Abstract
Secundaire groei stam in de bomen en de bijbehorende houtvorming zijn aanzienlijk, zowel uit biologische en commerciële perspectieven. Echter, relatief weinig bekend is over de moleculaire controle die hun ontwikkeling regeert. Dit is gedeeltelijk te wijten aan de fysieke, middelen en tijd beperkingen vaak geassocieerd met de studie van de secundaire groeiprocessen. Een aantal van de in vitro technieken zijn gebruikt waarbij het gaat om planten een deel of de hele plant systeem in zowel houtige en niet-houtige plantensoorten. Echter, vragen over hun toepasbaarheid voor de studie van de secundaire groei stam processen, de weerbarstigheid van bepaalde soorten en arbeidsintensiteit zijn vaak onbetaalbaar voor medium tot high throughput toepassingen. Ook als we kijken naar steel ontwikkeling en houtvorming secundaire de specifieke kenmerken in het kader van het onderzoek mogelijk alleen meetbare worden laat in de levenscyclus van een boom na een aantal jaren van groei. Bij het aanpakken van deze uitdagingen alternatief in vivo protocols zijn ontwikkeld, genaamd-geïnduceerde somatische Sector Analysis, die de oprichting van transgene somatische weefsel sectoren direct te betrekken bij het voortgezet stengel van de plant. Het doel van dit protocol is een efficiënte, eenvoudige en relatief snelle manier om transgene plantenweefsel secundaire voor gentherapie en promotor functionele karakterisatie die kunnen worden gebruikt in verschillende boomsoorten creëren verschaffen. Hier gepresenteerde resultaten tonen aan dat transgene stam sectoren voortgezet kan worden gemaakt in alle levende weefsels en celtypen secundaire stengels van verschillende boomsoorten en hout morfologische kenmerken, zowel als promotor expressiepatronen in secundaire stengels beheersbaar zijn; vergemakkelijken gemiddeld tot hoog throughput functionele karakterisatie.
Introduction
Boom stengels bevatten een aanzienlijke hoeveelheid van de planeten biomassa en zijn van grote biologische, culturele en commerciële belang. Secundaire stengels maken leefgebied door het verstrekken van middelen en onderdak voor vele andere levensvormen. Ze leveren tal van andere diensten van de ecosystemen waarin ze wonen en werken als een hernieuwbare grondstof voor de productie van hout, pulp en papier en andere hout en niet-houtproducten. Secundaire steel ontwikkeling en meer specifiek houtvorming wordt beheerst door complexe moleculaire systeem dat de ontwikkeling van specifieke celtypen reguleren, de biochemische samenstelling van hun celwanden en hoe zij worden weefsels en organen te vormen. Ontrafeling van de moleculaire basis van secundaire ontwikkeling steel en houtvorming wordt verstoord door vele factoren, waaronder de variabiliteit van hout en steel eigenschappen binnen en tussen de stengels, lange generatie tijden, out-kruising paring systemen, hoge heterozygotie, hoge genetische belasting, seizoensgebonden slaaptoestand, lang volwassentrait vestiging periodes en de enorme fysieke grootte van volwassen bomen. Hierdoor begrip secundaire steel ontwikkeling ten opzichte van de gedetailleerde kennis van de meeste andere aspecten van de moleculaire controle van plantenontwikkeling, nog in de kinderschoenen.
Een aantal in vitro technieken zijn gebruikt voor onderzoek en begrijpen secundaire stam ontwikkeling, met name hout en secundaire vorming celwand. Deze protocollen gepaard met het gebruik van de gehele plant of deel systemen, waarbij ofwel transgene planten worden gemaakt of specifieke secundaire cellen of weefsels worden getransformeerd voor de studie van specifieke aspecten van hout en / of secundaire stuurpen ontwikkeling 1. Transgene planten kunnen worden gewonnen na genetische transformatie van diverse plantaardige weefsels en celtypen, maar het is een langzame, met name bij de analyse houtvezel eigenschappen vanwege de lange regeneratie en steel rijpingstijden (in de orde van jaren), hoge technische en arbeid demands, lage omzet van kandidaatgenen alsook problemen in het propageren van een aantal houtachtige plantensoorten. Soortgelijke technieken zijn ontwikkeld in niet-houtige modelsysteem zoals Arabidopsis die succesvol sommige van deze beperkingen te overwinnen, maar niet alle secundaire stamcellen celtypen een aanwezig in deze stammen en kenmerken in verband met seizoensinvloeden levensduur kan niet worden onderzocht bij deze soorten 2. Als alternatief plantendeel systemen, zoals Pinu s radiata calluscultures 3 vermindering van de bijbehorende termijnen. Deze werkwijzen zijn echter beperkt tot de studie van een celtype en lijden soortgelijke beperkingen als vermeld in vitro experimenten. Ook apicale stam culturen 4 waarbij hele stam explantaten hebben aangetoond belofte, maar nog niet zijn toegepast voor de studie van specifieke genen of promotoren van belang. Meer recent is een alternatief protocol waarbij hairy wortelkweken ontwikkeld voor eucalyptus en is met succes5 toegepast, deze wijze nog nodig vitro kweek, omvat zijwortels plaats stengels en tot op heden is beperkt tot één boomsoorten.
Geïnduceerde somatische sector analyse (ISSA), zoals hier beschreven, is ontwikkeld om een aantal van deze problemen het verstrekken van een medium tot high throughput screening functionele tool voor genen en promoters met een vermoedelijke rol in hout vorming en ontwikkeling secundaire stam weefsel te overwinnen. ISSA is een in vivo transformatie en screening systeem dat is ontwikkeld om de tijd voor transgene cellen en weefsels produceren een intacte secundaire stam het ondervangen arbeid verminderen, technische en doorvoer beperkingen van routinematig gebruikt in vitro werkwijzen. De hier beschreven protocollen zorgen voor het gelijktijdig creëren van honderden onafhankelijk getransformeerd weefsel sectoren en cellen in secundaire stengels binnen een korte tijd, in de boomsoorten weefsel van belang zonder gGenetic en / of milieu variatie binnen relatief korte tijd frames en de lage arbeidskosten. ISSA in vivo technieken werden voor het eerst beschreven voor het voortgezet steel 6 en bud 7 weefsels en hebben sindsdien in het voortgezet stam weefsel werd verfijnd door studies van genen en / of promoters die betrokken zijn bij cambial differentiatie en omvatten: tubuline (TON) 8, fascicline-achtige arabinogalactan ( FLA) 9, cellulose synthase (CESA) 10, secundaire celwand geassocieerd NAC domein (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 en echt interessant nieuw gen (RING) H2 eiwit 13. Deze studies werden uitgevoerd in het voortgezet stengels van populieren en eucalyptus planten en gaf inzicht in de cel morfologie, celwand chemie en genexpressie.
De hier beschreven protocollen zijn bedoeld om de ervaring een samenbrengennd kennis die is opgedaan door de ontwikkeling en toepassing van ISSA uit een reeks van gepubliceerde en ongepubliceerde studies in het afgelopen decennium. Zij richten zich op de in vivo transformatie van secundaire stam weefsels 6 en zich concentreren op studies met Populus alba 'pyramidalis' kloon, Eucalyptus globulus evenals 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis klonen. Dit document neemt onderzoekers via het protocol van het kweken van planten en bacteriën, de transformatie van stamcellen weefsels, de groei en de oogst van het weefsel, de identificatie van transgene cellen en weefsels, voorbereiding op fenotypische evaluaties en methoden voor het verzamelen en analyseren van gegevens. Terwijl technieken zijn met succes toegepast op de celwand monosaccharide samenstelling meet ook 9,11, als gevolg van de beperkte ruimte, dit document richt zich op technieken die worden gebruikt voor het meten van cellen en weefsel morfologie en het begrijpen van genexpressie patronen in het voortgezet stalleen ems. Dienovereenkomstig, het protocol zoals geschetst is geschikt voor mensen op zoek naar meer inzicht in de rol en / of expressie van genen in verband met secundaire krijgen stelen met behulp van een low cost, technisch eenvoudig, en medium tot high throughput methode.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van plantaardig materiaal
- Voorafgaand aan experimenten, werpen nieuwe zaailingen van de gewenste boomsoorten uit zaad of snijden en te groeien boom / s tot de diameter van de steel in de zone voor de experimenten bij benadering 1 cm in diameter.
Opmerking: De tijd die nodig is kan variëren als gevolg van de groei van planten tarieven dus mogelijk tussen 08:57 maanden voor deze stap.
2. Binary Vector Creation
- Voeren werk uit deze rubriek te vinden in hoofdstuk 7 in een laboratorium of kas waar Agrobacterium tumefaciens kan worden behandeld en dat de nodige persoonlijke beschermingsmiddelen voor het laboratorium voorgeschreven wordt gebruikt.
- Bereid een binaire vector die ofwel een gen van belang knockdown of overexpressie cassette en een β-glucuronidase (GUS) reportergen cassette of een promoter van belang gefuseerd met een GUS-gen afhankelijk van het type onderzoek.
Opmerking: Er zijn een aantal binaire vector backbones die in de handel of kunnen worden geproduceerd door middel van onderzoeksnetwerken evenals tal van technieken om genen en promotoren van belang in te voegen in binaire vectoren. In het kader van dit protocol is het aan de experimentator om de beslissing over de wijze waarop een binaire vector te maken te maken. - Transformeren binaire vector in een ontwapende stam van A. tumefaciens met behulp van elektroporatie of heat shock 14 en op te slaan op de juiste wijze totdat het nodig is voor experimenten.
- Herhaal stap 2.2 voor positieve en / of negatieve controles.
Opmerking: Negatieve controles moet een binaire vector die geen gen van interesse voor een gen van interesse studie en een promoter GUS voor een promoter van interesse studie omvatten. Positieve controle voor een promoter van interesse studie moet een bloemkoolmozaïekvirus 35S-promoter (CaMV35S) gefuseerd met een GUS reporter.
3. Bereiding van A. tumefaciens voor Inenting
- Ten minste een week vóór experimentation, neem een kleine hoeveelheid (ongeveer 1 pl) van A. tumefaciens voorbereid tijdens stap 2.2 en 2.3 en verspreid dun op aparte LB-medium met agar 14 platen met geschikte antibiotica voor bacteriële selectie. Groeien bij 28 ° C in een incubator om kleine kolonies vormen en bewaar bij 4 ° C totdat ze nodig.
- 48 uur voor experimenteren, dragen een kolonie van A. tumefaciens van elke plaat in afzonderlijke 50 ml met schroefdop buizen met 5 ml voorverwarmde (28 ° C) LB-medium 14 die geschikte antibiotica voor bacteriële selectie en schud bij 200 rpm op een shaker incubator gedurende ongeveer 48 uur bij 28 ° C tot mengsel is erg bewolkt.
- Tussen 4-6 uur voorafgaand aan het enten van stengels (deel 4) voeg 1 ml van de LB / A. tumefaciens mengsel in een verse 50 ml buis met schroefdop 19 ml (1:20 verdunning) vers warm (28 ° C) LB-medium met geschikte antibioticabacteriële selectie. Als optische dichtheid (OD) bij 600 nm (OD 600, zoals gemeten door spectroscopie) boven 0,1, verdund verder met warme LB totdat dit wordt bereikt.
- Plaats verdund LB / A. tumefaciens mengsel weer op de shaker incubator schudden onder dezelfde omstandigheden (200 rpm, 28 ° C) tot OD 600 tussen 0,4-0,6 en verwijderen.
- Centrifuge LB / A. tumefaciens mengsel gedurende 15 min bij 1000 xg en 4 ° C.
- Giet vloeistof en onmiddellijk mengen A. tumefaciens pellet in 1 ml gekoelde MS media 15, over te brengen naar 2 ml microbuisjes en op te slaan op ijs tot die nodig is voor enting (deel 4). Deze oplossing wordt aangeduid als Enten Media.
4. Enten van Plant Stem met A. tumefaciens
- Start experimenten tijdens de late voorjaar of de vroege zomer met behulp van planten die in paragraaf 1, die een actieve en snelgroeiende cambium hebben. Een goede diagnostisch voor eenactieve en snelgroeiende cambium is dat het floëem gemakkelijk kan worden afgepeld van het xyleem.
- Een duidelijke rechte stuk stengel nabij de basis van de plant en alle bladeren en takken te verwijderen.
- Met behulp van een scherpe scalpel (bij voorkeur No. 11) of scheermesje, maak een 1 cm 2 'cambial venster' in een vrije doorsnede van de stam door de invoering van twee verticale parallelle incisie door het floëem van 20 mm in de lengte en een 5 mm van elkaar dan een horizontale snede dat de twee verticale sneden hun basale einde verbindt.
- Schil het floëem strook door de insnijding boven het ontwikkelen xyleemweefsel belichten en voldoende Inoculatie Media toevoegen van 3,6 stap op het oppervlak van de blootgestelde ontwikkelen xyleem pipetteren (typisch 5-10 pl) nat. Onmiddellijk plaats de floëem strip.
- Bind het floëem strip aan de steel goed af met Parafilm.
- Herhaal stap 4,2-4,5 voor extra cambial vensters voor de gen (en) of de promotor (s) van belang tot eenny nieuwe cambial ramen minste 1 cm boven of onder andere cambial ramen en bij een 90 ° verschuiving.
- Volledige stappen 4,2-4,5 voor de positieve en negatieve controlevectoren (stap 2.4) zodat elk vector wordt toegevoegd aan dezelfde stam van elke plant gebruikt in het experiment.
- Monitor groei stengeldiameter regelmatig en oogst GUS-test (punt 5) als radiale groei van ten minste 5 mm waargenomen in stammen.
Opmerking: De hoeveelheid radiale groei nodig is afhankelijk van de hoeveelheid weefsel vereist voor downstream analyse.
5. Oogsten voor GUS histologisch Assay
- Accijnzen de 'cambial window' van de stengel verwijderen van elk weefsel geen deel uit van de nieuwe groei binnen de cambial venster.
- Voor studies met betrekking tot xyleem en floëem cel / weefsel morfologie rijpen, schil de floëem van het xyleem.
- Voor studies waarbij de cambial zone moet intacte promoter of expressiepatronen nog worden beoordeelded, snijd de cambial raam dwars met een scheermesje of een ander scherp mes in schijven van tussen de 0,5 en 1 mm dik.
- Plaats verwerkt cambial venster weefsels in 14 ml ronde bodem buizen en tweemaal spoelen met 0,1 M fosfaatbuffer bij pH 7 14. Controleer of het weefsel volledig ondergedompeld blijft in oplossing gedurende ten minste vijf minuten en alle overmaat oplossing wordt verwijderd eind de tweede spoeling.
- Voeg 5 ml GUS reagens (0,5 mM X-gluc (5-broom-4-chloor-3-indolyl-β-D-glucuronzuur), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 v / v, 0,5 mM kalium ferricyanide (III), 0,05 mM kaliumferrocyanide (II), aangevuld tot eindvolume van 0,1 mM fosfaatbuffer pH 7,. zie Hawkins et al 16) aan elke buis. Als weefsel niet volledig onder water, voeg extra GUS reagens.
- Incubeer buizen gedurende 10 minuten bij 55 ° C in het donker.
- Incubeer buizen nog eens 12-16 uur op een shaker incubator bij 37 ° C in het donkermiddels voorzichtig roeren (tussen 30 en 60 rpm) om te mengen.
- Na verwijdering van shaker incubator willekeurig controleer de pH van GUS reagens in een klein deel van de buizen met behulp van lakmoespapier met een pH-bereik 0-7.
- Als een van de buizen een pH van minder dan 6 labelen. Blijf de rest van de buizen controleren op pH bevestigen en het etiket als pH 6 of lager.
Opmerking: De monsters met een pH beneden 6 kan niet geschikt zijn voor analyse. Deze monsters van verdere analyse worden uitgesloten.
- Als een van de buizen een pH van minder dan 6 labelen. Blijf de rest van de buizen controleren op pH bevestigen en het etiket als pH 6 of lager.
- Decanteer GUS reagens en vervangen door 70% ethanol voldoende om weefsel te dekken.
- Bewaren bij 4 ° C totdat het nodig is.
6. Identificatie van transgene Tissue
- Met behulp van een tang, neem alles uit de cambial venster weefsel uit een buis en plaats in de kleine lade of petrischaaltje mogelijk te maken voor microscopische visualisatie.
- Met behulp van een dissectiemicroscoop tussen 1X en 4X vergroting identificeren en tally het aantal cellen of weefselsdie moeten een helder blauwe vlekken. Blauw gekleurde cellen of weefsel worden aangeduid als een sector vanaf dit punt. Tally ze op de volgende manieren.
- Voor monsters waar de floëem is verwijderd (stap 5.1.1), tel het aantal sectoren in cambial weefsel gevonden op het oppervlak van de ontwikkeling van xyleem (cambial sector, figuur 1a).
- Voor monsters die in schijven (stap 5.1.2) hebben gesneden, tel het aantal sectoren in de andere cel of weefsel types (figuur 1b, 1c, 1d). Sectoren kan worden gevonden in de volgende soorten weefsel: de periderm (periderm sector, figuur 1e), floeem (bastweefsel sector, figuur 1f), cambial weefsel (cambial sector, figuur 1g, 1h, 1I), wond parenchym (Wound Parenchyma Sector, Figuur 1j) en in thyllen (Tylose sector, figuur 1k).
- Tijdens een microscopischeBEOORDELING ervoor te zorgen dat beide zijden van een schijf zijn bekeken en dat sectoren die zich voordoen over twee schijven zijn op elkaar afgestemd zodat de nummers niet worden overschat.
- Plaats alleen het weefsel dat sectoren terug in de buis met 70% ethanol en opslag totdat het nodig is.
- Herhaal stap 6,1-6,3 voor bijkomende cambial vensters zoals de positieve en / of negatieve controle.
- Bereken de gemiddelde transformatie-efficiëntie voor ieder sector voor elk gen of promotor van belang en de controles afzonderlijk door het totale aantal sectoren te delen door het totale aantal van 1 cm 2 cambial ramen om een gemiddeld aantal transformatiegevallen per cm2 Cambium leiden geënt (ATScm -2).
- Ga verder met stap 7.2 en 8 voor de analyse van de promotor expressie patronen en stap 7.1, 7.2 of 7.3 voor technieken om cellen en weefsels morfologie beoordelen cambial weefsel.
7. Analyse van deCell en Tissue morfologie in cambial Tissue
Let op: Hieronder vindt u een selectie van technieken die met succes zijn gebruikt voor de analyse van de ISSA afgeleid monsters.
- Analyse van xyleem celoppervlak, lumenoppervlak, celwanddikte en celwand omgeving middels Scanning Electron Microscopy (SEM).
Let op: Dit protocol vereist een minimale monstervoorbereiding en zorgt voor een relatief hoge doorvoer van de sector analyse met betrekking tot de morfologische kenmerken geschetst.- Vanaf deze stap verder zorg er dan voor laboratoriumjas, oogbescherming en handschoenen worden gebruikt wanneer houtige weefsel wordt gehanteerd en behandeld.
- Identificeer een cambial sector voor analyse en maakt een incisie van ongeveer 0,5 mm tot weerszijden ervan middels een enkele rand scheermesje een schijf (Figuur 2a) te creëren.
- Snijd het overtollige xyleemweefsel laat ongeveer 1 mm van xyleem weefsel om de tangentiële kant van de sector (Figuur 2b).
- Voorzichtigly dwars doorgesneden door het midden van de sector met eenzelfde dubbele rand scheermesje (figuur 2c).
- Maak twee extra ondiepe radiale insnijdingen op het dwarsvlak weerszijden van sector tot de transgene weefsel (figuur 2d) af te bakenen. Als GUS kleuring niet diep zal doordringen in het weefsel te volgen langs de radiale bestanden van cellen aan weerszijden van lood weefsel gevonden op de cambial oppervlak.
- Bevestig bereid cambial sector gezicht tot stadium van een SEM pin stomp te monteren met behulp van SEM geleidende tape (figuur 2e) en in exsiccator te houden totdat het nodig is voor SEM visualisatie.
- Herhaal de stappen 7.1.2 tot en met 7.1.6 voor bijkomende sectoren, waaronder die van de negatieve controle.
- Met behulp van een SEM in een lage vacuüm-modus (energie 5 kV, spot 3,0 nm), visualiseren en neem foto's van de cellen / weefsel in de sector, evenals de cellen / weefsel direct naast de sector (figuur 2F). De hoeveelheid vergrotingafhankelijk van de kenmerken van belang. Voor xyleem vezels, 2,000X geschikt is (figuur 2G).
- Zodra een cambial sector is gevisualiseerd en foto's die met een geschikte vergroting, meten xyleem cel / weefsel morfologische kenmerken van belang het gebruik van image meetsoftware.
- Voor statistische analyse voeren meerdere paarsgewijze analyses gebruikmakend van gepaarde t-tests om het verschil tussen morfologische gemeten in de transgene sector en de naburige niet-transgene controle cellen / weefsel (gemeten in 0,5 mm uit sector rand) voor elke sector van een p bepalen vergelijk -waarde.
- Herhaal stap 7.1.10 voor de negatieve controle.
- Wanneer de positieve controle toont een lage p- waarde (α <0,05) Bereken het verschil tussen de transgene en naburige niet-transgene cellen / weefsel voor een morfologische eigenschap. Gebruik 'verschilwaarde in een gepaarde t-test om het effect van het gen van belang te vergelijken met de negative controle om een p-waarde te bepalen.
- Histochemische analyse van cambial cel / weefsel morfologie of promotor expressie patronen in stamcellen / weefsels met behulp van licht microscopie.
Opmerking: Terwijl meer tijd in beslag, deze methode zorgt voor meer analysemogelijkheden inclusief aspecten van cambial dynamiek, bijvoorbeeld cambial breedte als promotor expressie patronen. Bovendien, wanneer geen toegang een SEM Dit protocol kan worden gebruikt als alternatief voor stap 7,1.- Accijns sector plaats middels scheermesje en een aantal omliggende weefsel in kleine blokken (niet groter dan 1 mm 3) en plaats direct in 1-3 ml 100% ethanol in een monsterflesje met schroefdop ten minste 2 dagen bij 4 ° C op een schudinrichting. Bereid het blokje op een manier die het mogelijk maakt het oppervlak van belang worden benaderd door een microtoom.
- Herhaal dit voor eventuele bijkomende sectoren, waaronder die van de negatieve controle.
- Verwijder vloeistof en te vervangen door 25% ethanol: 75% LR wit mengsel gedurende 2 dagen het handhaven van omstandigheden.
- Herhaal stap 7.2.3 met 50% ethanol: 50% LR wit, 25% ethanol: 75% LR wit en dan eindelijk tweemaal met 100% LR wit.
- Plaats kleine blok in Inbedding Mold met het oppervlak van belang afgestemd op de korte kant en zorgvuldig bedekken met verse LR wit en polymeriseren volgens instructies van de fabrikant.
- Snijd 5 um secties van het oppervlak plaats op een roterende microtoom en monteren op een glasplaatje. Gebruik Safranine O (0,01%) kleuring celwand en / of andere functies te visualiseren.
- Voeg montage media, leg een deksel slip en laat 's nachts in te stellen.
- Bekijk onder een lichtmicroscoop tussen beeld vast te leggen 100X en 600X vergroting en.
- Leg morfologische kenmerken van beelden met behulp van beeld meetsoftware.
- Voor statistische analyse van de kwantitatieve morfologische kenmerken, volgen op stap 7.1.10.
- Voor de kwalitatieve analyse van morfologische kenmerken,vergelijken en beschrijven patronen waargenomen voor het gen of de promoter van belang en de negatieve en / of positieve controle.
- Analyse van microfibril Angle (MFA) in Gemacereerde Vezels met behulp van licht microscopie.
- Accijns transgeen xyleemweefsel direct van een sector en uit niet-transgene weefsel ernaast (binnen 0,5 mm, figuur 2h) en overbrengen in afzonderlijke 1,5 ml buizen. Herhaal dit voor eventuele bijkomende sectoren, waaronder die van de negatieve controle.
- Compleet stappen 7.3.3 tot 7.3.5 in een zuurkast.
- Voeg 250 ul van waterstofperoxide en 250 ui ijsazijn aan elke buis.
- Plaats buis verwarmingsblok bij 90 ° C gedurende 2 uur in zuurkast.
- Verwijder weefsel van buizen en zorgvuldig te spoelen met gedestilleerd water ten minste twee keer.
- Met behulp van een in water oplosbaar montage media, monteren weefsel op een glasplaatje en plagen elkaar met scherpe tang voorafgaand aan het aanbrengen van een cover slip.
- Uitzichtonder een lichtmicroscoop en vastleggen beelden van individuele vezels bij een vergroting van meer dan 400 x.
- Om microfibril hoek van vezels bepalen, meten de hoek tussen de put openingen en / of celwand strepen en de lange as van de vezel (figuur 2i) middels het meten software.
- Voor statistische analyse, volgen op stap 7.1.10.
8. Analyse van Promoter Expression Patterns
- Analyse van Promoter Expression Patronen in Secundaire Stem Doekjes.
- Kloppen de frequentie van elk type sector voor de promotor van belang en de positieve en negatieve controles uit stap 6.2.2.
- Vergelijk de frequentie van de verschillende types sector de promoter van belang met de positieve controle gebruikt chikwadraattoetsen p-waarden vast te stellen. Verdere analyse van de cel / weefsel specificiteit kan worden uitgevoerd met behulp van stap 7.2 als nodig is.
- Als er meer dan één promotorvan belang wordt onderzocht herhaal deze analyse maakt een vergelijking tussen alle initiatiefnemers van belang en de positieve controle.
- Als sectoren of blauwe vlekken worden waargenomen in de negatieve controle deze add vervolgens aan de analyse of te verlaten, afhankelijk van de omvang of als endogene kleuring wordt vermoed (zie Discussie).
- Analyse van Promoter Expression Patterns Tijdens cambial Afgeleide ontwikkeling en differentiatie.
- Met behulp van een stereomicroscoop, visualiseren cambial alle sectoren (figuur 1g, 1h, 1i) geïdentificeerd in stap 6,2 en bepaalt de aanwezigheid / afwezigheid van blauwe kleuring in drie typen weefsels afgeleid van het cambium; het floëem (P), de ontwikkeling van xyleem (X1) of ontwikkeld xyleem weefsel (X2) (zie figuur 3a).
- Volgens stap 8.1.2, vergelijkt de frequentie van aanwezigheid / afwezigheid van GUS kleuring in de P, X1 en X2 regio promotor interest met de positieve controle gebruikt chikwadraattoetsen p-waarden vast te stellen. Verdere analyse van de cel / weefsel specificiteit kan worden uitgevoerd met behulp van stap 7.2 als nodig is.
- Zie stappen 8.1.2.1 en 8.1.2.2 voor aanvullende overwegingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met dit protocol alle live secundaire stamcellen en weefseltypes is aangetoond dat vatbaar zijn A. tumefaciens transformaties en gedefinieerd in typen sector op basis van het celtype oorspronkelijk getransformeerde en latere ontwikkelingsstoornissen groeipatroon. Sector typen zijn periderm, floëem, cambial, wond parenchym en tylose (figuur 1b, 1c, 1d) en is te vinden in consistente locaties te beschrijven in het vervolg van deze paragraaf. Een periderm sector bestaat uit een groep van getransformeerde cellen uitsluitend de periderm en nooit gevonden uitstrekt in het floëem (figuur 1e). Een floëem sector is te vinden op diverse locaties tussen de initiërende laag en de periderm echter nooit in de uitbreiding van deze omliggende weefsels (figuur 1f). Een cambial sector omvat getransformeerd xyleem / cambium / floëem weefsels afgeleid van transformation van cambial initiële en kan in drie verschillende patronen: i) "volledige" cambial sector getransformeerde xyleem / cambial / floëem cellen zich vanaf de rand van de wond parenchym weefsel door het xyleem en cambial zone ten floëemweefsel die zowel ray en spoelvormige cellen of ray elementen alleen (figuur 1G), ii) verloren aanvankelijk "cambial sector, een variant van de volledige cambial sector waarin een eerste verloren gegaan uit de initiërende laag waardoor gespiegelde xyleem en floëem sectoren en niet-getransformeerde initiërend laag (fig 1h), en iii) xyleem slechts 'cambial sector getransformeerd xyleemweefsel uitstrekt vanaf de rand van de wond parenchym weefsel variabele lengte in het nieuw gevormde weefsel xylogenic maar nooit bereiken van de initiërende laag (Figuur 1i). Een wond parenchym sector bevat getransformeerde wond parenchymceUen gevonden als een individu cel of groepen cellen, vaak in radiale files, gelegen tussen de reeds bestaande hout en nieuw gevormde xyleem weefsel (figuur 1 j). Een tylose sector bestaat uit getransformeerd vaartuig thyllen gevonden binnen de reeds bestaande hout (figuur 1k).
Representatieve transformatie efficiëntiegegevens zowel gen en promotor plaats studies en de positieve controles wordt weergegeven in Tabel 1 en Tabel 2. De gegevens zijn afkomstig uit twee grote studies uitgevoerd over dezelfde periode (december-april) op dezelfde genotypen van eucalyptus en populieren over twee opeenvolgende jaren met een aantal houtvorming genen en promotoren van belang. Gericht op positieve controle van de promoter van belang studies (tabel 2), de meest gevoelige weefseltype A. tumefaciens T-DNA overdracht cambial weefsel met ongeveer 60% en 40% van de sectoren respectievelijk geïdentificeerd eucalyptus en populierenzijnde cambial sectoren. In eucalyptus, is de volgende meest voorkomende soort sector gewikkeld parenchym van 35%, terwijl de andere sector hadden ATScm -2 waarden onder 5%. In populieren, is de volgende meest voorkomende soort sector gewikkeld parenchym van 20%, gevolgd door floëem op 15% terwijl de rest van de types sector gevonden bij een frequentie onder 5%. Een hogere waarschijnlijkheid van het vinden van een sector in een cambial venster en grotere aantallen cambial sectoren die zijn typisch wanneer het floëem schil protocol wordt gebruikt (Tabel 1, stap 5.2.1) door de mogelijkheid voor het kleuren en de mogelijkheid om het visualiseren gehele gebied van het cambium.
Tijdens de ontwikkeling van deze protocollen werden een aantal variabelen onderzocht als onderdeel van protocol optimalisatie proeven. Deze omvatten bacteriële concentratie in Enten Media, mediatype gebruikt in Enten Media, toevoeging van acetosyringoon te Enten Media, weefsel leeftijd en A. tumefaciens stam en inoculatie en genotype. Cambial sector ATScm -2 gegevens uit deze studies wordt weergegeven in Tabel 3 en Tabel 4. De meeste onderzochte variabelen, als gewijzigd, leiden tot veranderingen in cambial ATScm -2 in beide soorten en in het bijzonder het verhogen van de concentratie van bacteriën in de inoculatie media, het gebruik van MS in de Inenting media en de keuze van A. tumefaciens stam. Bovendien, de tijd van inenting en boom genotype toonde significante verschillen in de eucalyptusbomen met inentingen in de vroege zomer tonen hoger ATScm -2 terwijl eucalyptus klonen SG21 en SG44 vertoonden hogere cambial ATScm -2, 41,6 en 40,4, respectievelijk in vergelijking met anderen in alle maanden samen.
Gemiddelde cambial sector varieert en is afhankelijk van de hoeveelheid van de tangentiële en radiale groei in een cambial venster. In één submonster van 53 sectoren populieren, gekweekt gedurende ongeveer 4 maanden, de tangentiële breedte van sectoren op het cambium varieerde tussen 0,09 en 0,58 mm met een gemiddelde van 0,27 mm en radiale groei in cambial vensters varieerden van 0,7 tot 2,2 mm met een gemiddelde van 1,35 mm. In combinatie zijn deze voorzien tussen 0,063 mm en 1,276 mm 2 2 van transgeen weefsel voor analyse. In een andere subgroep van 188 sectoren in de dezelfde soort, waarbij tussen 1,5-4 mm radiale groei in de hele cambial raam werd waargenomen over ongeveer 5 maanden, de gemiddelde sector massa was 72 ug (tabel 5).
De hoeveelheid transgeen weefsel gemaakt is aangetoond dat voldoende cellen en / of weefsel morfologische meet- en voor de studie van promoteractiviteit bieden. Bijvoorbeeld, de invloed van drie Eucalyptus grandis knip op een aantal xyleem vezel morfologische kenmerken 9 was ex plored in eucalyptus klonen en onthulde mogelijke rollen voor EgrFLA2 in MFA vastberadenheid en EgrFLA1 in de determinatie van celgrootte (tabel 6). Bovendien expressiepatronen van Eucalyptus grandis CESA genpromotor in ontwikkelingslanden xyleem (X1), ontwikkeld xyleem (X2) en bastweefsel (P) weefsels 10 die significant verschillende expressie patronen tussen EgrCESA1, 2, 3, en EgrCESA4, 5, 7 in eucalyptus stengels. In deze analyse, EgrCESA1, 2, 3 bleken voornamelijk uitgedrukt in ontwikkeling xyleem weefsel terwijl EgrCESA4, 5, 7 bleken uitgedrukt in zowel ontwikkelde xyleem en floëem weefsel (figuur 3b, tabel 7). Alle EgrCESA promoters hebben zeer verschillende expressiepatronen de positieve controle (CaMV35S promoter) (Tabel 7).
4553 / 54553fig1.jpg "/>
Figuur 1:. Transgene sectoren types (a) cambial sectoren zoals gezien op het oppervlak van de blootgestelde xyleem na verwerking via het floëem schil protocol (stap 5.2.1). Schijven met een aantal soorten sector dwarsoppervlak van populieren in (b) en eucalyptus (c) stammen na verwerking met de dwarssnede protocol (stap 5.2.2). (D) Schematische weergave van de verschillende vormen van sector gevonden in stengels. Voorbeelden van periderm sector (e), floeem sector (f), 'vol' cambial sector (g), 'verloren aanvankelijke' cambial sector (h), 'xyleem slechts' cambial sector (i), wond parenchym sector (j) en tylose sector (k) in populier. Zwarte pijlen geven aan waar kleinere sector zich bevinden. Alle schaal bars = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2:. Bereiding van cambial gebieden van morfologische analyse met SEM en lichtmicroscopie (a) Uitsnijding van schijf met sector. (B) Disc in orde gemaakt om overtollig weefsel te verwijderen. Doorsnijden dwarsoppervlak van de transgene sector (c). (D) Invoering van twee radiale bezuinigingen om te helpen in het lokaliseren van de transgene weefsel onder SEM. (E) Tissue gemonteerd op een SEM pin met behulp van geleidende tape. (F) Weergave van het gebied van transgene en niet-transgene weefsels die moeten worden afgebeeld voor analyse. (G) Typisch beeld van xyleem vezels en ray cellen gevangen bij 2,000X vergroting. (h (I) Gemacereerde vezel bekeken onder lichtmicroscopie die de hoek van de putten en / of celwand strepen en de lange as van de cel. Zwarte pijl geeft pit diafragma. Schaal bars = af, h = 1 mm, g, i = 20 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Analyse en resultaten van genpromotor expressiepatronen van cambial derivaten (a) Weergave van de P (floëem), X1 (ontwikkeling xyleem) en X2 (ontwikkeld xyleem) gebieden.. (B) De resultaten die aangeven aandeel van P, X1 en X2 kleuring in cambial sectoren uit een proef met een bereik van CESA Eucalyptus grandis omgezet in stengels van eucalyptus hybriden. Gegevens afkomstig van Creux et al. 10. n = aantal sectoren beoordeeld. Schaal bar = 0,5 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| boomsoorten | vector soort | Aantal genen van belang gebruikt | Totaal aantal vensters gemaakt | Totaal aantal ramen waar een sector werd geïdentificeerd (%) | Cambial ATScm -2 cambial (in ramen waar een sector werd geïdentificeerd) |
| Eucalyptus globulus x camaldulensis hybriden (in totaal drie klonen) | Positive Control (Genen van belang) | 1 (alleen GUS) | 96 | 97% | 45,1 (1,5) |
| Genen van belang | 20 | 630 | 92% | 46,1 (2,2) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Positive Control (genen van belang) | 1 (alleen GUS) | 110 | 74% | 10,8 (1,5) |
| Genen van belang | 20 | 700 | 81% | 14,6 (0,8) |
Tabel 1:. Typische cambial ATScm -2 voor de positieve controle en de genen van belang De cijfers zijn afkomstig uit studies die meer dan twee opeenvolgende jaren in dezelfde eucalyptus en populieren klonen met behulp van een reeks van genen en het floëem schil harvesting protocol (stap 5.2. 1). Standaardfout waarden tussen haakjes. </ P>
| boomsoorten | vector soort | Aantal promotor / genen | Totaal aantal vensters gemaakt | Totaal aantal ramen waar een sector werd geïdentificeerd (%) | ATScm -2 alle sectoren | ATScm -2 periderm | ATScm -2 Floëem | ATScm -2 cambial | ATScm -2 Wound Parenchyma | ATScm -2 Tylose |
| Eucalyptus globulus x camal- dulensis hybriden (in totaal drie klonen) | Positive control | <td> 1 (GUS) met118 | 63% | 25,74 (2,35) | 0,24 (0,07) | 0,89 (0,19) | 15,7 (1,71) | 8,84 (1,4) | 0,07 (0,03) | |
| Promotoren van Interest | 28 | 1050 | 31% | 14,67 (1,77) | 0,02 (0,01) | 0,05 (0,01) | 13,79 (1,75) | 0,78 (0,21) | 0,03 (0,01) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Positive control | 1 (alleen GUS) | 110 | 54% | 12,37 (1,77) | 0,22 (0,07) | 1,85 (0,29) | 5,07 (0,6) | 2,78 (0,75) | 0,29 (0,53) |
| Promotoren van Interest | 28 | 990 | 26% | 8,28 (1,18) | 0,16 (0,04) | 0,9 (0,09) | 6,67 (1,16) | 0,27 (0,07) | 0,28 (0,11) |
Tabel 2:. Typische sector ATScm -2 voor de positieve controle en de promotoren van rente De cijfers zijn afkomstig uit studies die meer dan twee opeenvolgende jaren in dezelfde eucalyptus en populieren klonen met behulp van een reeks van promoter sequenties en de schijf oogsten protocol (stap 5.2. 2). ATScm -2 waarden werden afgeleid van ramen waar een sector alleen werd geïdentificeerd. Standaardfout waarden tussen haakjes. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
| species | proces | behandeling Beschrijving | Aantal ramen in behandeling | |
| Eucalyptus globulus | Concentratie van A. tumefaciens in Enten Media | Gehersuspendeerd in 25 ml MS | 10 | 1,4 (0,62) |
| Geresuspendeerd in 5 ml MS | 10 | 1,6 (0,72) | ||
| Geresuspendeerd in 1 ml MS (controle) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| mediatype in Enten Media | POND | 10 | 0,4 (0,22) | |
| MS (controle) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| Toevoeging van acetosyringoon inoculatie Media | met acetosyringoon | 11 | 0,9 (0,37) | |
| Zonder acetosyringoon (controle) | 11 | 0,6 (0,64) | ||
| Age of stengel weefsel geënt | 6 maanden (control) | 11 | 1,1 (0,66) | |
| 18 maanden | 11 | 1,8 (0,95) | ||
| A. tumefaciens-stam | AGL1 (controle) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0,1 (0,1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0,6 (0,4) | ||
| Populus alba 'pyramidalis' | Concentratie van A. tumefaciens in media | Gehersuspendeerd in 25 ml MS | 10 | 2,2 (0,55) |
| Geresuspendeerd in 5 ml MS | 10 | 2.7 (0,63) | ||
| Geresuspendeerd in 1 ml MS (controle) | 10 | 5.1 (1,58) | ||
| Mediatype gebruikt voor stam inenting | POND | 10 | 2.8 (0,71) | |
| MS (controle) | 10 | 5.1 (1,58) | ||
| Toevoeging van acetosyringoon inoculatie Media | met acetosyringoon | 11 | 0,3 (0,14) | |
| Zonder acetosyringoon (controle) | 11 | 0,5 (0,25) | ||
| Age of stengel weefsel geënt | 6 maanden (controle) | 11 | 1,5 (0,33) | |
| 18 maanden | 11 | 1,5 (0,63) | ||
| A. tumefaciens-stam | AGL1 (controle) | 20 | 8.1 (2) | |
| C58 | 20 | 12.5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11,1 (2) |
Tabel 3: cambial ATScm -2 waarden voor een aantal variabelen onderzocht in het kader van het protocol optimalisatie paden. Variabelen werden onderzocht in een populier kloon en een scala aan Eucalyptus globulus individuen over een aantal jaren met cambial ATScm -2 data gepresenteerd. Cambial ramen werden geoogst met behulp van de schijf harvesting protocol (stap 5.2.2). Standaardfouten tussen haakjes.
| Eucalyptus globulus x camaldulensis kloon ID | Aantal cambial ramen voor elke maand | Cambial ATScm -2 Late Spring (november) Inenting | Cambial ATScm -2 begin van de zomer (december) Inenting | Cambial ATScm -2 Mid Summer (januari) Inenting | Cambial ATScm -2 Late Summer (februari) Inenting | Cambial ATScm -2 Vroege Herfst (maart)Inenting | Cambial ATScm -2 alle maanden samen |
| SG5 | 10 | 15,7 (7,8) | 50,7 (13,7) | 10.5 (5.1) | 30,7 (4,4) | 16,8 (6,3) | 24,9 (4,3) |
| SG6 | 10 | 6.1 (3.1) | 38,5 (15,1) | 4,5 (1,7) | 14.5 (3.3) | 27,6 (8,4) | 18,3 (4) |
| SG13 | 10 | 28,4 (6,7) | 41,8 (9,1) | 16,1 (7) | 29,3 (5,2) | 19,8 (4,3) | 27.1 (3.1) |
| SG18 | 10 | 6,7 (2,9) | 18,3 (6,7) | 17,4 (3,4) | 19.2 (6.1) | 18,1 (6,3) | 15,5 (2,4) |
| SG21 | 10 | 38,7 (14,3) | 77 (17,5) | 23,9 (5,7) | 27,5 (6,9) | 40,7 (13,5) | 41,6 (6) |
| SG35 | 10 | 23,5 (10,2) | 42,8 (12,2) | 7,6 (2,5) | 17,6 (4,3) | 31,3 (4,6) | 24,6 (3,8) |
| SG37 | 10 | 19,7 (8) | 55,2 (14,5) | 7,4 (1,8) | 35 (10,4) | 15,9 (4,5) | 26,6 (3,8) |
| SG39 | 10 | 12,5 (2,4) | 23,6 (6,3) | 6,9 (3) | 26,3 (8,1) | 7,3 (2,3) | 15,5 (2,6) |
| SG40 | 10 | 24,8 (11) | 24,5 (6,8) | 14 (5.6) | 35,6 (6,1) | 19,9 (4,2) | 23,8 (3,2) |
| SG44 | 10 | 22,3 (3,4) | 63 (29,3) | 9,8 (2,6) | 52,5 (10,3) | 54,3 (15) | 40,4 (7,4) |
| SG46 | 10 | 15.3 (5.2) d> | 63,9 (20,1) | 23,6 (4) | 22,5 (4,8) | 17,4 (4,9) | 28,5 (5,1) |
| Maandelijkse cambial ATScm -2 | 19,9 (5) | 45,3 (9,1) | 12,6 (2,8) | 27,8 (4,5) | 24 (5.1) |
Tabel 4:. Invloed van genotype en het tijdstip van enting op cambial ATScm -2 in eucalyptus klonen Tien ramen werden geïntroduceerd elke maand over het groeiseizoen 10 verschillende Eucalyptus globulus x camaldulensis klonen die waren geoogst in mei. Maandelijkse gegevens wordt gepresenteerd voor elk genotype met een totaal gemiddelde maandelijkse en genotypische ATScm -2 ook gepresenteerd. Cambial ramen werden geoogst met behulp van het floëem schil harvesting protocol (stap 5.2.1). Standaardfouten tussen haakjes.es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
| Plant Number | Aantal cambial sectoren uitgesneden | Totale massa van alle sectoren (ug) | Gemiddelde massa van sectoren (ug) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4460 | 172 |
| 5 | 15 | 1320 | 88 |
| 6 | 22 | 2490 | 113 |
| 7 | 19 | 1720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Totaal | 188 | 13.550 | 72 |
Tabel 5:. Typische massa van een cambial sector 45 vensters in negen planten werden onderzocht populier aan de gemiddelde massa van een sector bepalen en geoogst met de schijf harvesting protocol (stap 5.2.2). Planten werden gekweekt voor 5 maanden en de radiale groei over een cambial raam was tussen 1-4 mm.
| Morph- sche trait | GUS alleen (positieve controle) | Niet-transgene weefsel (alleen GUS) | P-waarde | Gen van belang 1 (FLA1) | Niet-transgene weefsel (FLA1) | P-waarde | Gen van belang 2 (FLA2) | Niet-transgene weefsel (FLA2) | P-waarde | Gen van belang 3 (FLA3) | Niet-transgene weefsel (FLA3) | P-waarde |
| Gemiddeld celwand Dikte (pm) * | 1,81 (0,1) | 1,65 (0,1) | 0,2692 | 1,47 (0,14) | 1,55 (0,12) | 0,6403 | 1,65 (0,13) | 1,78 (0,13) | 0,4839 | 1,59 (0,12) | 1,63 (0,11) | 0,8254 |
| Gemiddeld celwand Area (um 2) * | 69.1 (4.74) | 60,7 (2,03) | 0,1229 | 64,1 (15,68) | 59,9 (9.79) | 0,5004 | 61,6 (3,4) | 65 (3.96) | 0,5182 | 61,9 (3,56) | 61,5 (3.16) | 0,9438 |
| Gemiddeld Cell Area (um 2) * | 115,9 (11.01) | 99.9 (5.1) | 0,2041 | 124,4 (6,1) | 108 (4,36) | 0,0445 | 110,8 (8,45) | 111,3 (9,06) | 0,9671 | 108,5 (4,43) | 103 (3,07) | 0,3204 |
| Gemiddeld Lumen Area (um 2) * | 46,9 (7,55) | 39,2 (4,89) | 0,407 | 60.2 (5.28) | 48,1 (4,46) | 0,0991 | 49,2 (7,56) | 46,3 (7,5) | 0,7882 | 46,6 (3,31) | 41,5 (3,9) | 0,3264 |
| Gemiddeld microfibril Hoek (O) # | 24,3 (0,75) | 24,2 (0,45) | 0,8648 | 22,3 (0,82) | 22,7 (0,7) | 0,5664 | 23,7 (0,55) | 26,6 (0,5) | 0,0001 | 26 (0,88) | 27,2 (0,72) | 0,0903 |
Tabel 6:. ISSA vezelmorfologie metingen verkregen uit gen van belang studievergelijking vezels celwand, celgrootte en MVR metingen uit transgene vezels afkomstig van Eucalyptus globulus x camaldulensis klonen stammen getransformeerd met Eucalyptus grandis flas (EgrFLA1, 2, 3) en positieve controle (alleen GUS) met de naastgelegen niet transgene controle vezels. Gegevens afkomstig van MacMillan et al. 9. * Geeft studie omvatte de meting van 10 vezels in 10 sector (total van 100 vezels). # Geeft het proces betrokken zijn het meten van 5 vezels in 20 sectoren (totaal 100 vezels). α <0.05 vetgedrukt. Klik hier om een grotere versie van deze tabel te bekijken.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS alleen (positieve controle) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2,839 | 8,856 | 9,976 | 9.18 | 29,165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12,008 | 11,363 | 30,234 | |||
| EgrCESA3 | 15,151 | 16,123 | 15,488 | 37,791 | |||
| EgrCESA4 | 4,852 | 0,108 | 46,858 | ||||
| EgrCESA5 | 3,275 | 11,278 | |||||
| EgrCESA7 | 36,082 | ||||||
| GUS alleen (positieve controle) |
Tabel 7: Chi 2 waarde op basis van vergelijking van expressiepatronen promoter in cambial derivaten Chi 2 analyse waarbij de aanwezigheid / afwezigheid van GUS kleuring in P, X1 en X2 regio cambial derivaten. zes Eucalyptus grandis CESA gen promoters sequenties (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) en positieve controle (alleen GUS). Gegevens afkomstig van Creux et al. 10. α <0.05 getoond in onderstreping.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ISSA protocol is een relatief eenvoudige en efficiënte methode voor het creëren van transgene stam weefsels in boomsoorten in de ruimte van een paar maanden voor de analyse van genen en promoters van belang betrokken zijn in hout en steel formatie. Kleine moeite, voorbij het houden van planten in leven, is nodig om transgene stam weefsel na inenting, die staat in tegenstelling tot in vitro methoden, waar uitgebreide kweek is nodig om weefsel of planten, waar de houtproductie kan tot jaar te beginnen of wanneer een echte behouden groeien secundaire stam is niet gemaakt 1. ISSA is ook aangetoond toepasbaar op een breed scala aan boomsoorten, waaronder species in het geslacht Populus, Eucalyptus en Pinus 6 en acacia en Corymbia (gegevens niet getoond) zijn waar weinig of geen optimalisatie moet ontlenen transgeen weefsel. Bij deze methode is het dus mogelijk om een aantal onderzoeken of genen of promoters van belang zijn bij de meeste soorten van belang. Verder kan het protocol worden gebruikt op zichzelf of in combinatie met meer op grote schaal gebruikt in vitro-technieken waarbij meerdere genen kunnen worden onderzocht met behulp van ISSA in de eerste plaats om potentiële kandidaten te identificeren om verder te werken om meer betrokken in vitro methoden.
De beschreven voorbeelden laten zien dat er voldoende sectoren kunnen worden gecreëerd stroomafwaarts analyse uit te voeren met slechts een klein aantal transgene cambial ramen. Met ATScm -2 waarden van 46,1 en 14,6 in eucalyptus populier in slechts één of twee cambial ramen voldoende om een enkele eigenschap te onderzoeken zou als het mogelijk is om vele ramen bijdragen aan hetzelfde installatiestam of repliceren op talrijke planten. In de praktijk, echter niet alle cambial ramen leiden tot het ontstaan van een cambial sector die kan worden gebruikt (zie Tabel 1, Tabel 2) als de grootte van sectoren kunnen variëren, zijn ze algemeen kleinen in gevallen kan worden geplaatst in dichte nabijheid van elkaar beperkt het gebruik voor downstream analyse. Bovendien kan het gen van belang beïnvloeden cellevensvatbaarheid 12 of andere aspecten van celontwikkeling mogelijk resulteert in de volledige afwezigheid van transgene sectoren een specifiek gen van belang. Het is daarom raadzaam om altijd streven naar een groter aantal ramen dan nodig zou zijn voor analyse. Vergelijkbare voorzichtigheid dient te worden toegepast bij het gebruik van ISSA voor promotor studies als belangrijke variabiliteit kan worden verwacht met weinig / zwakke of geen expressie waargenomen in sommige gevallen (tabel 2). Echter een kleiner aantal sectoren, slechts 6, is aangetoond met succes worden gebruikt voor analyse 10. Deze resultaten tonen dat zeer bescheiden experimenten waarbij slechts een klein aantal vensters kan aanzienlijke inzichten genfuncties en promoteractiviteit.
Uit een analyse perspectief, de nabijheid van andere genenic en niet-transgene weefsel biedt een krachtig hulpmiddel om kleine maar betekenisvolle verschillen in eigenschappen tussen de genen van belang te identificeren. Cellen en weefsels bemonsterd direct naast elkaar van dezelfde genotypische achtergrond en zijn beïnvloed door dezelfde omgevingsomstandigheden vermindering van het aantal onafhankelijke variabelen en vereenvoudiging van de statistische analyse vereist. Vanuit sampling perspectief poweranalyse op ISSA afgeleide gegevens van verschillende experimenten (bijvoorbeeld, Tabel 6), blijkt dat een kleiner aantal metingen per sector, bijvoorbeeld, cel wanddikte van 3-5 cellen per sector, en het meten van een groter aantal sectoren, bijvoorbeeld 20-25 gebieden van een gen van interesse, verschaft een efficiëntere en statistisch robuuste bemonsteringstrategie. Elke sector vertegenwoordigt een onafhankelijke modificatie of 'lijn' van cellen met de statistische analyse die het bepalen van het gemiddelde effect van meerdere transformatie gebeurtenissenwaarbij het gen van belang. Ook de mogelijkheid om alle weefsels stam te transformeren biedt een mogelijkheid om de expressie van promoters van belang in de gehele steel en meer specifiek bestuderen tijdens cambium differentiatie. ISSA protocollen hier beschreven zorgen voor een betrouwbare en gevalideerde pijpleiding van de creatie van transgene weefsel door op het verzamelen van monsters, verzamelen en analyseren van gegevens voor de weefsels en cellen morfologie en voor de promotor expressie patronen.
In de meeste gevallen, sectoren zijn het resultaat van de transformatie van een enkele cel, dat door celdeling aanleiding kunnen hebben tot een aantal afgeleide cellen en weefsels. Bijvoorbeeld, een cambial sector vloeit voort uit de transformatie van een enkele cel die post wond herstel wordt een cambial eerste die op zijn beurt verdeelt periclinally en anticlinally een sector die zich uitstrekt helemaal van de oorspronkelijke wond in het floëem te creëren. In deze gevallen werd de getransformeerde initiële gehandhaafdbinnen de cambium tot het moment van de oogst en een 'full' variant wordt waargenomen, echter, wanneer deze eerste verloren gaat uit de cambial laag tijdens de radiale groei en vervangen door een niet-getransformeerde naburige cel door middel van 'cell-invasie', dan is een ' verloor aanvankelijk 'variant zal het resultaat zijn. Om de juiste indeling van soorten sector te garanderen en te helpen bij de interpretatie van de resultaten is het sterk aanbevolen dat het vertrouwd raken met anatomische kenmerken van de secundaire stam ontwikkeling en wond reacties zijn voorwaarden voor de analyse van de ISSA resultaten. Ook wordt regelmatig testen van de pH van het GUS reagens aanbevolen (zie stap 5,6). Een lage pH (bijvoorbeeld lager dan 6) kan leiden tot activatie van endogene β-glucuronidasen (GUS) in de plant stam die de ware omvang van een sector kan maskeren of leiden tot de identificatie van valse positieven. Indien dit wordt vermoed, wordt aanbevolen dat deze monsters uit verdere analyse worden uitgesloten. De GUS reagens protocolbetrouwbaar toegepast in de hier beschreven om mogelijke problemen endogene GUS activiteit werd aangepast van Hawkins et al verlichten studies. (2002) 16 en gebruikt bijkomende belangrijke stappen waaronder twee spoelingen met fosfaatbuffer monsters pH7 evenwicht en warmtebehandeling bij 55 o C gedurende 10 minuten te destabiliseren endogene GUS-activiteit 17,18. GUS reagens permeabiliteit is ook beperkt en is verantwoordelijk voor minder sectoren geïdentificeerd met de dwarse disc protocol vergeleken met het floëem schil protocol.
Soorten uitgetest hebben aangetoond vatbaar voor transformatie van cambial weefsel. Er zijn echter grote verschillen in de ATScm -2 zowel tussen als binnen geslachten en soorten waargenomen. Evenzo de stam van A. tumefaciens en tijd / seizoen van de inenting kunnen beïnvloeden ATScm -2. Er wordt gesuggereerd dat het uitvoeren van een aantal voorlopige testen van deze variabelen in de species en genotypes in onderzoek voorafgaand aan grotere schaal de goedkeuring van het protocol. In theorie is er geen grens aan de tijd of grootte van stengels waaraan ISSA kan zo lang er een actief groeiende cambium worden toegepast. Echter, voor het gemak van verdere verwerking van transgeen weefsel sectoren wordt aanbevolen enten stengels van ongeveer 1 cm diameter.
ISSA is niet zonder beperkingen. De betrekkelijk geringe omvang van transgeen weefsel sectoren beperkt nog downstream fenotypering methoden en dus slechts een beperkt aantal van dergelijke methoden zijn routinematig gebruikt tot op heden. Deze werkwijzen zijn vooral gericht op morfologische analyse als hierboven en semi- kwantitatieve schatting van monosacchariden samenstelling in de secundaire celwand beschreven zoals vermeld in de inleiding 9,11. Met de komst en verfijning van nieuwe technologieën voor fijne schaal analyse van biologische materialen is er meer mogelijkheden om extra phenotyping ontwikkelenpijpleidingen voor ISSA sectoren, bijvoorbeeld celwand samenstelling analyse. Het blijft echter moeilijk kwantitatief uit te voeren, per sector, ribonucleïnezuur (RNA) op basis van genexpressie en eiwit studies en / of te identificeren en uit te dragen ISSA afgeleide transgene cellen door in vitro kweken voor aanvullende analyse vanwege de destructieve aard van het GUS-assay . Enkele fluorescente reporter genen en afdrukken weefsel zijn uitgeprobeerd RNA kwantificeren van afzonderlijke sectoren maar tot op heden deze benaderingen niet succesvol gebruikt voor gemiddelde tot hoge throughput screening computer werkt. Verder kon transgene technieken niet uitgetest-to-date, zoals RNAi-analyse waarin GUS expressie en down-regulatie van target-gen niet kan co-Localize compliceren.
Er zijn weliswaar enkele huidige beperkingen, integratie van nieuwe en opkomende technologieën en analytische methoden zijn waarschijnlijk om deze beperkingen te overwinnen, verdere versterking van de rol van de ISSA eensa medium tot high throughput protocol voor het ontleden van de complexe moleculaire aard van cambial differentiatie, ontwikkeling van het hout en de steel formatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
