في هلام) وتجهيز جميع البروتينات في عينة معا ك "المكونات هلام."
      ملاحظة: إضافة DTT قبل initiaتينغ الكهربائي. إذا كنت تخطط للشروع في مرض التصلب العصبي المتعدد، قد تكون عينات الألكيلية بعد الكهربائي 35؛ ومع ذلك، فإنه في كثير من الأحيان أكثر ملاءمة ليؤلكل قبل الكهربائي 36.

Representative Results

الرقم 1، ويوضح الفريق أن cryomilling وحبات مغناطيسية يمكن أن تعمل معا لتحسين جودة العينة. لوحات IA-C تثبت أن المواد التي تتألف منها المتوسطة غير قابلة للذوبان تستخدم لالتقاط تقارب يمكن أن تؤثر على بروتيوم تعافى 19. البروتين من الفائدة، وتنقيته الموسومة FLAG قلوية البكتيرية الفوسفاتيز (BAP)، وارتفعت إلى مقتطفات الخلية البشرية. وليس من المتوقع أن يتفاعل بشكل خاص مع وcopurify بروتينات بشرية خطة عمل بالي. توقيع copurifying البروتينات، يحكم من قبل SDS-PAGE وCoomassie تلطيخ، تختلف باختلاف الوسيلة المستخدمة. وأظهرت حبات مغناطيسية ميكرون على نطاق وأنظف الشخصية، مما يدل على مستوى منخفض نسبيا من امتصاص البروتين غير محددة. لوحات معرف وIE تبين أن طريقة تحلل الخلايا يمكن أن تؤثر أيضا على بروتيوم استردادها. في المثال المقدمة، وهو بروتين معقد الذاتية (على NEXT مجمع 37)، تعرض لcaptu تقاربإعادة من خلية cyromilled أو sonicated مقتطفات 19. وقد لوحظت أقل الملوثات جماعية عالية عندما تم إنتاج استخراج الخلايا من مسحوق خلية cryomilled.

والتحدي عند استخدام التقاط تقارب لدراسة مجمعات البروتين الذاتية هو أنه قد يكون من الصعب التمييز interactors الفسيولوجية حسنة النية من البروتين من الفائدة من ايجابيات كاذبة (FPS). ضباط الإتصال يمكن أن تنشأ من مصادر عديدة، بما في ذلك امتصاص غير محددة إلى الأنابيب والسفن، وسيلة تقارب، والأجسام المضادة أو تقارب يجند، و / أو لبروتين من الفائدة نفسها. ونتيجة لذلك، لا بد من بذل جهد كبير لتحسين عملية القبض عليه. يبقى الكشف عن ضباط الإتصال هو التحدي الرئيسي الذي وضعت عددا كبيرا من الأدوات المختلفة، بما في ذلك تجريبي 38-40 والنهج الحسابية 41-43، ولكل منها إيجابيات وسلبيات مختلفة. في التجارب الخاصة بنا لاحظنا سابقا نمط Fالبروتين P ملزمة، تم الحصول عليها بعد حضانة المتوسطة المغناطيسي α-FLAG مع مقتطفات خلية السيطرة، وأنه يختلف عن نمط الحصول عليها في وجود البروتينات الموسومة 3xFLAG. وعلاوة على ذلك، يمكن إطلاق سراح هؤلاء ضباط الإتصال من المتوسط من الحضانة مع 3xFLAG الببتيد 7. هذه الملاحظة بما يتفق مع ملزمة انتهازية من ضباط الإتصال إلى مستوقع α-FLAG في غياب حاتمة وما شابه ذلك. فهم طبيعة هذه الخلفية FP أمر مهم لأن العديد من الدراسات استخدام "خط الخلية الوالدية" علامة عليه كعنصر تحكم وهمية لالتقاط تقارب. وبالتالي قد تكون هذه الضوابط غير مناسب لتحديد خصوصية التفاعل مع البروتين الموسومة. لتحديد خلفية ملزمة ساهم المتوسطة تقارب لدينا عندما احتل paratopes الأجسام المضادة أو لا، أجرينا همية التجارب القبض على تقارب باستخدام ألفا-FLAG المتوسطة المغناطيسي ومقتطفات خلية كلوة 293T (لم يعرب أي بروتين الموسومة) في وجود أو عدم وجود 3xFLAGالببتيد ارتفاع في. وتظهر النتائج في الشكل 1، لوحة الثاني. لفترة وجيزة، وقد حضنت α-FLAG المتوسطة المغناطيسي في مقتطفات الخلية (من ≳10 ملغ / مل البروتين الكلي) تحتوي على 500 ملي مول كلوريد الصوديوم و 1٪ ت / ت تريتون X-100 في 20 ملي HEPES نا 7.4 درجة الحموضة لمدة 30 دقيقة. ثم حضنت المتوسطة مع 1 ملغ / مل 3xFLAG الببتيد لتهجير تنافسية أي البروتينات منضمة إلى مستوقع α-FLAG أصلا أو مع العازلة عينة SDS-PAGE لتحقيق شطف تغيير طبيعة. بالإضافة إلى ذلك، تم إجراء نفس التجربة عندما تم ارتفعت مقتطفات الخلية مع 1 ميكروغرام / مل و 10 ميكروغرام / مل من 3xFLAG الببتيد. تم إخضاع جميع الكسور مزال إلى SDS-PAGE وتلطيخ الفضة. لاحظنا أنه في غياب حاتمة لها وما شابه ذلك، α-FLAG المتوسطة التي تحصل عليها على مستوى اكتشاف البروتينات الخلفية التي يمكن مزال مع 3xFLAG الببتيد - في المثال المقدمة من الشكل 1-II، لوحظ وجود الأنواع السائد ما بين 37 و 50 كيلو دالتون. نمط مزال معكان عينة العازلة SDS-PAGE مقارنة مع الأنواع بارزة إضافية. ومع ذلك، في وجود من 1 ميكروغرام / مل 3xFLAG الببتيد، FP ملزم إلى وسيلة تقارب وكان القضاء إلى ما دون مستوى الكشف ولم يكن لوحظ في أي كسور شطف الأم أو تغيير طبيعة. وتشير هذه النتيجة إلى أن paratopes الأجسام المضادة غير مأهولة يمكن أن يكون غير شرعي في غياب حاتمة بهم وما شابه ذلك، وتسهم إلى حد كبير في بروتيوم التي تم الحصول عليها أثناء التقاط تقارب حتى عن الأجسام المضادة التي تربط حاتمة بهم في تقارب عالية، كما هو الحال بالنسبة ل3xFLAG / α-FLAG M2 الاقتران. ومن suggestd أيضا أن شروط صارمة جدا باستخدام الملح العالية، وغالبا ما اختار لتخفيف غير محددة وملزمة، قد تكون فعالة في حالة عدم وجود تفاعل مستضد / الأجسام المضادة. لمتابعة أجرينا التجربة بما في ذلك تحليل مماثل من قبل SDS-PAGE وكذلك الكمية MS (الشكل S1). من 347 البروتينات كميا، لاحظنا أن كل بروتين انقاذ واحد (ديسكو كاذبةمعدل جدا = 1٪، وارتبط S1 الجدول) مع بروتين الطعم الموسومة 3xFLAG-بالمقارنة مع الببتيد 3xFLAG ارتفعت العينة الضابطة. وتشير هذه النتائج إلى أن في تجاربنا ومن المرجح أن يشارك في تنقية مع البروتين الموسومة الأغلبية الساحقة من البروتينات لاحظ أو هي بعيدا عن الهدف من المنتجات من غير مأهولة paratopes α-FLAG. في تجربتنا، ويتمثل النتائج القبض على تقارب عالية الإشارة إلى الضوضاء في SDS-PAGE وتلطيخ البروتين نمط محدد من العصابات حادة، وفيرة ومتكافئة تقريبا، فضلا عن ندرة تلوين الخلفية من العصابات خفوتا الأخرى؛ العديد من الأمثلة على هذا المبدأ يمكن أن ينظر في اشارة 11.

الدافع لاستخدام عازل PTFE (والذي هو موصى به) عندما cryomilling هو الحد من معدل ارتفاع درجة حرارة جرة أثناء الطحن، والتخفيف من عبء المتكررة LN 2 التبريد أثناء عملية الطحن، وخفض درجة الجليدتشكيل في جرة. هذا يسهل أداء طحن ثابت ويخفف من التعامل مع مسحوق الخلية. العوازل سبيل المثال يمكن العثور في اشارة 27 (كرات الصولجان) وصورت في الشكل 2 أدناه (جلبة، وعفريت).

شكل 1
الشكل 1: اختر ممثل النتائج. تم تعديل (I) هذه اللوحة من إشارة 19. Coomassie الأزرق الملون هلام SDS-بولكرلميد. الخرز (LEFT) ميكرون على نطاق المغناطيسي تظهر أقل خارج هدف ملزم من وسائل الإعلام على أساس الأغاروس. (A) حبات مغناطيسية. (ب) الاغاروز التقليدي. (C) الحديد المشرب (المغناطيسي) الاغاروز. كل جانب لأضداد FLAG M2 واستخدامها لالتقاط العلم الموسومة البكتيرية الفوسفاتيز القلوية (BAP، المسمى) ارتفعت إلى مستخرجات الناتجة من cryomilled خلايا كلوة-293. التنقيات القائم على الاغاروزأظهرت مستويات أعلى من امتصاص غير محددة (العصابات غير المسماة). (يمين) مقتطفات المنتجة من خلايا هيلا cryomilled يحمل انخفاض امتصاص بعيدا عن الهدف على حبات مغناطيسية، إلى جانب الضد من تلك التي تنتجها صوتنة عندما تستخدم لتنقية مجمع البروتين الذاتية. 44 RBM7 وتقارب التقاطها باستخدام الخرز المغناطيسي بالإضافة إلى أجسام مضادة للGFP بولكلونل لتنقية القادم معقدة 19،37 (D) استخراج تنتج من مسحوق cryomilled الموسومة LAP. (E) مقتطفات التي تنتجها صوتنة من خلايا سليمة. شريط أسود الرأسي يسلط الضوء على المنطقة من هلام حيث لوحظ interactors جماعية عالية غير محددة لتخصيبه في العينة التي صوتنة أعد. وأشارت السهام السوداء interactors المحددة المتوقعة (المسمى). عصابات لاحظ ~ 50 كيلو دالتون في الممرات D و E يمكن أن تعزى إلى اللاما مفتش السلاسل الثقيلة. (II) ملطخة الفضة هلام SDS-بولكرلميد. (الأمراض المنقولة جنسيا.) وحمل القبض على تقارب وهمية خارج على كلوة-293مقتطفات الخلايا التائية في طريقة قياسية. بعد القبض، وقد تحقق شطف من المواد المربوطة عن طريق (N) عدم تغيير طبيعة شطف مع 1 ملغم / لتر 3xFLAG الببتيد أو (D) تغيير طبيعة شطف في المخزن عينة SDS-PAGE. (PB 1)، والأمراض المنقولة جنسيا. ولكن أدرج الببتيد 3xFLAG في حل استخراج في 1 ميكروغرام / مل لمنع paratopes α-FLAG على المدى المتوسط ​​تقارب. (PB 10) كما PB 1 ولكن في ظل وجود 10 ميكروغرام / مل 3xFLAG الببتيد. وصفت العصابات المرتبطة مفتش و3xFLAG الببتيد. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: كم و-عفريت PTFE عازل. ويرد PTFE جرة 250 مل (1). A 50 مل المقاوم للصدأ جرة الصلب طحن (2) تناسبها داخل الجرة PTFE (3) وتقدمفرصة لمغادرة جرة طحن المثبتة داخل مطحنة بين الدورات. يتم استخدام عفريت PTFE عازل العلوي (2) بين الجمعية المشبك وغطاء جرة. لتبريد تثبيت جرة وعازل التجمع (3)، يضاف LN 2 مباشرة في جسم عازل، المحيطة جرة. ويمكن بعد ذلك أن تبدأ الدورة القادمة للطحن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

كاشف تركيز اقترح الملاحظات
كلوريد الصوديوم 0،1-0،5 M تركيزات عالية (> 300 ملم) تميل إلى تحسين استخراج البروتين الكلي والحفاظ على خلفية منخفضة، ولكن قد تجرد بعيدا بعض بين مستقرة على خلاف ذلكالجهات الفاعلة. تركيزات أقل من 150 ملي ليست فعالة بشكل خاص في الحد من خلفية غير محددة.
خلات الأمونيوم 0،2-2 M والملح، وتتكون من اثنين من مخازن، أن ينتج حلا درجة الحموضة محايد 57. تركيزات أعلى تستقر بعض المجمعات البروتين. يمكن المحاليل الحمضية تنجم عن والأسهم البلورية تخزينها بشكل غير صحيح القديمة على حساب فقدان الأمونيا. ليس هناك حاجة لدرجة الحموضة عازلة إضافية أو الأملاح في extractants تحتوي على خلات الأمونيوم. قد تكون جنبا إلى جنب مع كلوريد الصوديوم لتعديل النتائج التي تم الحصول عليها.
توين 20 0.1٪ ت / ت والمنظفات غير الأيونية 58؛ عادة جنبا إلى جنب مع كلوريد الصوديوم.
تريتون X-100 0.5-1٪ ت / ت والمنظفات غير الأيونية 58؛ عادة جنبا إلى جنب مع أي كلوريد الصوديوم أو NH 4 CH 3 CO 2 H
CHAPS 5 ملم والمنظفات zwitterionic 58 </ سوب>. عادة جنبا إلى جنب مع كلوريد الصوديوم.
Sarkosyl 1 ملم منظف انيوني 58 الذي يقلل الخلفية ويمكن تجريدها من مكونات معقدة مستقرة، مما قد يكشف عن اتصال ثنائي. عادة جنبا إلى جنب مع كلوريد الصوديوم.
تريس الكلورين 20 ملي PK لمن 8.8 في 4 درجات مئوية، 8.1 عند 25 درجة مئوية.
(درجة الحموضة 8.0)
HEPES نا 20 ملي PK على 7.8 في 4 درجات مئوية، 7.5 عند 25 درجة مئوية. هيدروكسيد الصوديوم أو كوه تستخدم لموازنة درجة الحموضة اعتمادا على الملح (على سبيل المثال، كلوريد الصوديوم، بوكل، أو CH 3 CO 2 K) المستخدمة في مستخلصة.
(7.4 درجة الحموضة)

الجدول 1: عدد قليل من اقترح الكواشف مفيد لتنقية البروتين المجمعات. هذا الجدول لISTS بعض الكواشف وجدنا من المفيد للمجمعات البروتين تنقية من خطوط الخلايا البشرية، مع تركيز العمل المقترحة. يحتوي على صياغة مستخلصة نموذجية منطقة عازلة درجة الحموضة، والملح، والمنظفات 1،11،24،45-48. أفضل الممارسات لتحديد أقل مزيج معقد من المواد الكيميائية التي تعطي النتيجة المرجوة.

شخصية S1
شخصية S1: اخلطي بعد تحليل تنقية (MAP-) SILAC من ايجابيات كاذبة. أولا الرسم التخطيطي: في هذه التجربة 3xFLAG الموسومة المجمعات البروتين ORF2p (معبرا من pLD401) وتنقيته من الخلايا كلوة-293T heavy- وصفت ضوء 7، على التوالي. وقد ارتفعت ضوء المسمى استخراج الخلايا مع 3xFLAG الببتيد لمنع القبض على تقارب من ORF2p 3xFLAG الموسومة عن طريق تثبيط تنافسية. هذا ليس من المتوقع أن منع الربط من البروتينات التي قد تحدث غير specifi-أتوماتيكيا مع المتوسط ​​المغناطيسي أو الهياكل غير paratopic من الأجسام المضادة. بعد شطف من الخرز المغناطيسي، وكانت العينات الثقيلة والخفيفة المختلطة بعد تنقية وتحليلها من قبل MS الكمي (MAP-SILAC 39) لتحديد جزء من البروتينات المرتبطة إما عينة. مزيد من التفاصيل المنهجي الموجود في الجدول S1. II. الفضة الملون هلام توضح أن المواد الخفيفة والثقيلة وصفت تسفر عن نتائج مماثلة (قارن L مع H)، وأن تنقية أجريت في وجود 3xFLAG-ارتفاع في (LI) كانت تحول دون منافسة. أدناه، Coomassie الأزرق G-250 هلام الملون المكونات التي تتألف من H المختلط وكسور LI، قبل تحليل البروتين القائم على هلام، كما هو موضح في الجدول S1. يرجى الضغط هنا لتحميل نسخة أكبر من هذا الرقم.

الجدول S1:MAP-SILAC. هذه ورقة تحتوي على البيانات التي تم الحصول عليها عند تنفيذ التجربة MAP-SILAC هو موضح في الشكل S1. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

وتعمل هذه البروتوكولات الثلاثة جنبا إلى جنب ل(1) إعداد الخلايا لكسر الحالة الصلبة التي cryomilling، (2) تحقيق الكسر في طاحونة الكرة الكواكب، و (3) تقديم مقتطفات من مسحوق الخلية إلى تقارب القبض على بروتين من الفائدة في مجمع مع interactors الفسيولوجية. وتوجد العديد من التقنيات خلية تحلل مختلفة، بما في ذلك النهج الميكانيكية / المادية توظيف سحق تأثير، القص، و / أو ضغط، وكذلك المواد الكيميائية / النهج الأنزيمية، ولكل منها إيجابيات وسلبيات 49،50 مختلفة. يشجع كل محقق لاستكشاف الطرق الأكثر ملائمة لتحليلاتهم، مع الأخذ في الاعتبار أن أي نهج المختار لكسر الخلايا واستخراج البروتين من المرجح أن يعرض التحيزات 51،52 يستلزم تحسين التجريبية (التي تناقش أدناه). طرق ميكانيكية قد تؤدي إلى ارتفاع الحرارة و / أو قوى القص التي يمكن أن تعطل مجمعات البروتين. Cryomilling يتجنب آثار التدفئة بحكم توظيف LN 2 تبريد عينات لرانه مدة العملية. فهم مطاحن الكرة الكواكب الاعتماد على قوات التأثير والاحتكاك، بما في ذلك إجهاد القص، ومكونات الجسيمات خفض حجم 53،54. في إعدادات ذكرت أننا لم احظ انحطاط مجمعات البروتين. في الواقع لدينا استخراج واسترجاع ما يبدو سليما ~ 50 نجمة داود الحمراء المجمعات المسام النووي 11 و إنزيمي retrotransposons نشط اظهار النشاط أعلى معين من التحضيرات توظيف "لطيف" القائم على المنظفات تحلل 7. الكيميائية الأساليب / الأنزيمية للتحلل الخلية تعاني من القيود التي يتم الافراج عن محتويات الخلية في المختبر في الوسط الذي يدعم تعطل أغشية الخلايا والجزيئات الهيكلية ولكن قد لا تكون مناسبة لصيانة سلامة المركب البروتيني (الخانات ) من اهتمام. في كثير من الأحيان، لا المكونة من المجمعات شكلت مع البروتين من الفائدة ولا الظروف اللازمة لتحقيق الاستقرار في المجمعات المستهدفة هيمعروفة مسبقا. وهناك فائدة كبيرة من الطحن الحالة الصلبة هي أن الكسر واستخراج وفكت، والسماح مصدر المواد لتكون مستعدة خالية من السائل وأضاف، تخزين (-80 درجة مئوية أو أقل)، جمعت، وسهولة استرجاعها لإجراء التجارب على الطلب. على سبيل المثال، لاستكشاف الأمثل في ظروف المختبر لالتقاط تقارب. تفاعلات البروتين هي الأكثر استقرارا في تركيز عال 55،56، وبالتالي التقليل من حجم مستخلصة يمكن أن يكون مفيدا للحفاظ على التفاعلات الفسيولوجية. من ناحية أخرى، هناك اعتبارات عملية - المجمعات البروتين لا بد من تقسيم للخروج من الخلايا وإلى المرحلة المائية غير لزجة، وخالية من الركام غير قابلة للذوبان، وذلك لتختلط المجمعات الهدف مع متوسط ​​النسب. وعلاوة على ذلك، هناك حاجة إلى بعض التقييس والسيطرة على البيئة في المختبر (درجة الحموضة، تركيز الملح، الخ) لتنظيم والتكاثر. نجد أن يستخرج العلاقات العامةoduced في نطاق التخفيف من 1: 4-1: 9 (ث: •) تلبية الاهتمامات العملية والنظرية، مما أسفر عن نتائج جيدة. بالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة المثلى لاستخراج الخلايا إلى تقارب احتياجات المتوسطة يحدد لاحقا. ويتم ذلك تجريبيا عن طريق المعايرة مقتطفات مع كميات متفاوتة من متوسطة تقارب ويمكن أن يكون لها آثار للكشف على نسبة من التجربة إشارة إلى الضجيج، لمزيد من المناقشة أدناه. استنزاف ممتازا للبروتين الهدف هو عادة ≥70٪ من نسبة ذوبان البروتين الهدف، ولكن> 90٪ أمر مرغوب فيه ويمكن أن يكون قابلا للتحقيق مع المعايير والثوابت دقيق للظروف الاستخراج. وتغطي العديد من هذه الاعتبارات العملية في إشارة 1. يتم التلاعب الخرز ممغطس باستخدام مغناطيس النيوديميوم في حامل أنبوب microcentrifuge المتخصصة، على الرغم من أن بدائل محلية الصنع قادرة على البقاء. عند وضعها داخل حامل، وحبات تتجمع في جانب من أنبوب تحت تأثير الحقل المغناطيسي للأرض. ومن ثم يمكن إزالة الحلول دون ديsturbing الخرز.

واحد الحد من بروتوكول cryomilling المقدمة، وضعت مع طاحونة الكرة الكواكب المستخدمة هنا (انظر جدول المواد)، غير أن الحد الأدنى من المواد مطلوب بشكل فعال مطحنة واستعادة مسحوق الخلية باستخدام هذا الجهاز (> 1 غرام). يتم الحصول على هذه الكميات بسهولة مع العديد من الميكروبات، خطوط الخلايا والكائنات الحية النموذج، ويمكن أيضا في كثير من الأحيان أن يتحقق مع الأنسجة استئصاله من الحيوانات المختبرية. ومع ذلك، قد تكون بعض خطوط الخلايا من الصعب جدا أن ينمو في الأنسجة وفرة والحيوان قد تكون نادرة. كميات أقل من المواد يمكن المضروب نسبيا باستخدام أجهزة أخرى تستخدم حاويات أصغر، على الرغم من أن يحتمل في التضحية من صفاء مسحوق تحقيقه. وبالإضافة إلى ذلك، فإن تكلفة أجهزة الطحن الميكانيكية قد تكون باهظة التكاليف لبعض المختبرات. Cryomilling يمكن تحقيق ذلك باستخدام عدد من الاجهزة البديلة 14-19، بما في ذلك أكثر كلفة معقولة من ناحية استخدام آفةلو وقذائف هاون، على الرغم من كفاءة الكسر قطرات إلى حد كبير. بروتوكولات القبض على التقارب تهدف عادة لكفاءة عالية من تحلل الخلية لتسهيل استخراج أقصى البروتين إلى حل، وبالتالي، إمكانية القصوى للقبض على المجمعات البروتين المستهدف. من ناحية أخرى، فقد ثبت للخميرة في الربط المختبر مقتطفات أن تحلل القصوى قد لا يتساوى مع القصوى في النشاط الكيميائي الحيوي المختبر 57،58. لم نلحظ مثل هذه المشاكل في النظم اختبرناها حتى الآن، وبالتالي لا تحد هادف لدينا الكسر الخلية عندما cryomilling. ومع ذلك، ينبغي أن يؤخذ هذا الاحتمال في الاعتبار عند تحسين لفحوصات في المختبر الأنزيمية. على الرغم من أن cryomilling هي طريقة فعالة للغاية لكسر الخلايا، كمية محدودة من صوتنة غالبا ما يعود بالنفع على إنتاج متجانسة مقتطفات خلية كاملة من أنسجة الثدييات بسبب المجاميع غير متجانسة يمكن في بعض الأحيان أن يلاحظ بالفحص البصري: عادةفي ظروف عملية الاستخلاص باستخدام منخفضة إلى معتدلة الملح (100-300 ملم) والمنظفات غير الأيونية (0،1-1٪ ت / ت) تركيزات. لأننا لوحظ أن وجود هذه المجاميع يمكن أن تقلل من المحصول و/ أو نوعية القبض على تقارب لاحق، علينا أن ننفذ بشكل روتيني صوتنة لتفريقهم (حتى عندما لا تراعى أنها بالعين المجردة). المجاميع تتفق مع شظايا غشاء متكتل، مماثلة لتلك التي ذكرت سابقا في مقتطفات من خلايا الخميرة المضروب 58. يستخدم صوتنة أيضا في بعض البروتوكولات ليجز الحمض النووي وتحرير أجزاء لونين إلى حل، ولكن درجة صوتنة المطبقة في هذا البروتوكول لا ملحوظ تفتيت الحمض النووي. محدودية (أو تكلفة عالية) ليجند تقارب ممتاز أو الأجسام المضادة ضد بروتين معين من الاهتمام قد يكون عائقا آخر. وهناك مجموعة واسعة من الكواشف تقارب المتاحة تجاريا من الممكن زيادته عند الكائن الحي نموذج هو قابل للعلامات الجينوم أو آرansfection مع ناقلات التعبير خارج الرحم، والسماح للتعبير عن البروتينات التي تهم واندماج الموسومة تقارب. ومع ذلك، أصبح إنتاج الأجسام المضادة مخصصة ممكنا على نحو متزايد ويمكن لكل من الأجسام المضادة وحيدة النسيلة وأداء ممتاز في التطبيقات القبض على تقارب. وتغطي هذه الاعتبارات كثيرة أيضا بمزيد من التفصيل في إشارة 1.

ويوضح أمثلة لكيفية طريقة خلية تحلل واختيار المتوسطة تقارب يمكن أن تؤثر على النتائج في الشكل 1. ويمكن رؤية أمثلة على الآثار التي كتبها extractants المختلفة المبذولة في المراجع 1،11،24. لأن هذه وغيرها من المعالم التجريبية تؤثر على جودة التقاط تقارب، مما يجعل من الصعب التمييز ضباط الإتصال، مستودعات لل"proteomes حبة" والنهج الحسابية للقضاء وضعت الملوثات غير محددة للمساعدة في تحديد ضباط الإتصال 40-43. ومع ذلك، هذه النهج فقط substitيوت لإعداد نموذج الأمثل لدرجة محدودة 59. مراقبة أفضل الممارسات وتحسين تجريبيا سوف التقاط تجربة تقارب توفير أعلى جودة عينات لتحليل المصب، وناقش بالتفصيل أدناه. ممارسة تنفيذها بسهولة التي يمكن أن تحسن نقاء العينة شطف الأصلي. في أغلب الأحيان يستخدم شطف الأصلي للحصول على تقارب معزول بروتين معقد، سليمة، لمزيد من التجارب. ولكن كما هو في كثير من الأحيان يعزز نقاء العينة، فإنه يمكن أن تستخدم أيضا لهذا السبب وحده. ومع ذلك، كما هو موضح في الشكل رقم 1، لوحة الثاني، قدرة شطف الأصلي لتحسين نقاء العينة قد تعتمد على معايرة دقيقة لكمية متوسطة تقارب وفرة من البروتين المستهدف في استخراج الخلايا - عندما المتوسطة في زيادة ، paratopes غير مأهولة قد تسمح تراكم بعيدا عن الهدف من البروتينات FP يمكن ملاحظتها في كسور مزال أصلا. باستخدام الكواشف والإجراءات الموضحة هنا، فإنه حكما كانت تجربتنا أن أكبر مساهم منفرد من ضباط الإتصال لتجاربنا هو البروتين الموسومة نفسه إزالة مرة واحدة من سياق الخلية الحية. (الشكل 1.II والشكل S1). في مثل هذه الحالات، الأبوية الضوابط خط الخلية التي تحقق proteomes غير ذات صلة في حالة عدم وجود مستضد لا قيمة عملية؛ كذلك لعناصر العلامة فقط أو ارتفاع في أن تخلو من أي شيء ولكن المستضد الهدف. لذلك، كلما كان ذلك عمليا ننفذ I-الترابية 7،38، والذي يقيس مباشرة تراكم بروتين تفاعلات ما بعد تحلل باستخدام MS الكمية. كما ذكر في الخطوة 3.2.7 من البروتوكول، وإجراءات لشطف الأصلي تختلف مع تفاصيل النظام تقارب المستخدمة. ويتحقق شطف الأصلي الأكثر شيوعا من النزوح تنافسية من البروتين الموسومة انشقاق معقدة أو بروتين من العلامة، والإفراج عن مجمع من وسيلة تقارب. العديد من أنظمة تقارب تتألف من علامات حاتمة صغيرة موجودة، فوص الذي حاتمة نفسها هي متوفرة كما الببتيد مفيدة لشطف التنافسي للمجمعات البروتين الموسومة 60. وبالمثل، تتوفر ليلتصق على وجه التحديد المواقع المشابهة موقع استراتيجي في تقارب عدة البروتياز الموسومة البروتينات الانصهار 61. تبعا لخصوصيات النظم تقارب المختار، قد اعتمد خطة شطف المناسب.

عموما، ونوعية النتائج التي تم الحصول عليها سوف تتأثر بشكل كبير من خلال نوعية من إعداد العينة. من المهم أن تعمل بعناية وبدقة من خلال كل خطوة من هذه البروتوكولات، وبأسرع وقت ممكن مع الحفاظ على بعناية ودقة. فإنه من المستحسن أن تتبع التقسيم من البروتين من الفائدة من خلال كل خطوة لفهم كفاءة كل تلاعب. على سبيل المثال: كيف وفيرة هي بروتين من الفائدة في الخلايا او الانسجة في السؤال؟ ولعل بروتين قيد الدراسة (والمجمعات الخاصة به) سيكون تحديا للتميز من قبل كتلةمطياف يرجع إلى وفرة منخفضة. إذا المجمعات النقاء قابلة للكشف من قبل تلطيخ بروتين العام (حوالي نانوجرام المدى)، ومن المرجح أن تنجح مطياف الكتلة. إذا كان من الممكن الكشف عن البروتين القبض على المصالح فقط من حساسية تعزيز النشاف الغربي chemiluminescent (ما يقرب من مجموعة بيكو غرام)، هو أقل احتمالا أن تكون فعالة مطياف الكتلة. حتى لو كان البروتين من الفائدة وفرة في الخلية، كيف وفيرة هو عليه في استخراج الخلايا المنتجة؟ هل تقسيم البروتين إلى حل أم أنها في بيليه؟ إذا كان هذا الأخير، وهو حل استخراج الجديد يمكن وضع قد تحسن الانتعاش. مرة واحدة يتم الجمع بين استخراج الخلايا مع وسيلة تقارب، مدى فعالية يتم التقاط البروتين؟ لا تزال بروتين ملزمة من خلال يغسل اللاحقة؟ ماذا عن البروتينات copurifying أخرى؟ عن طريق توفير قسامة من كل عينة في الخطوات المناسبة للبروتوكول هذه الأسئلة يمكن بسهولة أن يجيب، وعادة من قبل النشاف الغربي ضد بروتين من الفائدةأو تلطيخ بروتين العام، ولكن فحوصات أخرى قد تكون مناسبة أيضا. وتحسين كل خطوة تعزيز المحصول ونقاء المجمعات القبض عليه، رغم أنه قد يكون هناك مفاضلة ليتم في تعظيم سمة واحدة أو أخرى.

تطبيق نموذجي من القبض على تقارب لكثير من الباحثين في تحديد المرشح في interactors الجسم الحي لعدد قليل من البروتينات في المصالح؛ ويتعرض هؤلاء المرشحين عادة إلى التحقق من النهج المتعامدة في الجسم الحي للتدليل على الأهمية البيولوجية للinteractors المادية. ويعمل القبض على التقارب أيضا دراسات الإنتاجية العالية لتوليد قوائم copurifying البروتينات لوحظ على أساس (تقريبا) واسعة بروتيوم، تسهيل الاستدلالات الحسابية المتعلقة المفترضة في المجمعات الجسم الحي. يمكن العثور على العديد من الأمثلة على هذه الدراسات في الأدب. هذا النهج تحرم تعظيم الاستفادة من ظروف اعتقال لأي هدف معين لصالح استكشاف الرجلأهداف ذ. على هذا النحو، والمجمعات الاستدلال نادرا ما يتم استرداد أنفسهم سليمة تماما ونقية للغاية في أي عينة معينة. وبدلا من ذلك، يتم استخدام التداخل الجزئي في التراكيب لوحظ بين العديد من العينات الملتقطة تقارب متميزة كأساس للالاستدلالات 42. كلا النهجين تساهم بيانات قيمة لفهمنا للinteractome. ومع ذلك، فائدة كبيرة واحدة من القبض على تقارب هو أنه لا وكثيرا ما تتيح الفرصة للحصول على المجمعات المقدمة سليمة وتنقيته للغاية، أن تبذل الجهود لتحسين العملية. ونحن نعتقد أن مستقبل النهج يكمن في زيادة سهولة وكفاءة الاستفادة المثلى من القبض على مجمعات البروتين الذاتية 11، لتقييم أكثر دقة من سلسلة من interactors الفسيولوجية واستخدام أكثر تواترا في مزيد من البيوكيميائية المصب، enzymological، والدراسات الهيكلية، على سبيل المثال، تشير 7،9،23.

Acknowledgments

نشكر الأستاذ براين T. Chait لله لا يقدر بثمن المشورة والدعم والوصول إلى MS الأجهزة، وكذلك السيدة كيلي ر مولوي حصول على الدعم الفني الممتاز. نشكر السيدة كيلي باري لدعم مع تحرير نسخة. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة المعاهد الوطنية للصحة P41GM109824، P41GM103314، وP50GM107632.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2 L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62x44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 kPa pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5-2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
  2. Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
  3. Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
  4. Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  5. Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
  6. Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
  7. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
  8. Liu, J. -J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -Y., Ke, A., Wang, H. -W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
  9. Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
  10. Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
  11. Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
  12. Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  13. Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  14. Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
  15. Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
  16. Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
  17. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
  18. Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
  19. Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. 0 (0), 1-6 (2012).
  20. Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
  21. Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
  22. Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
  23. Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
  24. LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
  25. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells. , John Wiley & Sons. (2011).
  26. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Basic Cell Culture Protocols. 946, Humana Press. (2013).
  27. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
  28. Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
  29. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. , 1–3at Retsch GmbH. http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/ (2014).
  30. Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  31. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
  32. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
  33. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
  34. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A. N., Padovan, J. C., Zhang, W. MALDI Sample Preparation. , Available from: rockefeller.edu at http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html (2006).
  37. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  38. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
  39. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
  40. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
  41. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
  42. Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
  43. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
  44. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1 (2005).
  45. Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839 (1999).
  46. Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
  47. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
  48. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
  49. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
  50. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
  51. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
  52. Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  53. Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
  54. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201 (2012).
  55. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345 (1982).
  56. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  57. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, City of Hope. (2003).
  58. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , Retsch GmbH. (2005).
  59. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
  60. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
  61. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).

Tags

الكيمياء الحيوية، العدد 118، القبض على تقارب وتنقية تقارب، مناعي، IP، cryomilling، واختلال الخلايا والبروتين تنقية معقدة

Erratum

Formal Correction: Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells
Posted by JoVE Editors on 01/20/2017. Citeable Link.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:

  1. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  2. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  3. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  4. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  5. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  6. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  7. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  8. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  9. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  10. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  11. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  12. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  13. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  14. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  15. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  16. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  17. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  18. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  19. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  20. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  21. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  22. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  23. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  24. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  25. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  26. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  27. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  28. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
  29. Williams, R. J., & Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911–1912 (1932).
  30. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).
  31. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  32. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  33. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  34. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).

to:

  1. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1–3at <http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/> Retsch GmbH (2014).
  2. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  3. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  4. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  5. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  6. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  7. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  8. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  9. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  10. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  11. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  12. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  13. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  14. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  15. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  16. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  17. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  18. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  19. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  20. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).
  21. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  22. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  23. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  24. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  25. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  26. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  27. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  28. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  29. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  30. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  31. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  32. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  33. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
البروتين مجمع القبض على الانجذاب من خلايا الثدييات Cryomilled
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P.… More

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter