Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller

Published: December 9, 2016 doi: 10.3791/54518
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Laboratory of Cellular and Structural Biology, The Rockefeller University, 2Institute for Systems Genetics, Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology, New York University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

Her beskriver vi protokoller for å forstyrre pattedyrceller av solid-state fresing ved en kryogenisk temperatur, produserer en celle ekstrakt fra den resulterende celle pulver, og isolere protein komplekser av interesse ved affinitet fangst på antistoff kombinert mikron-skala paramagnetiske kuler.

Abstract

Affinity fangst er en effektiv teknikk for å isolere endogene protein komplekser for videre studier. Når den brukes i forbindelse med et antistoff, blir denne teknikken også ofte referert til som immunutfelling. Affinitet fangst kan brukes i en benk-skala og i en high-throughput sammenheng. Når kombinert med protein massespektrometri har affinitet fangst vist seg å være en arbeidshest av interactome analyse. Selv om det er potensielt mange måter å utføre de mange trinnene som er involvert, følgende protokoller gjennomføre våre favoriserte metoder. To egenskaper er karakteristiske: bruk av cryomilled celle pulver for å fremstille celle-ekstrakter, og antistoff-koplet paramagnetiske kuler som affiniteten medium. I mange tilfeller har vi fått bedre resultater som ble oppnådd med mer konvensjonelle affinitet fangst praksis. Cryomilling unngår mange problemer forbundet med andre former for celle brekkasje. Den gir effektiv knusing av materialet, og samtidig unngå denatrasjonsside problemstillinger knyttet til oppvarming eller skumming. Det beholder den opprinnelige proteinkonsentrasjonen opp til det punktet av utvinning, formildende macromolecular dissosiasjon. Det reduserer tiden ekstrahert proteiner tilbringer i oppløsning, noe som begrenser skadelige enzymatiske aktiviteter, og det kan redusere den ikke-spesifikke adsorpsjon av proteiner ved affinitets-medium. Micron stilt magnetisk affinitet medier har blitt mer vanlig de siste årene i økende grad erstatte den tradisjonelle agarose- og Sepharose-baserte medier. Viktigste fordelene med magnetiske medier omfatter vanligvis lavere ikke-spesifikt protein adsorpsjon; no størrelseseksklusjonsgrense fordi proteinkompleks binding oppstår på perleoverflaten i stedet for i porene; og enkel manipulasjon og håndtering ved hjelp av magneter.

Introduction

En typisk anvendelse av de fremlagte fremgangsmåter er for å stabilisere og oppnå et høyt utbytte og renhet av endogene proteinkomplekser av interesse for interactomic karakterisering 1. Det skal forstås at dynamiske nettverk av både stabil og transient tilhørende makromolekylære komplekser, hovedsakelig består av proteiner, organisere cellulære prosesser 2,3. Mens det er mange eksperimentelle tilnærminger for å identifisere protein-protein-interaksjoner er affiniteten fange blant de mest brukte metoder for isolering og dissekere fysiologiske proteinkomplekser 4-6. Videre har denne teknikken den fordelen gir de makromolekylære komplekser som fysiske enheter, ikke bare som datapunktene i en lese-out; Fordelaktig kan de oppnådde komplekser således anvendes i en mengde av ytterligere nedstrøms biokjemiske, enzymatisk, og strukturelle analyser 7-9. De presenterte protokoller har blitt utviklet som svar på behovet for å kartlegge Proteinkonn-protein interaksjonsnettverk og karaktermakromolekylære komplekser i sine roller som de effektor molekyler av cellebiologi. De er detaljert med hensyn til deres anvendelse i pattedyrceller dyrket i vevskultur, men er like anvendelig for et bredt spekter av biologiske prøver som er gitt passende systemspesifikke tilpasninger.

Historien om affinitet fangst strekker seg tilbake til begynnelsen av det tjuende århundre med de første immunoaffinitetskromatografi eksperimenter - likner det som oftest referert til i dag som immunoprecipitation (IP) - vises i litteraturen av de tidlige 1950-tallet. Mainstream bruk av teknikken utvikles videre gjennom svingen av dette århundre til i dag 10-13. Diverse celle og molekylærbiologiske studier har benyttet mekanisk brudd av cellene ved fresing ved kryogeniske temperaturer for minst de siste førti år 14-19; og molekylære separasjoner utnytte (super) paramagnetiske kuler har become stadig vanligere i løpet av de siste to tiårene 20. Ved å kombinere disse ulike teknologiene har bidratt til å synergistisk forbedre resultatene som kan oppnås i proteinkompleks affinitet fangst eksperimenter 1, noe som gjenspeiles av en omfattende mengde arbeid produsert av oss selv og bredere fagmiljø 7,9,11,18,19,21 -23. Hjelpemiddel Resultatene er presentert i figur 1.

En samling av begrensninger og hensyn som gjelder for gjennomføring av effektive affinitet fangst eksperimenter kan bli funnet i referanse 1. Vanligvis denne tilnærmingen er mest hensiktsmessig å: (I) katalogisere interactors av et protein av interesse, dvs. bruke protein massespektrometri (MS) for å identifisere hittil ukjente copurifying proteiner (utforskende analyse); (II) analyse med hensyn på tilstedeværelsen av en spesiell samvirkende partner, det vil si bruker MS eller western blot for å detektere et bestemt protein eller begrenset sett av proteiner mistenkes for å iteract med proteinet av interesse (hypotesetesting); eller (III) utarbeide endogent samlet protein komplekser som inneholder protein av interesse for videre studier ved flere teknikker (preparativ opparbeiding). Før tar fatt på en affinitet fangst eksperimentelt regime er det absolutt nødvendig å ha en høy kvalitet affinitet reagens som binder seg til mål-protein, typisk en IP-kompetent antistoff mot det native målet protein av interesse eller mot et merke festet til et fusjonsprotein. Det er også viktig å ha egnede metoder for eksperimentell avlesning på plass: generelle protein-farging (som Coomassie blue, Sypro Ruby, eller sølv, etter SDS-PAGE), western blotting, og protein MS er alle vanligvis brukes i forbindelse med affinitet fangst 1. De presenterte protokoller utnytte antistoff konjugert magnetiske kuler som affinitet medium. Selv om funksjonen av affiniteten mediet kan i utgangspunktet bli validert i tester som benytter få eksperimentelle parametrene,oppnå de beste resultatene hvert forsøk bør empirisk optimalisert 1,11,24. Protokollene blir separert i tre distinkte faser: (1) fremstilling av frosne cellemateriale; (2) celle brudd ved fastfase-fresing ved kryogen temperatur; og (3) protein utvinning og affinitet fangst ved bruk av antistoff-koblet paramagnetiske kuler.

Protocol

1. Cell Høsting og frysing

  1. Vokse 1-8 g av cellematerialet ved bruk av egnede dyrkningsbetingelser for den aktuelle cellelinjen 25,26. Denne protokollen er optimalisert for opp til 8 gram celler (~ 10 9 celler), modifisert fra referanser 19,27,28. Typisk, ~ 5 g av HEK-293 eller HeLa-celler som kan fås fra åtte 500 cm2 dyrkningsskåler dyrket til ~ 90% konfluens.
    FORSIKTIG: Disse protokollene bruke flytende nitrogen (LN 2), i stand til å forårsake alvorlige kryogeniske forbrenninger. Don verneklær og trening passende forholdsregler for håndtering.
  2. Hell av vekstmediet (avfall) inn i et stort begerglass.
  3. Plasser kulturen fatet på is i et stort rektangulært is panne.
  4. Tilsett 20 ml iskald 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) til dyrkningsskålen og frigjøre cellene fra formen ved hjelp av en stor celle skraper; overføre celler til et 50 ml rør, pre-avkjølt på is; holde røret på is.
    NOTAT: For alle cellehåndterings trinn bruker en elektro-pipetten satt til "lav" og 25 ml pipetter for å unngå overdreven klipping av celler under overføring manipulasjoner. Ordne 50 ml samling rør og 1x PBS i en isen bøtte før start prosedyren.
  5. Legg ytterligere 10 ml iskald 1x PBS til samme parabolen. Samle de gjenværende cellene og overføre dem til 50 ml tube.
  6. Gjenta for hver rett; Cellesuspensjoner fra forskjellige retter, kan kombineres for å redusere prøvenummeret og plastavfall.
    MERK: Siden cellene selv ikke vil utgjøre en stor andel av suspensjonen volum, kan tre plater igjen av cellesuspensjon settes sammen til to 50 ml-rør. Fordi 50 ml rør faktisk holder mer enn den nominelle volum, kan åtte plater typisk være spredt over fem slike rør.
  7. Sentrifuger i 5 min ved 1000 x g, 4 ° C.
  8. Hell forsiktig av supernatanten. Resuspender hver pellet i 10 ml iskald 1 x PBS. Konsolidere resuspended pellets, opp til 5 per 50 ml rør, for å redusere prøvenummer.
  9. Sentrifuge 5 min ved 1000 x g, 4 ° C.
  10. Hell forsiktig av supernatanten. Resuspender pelleten i 10 ml iskald PBS 1x
  11. Fjern stempelet fra en 20 ml sprøyte og sett den til side. Cap dysen til sprøyten og overføre cellesuspensjonen til den.
  12. Plasser sprøyten inne i et 50 ml rør og sentrifuger i 5 minutter ved 1000 xg, 4 ° C.
  13. Aspirer supernatanten med en fin spiss pipette festet til et vakuumsystem felle inntil bare det øverste laget av cellene begynner å bli sugd opp. Dette resulterer i en våt cellepellet.
  14. Slipp ut sprøyten, sett stempelet og dryppe cellene direkte inn i en stor plastbeger fylt med LN 2, som ble holdt i en LN 2 bad i en Styrofoam boks. Tvang styrter de gjenværende cellene fra sprøyten.
  15. Overfør de frosne celler til 50 ml rør ved å helle. Løst cap rørene for å tillate at overskudd av LN 2 for å fordampe; hold them over natten ved -80 ° C. Stram caps fullt neste dag. Den frosne celle kan lagres på denne måten ved -80 ° C inntil cryomilling.
    MERK: Ikke tett lukke rørene før alle LN 2 har synlig fordampet, ellers stort trykk kan føre til at slangen til å eksplodere. Ikke lukker rørene etter at LN 2 har forsvunnet, kan resultere i akkumulering av rim på celler materiale, å tilsette overskudd av vann i vekt og effektivt redusere proteinkonsentrasjonen ved fresing.

2. Cryogenic Forstyrrelse av frosne celler

MERK: Alle verktøy for fresing og manipulasjoner bør være forhåndskjølt med LN 2. En liten karaffel vil være nødvendig for å legge til LN 2 inne i glasset og for å helle LN 2 over toppen av den lukkede fresing glasset. En hjemmelaget verktøy er vist i referanse 19. Kryogeniske hansker vil være nødvendig for å håndtere LN 2 avkjølt apparater for fresing. frese~~POS=TRUNCjar lokk som brukes her (se tabell for material) vanligvis leveres med en gummipakning installert; dette må bli erstattet med en kommersielt tilgjengelig Teflon lokkpakningen for å utføre en pålitelig måte den følgende protokoll. Videre, fordi trykket fra gass N2 kan bygge opp til høye nivåer i glasset under fresing, anbefaler vi å installere en kommersielt tilgjengelig 5 bar / 500 kPa trykkventil som en sikkerhets utgivelse forholdsregel 28.

  1. Fjern celle perler fra -80 ° C lagring og hold i en 50 ml tube holder i en LN 2 bad.
  2. Pre-kjøle 50 ml krukke, to 20 mm kuler, og lokk i en ren rektangulær isen bøtte med LN 2. Pre-kjøle Polytetrafluoroethylene (PTFE) isolator hvis du bruker en; enten et sett av pucker (se henvisningstallet 27), eller en hylse-og-puck (se figur 2). Forkjøling er fullført når voldsom koking av LN 2 beroliger.
  3. Sett passende motvekt påmølle.
    MERK: Dette vil være lik massen av glasset, krukke lokk, idet malekuler som brukes, og cellemengden som skal tilsettes til krukken. Hvis noen PTFE isolatorer brukes, bør massen også inkluderes. Vi foreslår at du tar opp massene av glasset, lokk og baller (og deres samlede masse, inkludert noen isolator brukes) på forhånd og spille dem inn på et informasjonsblad oppbevares i nærheten av møllen.
  4. Bruk pinsett, plasserer de to pre-avkjølte 20 mm frese baller og frosne celler inne i pre-avkjølte fresing krukke.
    Merk: På grunn av små tap av materialet på glasset og kuleflater under fresing, andelen gjenvunnet materiale øker etter hvert som massen av celler frest øker. Ved fremgangsmåten beskrevet, vesentlige tap er meget beskjedne, å være i størrelsesorden ~ 0,3 g våt cellevekt (WCW). Produsentens retningslinjer indikerer maks volum av prøven lastet bør være ~ 1/3 av glasset volum. 29 Det totale volumet av kulene bør være ca. 1/3 og remaining ~ 1/3 ledig plass er for fri bevegelse av ballene.
  5. Legg LN 2 til glasset opp til ~ ½ full, legg lokket på glasset og overføre forsamlingen til møllen.
    MERK: Installer først valgt isolator hvis du bruker en.
  6. Klem montering på plass og utføre tre sykluser av fresing ved hjelp av følgende program: 400 rpm, 3 min, omvendt rotasjon hvert minutt, uten intervall pause. Avkjøl fresing krukke med LN to i mellom hver syklus.
    MERK: Under fresing en distinkt clunking støy genereres som kulene kolliderer innenfor glasset i planetenes bevegelser. Hvis disse lydene ikke blir hørt, er fresing ikke oppstår. Avslutt fresing syklus, teller ikke denne syklusen, flytte glasset forsamlingen tilbake til LN 2 og undersøke innholdet i glasset. Sikre at ingen isen har dannet, og hvis den har, chip den bort fra glasset veggene med en pre-avkjølt slikkepott. Begynn på nytt fra trinn 2.5.
    Hvis du bruker noen isolator eller isolator pucker, flytte glasset forsamlingen tilbake til LN 2 til ~ ½ full hver gang. LN 2 tilsettes vil fordampe i løpet av glasset som temperaturen av glasset øker i løpet av fresing. Dette resulterer i trykkoppbygging inne i glasset. Derfor, når løsrev glasset fra møllen, slipper klemmen veldig sakte. Hvis klemmen frigjøres hurtig, kan celle pulver unnslippe med rask trykkavlastning. En langsom frigjøring av klemmen gjør at presset til å flykte fra glasset i en mild, kontrollert måte, og hindrer tap av cellemateriale. Den milde utslipp av gass N2 kan ofte bli hørt knitring som klemmen frigjøres sakte - dette er normalt.
    Hvis du bruker en hylse-and-puck isolator, kan glasset forsamlingen stå i møllen og LN 2 lagt til isolator / krukke montering in situ.
  7. Flytt glasset tilbake til LN 2, og la hvile et øyeblikk for å kjøle seg ned. Ved hjelp av en hylse-og-puck isolator, kan glasset fjernes fra hylsen wed hjelp av to slikkepotter, som gir innflytelse på hver side. Når glasset hviler i LN 2, forsiktig fjerne lokket, fjerne ballene ved hjelp av tang, og overføre pulveret til en pre-avkjølt 50 ml rør ved hjelp av en pre-avkjølt slikkepott. Legge litt LN 2 til åpen krukke / pulver kan bidra til å løsne pulver som er deigete på ballene, før du fjerner dem.
    MERK: Når glasset er åpnet, legge til en liten mengde LN 2 til det før du fjerner ballene. Dette vil bidra til å gjenopprette pulver caked på flatene. Cell pulver bør holdes ved -80 ° C eller lavere inntil bruk. I vår erfaring, kan celle pulver lagres på denne måte, i alt vesentlig ubestemt tid, uten å påvirke ytelsen.

3. Affinity Capture av protein komplekser fra celleekstrakter

NB: Den følgende protokoll implementerer affinitet media bestående av en affinitetsligand, agn, eller antistoff som kommuniserer med proteinet av interesse, coupled Microns stilt paramagnetiske kuler. Disse kan være forberedt på huset 19,30, ved hjelp av kommersielt tilgjengelige kits, eller kjøpes som ferdige reagenser.

  1. Cell Extract Forberedelse
    MERK: Når du håndterer celle pulver, husk å bruke redskaper og rør pre-avkjølte med LN 2. Rørene inneholdende cellen Pulveret bør alltid holdes på LN 2 når ikke ved -80 ° C. Plasser 50 ml rør (r) inneholdende celle pulver i et rørstativ, i et Styrofoam beholder med LN 2.
    1. Vei ut 100 mg av celle pulver inn i en 1,5 eller 2 ml mikrosentrifugerør.
      MERK: Vi har observert at denne mengden av celler er et godt utgangspunkt som vil vanligvis gi målet protein i titalls til hundrevis av nanogram varierer etter affinitet fangst for en moderat uttrykte protein (~ 50 kDa masse, tilstede på tusenvis av eksemplarer per celle), forutsatt at utvinning og fangingseffektiviteter av målet er ≳70%. Slike renter gir for direkte visualizasjon av det rensede fraksjon ved hjelp av SDS-PAGE og proteinfarging.
    2. Tare analytisk balanse med den tomme mikrosentrifugerør. Tilsett celle pulver i et rør ved hjelp av en LN 2 avkjølt skje eller slikkepott. Sjekk massen av pulveret anbrakt i røret på analysevekt.
      MERK: For å lette veier ut av celle pulver, kan små volumetriske måleskjeer brukes. Disse har vist seg å gi reproduserbare resultater (se referanse 19). Vi har funnet de beste resultater ved hjelp av skrulokk eller "safe-lock 'mikrosentrifugerør. Trykket fra fordamper LN 2 som kan gå inn i rørene kan føre til standard mikrosentrifugerør til åpne under den etterfølgende oppvarming like før tilsetningen av ekstraksjonsløsningen - potensielt kan resultere i tap av prøven.
    3. Åpne røret (eller løsne skrulokk) med cellepulver og la stå ved romtemperatur i 1 min. Dette vil frigjøre trykket inne i røret og forhindre umiddelbar frysing av ekstraksjonløsning når de tilsettes til pulveret. Ingen tining blir observert i løpet av denne ett minutters inkubering.
    4. Legg 400 mL av ekstraksjonsmiddel supplert med proteasehemmere og vortex kort, så hold på is mens du går videre til trinn 3.1.5. Prøvene bør holdes på is mellom alle etterfølgende manipulasjoner før eluering.
      MERK: det beste sammensetning av ekstraksjonsmidlet vil avhenge av protein-kompleks (er) som skal renses. Noen generell veiledning er gitt i tabell 1 og støtte referanser.
    5. Bruke en mikrotip ultrasonicator for å gi prøven et kort lav energipuls for å dispergere eventuelle aggregater. (Ultra) sonicate med 4 pulser (2 sek hver, 2 A, ca 15-20 J av total energi).
      MERK: vorteksing utleverer cellen pulveret inn i ekstraksjonsmidlet, men avhengig av karakteren oppløsning, kan noen aggregater observeres. Vi har funnet at å dispergere disse aggregater gir det beste utbytte i løpet av påfølgende affinitet fangst. En kort mikrotip sonikasjon sprer lett disse aggregatene. Oppløsningen skal være delvis gjennomsiktige, men homogen, uten åpenbare aggregater. Vann bade sonicators tendens til å være for lite strøm til å effektivt spre slike aggregater uten vesentlig lengre prøvehåndtering ganger, men kan være egnet med riktige innstillinger.
    6. Avklare ekstrakten ved sentrifugering (f.eks, 20 000 xg, 10 min, 4 ° C).
      MERK: En aliquot av den klarede celleekstrakt kan bli lagret for sammenligning med innholdet i pelleten, etter affinitet fangst supernatant, og fraksjonene som oppnås etter eluering fra affinitet medium for å bestemme effektiviteten av utvinning og fangst av målproteinet , for eksempel ved western blot (se diskusjon).
    7. Fjern supernatanten (avklares ekstrakt) og gå videre til affinitet fangst.
      MERK: pellet kan bli ekstrahert i SDS-PAGE-prøveladningsbuffer ved 70 ° C for å fastslå graden av frigjøring av målproteinet during den første ikke-denaturerende ekstraksjon i forhold til ekstraktet oppnådd i trinn 3.1.6.
  2. Affinity Capture
    1. Forvask den magnetiske affinitet medium. Dette kan gjøres mens celleekstrakter blir sentrifugert.
    2. Plasser røret (e) på magneten. Kulene vil samle seg på den side av røret i løpet av sekunder, hvilket tillater lagringsløsningen som skal fjernes.
    3. Legg 500 mL av ekstraksjon løsning på perlene. I korthet vortex mix på middels hastighet (tilstrekkelig til å suspendere). Puls-spinn rørene i en mini-sentrifuge for å samle alt innholdet til bunnen. Gjør du det sikrer minimum overføring av løsninger. Plasser rørene på magnet og aspirer løsning.
      MERK: Magnetiske media med karakteristiske kjennetegn er tilgjengelig fra en rekke kommersielle leverandører. Resultatene kan variere avhengig av slike egenskaper, herunder kulestørrelse, ensartethet, overflatebelegg, og antistoff koblingskjemi. Side-by-side prøvelser i søknaden er anbefalt før settling på et valg reagens.
    4. Initiere affinitet fangst ved å overføre avklart celleekstrakt til en 1,5-2,0 ml tube inneholder forvasket affinitet medium og vortex kort for å suspendere.
    5. Inkuber i 30 minutter ved 4 ° C under kontinuerlig forsiktig omrøring på en rotator hjulet; perlene bør forbli suspendert hele inkubasjon.
    6. Puls-spinne rørene i en mini-sentrifuge for å samle alle innholdene til bunnen av røret. Aspirer supernatanten og vasking av perlene som tre ganger med 1 ml kald ekstraksjon oppløsning som beskrevet i trinn 3.2.3. Plasser rørene på magnet. Fjerne oppløsningen. Fortsett å legge til neste løsning og gjenta. Under 2. vask, overføre perler og vaskeløsning sammen til en frisk mikrosentrifugerør ved pipettering. Dette reduserer forurensning av prøven, ved punktet for eluering, ved tilfeldige proteiner adsorberes til veggene av røret som benyttes for inkubering med than celleekstrakt. Etter at 3. vask, bør kulene være kort puls-spunnet i en mini-sentrifuge for å samle alle innhold til bunnen. Plasser slangen tilbake på magnet, og fjerne eventuelle gjenværende væske. Dette tillater fjerning av de siste få ul av oppløsning før eluering, slik de eluerte prøvene vil ha ensartede volumer. Det sikrer også at elueringen skal være effektiv, så elueringsoppløsningen ikke vil bli fortynnet av rester av vaske; slike rester kan også bidra til salt effekter og endre vandring av proteiner i SDS-PAGE (se nedenfor).
      MERK: En porsjon av post-bindende supernatant kan lagres for sammenligning med den klar ekstrakt generert i 3.1.6. av western blot. Resultatet vil indikere graden av uttynning av mål-proteinet fra celleekstrakt.
    7. Elueres i enten en innfødt eller denaturerende måte; vurdere strategien best for nedstrøms søknaden en.
      MERK: Detaljene i mors eluering strategies vil avhenge av den affinitetsmerkelapp anvendt (se diskusjon). For de fleste brukere, denaturerende eluering med SDS-PAGE-prøvebuffer etterfulgt av analyse av prøven ved hjelp av SDS-PAGE med protein fargings 31, vil være den mest praktiske første tilnærming.
      MERK: Sammensetningen av prøvebuffer vil avhenge av elektroforese system som benyttes. Mange laboratorier kastet sine egne Tris-glysin gels, gjør bruk av usammenhengende elektroforese og Laemmli buffersystem 32-34. En vanlig prøvebuffer oppskrift (1x) inkluderer: 10% (vekt / volum) sukrose, 50 mM DTT, 2% (vekt / volum) SDS, 62,5 mM Tris-Cl pH 8,8, 0,0004% (w / v) bromfenol blå 31 . Vi foreslår at du forbereder en 1,1x lager som utelater DTT. 1/10 volum av 500 mM DTT bør tilsettes til prøven før SDS-PAGE (se nedenfor). Mange kommersielt tilgjengelige SDS-PAGE-systemer er også tilgjengelig; disse kan inkludere systemspesifikke sample buffere.
    8. Legg SDS-PAGE-prøvebuffer uten reduksjonsmiddel (for å redusere frigjøringsav antistoffkjedene fra perlene), og inkuberes i 5-10 minutter ved romtemperatur med omrøring.
      MERK: Dette vil påvirke de fleste affinitet basert samhandling, slipper de fangede proteinene i supernatanten. Mer vedvarende interaksjoner kan ha nytte av forhøyet temperatur for utgivelse (typisk 70 ° C er tilstrekkelig).
    9. Samle og lagre supernatanten. Prøvene kan fryses ved -20 ° C i kort lagring (noen få dager) eller -80 ° C i lengre lagring inntil analyse er ønsket.
    10. Utsette prøvene for SDS-PAGE etterfulgt av proteinfarging ved anvendelse av standardteknikker 31. MS kan anvendes for å karakterisere prøvesammensetningen 1. Individuelle proteinbånd kan skjæres ut for identifikasjon eller hele prøven kan bli karakterisert ved en enkelt analyse av electrophoresing prøven bare kort (4-6 mm inn i gelen) og behandling av alle proteinene i prøven sammen som en "gel plugg. '
      MERK: Legg DTT før innledetting elektroforese. Hvis du planlegger å gå videre til MS, kan prøvene være alkylerte etter elektroforese 35; imidlertid, er det ofte mer praktisk å alkylat før elektroforese 36.

Representative Results

Figur 1, panel jeg illustrerer at cryomilling og magnetiske kuler kan arbeide sammen for å forbedre prøvekvalitet. Paneler IA-C viser at det materiale som omfatter den uløselige medium som anvendes for affiniteten fangst kan påvirke den gjenopprettede proteome 19. For proteinet av interesse, renset FLAG-merket bakteriell alkalisk fosfatase (BAP), ble tilsatt i humane celleekstrakter. BAP forventes ikke å spesifikt samhandle med og copurify humane proteiner. Signaturen til copurifying proteiner, bedømt ved SDS-PAGE og Coomassie-farging, varieres avhengig av mediet som brukes. Mikron stilt magnetiske kuler viste det reneste profilen, noe som indikerer et relativt lavt nivå av ikke-spesifikt protein adsorpsjon. Paneler ID og IE illustrerer at fremgangsmåten for cellelysering kan også påvirke den gjenopprettede proteome. I det viste eksempel brukes et endogent proteinkompleks (NEXT-kompleks 37), ble underkastet affinitets-capture fra cyromilled eller ultralydbehandlet celle ekstrakter 19. Færre høye masse forurensninger ble observert når celleekstrakt ble fremstilt fra cryomilled celle pulver.

En utfordring ved bruk av affinitet fangst å studere endogene protein komplekser er at det kan være vanskelig å skille bona fide fysiologiske interactors av proteinet av interesse fra falske positiver (FPS). FPS kan oppstå fra mange kilder, inkludert ikke-spesifikk adsorpsjon til rør og fartøyer, affiniteten medium, antistoffet eller affinitetsliganden, og / eller til proteinet av interesse i seg selv. Som et resultat, må betydelig innsats være viet til å optimalisere digitaliseringsprosessen. Påvisning av FPS forblir en sentral utfordring for som et stort antall ulike verktøy har blitt utviklet, herunder eksperimentell 38-40 og beregningsorientert tilnærminger 41-43, hver med ulike fordeler og ulemper. I våre egne eksperimenter vi tidligere bemerket et mønster av FP proteinbinding, oppnådd etter inkubering av α-FLAG magnetisk medium med kontrollcelle-ekstrakter, som var forskjellig fra det man fikk i nærvær av 3xFLAG-merkede proteiner. Videre kan disse FPS bli frigitt fra mediet ved inkubasjon med 3xFLAG peptid 7. Denne observasjonen er i overensstemmelse med opportunistisk binding av fps til α-FLAG paratop i fravær av beslektet epitop. Forståelse av innholdet i denne FP bakgrunn er viktig siden mange studier bruker et ukodet "foreldrecellelinje" som en mock-kontroll for affinitet fangst; disse kontrollene kan derfor være hensiktsmessig å bestemme spesifisiteten av interaksjoner med tagget protein. For å finne ut bakgrunnen binding bidratt med vår tilhørighet medium når antistoff paratopes er opptatt eller ikke, vi gjennomførte mock affinitet fangst eksperimenter med α-FLAG magnetisk medium og HEK 293T celleekstrakter (ingen merket protein uttrykt) i nærvær eller fravær av en 3xFLAGpeptid pigg inn. Resultatene er vist i figur 1, panel II. I korthet ble α-FLAG magnetisk medium inkubert i celleekstrakter (av ≳10 mg / ml totalt protein) inneholdende 500 mM NaCl og 1% volum / volum Triton X-100 i 20 mM HEPES-Na pH 7,4 i 30 minutter. Mediet ble deretter inkubert med 1 mg / ml peptid 3xFLAG til kompetitivt å forskyve eventuelle proteiner bundet til α-FLAG paratop fritt eller med SDS-PAGE-prøvebuffer for å oppnå en denaturering eluering. I tillegg ble det samme eksperiment utført når celleekstrakter ble tilsatt med 1 ug / ml og 10 ug / ml 3xFLAG peptid. Alle de eluerte fraksjonene ble utsatt for SDS-PAGE og sølvfarging. Det ble observert at i fravær av sin beslektet epitop, betyr α-FLAG medium fange et påvisbart nivå av bakgrunns proteiner som kan bli eluert med 3xFLAG peptid - i eksempelet som er vist i figur 1-II, ble det observert en dominerende arter på mellom 37 og 50 kDa. Mønsteret eluert medSDS-PAGE-prøvebuffer var sammenlignbare, med flere fremstående arter. Imidlertid, i nærvær av 1 pg / ml 3xFLAG peptid, FP binding til affiniteten medium ble fjernet til under påvisningsnivået, og ble ikke observert i enten native eller denaturerende eluering fraksjoner. Dette resultatet tyder på at ubebodde antistoff paratopes kan være promiskuøse i fravær av sin beslektet epitop og bidra vesentlig til proteomet innhentet under affinitet fangst selv for antistoffer som binder sin epitop på høy affinitet, slik tilfellet er for 3xFLAG / α-FLAG M2 sammenkobling. Det også suggestd at meget strenge betingelser ved anvendelse av høyt saltinnhold, ofte valgt for å redusere ikke-spesifikk binding, kan være ineffektiv i fravær av antigen / antistoff-interaksjoner. For å følge opp gjennomførte vi en lignende eksperiment inkludert analyse av SDS-PAGE samt kvantitative MS (Fig. S1). Av de 347 proteiner kvantifiseres, observerte vi at hver protein redde for en (falsk discoveldig rate = 1%; Tabell S1) ble forbundet med den 3xFLAG-merket agn protein, sammenlignet med et peptid 3xFLAG tilsatt kontrollprøve. Disse resultatene tyder på at i våre eksperimenter det overveldende flertallet av proteiner observert er sannsynlig å co-rense med tagget protein eller er off-target biprodukter av ubebodde α-FLAG paratopes. Vår erfaring er høyt signal-til-støy affinitet fangst resultater eksemplifisert i SDS-PAGE og protein flekker av en diskret mønster av skarpe, rike og omtrent støkiometriske band samt en mangelen på bakgrunnsfarging fra andre svakere band; tallrike eksempel på dette prinsipp kan sees i referanse 11.

Motivet for å bruke en PTFE isolator (som anbefales) når cryomilling er å redusere frekvensen av oppvarming av glasset under fresing, redusere byrden av gjentatte LN 2 kjøling under maleprosessen, og redusere graden av isdannelse i glasset. Dette letter konsistent maleytelse og letter håndteringen av cellen pulver. Eksempel isolatorer kan finnes i referanse 27 (pucker) og som er avbildet i Figur 2, under (sleeve-og-puck).

Figur 1
Figur 1: Velg Representant Resultater. (I) Dette panelet har blitt modifisert fra referanse 19. Coomassie blå farget SDS-polyakrylamidgel. (Venstre) Micron stilt magnetisk perler viser lavere off-target bindende enn agarose-baserte medier. (A) magnetiske kuler; (B) tradisjonell agarose; (C) jern impregnert (magnetisk) agarose; hver koblet til anti-FLAG M2-antistoffer og brukes til å fange FLAG-merket bakteriell alkalisk fosfatase (BAP; merket) tilsatt i utdrag produsert fra cryomilled HEK-293 celler. Agarose-baserte renselserviste høyere nivåer av ikke-spesifikk adsorpsjon (umerkede bånd). (høyre) Utdrag produsert fra cryomilled HeLa-celler som utviser lavere off-target adsorpsjon på antistoff-coupled magnetiske kuler enn de som produseres av ultralydbehandling når den brukes til å rense en endogen proteinkompleks. LAP-merket 44 RBM7 ble affinitet tatt med magnetiske kuler koblet til polyklonale anti-GFP antistoffer for å rense NESTE kompleks 19,37 (D) Pakk produsert fra cryomilled pulver; (E) ekstrakter fremstilt ved sonikering av intakte celler. Den vertikale svarte feltet fremhever en region av gelen der høye masse uspesifikke interactors er observert å være anriket på Prøve ble fremstilt ved ultralydbehandling. De svarte pilene angitte forventede konkrete interactors (merket). Bands observert ~ 50 kDa i baner D og E tilskrives llama IgG tunge kjettinger. (II) sølvfarget SDS-polyakrylamid-gel. (Std.) En mock affinitet fangst utført på HEK-293T-celle-ekstrakter på vanlig måte. Etter fangst, ble eluering av bundet materiale oppnådd via (N) ikke-denaturerende eluering med 1 mg / ml 3xFLAG peptid eller (D) denaturering eluering i SDS-PAGE prøvebuffer; (PB 1) som Std. men den 3xFLAG peptid ble inkludert i ekstraksjonsløsningen ved 1 ug / ml for å blokkere α-FLAG paratopes på affiniteten medium; (PB 10) som PB 1, men i nærvær av 10 ug / ml 3xFLAG peptid. IgG-relaterte band og 3xFLAG peptid er merket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Sleeve-og-puck PTFE isolator. En 250 ml krukke PTFE er vist (1). En 50 ml av rustfritt stål frese krukke (2) passer inne i PTFE glasset (3) og tilveiebringeranledning til å forlate male glasset installert i møllen mellom syklusene. En øvre PTFE isolator puck (2) brukes mellom klemmeenhet og glasset lokket. For å kjøle den installerte glasset og isolasjonen (3), blir LN 2 legges direkte inn i kroppen av isolatoren, rundt glasset. Den neste syklus av fresing kan så igangsettes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

reagens Forslag Konsentrasjon Merknader
Natriumklorid 0,1-0,5 M Høye konsentrasjoner (> 300 mM) har en tendens til å forbedre utvinning av totalt protein og holde bakgrunn lav, men kan strippe bort noe annet er stabil interskuespillere. Konsentrasjoner på under 150 mm er vanligvis ikke effektive for å redusere ikke-spesifikk bakgrunn.
ammoniumacetat 0,2-2 M Et salt, bestående av to buffere, som gir en nøytral pH-verdi løsning 57. Høyere konsentrasjoner stabilisere noen proteinkomplekser. Sure løsninger kan skyldes gamle, feilaktig lagret krystallinske aksjer på grunn av ammoniakktapet. Ingen ytterligere pH-buffer eller salter er nødvendige i ekstraksjonsmidler inneholdende ammoniumacetat. Kan kombineres med NaCl for å modulere oppnådde resultater.
Tween 20 0,1% volum / volum Et ikke-ionisk detergent 58; vanligvis kombinert med NaCl.
Triton X-100 0,5-1% v / v Et ikke-ionisk detergent 58; vanligvis kombinert med enten NaCl eller NH 4-CH 3 CO 2 H
CHAPS 5 mm En zwitterionisk vaskemiddel 58 </ Sup>; vanligvis kombinert med NaCl.
sarkosyl 1 mm En anionisk vaskemiddel 58 som reduserer bakgrunns og kan kle av stabile komplekse komponenter, potensielt avslørende binær-tilkobling; vanligvis kombinert med NaCl.
Tris-Cl 20 mm pKa på 8,8 ved 4 ° C, 8,1 ved 25 ° C.
(PH 8,0)
HEPES-Na 20 mm pKa på 7,8 ved 4 ° C, 7,5 ved 25 ° C. NaOH eller KOH som brukes for pH-likevekt, avhengig av salt (f.eks, NaCl, KCl, eller CH 3 CO 2 K) anvendes i ekstraksjonsmidlet.
(PH 7,4)

Tabell 1: Noen foreslo reagenser nyttig for rensing av protein komplekser. Denne tabellen lists noen reagenser vi har funnet nyttig for rensing av protein komplekser fra humane cellelinjer, med foreslåtte arbeider konsentrasjoner. En typisk ekstraksjonsmiddel formuleringen inneholder en pH-buffer, et salt, og et vaskemiddel 1,11,24,45-48. Beste praksis er å identifisere den minst kompleks blanding av reagenser som gir det ønskede resultat.

Figur S1
Figur S1: Bland Etter Rensing (kartet-) SILAC analyse av falske positiver. I. Prinsippskisse: I dette forsøket 3xFLAG-merket ORF2p protein komplekser (uttrykt fra pLD401) ble renset fra tung og lys-merket HEK-293T celler 7, henholdsvis. Lyset merket celleekstrakt ble tilsatt 3xFLAG peptid å hindre affinitet fangst av 3xFLAG-taggede ORF2p av kompetitiv hemming; dette forventes ikke å blokkere binding av proteiner som kan oppstå ikke-spesifitisk med det magnetiske medium eller de ikke-paratopiske strukturer av antistoffet. Etter eluering av de magnetiske kuler, de tunge og lette prøvene ble blandet, etterrensing og analysert med kvantitativ MS (MAP SILAC-39) for å bestemme den fraksjon av proteiner forbundet med enten prøven; videre metodologisk detalj lokalisert i tabell S1. II. Sølvfarget gel som viser at lys- og tunge-merkede materialer gir sammenlignbare resultater (sammenlign med L H), og at rensingen utføres i nærvær av 3xFLAG pigg-i (LI) ble kompetitivt inhibert. Nedenfor en Coomassie Blå G-250 farget gel plugg som består av de blandede H og LI fraksjoner, før gel-basert proteomikk analyse, som beskrevet i tabell S1. Klikk her for å laste ned en større versjon av dette tallet.

Tabell S1:MAP-SILAC. Dette arket inneholder data innhentet ved gjennomføring av MAP-SILAC eksperiment beskrevet i figur S1. Klikk her for å laste ned denne tabellen.

Discussion

Disse tre protokollene arbeide sammen for å (1) forberede celler for solid-state brudd av cryomilling, (2) oppnå brudd i en planet ball mill, og (3) produsere uttrekk fra celle pulver til interesse fange et protein av interesse i kompleks med dets fysiologiske interactors. Mange forskjellige cellelyse teknikker eksisterer, inkludert mekaniske / fysiske tilnærminger ansette knusing innvirkning, klipping, og / eller trykk, samt kjemiske / enzymatiske metoder, hver med ulike fordeler og ulemper 49,50. Hver etterforsker oppfordres til å utforske metoder som passer best for sine analyser, men husk at en valgt tilnærming for celle brudd og protein utvinning er sannsynlig å introdusere skjevheter 51,52 nødvendig empirisk optimalisering (omtalt nedenfor). Mekaniske metoder kan produsere høy varme og / eller skjærkrefter som kan forstyrre protein komplekser. Cryomilling unngår varmeeffekter på grunn av anvendelse av LN 2 nedkjøling av prøver for than varigheten av prosessen. Planetkulemøller er forstått å stole på støt- og friksjonskrefter, blant annet skjærspenning, som komponenter i partikkelstørrelsesreduksjon 53,54. På innstillingene rapporterte vi har ikke observert degenerasjon av protein komplekser. Faktisk har vi trukket ut og hentet tilsynelatende intakte ~ 50 MDA atom pore komplekser 11 og enzymatisk aktive retrotransposons stiller høyere spesifikk aktivitet enn preparater som syssels 'milde' vaskemiddel-baserte lyse syv. Kjemiske / enzymatiske fremgangsmåter for cellelysering beheftet med den begrensning at innholdet i cellen blir sluppet ut i en in vitro miljø som støtter ødeleggelse av cellemembraner og strukturelle makromolekyler, men kan ikke være egnet for opprettholdelse av integriteten til proteinkomplekset (es ) av interesse. Ofte, hverken bestanddelene av kompleksene dannet med protein av interesse eller de betingelser som er nødvendig for å stabilisere målet komplekser erkjent på forhånd. En stor fordel med solid-state fresing er at brudd og utvinning er frakoblet, tillater kildematerialet for å være forberedt uten tilsatt væske, lagret (ved -80 ° C eller lavere), samlet, og praktisk hentet for on-demand eksperimentering; for eksempel, for å utforske optimalisert in vitro betingelser for affinitet fangst. Protein interaksjoner er mest stabile ved høy konsentrasjon 55,56, derfor minimere volumet av ekstraksjonsmidlet kan være fordelaktig for å bevare fysiologiske interaksjoner. På den annen side er det praktiske hensyn - til proteinkomplekser trenger å bli fordelt ut av cellene og inn i en ikke-viskøs vandig fase, fri for uoppløselige aggregater, for å blande målet komplekser med affinitet medium. Videre er noen standardisering og kontroll over den in vitro miljø (pH, saltkonsentrasjon, etc.) som er nødvendig for systematisering og reproduserbarhet. Vi finner at ekstrakter produced i fortynningen området 1: 4-1: 9 (w: v) tilfredsstiller praktiske og teoretiske hensyn, noe som ga bedre resultater. I tillegg er den optimale andel av celleekstrakt til interessemellom må bestemmes. Dette gjøres empirisk ved titrering av ekstraktene med varierende mengder av affinitet medium og kan ha påvisbar virkning på signal-til-støy-forholdet av eksperimentet, nærmere diskutert nedenfor. En utmerket uttømming av målproteinet er typisk ≥70% av den løselige fraksjon av målproteinet, men> 90% er ønskelig, og kan være oppnåelige med forsiktig parameterisering av ekstraksjonsbetingelser. Mange slike praktiske hensyn er dekket i referanse 1. Paramagnetiske kuler er manipulert ved hjelp av neodymmagneter i et spesialisert mikrosentrifugerør holder, selv om hjemmelagde alternativer er levedyktig. Når de plasseres i holderen, perler samle seg på siden av røret under påvirkning av det magnetiske felt. Oppløsninger kan deretter fjernes uten disturbing perlene.

En begrensning av den presenterte cryomilling protokollen, utviklet med planetkulemølle som brukes her (se tabell of Materials), er at et minimum av materiale som er nødvendig for effektivt å mølle og gjenopprette celle pulver ved hjelp av denne anordning (> 1 g). Slike mengder kan lett oppnås med mange mikroorganismer, cellelinjer, og modellorganismer, og kan også ofte oppnås med vev skåret ut fra forsøksdyr. Imidlertid kan visse cellelinjer være meget vanskelig å vokse i overflod og animalsk vev kan være mangelvare. Mindre mengder av materialet kan forhold malt ved hjelp av andre enheter som bruker mindre beholdere, men potensielt på bekostning av pulveret finhet oppnådd. I tillegg kan kostnaden av mekaniske anordninger frese være uoverkommelig kostbart for noen laboratorier. Cryomilling kan oppnås ved hjelp av en rekke alternative oppsett 14-19, inkludert de fleste rimelig for hånd med en pestle og mørtel, selv om brudd effektivitet synker betraktelig. Affinity fange protokoller vanligvis tar sikte på en høy virkningsgrad av cellelysering for å lette maksimal proteinekstraksjon i oppløsning og dermed maksimal potensial for fangst av mål-proteinkomplekser. På den annen side har det blitt demonstrert for gjær in vitro spleising ekstrakter at maksimal lysering ikke kan likestille med maksimal in vitro biokjemisk aktivitet 57,58. Vi har ikke observert slike problemer i systemene vi har testet så langt, og derfor ikke med vilje begrense vår celle brudd når cryomilling. Likevel bør denne muligheten tas i betraktning når du optimaliserer for in vitro enzymatiske analyser. Selv om cryomilling er en svært effektiv metode for å bryte cellene, en begrenset mengde av ultralydbehandling ofte fordeler produksjons homogene hele celleekstrakter fra pattedyrvev fordi inhomogene aggregater kan noen ganger observeres ved visuell kontroll: vanligvisi ekstraksjonsbetingelsene ved bruk av lav til moderat salt (100-300 mM) og ikke-ionisk detergent (0,1-1% v / v) konsentrasjon. Fordi vi observert at tilstedeværelsen av disse aggregater kan redusere utbyttet og / eller kvaliteten av den etterfølgende affinitet fangst, vi rutinemessig gjennomføre ultralydbehandling for å dispergere dem (selv når de ikke er observert med det blotte øye). Aggregatene er i overensstemmelse med agglomererte membranfragmenter, kan sammenlignes med de som tidligere er rapportert i ekstrakter fra oppmalte gjærceller 58. Sonikering blir også brukt i noen protokoller for å skjære DNA, og frigjøre kromatin fragmenter i oppløsning, men graden av ultralydbehandling anvendt i denne protokollen ikke nevneverdig fragment DNA. Den begrensede tilgjengelighet (eller de høye kostnadene) av en utmerket affinitet ligand eller antistoff mot det bestemte protein av interesse kan være en annen hindring. Et bredt utvalg av kommersielt tilgjengelige tilhørighet reagenser kan utnyttes når modellorganisme er mottagelig for genomisk tagging eller transfection med ektopiske ekspresjonsvektorer, og som tillater ekspresjon av proteiner av interesse som affinitets-merket fusjoner. Imidlertid har produksjon av tilpassede antistoffer blitt stadig mer gjennomførbart og både polyklonale og monoklonale antistoffer kan utføre utmerket i affinitet fangst applikasjoner. Disse mange hensyn er også dekket i større detalj i referanse 1.

Eksempler på hvordan de cellelysemetoden og valg av affinitet medium kan påvirke resultatene er illustrert i figur 1. Eksempler på virkninger som utøves av forskjellige ekstraksjonsmidler kan ses i henvisningene 1,11,24. Fordi disse og andre eksperimentelle parametere påvirker kvaliteten på affinitet fangst, noe som gjør det vanskelig å skille FPS, til samlinger av "perle proteom" og beregningsorientert tilnærminger eliminere uspesifikke forurensninger har blitt utviklet for å bistå i å identifisere fps 40-43. Likevel, slike tilnærminger bare substitUte for optimal prøveopparbeidelse i begrenset grad 59. Observerer beste praksis og empirisk optimalisere affinitet fangst eksperimentet vil gi den høyeste kvalitet prøver for nedstrøms analyser, nærmere omtalt nedenfor. En enkelt implementeres praksis som kan forbedre prøve renhet er innfødt eluering. Native eluering blir oftest anvendt for å oppnå affiniteten isolerte proteinkomplekset, intakt, for ytterligere eksperimentering; men som det ofte forbedrer prøve renhet, det kan også brukes av denne grunn alene. Imidlertid, som vist i figur 1, panel II, kan evnen til naturlig eluering for å forbedre prøve renhet er avhengig av en nøyaktig titrering av mengden av affinitet medium til overflod av målproteinet i celleekstrakt - når mediet er i overskudd , ubebodde paratopes kan tillate off-target opphopning av FP proteiner observer i opprinnelig eluerte fraksjoner. Bruke reagenser og prosedyrer som er beskrevet her, det hsom er vår erfaring at den største bidragsyteren av FPS til våre eksperimenter er merket protein i seg selv en gang fjernet fra rammen av levende celle. (Fig. 1.II og S1 fig.). I slike tilfeller, foreldrecellelinje kontroll som gir irrelevante proteom i fravær av antigenet er av noen praktisk verdi; likeså for tag-bare eller pigg-kontroller som er blottet for alt annet enn målet antigen. Derfor, når praktisk vi implementere I-DIRT 7,38, som direkte måler akkumulering av post-lysis protein interaksjoner som bruker kvantitative MS. Som nevnt i trinn 3.2.7 i protokollen, vil prosedyrer for opprinnelig eluering varierer med detaljene i affinitet systemet som brukes. Native eluering er oftest oppnås ved konkurranse forskyvning av merket protein kompleks eller proteolytisk spalting av koden, frigjøre komplekset fra affinitet medium. Flere interesse systemer som består av små epitop koder finnes, for som epitopen i seg selv er tilgjengelig som peptid nyttig for konkurranse eluering av merket protein komplekser 60. Likeledes flere proteaser er tilgjengelige for å spesifikt spalte beslektede områder strategisk plassert i affinitet tagged fusjonsproteiner 61. Avhengig av detaljene i de valgte affinitet systemer, kan den aktuelle eluering ordningen vedtas.

Vanligvis, vil kvaliteten av de oppnådde resultater bli betydelig påvirket av kvaliteten av prøvepreparering. Det er viktig å arbeide nøyaktig og presist gjennom hvert trinn av disse protokollene, og så raskt som mulig, og samtidig opprettholde omhu og presisjon. Det er tilrådelig å spore oppdeling av proteinet av interesse gjennom hvert trinn for å forstå effektiviteten av hver manipulasjon. For eksempel: hvordan rikelig er proteinet av interesse i cellen eller vevet i spørsmålet? Kanskje proteinet under studie (og dets komplekser) vil være vanskelig å karakterisere masse-spektrometri grunn av lav overflod. Hvis de rensede komplekser kan påvises ved generell protein flekker (ca. nanogram range), er massespektrometri sannsynlig å lykkes. Dersom det innfangede proteinet av interesse bare kan påvises ved sensitive forbedret kjemiluminescerende western blotting (ca. pikogram område), er mindre sannsynlig å være effektive massespektrometri. Selv om proteinet av interesse er rikelig i cellen, hvor rik er det i cellen produserte ekstrakt? Gjør proteinet partisjonen til løsningen eller det er i pellet? Hvis det siste, kan en ny utvinning løsning utarbeides som kan øke utvinningen. Når celleekstrakt er kombinert med affinitet medium, hvor effektivt blir proteinet fanges? Har proteinet fortsatt være bundet gjennom Senere vaskes? Hva om andre copurifying proteiner? Ved å lagre en porsjon av hver prøve på hensiktsmessige trinnene i protokollen disse spørsmålene kan lett bli besvart, typisk ved western-blotting mot proteinet av interesseeller generell proteinfarging, men andre assays kan også være egnet. Optimalisering av hvert trinn vil forbedre utbyttet og renheten av fanget komplekser, selv om det kan være en avveining må gjøres i å maksimere en egenskap eller den andre.

En typisk anvendelse av affinitet fange for mange forskere er å identifisere kandidat in vivo interactors for et lite antall av proteiner av interesse; disse kandidatene blir ofte utsatt for validering av ortogonale tilnærminger in vivo for å demonstrere den biologiske betydningen av de fysiske interactors. Affinity fangst er også ansatt i high-throughput studier for å generere lister over copurifying proteiner observert på en (nesten) proteom- basis, tilrettelegging beregnings slutninger om antatte in vivo komplekser. Tallrike eksempler på slike undersøkelser kan finnes i litteraturen. Denne tilnærmingen avstår optimalisering av avtalene om fangst for en gitt mål i favør av å utforske manny mål; Som sådan, inferred komplekser selv er sjelden hentes fullt intakt og svært ren i en gitt prøve. Snarere er de delvis overlapper i komposisjoner observert mellom mange forskjellige affinitet-fanget prøvene brukt som grunnlag for slutninger 42. Begge tilnærmingene bidrar verdifulle data til vår forståelse av interactome. Likevel, en stor fordel med affinitet fangst er at det ikke tilbyr ofte mulighet til å få komplekser intakt og høyt renset, forutsatt at arbeidet er gjort for å optimalisere prosedyren. Vi tror at fremtiden for tilnærming ligger i å øke brukervennlighet og effektivitet for å optimalisere fangst av endogene protein komplekser 11, for mer nøyaktig vurdering av skalaen av fysiologiske interactors og hyppigere bruk i videre nedstrøms biokjemiske, enzymological og strukturelle studier, f.eks refererer 7,9,23.

Acknowledgments

Vi takker professor Brian T. Chait for hans uvurderlige råd, støtte og tilgang til MS instrumentering, samt Ms Kelly R. Molloy for god teknisk støtte. Vi takker Ms. Kelly Bare for støtte med kopi redigering. Dette arbeidet ble støttet delvis av NIH tilskudd P41GM109824, P41GM103314, og P50GM107632.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Growth media & cell culturing implements For producing frozen cells (I)
500 cm2 culture dishes Corning 431110 For producing frozen cells (I)
Large beaker (1-2 L) For producing frozen cells (I)
Rectangular ice pan  Fisher Scientific  13-900-747 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
Phosphate buffered saline (PBS) For producing frozen cells (I)
Large cell scrapers Fisher Scientific  08-100-242 For producing frozen cells (I)
Liquid nitrogen  For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
50 ml conical tubes Corning 352098 For producing frozen cells (I), & cryomilling (II)
20 ml Luer lock syringe For producing frozen cells (I)
Leur lock syringe caps www.dymax.com T11182 For producing frozen cells (I)
Refrigerated centrifuge For producing frozen cells (I)
50 ml tube rack, 4 position For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Styrofoam box For producing frozen cells (I), cryomilling (II), & affinity capture (III)
Planetary ball mill, PM 100  Retsch 20.540.0001  For cryomilling (II)
Stainless steel milling jar, 50 ml  Retsch 01.462.0149 For cryomilling (II)
Stainless steel milling balls, 20 mm Ø  Retsch 05.368.0062 For cryomilling (II)
Lid gasket: PFA encapsulated spring energized seal, 2.62 mm 44.63 mm   www.marcorubber.com T1044-2.62x44.63 For cryomilling (II)
mini-LN2 decanter homemade see Ref 19 For cryomilling (II)
250 ml PTFE jar insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request
PTFE puck insulator (optional) homemade The Rockefeller University For cryomilling (II); can be produced by The Rockefeller University High Energy Physics Instrument Shop, or design blueprints provided, upon request.
5 bar/500 kPa pressure relief valve (optional) http://www.leeimh.com/ 558 series check valve For cryomilling (II)
1.5-2 ml microfuge tubes For affinity capture (III)
Extractant For affinity capture (III)
Complete EDTA free protease inhibitor cocktail tablets Roche Applied Science 11873580001 For affinity capture (III)
Vortex mixer For affinity capture (III)
Ice bucket For affinity capture (III)
Microtip sonicator, Q700 Qsonica Q700 For affinity capture (III)
low intensity 1/16” microtip probe Qsonica 4717 For affinity capture (III)
Bench-top refrigerated microcentrifuge For affinity capture (III)
Dynabeads M-270 Epoxy Thermo Fisher 14302D For affinity capture (III)
Antibody or affinity ligand coupled to Dynabeads homemade For affinity capture (III); see reference 19
Sample rotator  For affinity capture (III)
Neodymium magnet Life Technologies 123-21D  For affinity capture (III)
SDS-PAGE sample buffer (no reducing agent) For affinity capture (III)
DTT For affinity capture (III)
SDS-PAGE system For affinity capture (III)
SDS-polyacrylamide gel For affinity capture (III)
Protein Stain For affinity capture (III)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. LaCava, J., Molloy, K. R., Taylor, M. S., Domanski, M., Chait, B. T., Rout, M. P. Affinity proteomics to study endogenous protein complexes: Pointers, pitfalls, preferences and perspectives. BioTechniques. 58 (3), 103-119 (2015).
  2. Devos, D., Russell, R. B. A more complete, complexed and structured interactome. Curr Opin Struct Biol. 17 (3), 370-377 (2007).
  3. Aitchison, J. D., Rout, M. P. The interactome challenge. J Cell Biol. 211 (4), 729-732 (2015).
  4. Nie, Y., Viola, C., et al. Getting a grip on complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
  5. Bonetta, L. Protein-protein interactions: Interactome under construction. Nature. 468 (7325), (2010).
  6. Perkel, J. M. Protein-Protein Interaction Technologies Toward a Human Interactome. Science. 329 (5990), 463-465 (2010).
  7. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Affinity Proteomics Reveals Human Host Factors Implicated in Discrete Stages of LINE-1 Retrotransposition. Cell. 155 (5), 1034-1048 (2013).
  8. Liu, J. -J., Bratkowski, M. A., Liu, X., Niu, C. -Y., Ke, A., Wang, H. -W. Visualization of distinct substrate-recruitment pathways in the yeast exosome by EM. Nat Struct Mol Biol. 21 (1), 95-102 (2014).
  9. Shi, Y., Pellarin, R., et al. A strategy for dissecting the architectures of native macromolecular assemblies. Nat Methods. 12 (12), 1135-1138 (2015).
  10. Roque, A. C. A., Lowe, C. R. Affinity chromatography: History, perspectives, limitations and prospects. Methods in Molecular Biology. 421 (1), 1-21 (2007).
  11. Hakhverdyan, Z., Domanski, M., et al. Rapid, optimized interactomic screening. Nat Methods. 12 (6), 553-560 (2015).
  12. Huttlin, E. L., Ting, L., et al. The BioPlex Network: A Systematic Exploration of the Human Interactome. Cell. 162 (2), 425-440 (2015).
  13. Hein, M. Y., Hubner, N. C., et al. A Human Interactome in Three Quantitative Dimensions Organized by Stoichiometries and Abundances. Cell. 163 (3), 712-723 (2015).
  14. Smucker, R. A., Pfister, R. M. Liquid nitrogen cryo-impacting: a new concept for cell disruption. Appl Microbiol. 30 (3), 445-449 (1975).
  15. Schultz, M. C., Choe, S. Y., Reeder, R. H. Specific initiation by RNA polymerase I in a whole-cell extract from yeast. Proc Natl Acad Sci USA. 88 (3), 1004-1008 (1991).
  16. Schultz, M., Hockman, D., Harkness, T., Garinther, W., Altheim, B. Chromatin assembly in a yeast whole-cell extract. Proc Natl Acad Sci USA. 94 (17), 9034-9039 (1997).
  17. Stevens, S. W., Abelson, J. Yeast pre-mRNA splicing: Methods, mechanisms, and machinery. Method Enzymol. 351, 200-220 (2002).
  18. Oeffinger, M., Wei, K. E., et al. Comprehensive analysis of diverse ribonucleoprotein complexes. Nat Methods. 4 (11), 951-956 (2007).
  19. Domanski, M., Molloy, K., et al. Improved methodology for the affinity isolation of human protein complexes expressed at near endogenous levels. BioTechniques. 0 (0), 1-6 (2012).
  20. Sinclair, B. To bead or not to bead: Applications of magnetic bead technology. Scientist. , (1998).
  21. Cristea, I., Williams, R., Chait, B., Rout, M. Fluorescent proteins as proteomic probes. Mol Cell Proteomics. 4 (12), 1933-1941 (2005).
  22. Di Virgilio, M., Callen, E., et al. Rif1 prevents resection of DNA breaks and promotes immunoglobulin class switching. Science. 339 (6120), 711-715 (2013).
  23. Heider, M. R., Gu, M., et al. Subunit connectivity, assembly determinants and architecture of the yeast exocyst complex. Nat Struct Mol Biol. 23 (1), 59-66 (2016).
  24. LaCava, J., Fernandez-Martinez, J., Hakhverdyan, Z., Rout, M. P. Protein Complex Purification by Affinity Capture. Budding Yeast: A Laboratory Manual. 2016 (21), 383-397 (2016).
  25. Freshney, R. I. Culture of Animal Cells. , John Wiley & Sons. (2011).
  26. Uphoff, C. C., Drexler, H. G. Basic Cell Culture Protocols. 946, Humana Press. (2013).
  27. Taylor, M. S., LaCava, J., et al. Characterization of L1-Ribonucleoprotein Particles. Transposons and Retrotransposons. 1400 (Chapter 20), 311-338 (2016).
  28. Obado, S. O., Field, M. C., Chait, B. T., Rout, M. P. High-Efficiency Isolation of Nuclear Envelope Protein Complexes from Trypanosomes. The Nuclear Envelope. 1411, 67-80 (2016).
  29. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. , 1–3at Retsch GmbH. http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/ (2014).
  30. Cristea, I. M., Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5), (2011).
  31. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63-117 (2005).
  32. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321-349 (1964).
  33. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404-427 (1964).
  34. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
  35. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  36. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A. N., Padovan, J. C., Zhang, W. MALDI Sample Preparation. , Available from: rockefeller.edu at http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html (2006).
  37. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624-637 (2011).
  38. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752-1756 (2005).
  39. Wang, X., Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46-57 (2008).
  40. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223-239 (2008).
  41. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861-879 (2010).
  42. Armean, I. M., Lilley, K. S., Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1-13 (2013).
  43. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. , (2013).
  44. Cheeseman, I. M., Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE. 2005 (266), 1 (2005).
  45. Deppert, W. R., Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839 (1999).
  46. Ugwu, S. O., Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86-108 (2004).
  47. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603-617 (2009).
  48. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359-376 (2012).
  49. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Mole Bio. 424 (Chapter 1), 3-22 (2008).
  50. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285-303 (2009).
  51. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403-3408 (2015).
  52. Glatter, T., Ahrné, E., Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  53. Zhao, Q. Q., Yamada, S., Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29-36 (1989).
  54. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B. 21 (7), 078201 (2012).
  55. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345 (1982).
  56. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597-604 (2001).
  57. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2, City of Hope. (2003).
  58. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. , Retsch GmbH. (2005).
  59. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783-784 (2007).
  60. Zhao, X., Li, G., Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093-581098 (2013).
  61. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. Protein Expr Purif. 80 (2), 283-293 (2011).

Tags

Biokjemi affinitet fangst affinitet rensing immunoprecipitation IP cryomilling celle avbrudd protein kompleks rensing

Erratum

Formal Correction: Erratum: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells
Posted by JoVE Editors on 01/20/2017. Citeable Link.

A correction was made to: Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. The References section has been updated from:

  1. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  2. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  3. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  4. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  5. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  6. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  7. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  8. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  9. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  10. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  11. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  12. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  13. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  14. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  15. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  16. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  17. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  18. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  19. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  20. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  21. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  22. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  23. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  24. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  25. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  26. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  27. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  28. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
  29. Williams, R. J., & Lyman, C. M. A neutral buffered standard for hydrogen ion work and accurate titrations which can be prepared in one minute. J Am Chem Soc. 54 (5), 1911–1912 (1932).
  30. Johnson, M. Detergents: Triton X-100, Tween-20, and More. labome.com. 3 (163) (2013).
  31. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  32. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  33. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  34. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).

to:

  1. Ball Mills - Guidelines for sample amount and ball charge. 1–3at <http://www.retsch.com/products/milling/ball-mills/planetary-ball-mill-pm-100/information-downloads/> Retsch GmbH (2014).
  2. Cristea, I. M., & Chait, B. T. Conjugation of magnetic beads for immunopurification of protein complexes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (5) (2011).
  3. Rosenberg, I. M. Electrophoretic Techniques. Protein Analysis and Purification. (4), 63–117 (2005).
  4. Ornstein, L. Disc Electrophoresis. I. Background and Theory. Ann N Y Acad Sci. 121 (A2), 321–349 (1964).
  5. Davis, B. J. Disc Electrophoresis. II. Method and Application to Human Serum Proteins. Ann N Y Acad Sci. 121, 404–427 (1964).
  6. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680–685 (1970).
  7. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., & Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nature protocols. 1 (6), 2856–2860 (2006).
  8. DeGrasse, J. A., Kalkum, M., Krutchinsky, A.N., Padovan, J. C., & Zhang, W. MALDI Sample Preparation. rockefeller.edu at <http://prowl.rockefeller.edu/protocols/in-gel-digestion.html> (2006).
  9. Lubas, M., Christensen, M. S., et al. Interaction profiling identifies the human nuclear exosome targeting complex. Mol Cell. 43 (4), 624–637 (2011).
  10. Tackett, A. J., DeGrasse, J. A., Sekedat, M. D., Oeffinger, M., Rout, M. P., & Chait, B. T. I-DIRT, a general method for distinguishing between specific and nonspecific protein interactions. J Proteome Res. 4 (5), 1752–1756 (2005).
  11. Wang, X., & Huang, L. Identifying dynamic interactors of protein complexes by quantitative mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 7 (1), 46–57 (2008).
  12. Trinkle-Mulcahy, L., Boulon, S., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183 (2), 223–239 (2008).
  13. Boulon, S., Ahmad, Y., et al. Establishment of a protein frequency library and its application in the reliable identification of specific protein interaction partners. Mol Cell Proteomics. 9 (5), 861–879 (2010).
  14. Armean, I. M., Lilley, K. S., & Trotter, M. W. B. Popular computational methods to assess multiprotein complexes derived from label-free affinity purification and mass spectrometry (AP-MS) experiments. Mol Cell Proteomics. 12 (1), 1–13 (2013).
  15. Mellacheruvu, D., Wright, Z., et al. The CRAPome: a contaminant repository for affinity purification-mass spectrometry data. Nat Methods. (2013).
  16. Cheeseman, I. M., & Desai, A. A combined approach for the localization and tandem affinity purification of protein complexes from metazoans. Sci. STKE 2005 (266), pl1 (2005).
  17. Deppert, W. R., & Lukaĉin, R. Buffers and Additives. Journal of Chromatography Library. 61 (C), 839–862 (1999).
  18. Ugwu, S. O., & Apte, S. P. The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability. Pharmaceutical Technology. 28 (3), 86–108 (2004).
  19. Linke, D. Detergents: an overview. Methods in Enzymology. 463 (34), 603–617 (2009).
  20. Zhang, J. Protein-Protein Interactions in Salt Solutions. Protein-Protein Interactions Computational and Experimental Tools. (18), 359–376 (2012).
  21. Goldberg, S. Mechanical/physical methods of cell disruption and tissue homogenization. Methods in Molecular Biology. 424 (Chapter 1), 3–22 (2008).
  22. Grabski, A. C. Advances in preparation of biological extracts for protein purification. Methods in Enzymology. 463 (C), 285–303 (2009).
  23. Dhabaria, A., Cifani, P., Reed, C., Steen, H., & Kentsis, A. A High-Efficiency Cellular Extraction System for Biological Proteomics. J Proteome Res. 14 (8), 3403–3408 (2015).
  24. Glatter, T., Ahrné, E., & Schmidt, A. Comparison of Different Sample Preparation Protocols Reveals Lysis Buffer-Specific Extraction Biases in Gram-Negative Bacteria and Human Cells. J Proteome Res. 15 (2), 679 (2016).
  25. Zhao, Q.-Q., Yamada, S., & Jimbo, G. The Mechanism and Grinding Limit of Planetary Ball Milling. KONA. 7, 29–36 (1989).
  26. Sheng-Yong, L., Qiong-Jing, M., Zheng, P., Xiao-Dong, L., & Jian-Hua, Y. Simulation of ball motion and energy transfer in a planetary ball mill. Chinese Phys. B 21 (7), 078201 (2012).
  27. Fulton, A. B. How crowded is the cytoplasm? Cell. 30 (2), 345–347 (1982).
  28. Ellis, R. J. Macromolecular crowding: obvious but underappreciated. Trends Biochem Sci. 26 (10), 597–604 (2001).
  29. Kalkum, M. Using the Retsch MM301 Ball Mill for Cryogenic Disruption of Yeast Cells. 2 City of Hope, (2003).
  30. Staley, J. Making Whole Cell Extract of Saccharomyces cerevisiae cells using the Retsch MM301 Ball Mill. Retsch GmbH: (2005).
  31. Bell, A. W., Nilsson, T., Kearney, R. E., & Bergeron, J. J. M. The protein microscope: Incorporating mass spectrometry into cell biology. Nat Methods. 4 (10), 783–784 (2007).
  32. Zhao, X., Li, G., & Liang, S. Several affinity tags commonly used in chromatographic purification. J Anal Methods Chem. 2013 (1), 581093–8 (2013).
  33. Waugh, D. S. An overview of enzymatic reagents for the removal of affinity tags. 80 (2), 283–293 (2011).
Protein Complex Affinity Capture fra Cryomilled pattedyrceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P.… More

LaCava, J., Jiang, H., Rout, M. P. Protein Complex Affinity Capture from Cryomilled Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (118), e54518, doi:10.3791/54518 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter