Abstract
在树上二级茎生长和相关的木材形成都来自生物和商业的角度显著。然而，相对知之甚少的支配其发展的分子控制。这部分是由于经常与二次生长过程的研究相关的物理，资源和时间的限制。许多体外技术已被用于涉及两个木质和非木质植物物种或植物部分或整个植物系统。然而，关于它们的适用性进行二次茎的生长过程的研究问题，某些物种和劳动强度的顽抗往往望而却步中高吞吐量的应用。此外，在寻找专干发展，木材形成，当被调查的具体特征可能只历经数年的增长成为衡量一棵树的生命周期的后期。在解决体内 p这些挑战替代rotocols被开发出来，命名为诱导体部门分析，涉及直接在工厂的专干转基因体组织部门的创建。该协议的目的是提供一种有效的，简单和相对快速的方法来创建用于基因和启动子的功能分析，可在一个范围内树种可以利用转基因植物次生组织中。这里提出的结果表明，转基因次级干扇区可以在所有活的组织和细胞类型中创建二次茎的各种树种的木材形态特征的以及在次要启动子表达模式茎可容易地评估促进中到高通量功能特性。
Introduction
树茎包括行星生物量的显著量是巨大的生物，文化和商业上的重要性。二级茎由许多其他生命形式提供资源和庇护所创造的栖息地。他们以他们居住，并充当生产木材，纸浆和造纸等木材和非木材产品的可再生资源的生态系统提供多项服务。二次干发展并且更具体木材形成通过调节特定细胞类型的发展复杂的分子体系的约束，其细胞壁的生化成分，以及他们如何被布置为形成组织和器官。解剖专干的开发和木材形成的分子基础是由许多因素，包括木材和干性内部和之间的茎，长代次，异交交配系统，高杂合度，高遗传负荷，季节性休眠，长的可变性混淆成熟特点建立期和成熟的树木纯粹的物理尺寸。其结果是，干的发展相对于植物发育的分子控制的其它方面的详细知识次要的认识，仍处于起步阶段。
许多体外技术已被用于研究和了解二次干发展，尤其是木材和二级细胞壁的形成。这些协议包括使用整个植物或植物部分的系统，其中任一转基因植物产生或特定辅助细胞或组织转化为木材和/或仲干发展1的具体方面的研究。转基因植物可以从各种各样的植物组织和细胞类型的回收后的遗传转化，但是，进展缓慢，特别是在分析木纤维性状由于长期再生时和干成熟时间（年的顺序），高的技术和劳动德曼DS，可以通过低的候选基因，以及在传播一些木本植物物种困难。类似的技术已在非木质模型系统被开发，如拟南芥，成功地克服了这些限制，但不是所有的二次干细胞类型中在这些本茎和相关的季节性或长寿性状不能在这些物种2进行研究。备选地，植物部分系统，例如Pinu酒店小号辐射愈伤组织培养物3减少相关的时限。然而这些方法被限制于单个细胞类型的研究，并如所指出用于体外实验遭受类似的限制。同样，涉及整个茎段根尖干文化4显示的承诺，但目前还没有适用于特定基因或发起人的研究。最近，涉及毛状根替代协议已被开发用于桉树并已成功施加5，但是，这种方法仍需要在体外培养，涉及二次根而非茎和迄今它仅限于单一树种。
诱导的体部门分析（ISSA），如这里描述的，被开发来克服的一些问题，提供用于基因和启动子的高通量功能筛选工具的培养基中，在木材形成和二次茎组织发育疑似角色。 ISSA是被开发，以减少所产生的转基因细胞和组织在一个完整的辅助阀杆同时克服劳动时间在体内转化和筛选系统，体外方法中使用的常规技术和吞吐量的限制。这里所描述的协议允许用于同时建立数百独立地转化组织扇区和小区的一个短的时间期间内的次级茎，在树种和感兴趣组织而不克相对较短的时间框架和低廉的劳动力成本中enetic和/或环境的变化。 ISSA 体内技术首先被用于辅助阀杆6和芽7组织以来，通过参与形成层分化和基因和/或促进研究二次茎组织了细化说明，并有包括： 微管蛋白 （TUB）8，fasciclin样阿拉伯半乳聚糖 （ FLA）9， 纤维素酶 （CESA）10， 次生壁相关NAC域 （SND 2）11，ARBORKNOX（ARK1）12和非常有趣的新基因 （RING）H2蛋白13。在次级进行了这些研究茎杨树和桉树植物和提供见解细胞形态，细胞壁化学和基因表达。
这里描述的协议的目的是汇集经验第二，通过知识的ISSA从一系列在过去十年中发表和未发表的研究开发和应用获得的。他们专注于专干组织6 在体内转化，集中力量对涉及新疆杨“锥状'克隆， 蓝桉以及11个桉×赤桉克隆研究。本文通过从植物和细菌，茎组织，生长和组织的收获，转基因细胞和组织的鉴定，为收集和分析数据的表型评估和方法编制转型的种植协议进行研究。虽然技术已成功应用于测量细胞壁的单糖组成也9,11，由于篇幅所限，本文集中用于二次ST测量细胞和组织的形态和理解基因表达模式技术只有EMS。因此，如所概述的协议是适合于那些希望获得进一步深入了解的基因连接于次级的作用和/或表达的茎使用成本低，在技术上容易，中到高通量方法。
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Protocol
1.植物材料的制备
- 之前的实验，提高从种子或切割的优选树种新的幼苗和生长树/秒，直到在用于实验的区域中的杆的直径是直径约1厘米。
注：需要可能会有所不同，由于植物的生长速度，因此三至九个月这一步之间允许的时间。
2.二进制向量创建
- 从此部分进行工作，以在实验室或温室，其中根癌农杆菌可以处理和规定为实验室适当的个人防护设备部分7被使用。
- 制备含有任何兴趣击倒或过表达盒和一个β葡萄糖醛酸酶（GUS）报道基因盒的一个基因或融合于取决于研究的类型GUS基因的感兴趣的启动子的二元载体。
注意：有一些二元载体BAC的可商购或可来源通过提供给插入基因和感兴趣的启动子进二元载体研究网络以及许多技术kbones。在这个协议的情况下达到实验者就如何创建一个二进制向量的决定。 - 变换二元载体导入A的解除武装应变利用农杆菌电或热休克14，直到需要进行实验适当存放。
- 重复步骤2.2为任何阳性和/或阴性对照。
注意：阴性对照应包括含有无目的基因进行兴趣研究的基因和感兴趣研究的启动子的启动子的GUS二元载体。利息研究的启动子阳性对照应包括融合到GUS记者花椰菜花叶病毒35S启动子（CaMV35S启动）。
3. A.制备农杆菌接种
- 至少一周之前EXPERimentation，拿A.少量（约1微升）步2.2和2.3 农杆菌中，并准备与琼脂独立LB培养基上显得捉襟见肘含有细菌选择适当的抗生素板块14。在孵化器成长在28°C，形成小菌落，然后在4个商店 直到需要°以下。
- 之前的实验48小时后，转移A的一个菌落从各板成的50ml 农杆菌螺杆含有5ml预热（28℃）的LB培养基包含用于细菌选择适当的抗生素和在200rpm搅动振荡器上孵化约48小时，在28℃直至14的顶管混合物非常浑浊。
- 4-6之间茎小时之前，工厂的接种（第4）加1毫升LB / A的农杆菌混合成一个新的容量50mL的螺纹含有新鲜温热（28°C）24毫升（1:20稀释）顶管LB培养基与适当的抗生素细菌选择。如果在600nm（OD 600，如通过光谱学测定）的光密度（OD）大于0.1，直到这实现进一步用温水的LB稀释。
- 将稀释LB / A.农杆菌混合重上摇动孵化和动摇在相同条件下（200转，28°C），直到OD 600为0.4-0.6，并删除之间。
- 离心机LB / A.农杆菌混合物在1000 xg离心15分钟，4℃。
- 倒出液体，并立即重悬A.农杆菌沉淀在1ml的冷却MS媒体15，转移〜2毫升离心管，直到需要接种（第4）冰上存储。这种溶液被称为接种媒体。
4.接种植物与干A.农杆菌
- 春末或初夏使用具有积极而快速增长形成层在第1中创建植物在开始实验。一个好的诊断为活性和快速增长的形成层是韧皮部可从木质部容易地剥离。
- 发现茎植物的基地附近一个清晰的直线部分，并移除任何树叶和树枝。
- 用锋利的手术刀（最好是第11号）或刀片，通过引入两个垂直平行的切口，通过20毫米的长度和1个5毫米相隔韧皮部再创建茎明确的部分1厘米2'形成层窗口“横向切断连接在其底端的两条垂直切割。
- 通过剥离切口向上露出木质部发展组织及步骤3.6补充足够的接种媒体湿用吸管（通常是5-10微升）露出木质部开发的表面产生的韧皮部条。立即重新插入韧皮条。
- 绑定韧皮部地带茎紧密封口膜。
- 重复步骤4.2至4.5为任何额外形成层窗户兴趣创建的基因（S）或子（S）NY新形成层窗口至少1cm上方或下方等形成层的窗口，并在90°的偏移。
- 完成步骤4.2至4.5的阳性和阴性对照载体（步骤2.4）确保每个向量被添加到在实验中使用的各植物的相同干。
- 定期监测树干直径的生长和收获GUS检测时至少5 mm径向增长茎中被观察到（第5）。
注意：所需要的径向生长的量依赖于组织的用于下游分析所需的量。
5.收获了GUS的组织学分析
- 消费税从阀杆“形成层窗口'移动任何组织不能形成层窗口中新的增长点的一部分。
- 对于与成熟的木质部和韧皮部的细胞/组织形态的研究，从剥离木质部韧皮部。
- 对于需要在形成层区保持完整或启动子的表达模式的研究是要评估版，切片形成层窗口横向使用刀片或其他锋利的刀刃成厚0.5和1之间的光盘。
- 放置加工形成层窗口组织在14毫升圆底管和在pH 7 14 0.1M磷酸盐缓冲液冲洗两次。确保组织被完全淹没，保留在溶液中至少五分钟，所有过量的溶液在末端被除去第二漂洗。
- 添加5毫升GUS试剂（0.5毫米×-GLUC（5-溴-4-氯-3-吲哚 - β-D-葡糖醛酸），10毫摩尔EDTA，0.5％的Triton X-100 V / V，0.5毫钾铁氰化物（III），0.05毫亚铁氰化钾（II）中，由于最终体积为0.1mM磷酸盐缓冲液pH 7;参见Hawkins 等 16）到每个管中。如果组织没有完全淹没，添加额外的GUS试剂。
- 在黑暗中在55℃孵育管10分钟。
- 在黑暗中在37℃孵育管用于在摇床培养箱进一步12-16小时使用（30至60转）温和搅拌以允许混合。
- 当从摇床培养箱除去随机检查GUS试剂的pH值使用石蕊试纸pH范围0-7管的一小部分。
- 如果任何管子的pH值低于6再贴上标签。继续检查管子的其余部分，以确认pH和标签如果pH为6或更低。
注意：用pH值低于6的样品可能不适合用于分析。这些样品必须从进一步分析中排除。
- 如果任何管子的pH值低于6再贴上标签。继续检查管子的其余部分，以确认pH和标签如果pH为6或更低。
- 滗GUS试剂并有足够的70％的乙醇代替以覆盖组织。
- 直到需要储存于4℃。
6.确定转基因组织
- 使用镊子，取出全部来自于小托盘或培养皿管和地点形成层窗口组织允许微观可视化。
- 使用1X和4X放大率之间的解剖显微镜，鉴定并计算细胞或组织的数量有一个明亮的蓝色染色。蓝染色的细胞或组织被称为从这时开始扇区。理货他们在以下几个方面。
- 对于其中韧皮部已被删除（步骤5.1.1）的样品，计算在显影木质部（形成层扇区， 图1a）的表面上发现形成层组织的扇区数。
- 对于已经被切割成盘（步骤5.1.2）的样品，计算在不同的细胞或组织类型中发现的扇区数（ 图1B，1C，1D）。扇区可以在以下的组织类型中找到：周皮（周皮扇区， 图1E），韧皮部（韧皮部扇区， 图1F），形成层组织（形成层扇区， 图1G，1H，1I），伤口实质（伤口薄壁扇区， 图1J）和侵填体（TYLOSE部门， 图1K）。
- 在显微镜下一个ssessment确保盘的两侧已经被浏览和跨两个盘出现的行业相匹配，以使数字不被高估。
- 放置仅含有组织部门放回含有70％的乙醇和存储，直到需要该管。
- 重复步骤6.1至6.3为任何额外形成层窗口包括正和/或阴性对照。
- 除以扇区的总数乘以1厘米2形成层窗口的总数来推导每形成层的cm 2的转化事件的平均数计算每个扇区类型为每个基因或启动子和控制平均转化效率分别接种（ATScm -2）。
- 继续执行步骤7.2和8的启动子表达模式的分析和步骤7.1，7.2或7.3的技术评估组织形成层细胞和组织的形态。
7.分析在形成层组织细胞和组织形态
注：下面是已成功地用于ISSA的分析技术的选择衍生的样品。
- 分析木质部小区区域，管腔面积，细胞壁厚度和细胞壁面积使用扫描电子显微镜（SEM）的。
注：此协议需要最少的样品制备和允许相对高吞吐量与概括的形态性状行业分析。- 从这一步开始，请确保白大褂，保护眼睛和木本时组织被处理，处理后用于手套。
- 识别用于分析的形成层部门和使一个切口大约0.5mm至其任一侧使用单个边缘刀片创建光盘（ 图2a）。
- 修剪掉多余木质部组织留下木质部组织约1mm到扇区的切向一侧（ 图2b）。
- 小心LY使用新鲜双刃刀片（ 图2c）横向切割通过该扇区的中心。
- 使在横向平面任扇区侧的两个附加浅径向切口划定转基因组织（ 图2d）。如GUS染色不会深入渗透到组织沿着细胞的径向文件遵循在形成层表面发现染色的组织的两侧。
- 附上准备形成层界面到的SEM销存根的阶段使用SEM导电性带（ 图2e）装入和保持在干燥器直到需要用于SEM可视化。
- 重复步骤7.1.2至7.1.6为任何附加扇区包括来自阴性对照。
- 在低真空模式使用SEM（能源5千伏，斑3.0纳米），可视化和取该扇区内的细胞/组织的照片，以及将细胞/组织直接相邻的扇区（ 图2F）。倍率的量依赖于感兴趣的特征。对于木质部纤维，是2000倍适宜（ 图2G）。
- 一旦形成层部门已经显现，并在适当的放大倍率拍摄的照片，用图像测量软件测量感兴趣木质部细胞/组织形态特征。
- 进行统计分析，并进行多成对分析使用配对t检验来比较在转基因部门和相邻的非转基因的对照细胞/组织用于每个扇区确定的p（内从扇区边缘0.5毫米测量）测量形态之间的差-值。
- 重复步骤7.1.10为阴性对照。
- 在阳性对照示出了低的p值（α<0.05）的情况下，计算出转基因和相邻的非转基因细胞/组织的形态学性状之间的差异。在非配对t检验使用这个“差分值”与negat比较感兴趣的基因的作用香港专业教育学院控制以确定p值。
- 使用光学显微镜的干细胞/组织的形成层细胞/组织形态或启动子表达模式组织化学分析。
注：虽然耗费更多的时间，这种方法允许更多的分析选项，包括形成层动态， 如形成层宽度以及启动子表达模式的各个方面。此外，如果无法访问的SEM，该协议可被用作用于步骤7.1的替代品。- 使用剃刀刀片兴趣消费部门和直接与螺丝帽在至少2天的样品小瓶1-3毫升100％的乙醇于4℃一些周围组织的小块（不大于1mm 3）和地点在摇床上。的方式，将允许感兴趣的表面，以用切片机进行访问准备小块。
- 重复为任何附加扇区包括来自阴性对照。
- 除去液体并用2取代5％乙醇：75％的LR白混合物2天维持的条件。
- 重复步骤7.2.3用50％乙醇：50％的LR白，25％乙醇：75％的LR用100％LR白白然后最后两次。
- 将小块与对齐到短端利率表面嵌入模具，并用新鲜LR的白色仔细覆盖和聚合按照制造商的说明。
- 切割在旋转切片机从感兴趣的表面5μm的部分，并安装在载玻片。用番红O（0.01％）染色可视化细胞壁和/或其它特征。
- 添加安装媒体，放置盖玻片，并允许设置过夜。
- 查看100X和600X放大倍率和捕捉图像的光学显微镜下。
- 从捕获使用图像测量软件图像形态特征。
- 对于定量形态性状的统计分析，从步骤7.1.10遵循。
- 对于形态性状的定性分析，比较和描述了基因或感兴趣的启动子和负极和/或阳性对照观察到的模式。
- 在浸软纤维使用光学显微镜微纤丝角（MFA）分析。
- 消费转基因木质部直接从一个扇区以及从邻近它的非转基因组织的组织（在0.5毫米， 图2h），并发生在分开1.5毫升管中。重复为任何附加扇区包括来自阴性对照。
- 完成步骤7.3.3 7.3.5在通风橱。
- 添加过氧化氢的250微升和250微升冰醋酸至每个管。
- 放置管在加热块在90℃下，在通风橱2小时。
- 从管中取出组织并用蒸馏水仔细漂洗至少两次。
- 使用的水溶性安装介质，安装在载玻片组织并与前固定用盖玻片尖锐的镊子挑逗分开。
- 视图下，在放大倍数超过400倍较大的个体纤维的光镜和捕捉图像。
- 为了确定纤维的微纤丝角，测量坑孔和/或细胞壁条纹和利用图像测量软件的纤维（ 图2I）的长轴之间的角度。
- 进行统计分析，从步骤7.1.10遵循。
8.启动子的分析表达模式
- 分析专干组织中启动子表达模式。
- 相符的每个扇区类型感兴趣的启动子，以及阳性和阴性对照的频率如在步骤6.2.2说明。
- 比较不同扇区类型的频率的使用卡方检验，建立p值的阳性对照感兴趣的启动子。细胞/组织特异性的进一步分析可以使用步骤7.2根据需要进行。
- 如果多于一个的启动子的兴趣正在调查然后重复所有感兴趣的启动子和阳性对照之间的这种分析作出比较。
- 如果阴性对照观察到的部门或蓝染色，然后将它添加到分析，或根据程度或内源性染色怀疑（见讨论 ）抛弃。
- 启动子表达模式的分析过程中形成层衍生发展与分化。
- 使用解剖显微镜，可视化所有在步骤6.2中确定的形成层的扇区（图1G，1H，1I），并判断在从形成层的三种组织类型的存在/不存在蓝染色的;韧皮部（P），显影木质部（X1）或开发的木质部组织（X2）（参见图3a）。
- 按照步骤8.1.2，比较存在/不存在GUS染色的频率中的int启动子的P，X1和X2的区域用卡方检验，建立p值阳性对照erest。细胞/组织特异性的进一步分析可以使用步骤7.2根据需要进行。
- 欲了解更多考虑的步骤8.1.2.1 8.1.2.2和。
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Representative Results
使用该协议的所有活二次干细胞和组织类型已被证明是容易A.农杆菌转化并已确定为根据最初转化的细胞类型行业类型和其后续发展的增长模式。行业类型包括周皮，韧皮部，形成层，伤口实质和纤基乙酸钠（ 图1b，1C，1D）和一致的位置将在本段的剩余部分描述可以发现。一个周皮扇区包括发现只在周皮和从不延伸到所述韧皮部（ 图1e）的一组转化的细胞的。韧皮部扇区可以在发起层与周皮之间的各个位置然而发现，从不延伸到这些周围组织（ 图1F）。一个形成层部门由来自TRAN衍生转化木质部/形成层/韧皮组织的形成层初始和sformation可以发生在三种不同的模式：同时含有光线I）'完整'的形成层部门，摇身一变木质部/形成层/韧皮部通过木质部和形成层区从伤口实质组织的边界延伸到韧皮组织细胞，梭形细胞或射线元素只（ 图1G），二）“失去最初的”形成层界，全面形成层部门的一个变体，其中初始已从引发层留下镜像木质部和韧皮部部门和非转化引发层丢失（ 图1小时 ），和iii）'木质部只有'形成层界，从伤口薄壁组织，以可变的长度的边界延伸到新形成的xylogenic组织，但从未到达发起层（ 图1i）中转化的木质部组织。一种创伤实质扇区包含转化径向FIL发现无论是作为一个单独的细胞或细胞群体，往往伤口薄壁细胞ES，位于前现有的木材和新形成的木质部（ 图1J）之间。一纤基乙酸钠行业包括预先存在的木材中发现的船只改造的侵填体（ 图1K）。
两种基因和感兴趣的研究，以及它们的阳性对照的启动子代表转化效率数据示于表1和表2中 。数据已经从在相同的时间段（DEC-4月）在相同的基因型进行了两次大型试验得出桉树的杨树和跨连续两年参与了一些木材形成的基因和感兴趣的推动者。着眼于阳性对照从兴趣研究的启动子（ 表2）时，最容易的组织类型为A.癌农杆菌的T-DNA转移是形成层组织中约60％，并分别在桉树和杨树确定的部门的40％为形成层部门。在桉树，未来最丰富的行业类型是在35％伤口软组织，而其他部门的类型都有5％以下ATScm -2值。在杨树，下一个最丰富的扇区类型是在20％，其次是韧皮部在15％卷绕实质而所述扇区类型的其余部分在低于5％的频率被发现了。其中韧皮部剥离协议用于（ 表1，步骤5.2.1）由于能力用于染色和可视化的可能性在形成层窗口找到一扇区，以及确定形成层扇区更大数目的较高可能性是典型形成层的整个区域。
在这些协议的发展许多变量进行了探索作为协议优化试验的一部分。这些措施包括细菌浓度在接种介质，介质类型在接种媒体，除了乙酰丁香酮的接种媒体，组织年龄和一个用。癌农杆菌菌株以及接种和基因型的时间。形成层扇区ATScm -2从这些试验的数据列于表3和表4。所研究的大多数变量，改变的时候，导致改变形成层ATScm -2物种和包括特别是在接种增加细菌的浓度媒体，在接种媒体使用MS和A.选择农杆菌菌株。此外，接种和树木基因型时表现出与接种桉树初夏更高ATScm -2，而桉树无性系和SG21 SG44表现出较高的形成层ATScm -2，41.6和40.4，分别比呈现给他人所有月份的总和显著差异。
平均形成层扇区大小而不同，并且依赖于它的切向和径向生长在形成层窗口的量。在一个子53扇区杨树，生长大约4个月的样品，扇区在形成层的切向宽度0.09和0.58毫米，平均为0.27mm之间变化，同时在范围为0.7至2.2毫米，平均为1.35形成层窗口的径向生长毫米。合并后，这些提供0.063 2和1.276转基因组织之间毫米毫米2进行分析。在相同物种188扇区的另一子样本，其中观察到在大约5个月横跨形成层窗口的径向生长的毫米1.5-4之间，平均扇区质量为72微克（ 表5）。
创建的转基因组织的量已被证明提供了足够的细胞和/或组织进行形态学测量以及对启动子活性的研究。例如，三个桉树的影响巨多项木质部纤维形态性状9是前的FLA文件 plored桉树无性系，并揭示了细胞大小确定（ 表6）EgrFLA2在MFA的决心和EgrFLA1可能发挥的作用。此外， 桉树表达模式巨在显影木质部（X1）CESA基因启动子，开发木质部（X2）和韧皮部（P）的组织中EgrCESA1，2，3，和EgrCESA4，5，7之间10确定显著不同的表达模式在桉树茎。在这种分析中，EgrCESA1，2，3被证明在显影木质部组织而EgrCESA4，5，7分别示出在两个显影木质部和韧皮部组织（ 图3b， 表7）待表达被主要表达。所有EgrCESA启动子表现出显著不同的表达模式与阳性对照（CaMV35S启动子）（ 表7）。
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图 1： 转基因扇区类型 （a）在使用韧皮部剥离协议（步骤5.2.1）处理后暴露的木质部的表面上观察形成层扇区。光盘显示杨树（B）的横向表面和桉树（c）使用了横向切割协议（步骤5.2.2）处理后的茎在一系列行业类型。 （ 四 ）扇区类型的发现在植物的茎的范围的示意图。周皮部门（E），韧皮部部门（F），'完整'的形成层部门（ 克 ），“失去了最初的”形成层部门（H），“木质部只有'形成层部门（I），伤口软组织部门（J）的例子和杨树部门纤基乙酸钠（K）。黑色箭头表示小尺寸领域的位置。所有比例尺= 1毫米。尔斯/ ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2：形成层部门利用扫描电镜和光学显微镜形态分析准备 （a）含有碟界切除术。 （ 二 ）盘调整，以去除多余的组织。通过转基因部门（C）的横向面切割。两个径向切口（ 四 ）介绍，以帮助 在扫描电镜定位下，转基因组织。安装在使用导电胶带的SEM针（ 五 ）组织。 （ 六 ）应被成像分析的转基因和非转基因组织的区域的描写。 （g）在放大2000倍捕获木质部纤维和射线细胞的典型形象。 （H 一 ）浸解纤维在光学显微镜下描绘凹坑和/或细胞壁条纹的角度和到该单元的长轴观看。黑色箭头指示坑光圈。比例尺= AF，H = 1毫米，G，I = 20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3： 分析与形成层衍生物的基因启动子的表达模式的结果 （ 一 ）在P（韧皮部）中，X（显影木质部）和X2（显影木质部）区的描写。 （ 二 ）的结果指示从涉及一系列CESA的试用在形成层扇区P，X1和X2染色的比例桉子桉转化成茎桉树杂交。数据Creux 等 10采购。 N =评估的扇区数。比例尺= 0.5毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 树种 | 矢量型 | 使用感兴趣的基因的数目 | 创建的窗口总数 | 窗口的总数，其中一个部门被确定（％） | 形成层ATScm -2形成层（在windows其中一个部门被确定） |
| 蓝桉×赤桉杂种（共三个克隆） | 阳性对照（感兴趣的基因） | 1（仅GUS） | 96 | 97％ | 45.1（1.5） |
| 感兴趣的基因 | 20 | 630 | 92％ | 46.1（2.2） | |
| 银白杨“锥状” | 阳性对照（目的基因） | 1（仅GUS） | 110 | 74％ | 10.8（1.5） |
| 感兴趣的基因 | 20 | 700 | 81％ | 14.6（0.8） |
表1：典型形成层ATScm -2阳性对照和感兴趣的基因图已经从和使用一系列基因和韧皮部剥离收获协议（步骤5.2中相同的桉树以上连续两年进行的研究杨树克隆来源。 1）。括号中的标准误差值。</ P>
| 树种 | 矢量型 | 启动子/基因数目 | 创建的窗口总数 | 窗口的总数，其中一个部门被确定（％） | ATScm -2各界 | ATScm -2周皮 | ATScm -2韧皮部 | ATScm形成层-2 | ATScm -2伤口薄壁 | ATScm -2 TYLOSE |
| 蓝桉点¯xcamal- dulensis混合动力车（共三个克隆） | 阳性对照 | <TD> 1（GUS只）118 | 63％ | 25.74（2.35） | 0.24（0.07） | 0.89（0.19） | 15.7（1.71） | 8.84（1.4） | 0.07（0.03） | |
| 感兴趣的促销员 | 28 | 1050 | 31％ | 14.67（1.77） | 0.02（0.01） | 0.05（0.01） | 13.79（1.75） | 0.78（0.21） | 0.03（0.01） | |
| 银白杨“锥状” | 阳性对照 | 1（仅GUS） | 110 | 54％ | 12.37（1.77） | 0.22（0.07） | 1.85（0.29） | 5.07（0.6） | 2.78（0.75） | 0.29（0.53） |
| 感兴趣的促销员 | 28 | 990 | 26％ | 8.28（1.18） | 0.16（0.04） | 0.9（0.09） | 6.67（1.16） | 0.27（0.07） | 0.28（0.11） |
表2：典型扇区ATScm -2阳性对照和感兴趣的启动子图已经从和使用一系列启动子序列和盘收获协议（步骤5.2中相同的桉树以上连续两年进行的研究杨树克隆来源。 2）。 ATScm -2值从那里一个部门只确定窗口的。括号内的标准误差值。 请点击这里查看此表的放大版本。
| 种类 | 审讯 | 处理说明 | 治疗窗数 | |
| 蓝桉 | A.集中在根癌农杆菌接种媒体 | 再悬浮在25毫升的MS | 10 | 1.4（0.62） |
| 再悬浮在5毫升的MS | 10 | 1.6（0.72） | ||
| 再悬浮在1ml MS（对照） | 10 | 2.4（1.16） | ||
| 在接种媒体媒体类型 | 磅 | 10 | 0.4（0.22） | |
| MS（控制） | 10 | 2.4（1.16） | ||
| 乙酰丁香酮除了接种媒体 | 随着乙酰丁香酮 | 11 | 0.9（0.37） | |
| 无乙酰丁香酮（对照组） | 11 | 0.6（0.64） | ||
| 茎组织的接种年龄 | 6个月（CONTRO升） | 11 | 1.1（0.66） | |
| 18个月 | 11 | 1.8（0.95） | ||
| A.杆菌菌株 | AGL1（对照组） | 18 | 0（0） | |
| C58 | 18 | 0.1（0.1） | ||
| LBA4404 | 18 | 0.6（0.4） | ||
| 银白杨“锥状” | A.浓度农杆菌媒体 | 再悬浮在25毫升的MS | 10 | 2.2（0.55） |
| 再悬浮在5毫升的MS | 10 | 2.7（0.63） | ||
| 再悬浮在1ml MS（对照） | 10 | 5.1（1.58） | ||
| 用于干接种介质类型 | 磅 | 10 | 2.8（0.71） | |
| MS（控制） | 10 | 5.1（1.58） | ||
| 乙酰丁香酮除了接种媒体 | 随着乙酰丁香酮 | 11 | 0.3（0.14） | |
| 无乙酰丁香酮（对照组） | 11 | 0.5（0.25） | ||
| 茎组织的接种年龄 | 6个月（对照组） | 11 | 1.5（0.33） | |
| 18个月 | 11 | 1.5（0.63） | ||
| A.杆菌菌株 | AGL1（对照组） | 20 | 8.1（2） | |
| C58 | 20 | 12.5（2） | ||
| LBA4404 | 20 | 11.1（2） |
表3：形成层ATScm -2调查作为协议优化创新的一部分，一系列变量的值。变量在杨树克隆并在数年以呈现形成层ATScm -2数据的范围蓝桉个体进行了调查。使用光盘收获协议（步骤5.2.2），形成层窗户收获。括号中的标准误差值。
| 蓝桉 × 赤桉克隆ID | 形成层的窗户每个月数 | 形成层ATScm -2晚春（月）接种 | 形成层ATScm -2麦秋（月）接种 | 形成层ATScm -2盛夏（1月）接种 | 形成层ATScm -2夏末（月）接种 | 形成层ATScm -2早秋（三月）接种 | 形成层ATScm -2所有月份的总和 |
| SG5 | 10 | 15.7（7.8） | 50.7（13.7） | 10.5（5.1） | 30.7（4.4） | 16.8（6.3） | 24.9（4.3） |
| SG6 | 10 | 6.1（3.1） | 38.5（15.1） | 4.5（1.7） | 14.5（3.3） | 27.6（8.4） | 18.3（4） |
| SG13 | 10 | 28.4（6.7） | 41.8（9.1） | 16.1（7） | 29.3（5.2） | 19.8（4.3） | 27.1（3.1） |
| SG18 | 10 | 6.7（2.9） | 18.3（6.7） | 17.4（3.4） | 19.2（6.1） | 18.1（6.3） | 15.5（2.4） |
| SG21 | 10 | 38.7（14.3） | 77（17.5） | 23.9（5.7） | 27.5（6.9） | 40.7（13.5） | 41.6（6） |
| SG35 | 10 | 23.5（10.2） | 42.8（12.2） | 7.6（2.5） | 17.6（4.3） | 31.3（4.6） | 24.6（3.8） |
| SG37 | 10 | 19.7（8） | 55.2（14.5） | 7.4（1.8） | 35（10.4） | 15.9（4.5） | 26.6（3.8） |
| SG39 | 10 | 12.5（2.4） | 23.6（6.3） | 6.9（3） | 26.3（8.1） | 7.3（2.3） | 15.5（2.6） |
| SG40 | 10 | 24.8（11） | 24.5（6.8） | 14（5.6） | 35.6（6.1） | 19.9（4.2） | 23.8（3.2） |
| SG44 | 10 | 22.3（3.4） | 63（29.3） | 9.8（2.6） | 52.5（10.3） | 54.3（15） | 40.4（7.4） |
| SG46 | 10 | 15.3（5.2） D> | 63.9（20.1） | 23.6（4） | 22.5（4.8） | 17.4（4.9） | 28.5（5.1） |
| 每月形成层ATScm -2 | 19.9（5） | 45.3（9.1） | 12.6（2.8） | 27.8（4.5） | 24（5.1） |
表4：基因型和接种上形成层ATScm -2桉树无性系 时间的影响十个窗户都被每月推出超过生长期这是在五月收获的所有10种不同的蓝桉×赤桉克隆。月度数据提出了与总体平均每月和基因型ATScm -2也提出了各自的基因型。使用韧皮部剥离收获协议（步骤5.2.1）形成层窗户收获。括号中的标准误差值。ES / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg“目标=”_空白“>请点击这里查看此表的放大版本。
| 工厂编号 | 切除形成层的扇区数 | 所有部门的总质量（微克） | 行业的平均质量（微克） |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4,460 | 172 |
| 五 | 15 | 1320 | 88 |
| 6 | 22 | 2,490 | 113 |
| 7 | 19 | 1,720 | 91 |
| 8 | 三十 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| 总 | 188 | 13550 | 72 |
表5：一形成层扇区的典型质量九个植物45的窗口在杨树进行了研究，以确定扇区的平均质量并使用光盘收获协议（步骤5.2.2）收获。植物生长5个月，并穿过形成层窗口的径向增长是1-4毫米之间。
| 变形- ological特质 | GUS只（阳性对照） | 非转基因组织（仅GUS） | P值 | 利息1基因（FLA1） | 非转基因组织（FLA1） | P值 | 利息2基因（FLA2） | 非转基因组织（FLA2） | P值 | 息3的基因（FLA3） | 非转基因组织（FLA3） | P值 |
| 平均细胞壁厚度（μm）* | 1.81（0.1） | 1.65（0.1） | 0.2692 | 1.47（0.14） | 1.55（0.12） | 0.6403 | 1.65（0.13） | 1.78（0.13） | 0.4839 | 1.59（0.12） | 1.63（0.11） | 0.8254 |
| 平均细胞壁面积（微米2）* | 69。1（4.74） | 60.7（2.03） | 0.1229 | 64.1（15.68） | 59.9（9.79） | 0.5004 | 61.6（3.4） | 65（3.96） | 0.5182 | 61.9（3.56） | 61.5（3.16） | 0.9438 |
| 平均细胞面积（微米2）* | 115.9（11.01） | 99.9（5.1） | 0.2041 | 124.4（6.1） | 108（4.36） | 0.0445 | 110.8（8.45） | 111.3（9.06） | 0.9671 | 108.5（4.43） | 103（3.07） | 0.3204 |
| 平均管腔面积（微米2）* | 46.9（7.55） | 39.2（4.89） | 0.407 | 60.2（5.28） | 48.1（4.46） | 0.0991 | 49.2（7.56） | 46.3（7.5） | 0.7882 | 46.6（3.31） | 41.5（3.9） | 0.3264 |
| 平均微纤丝角（O）＃ | 24.3（0.75） | 24.2（0.45） | 0.8648 | 22.3（0.82） | 22.7（0.7） | 0.5664 | 23.7（0.55） | 26.6（0.5） | 0.0001 | 26（0.88） | 27.2（0.72） | 0.0903 |
表6：ISSA纤维形态测量从感兴趣研究的基因衍生的纤维细胞壁，细胞的大小和从桉×赤桉克隆来源的转基因纤维采取的MFA测量的比较茎桉树转化桉FLA文件 （EgrFLA1，2，3）和阳性对照组（仅GUS）与邻近的非转基因对照纤维。数据麦克米兰等 9来源。 *表示试验包括10根纤维的测量10部门（TOT100纤维的人）。 ＃表示试验涉及5纤维的测量在20个行业（共100根纤维的）。 α<以粗体显示0.05。 请点击这里查看此表的放大版本。
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS只（阳性对照） | |
| EgrCESA1 | 0.708 | 2.839 | 8.856 | 9.976 | 9.18 | 29.165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12.008 | 11.363 | 30.234 | |||
| EgrCESA3 | 15.151 | 16.123 | 15.488 | 37.791 | |||
| EgrCESA4 | 4.852 | 0.108 | 46.858 | ||||
| EgrCESA5 | 3.275 | 11.278 | |||||
| EgrCESA7 | 36.082 | ||||||
| GUS只（阳性对照） |
表7：智 在形成层衍生启动子表达模式比较得到 2 值 2驰对比分析，形成层中衍生P，X1和X2地区的存在/不存在GUS染色。间6 巨桉CESA基因启动子序列（EgrCESA 1，2，3，4，5，7）和阳性对照（GUS只）。数据Creux 等 10采购。 α<0.05下划线表示。
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Discussion
在ISSA协议是在几个月的基因和所涉及的木材感兴趣的启动子的分析在空间中树种创造转基因茎组织的相对简单和有效的方法和茎的形成。举手之劳，除了保持植物活，需要成长接种后其鲜明的对比，其中需要大量的培养，以维持组织或植物，其中木材生产可能需要长达几年开始或者一个真正的体外方法转基因茎组织专干不创建1。 ISSA也被证明是适用于广泛范围的树种，包括杨树 ， 桉树和松 6的属物种以及相思和Corymbia的（数据未示出），其中很少，如果有的话，优化需要获得转基因组织。使用这种方法，因此可以进行调查多家ö˚F基因或感兴趣品种最感兴趣的推动者。此外，该协议可自行或会同更广泛地应用于体外技术，多个基因可以在第一时间通过国际社会保障协会，以确定潜在的候选人向前采取更多的参与到体外方法进行调查中。
所描述的实施例表明，足够扇区可以创建从只有少量的转基因形成层的窗口进行下游分析。与ATScm -2杨树只有一个或两个形成层的窗口中桉树46.1和14.6的值将足以调查单性状，因为它有可能多个窗口添加到单个植物的茎或复制在众多植物。在实践中，然而，并非所有形成层窗口导致产生可以利用的一个形成层扇区的（ 见表1， 表2），为扇区的大小可以改变，它们通常是小并且在例可以位于靠近彼此限制了它们用于下游分析使用。此外，感兴趣的基因可在细胞生存力12或细胞发展的其他方面潜在地导致完全没有转基因的扇区对感兴趣的特定基因的影响。因此，建议以始终瞄准比可能需要用于分析更大数目的窗口。类似应谨慎使用ISSA启动子研究，作为显著变异可以与在某些情况下（ 表2）观察到的小/弱或无表达期望时被应用。然而，已显示出较少数量的扇区，少至6被成功地用于分析10。这些结果表明，仅涉及少数窗口相当温和的实验可导致显著见解基因功能和启动子活性。
从分析的角度来看，transgen的接近IC和非转基因的组织提供了一个功能强大的工具，以确定目的基因的性状之间的小而有意义的差异。取样直接彼此相邻的细胞和组织是相同的基因型背景，并通过在相同的环境条件下减少独立变量的数目和简化所需的统计分析被影响。从采样的角度来看，在ISSA功率分析衍生自多个实验数据（ 例如， 表6），已经表明，较小数目的每个扇区的测量， 例如，每扇区3-5细胞的细胞壁厚度，并测量更大数目扇区，例如 20-25扇区对于感兴趣的基因，提供了更有效和统计健壮抽样策略。每个扇区代表独立的转化事件或与确定多个转化事件的平均效果所进行的统计分析的细胞的'线'涉及感兴趣的基因。同样，要转换所有干组织的能力提供了一个机会来研究形成层分化期间的在整个干和更具体的利益的启动子的表达。这里描述ISSA协议通过到的样本，收集和组织和细胞形态和用于启动子表达模式的数据的分析收获提供从创建转基因组织的可靠和有效的管道。
在大多数情况下，扇区是一个单一的细胞，其通过细胞分裂可能已经引起一些衍生物的细胞和组织的转变的结果。例如，形成层扇区产生于术后伤口恢复成为形成层初始进而分割periclinally和anticlinally创建从原始伤口进入韧皮部延伸一路扇区的单个细胞的转化。在这些情况下，转化的初始保持形成层直至观察收获和一个“完整的”变体的时间内，然而，在这初始由径向生长期间形成层层丢失，取而代之的是一个未转化的通过“细胞浸润'相邻小区，那么'失去初始“变体将是的结果。为了保证行业类型的正确分类，并协助与结果的解释，强烈建议学生熟悉的二次开发茎缠绕和响应的解剖特点是ISSA结果分析的先决条件。此外，GUS试剂的pH值的定期测试建议（参见步骤5.6）。低pH（ 例如，低于6）可导致在植物茎内源性β-葡糖醛酸糖苷（GUS），其可以掩盖的扇区的真实程度或导致误报的识别的激活。其中，这是怀疑，则建议这些样品被从进一步分析中排除。该试剂GUS协议在为了缓解与内源GUS活性的潜在问题，从Hawkins 等被改编此处描述的研究可靠地施加。（2002）16，并利用附加的关键步骤包括二漂洗用磷酸盐缓冲液中平衡的样品到pH7，并热处理在55 10分钟摄氏度叫板内源性GUS活性17,18。 GUS试剂渗透性也是有限的，并且负责较少的部门使用横向圆盘协议相比，韧皮部剥离协议被识别。
造模已经显示的所有物种易受形成层组织的转型。但是，在两者之间和属和种内的ATScm显著差异-2已观察到。 A的类似应变农杆菌接种的时间/季节会影响ATScm -2。有人建议，开展这些变量的一些初步测试在特定在之前的大规模采纳该协议的调查ES和基因型。理论上有向年龄或大小没有限制的茎到ISSA可以只要有一个活跃生长形成层施加。然而，为了便于转基因组织扇区下游处理的建议接种茎约1cm的直径。
ISSA并非没有其局限性。转基因组织扇区的相对小的尺寸目前限制下游表型的方法，因此仅此类方法的一个有限数量的已被经常使用最新的。这些方法主要集中在形态学表征以上以及在二级细胞壁的单糖组合物的半定量估计所概述如在引言9,11指出。随着到来和生物材料的精细尺度分析新技术的细化有进一步发展潜力的其他分型为ISSA扇区管道，例如在细胞壁组成分析。它仍然困难的，但是，按部门来执行量化，扇区，基于核糖核酸（RNA）的基因表达和蛋白质研究和/或识别和传播ISSA通过体外培养衍生的转基因细胞用于到期GUS分析的破坏性附加分析。一些荧光报告基因和组织印刷已造模，以从各个扇区但迄今为止这些方法还没有被成功地用于介质在常规操作的高通量筛选量化的RNA。此外，如RNA干扰未试用迄今为止的转基因技术可以复杂化分析，其中GUS表达与靶基因的下调可能不共定位。
虽然有一些当前限制，新掺入和新兴技术和分析方法有可能克服这些限制，从而进一步增强ISSA一个的作用SA中高通量协议进行解剖形成层分化，木材发展的复杂的分子性质和形成干。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
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