Abstract
el crecimiento del tallo secundario en los árboles y la formación de madera asociados son significativos tanto desde las perspectivas biológica y comercial. Sin embargo, se sabe relativamente poco sobre el control molecular que regula su desarrollo. Esto es en parte debido a la física, los recursos y las limitaciones de tiempo a menudo asociados con el estudio de los procesos de crecimiento secundario. Un número de técnicas in vitro se han utilizado implica ya sea parte de la planta o sistema de toda la planta, tanto en leñosas y especies de plantas no leñosas. Sin embargo, las preguntas sobre su aplicabilidad para el estudio de los procesos de crecimiento de los tallos secundarios, la obstinación de ciertas especies y la intensidad del trabajo son a menudo prohibitivos para el medio a aplicaciones de alto rendimiento. Además, cuando se mira en la formación y el desarrollo del tallo secundario de la madera los rasgos específicos bajo investigación sólo podría llegar a ser medible tarde en el ciclo de vida de un árbol después de varios años de crecimiento. Al abordar estos retos alternativa in vivo protocols se han desarrollado, llamado inducido somática análisis del sector, lo que implica la creación de sectores de tejidos somáticos transgénicos directamente en el tallo secundario de la planta. El objetivo de este protocolo es proporcionar un medio eficaz, fácil y relativamente rápido para crear tejido vegetal secundario transgénicos para genes y caracterización funcional promotor que puede ser utilizado en una gama de especies de árboles. Los resultados presentados aquí indican que los sectores secundario del vástago transgénicas se pueden crear en todos los tejidos vivos y tipos de células en tallos secundarios de una variedad de especies de árboles y que la madera rasgos morfológicos, así como los patrones de expresión promotor en tallos secundarios se pueden evaluar fácilmente la facilitación de medio a alto caracterización funcional rendimiento.
Introduction
Troncos de los árboles comprenden una cantidad significativa de la biomasa y los planetas son de gran importancia biológica, cultural y comercial. Tallos secundarios crear hábitat proporcionando recursos y refugio para muchas otras formas de vida. Ofrecen muchos otros servicios de los ecosistemas que habitan y actúan como un recurso renovable para la producción de madera, pulpa y papel y otros productos madereros y no madereros. el desarrollo del tallo secundaria y la formación más específicamente la madera se rige por el sistema complejo molecular que regulan el desarrollo de determinados tipos de células, la composición bioquímica de sus paredes celulares y la forma en que se organizan para formar tejidos y órganos. La disección de las bases moleculares del desarrollo del tallo secundaria y formación de la madera es confundida por muchos factores, incluyendo la variabilidad de la madera y madre de propiedades dentro y entre los tallos, largos tiempos de generación, sistemas de apareamiento capaz de fecundación, alta heterocigosidad, de alta carga genética, inactividad estacional, a largo maduroperíodos de establecimiento de rasgos y el tamaño físico requerido por los árboles maduros. Como resultado de ello, la comprensión del desarrollo del tallo secundario en relación con el conocimiento detallado de la mayoría de los otros aspectos del control molecular del desarrollo de la planta, se encuentra todavía en su infancia.
Una serie de técnicas in vitro se han utilizado para estudiar y comprender el desarrollo del tallo secundario, en particular, la madera y la formación de la pared celular secundaria. Estos protocolos implican el uso de sistemas de parte de la planta de toda la planta o, cuando se crean cualquiera de las plantas transgénicas o células secundarias específicas o tejidos se transforman para el estudio de aspectos específicos de la madera y / o el desarrollo del tallo secundario 1. Las plantas transgénicas se pueden recuperar transformación posterior genético de una amplia variedad de tejidos de plantas y tipos de células, sin embargo, el progreso es lento, particularmente cuando se analizan rasgos de fibra de madera debido a la larga la regeneración y el vástago tiempos de maduración (en el orden de años), alta técnica y Deman laboralds, el bajo rendimiento de los genes candidatos, así como las dificultades en la propagación de algunas especies de plantas leñosas. Técnicas similares se han desarrollado en el modelo de sistema no leñosas tales como Arabidopsis que superar con éxito algunas de estas limitaciones, pero no todos los tipos de células madre secundaria un presente en estos tallos y rasgos relacionados con la estacionalidad o la longevidad no pueden ser estudiados en dichas especies 2. Alternativamente, los sistemas de parte de la planta, tales como cultivos de callos radiata Pinu s 3 reducen los marcos de tiempo asociados. Sin embargo, estos métodos están limitados al estudio de un tipo de célula individual y sufren limitaciones similares como se ha indicado para los experimentos in vitro. Del mismo modo, las culturas madre apical 4 implican explantes enteros madre han demostrado ser prometedores pero hasta el momento no se han aplicado para el estudio de los genes o promotores específicos de interés. Más recientemente, un protocolo alternativo que implica cultivos de raíces peludas se ha desarrollado para eucaliptos y ha sido con éxitoaplicó 5, sin embargo, este método todavía requiere de cultivo in vitro, implica raíces secundarias en lugar de tallos y hasta la fecha se limita a una sola especie arbórea.
Inducida análisis sector somática (ISSA), como se describe aquí, se ha desarrollado para superar algunos de estos problemas proporcionando un medio a alto rendimiento herramienta de cribado funcional para genes y promotores con sospecha de papeles en la formación de madera y el desarrollo del tejido del tallo secundario. ISSA es un sistema de transformación y el cribado in vivo que fue desarrollado para reducir el tiempo necesario para producir las células y tejidos transgénicos en un vástago secundario intacta, mientras que la superación de la mano de obra, las limitaciones técnicas y de rendimiento de forma rutinaria usados en métodos in vitro. Los protocolos descritos aquí permiten la creación simultánea de cientos de sectores y células de tejido transformadas independientemente en tallos secundarios dentro de un corto período de tiempo, en las especies de árboles y tejido de interés sin gEnetic variación y / o ambiental dentro de plazos relativamente cortos y mano de obra barata. Técnicas de la AISS en vivo se describió por primera vez para la secundaria del vástago 6 y el brote 7 tejidos y desde entonces han ido perfeccionando en el tejido del tronco secundario a través de estudios de los genes y / o promotores implicados en la diferenciación cambial e incluyen: tubulina (TUB) 8, arabinogalactano fasciclina como ( FLA) 9, celulosa sintasa (CESA) 10, célula de dominio NAC pared asociada secundaria (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 y realmente interesante nuevo gen de proteína (ANILLO) H2 13. Estos estudios fueron realizados en secundaria tallos de las plantas de álamo y eucalipto y proporcionó información sobre la morfología celular, la química de la pared celular y la expresión génica.
Los protocolos descritos aquí están destinadas a reunir a la experiencia de unand conocimientos adquiridos a través del desarrollo y aplicación de la AISS de una serie de estudios publicados y no publicados en la última década. Se centran en la transformación in vivo de los tejidos del tronco secundario 6 y se concentran en estudios con el clon 'piramidal' Populus alba, Eucalyptus globulus, así como 11 de Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento toma investigadores a través del protocolo desde el cultivo de plantas y bacterias, transformación de los tejidos del tallo, crecimiento y cosecha de los tejidos, la identificación de las células y los tejidos transgénicos, preparación para las evaluaciones fenotípicas y métodos para la recogida y análisis de datos. Mientras que las técnicas con éxito se han aplicado para medir la composición de monosacáridos de la pared celular también 9,11, debido a limitaciones de espacio, este documento se centra en técnicas utilizadas para la célula de medida y la morfología del tejido y la comprensión de los patrones de expresión de genes en st secundariaems solamente. De acuerdo con ello, el protocolo como se describe es adecuado para aquellos que buscan obtener más conocimientos sobre la función y / o expresión de genes relacionados con tallos secundarios usando un bajo costo, técnicamente fácil, y medio a método de alto rendimiento.
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Protocol
1. Preparación de material vegetal
- Antes de la experimentación, recaudar nuevas plántulas de las especies de árboles preferidos de la semilla o el corte y hacer crecer el árbol / s hasta que el diámetro del tallo en la zona destinada a la experimentación es de aproximadamente 1 cm de diámetro.
Nota: El tiempo necesario puede variar debido a las tasas de crecimiento de las plantas, por lo tanto permiten que entre tres y nueve meses de este paso.
2. Creación del vector binario
- Llevar a cabo el trabajo de esta sección a la sección 7 en un laboratorio o invernadero donde Agrobacterium tumefaciens se pueden manejar y que el equipo de protección personal adecuado prescrito por el laboratorio se usa.
- Preparar un vector binario que contiene ya sea un gen de interés o knockdown casete de sobreexpresión y un reportero casete del gen β-glucuronidasa (GUS) o un promotor de interés fusionada a un gen GUS en función del tipo de estudio.
Nota: Hay una serie de BAC vector binariokbones que pueden ser de origen en el mercado o a través de redes de investigación, así como numerosas técnicas disponibles para insertar genes y promotores de interés en vectores binarios. En el contexto de este protocolo es hasta el experimentador para tomar la decisión sobre cómo crear un vector binario. - Transformar vector binario en una cepa desarmada de A. tumefaciens mediante electroporación o de choque térmico 14 y almacenar apropiadamente hasta que se necesite para la experimentación.
- Repita el paso 2.2 para cualquier positivo y / o controles negativos.
Nota: Los controles negativos deben incluir un vector binario que contiene no gen de interés de un gen de interés y un estudio de GUS sin promotor por un promotor de estudio interés. control positivo para un promotor del estudio de interés debe incluir un promotor 35S del virus mosaico de la coliflor (CaMV35s) fusionado a un reportero GUS.
3. Preparación de A. tumefaciens para la inoculación
- Al menos una semana antes de la experimentation, tomar una pequeña cantidad (aproximadamente 1 l) de A. tumefaciens preparado durante el paso 2.2 y 2.3 y diluirse en medio LB agar independiente con 14 placas que contienen los antibióticos apropiados para la selección bacteriana. Crecer a 28 ° C en una incubadora para formar pequeñas colonias y luego se almacena a 4 ° C hasta que se necesite.
- 48 horas antes de la experimentación, la transferencia de una colonia de A. tumefaciens de cada placa en separadas 50 ml tornillo superior tubos que contenían 5 ml de pre-calentado (28 ° C) medio LB 14 que contiene los antibióticos apropiados para la selección bacteriana y agitar a 200 rpm en un incubador agitador durante aproximadamente 48 horas a 28 ° C hasta mezcla es muy nublado.
- Entre 4-6 horas antes de la inoculación de tallos de plantas (sección 4) añadir 1 ml de LB / A. mezcla de Agrobacterium en un fresco 50 ml tornillo tubo superior que contiene 19 ml (dilución 1:20) de reciente caliente (28 ° C) medio LB con los antibióticos adecuados paraselección bacteriana. Si la densidad óptica (DO) a 600 nm (OD 600, medido por espectroscopia) está por encima de 0,1, se diluye adicionalmente con cálido LB hasta que esto se logra.
- Coloque diluida LB / A. tumefaciens mezcla de nuevo en el incubador agitador y agitar en las mismas condiciones (200 rpm, 28 ° C) hasta que OD 600 es de entre 0,4 hasta 0,6 y quitar.
- Centrifugadora LB / A. tumefaciens mezcla durante 15 minutos a 1.000 x g y 4 ° C.
- Se decanta el líquido y volver a suspender de inmediato A. tumefaciens sedimento en 1 ml de medio MS enfriada 15, transferir a 2 ml microtubo y almacenar en hielo hasta que se requiera para la inoculación (sección 4). Esta solución se conoce como inoculación de medios.
4. La inoculación del tallo de la planta con A. tumefaciens
- Iniciar la experimentación a finales de primavera o principios de verano el uso de plantas creadas en el apartado 1 que tienen un cambium activo y de rápido crecimiento. Un buen diagnóstico para unacambium de crecimiento activo y rápido es que el floema se puede despegar fácilmente del xilema.
- Encuentra una sección recta clara del tallo cerca de la base de la planta y quitar las hojas y ramas.
- El uso de un escalpelo afilado (preferiblemente N ° 11) u hoja de afeitar, crear un 1 cm "ventana cambial '2 en una sección libre del vástago mediante la introducción de dos incisiones paralelas vertical a través del floema de 20 mm de longitud y un 5 mm entre sí y luego una corte horizontal que conecta los dos cortes verticales en su extremo basal.
- Peel la tira floema creado por la incisión hacia arriba la exposición del tejido xilema desarrollo y añadir suficiente inoculación de medios de la etapa 3.6 para mojar la superficie del xilema desarrollo expuesta utilizando una pipeta (típicamente 5 a 10 l). Inmediatamente vuelva a insertar la tira floema.
- Obligar a la tira de floema al vástago firmemente con Parafilm.
- Repetir los pasos 4.2 a 4.5 para ventanas adicionales del cambium para el gen (s) o promotor (s) de interés creando unany ventanas nueva cámbiales menos 1 cm por encima o por debajo de otras ventanas del cambium y en un 90 ° al eje.
- Complete los pasos 4.2 a 4.5 para los vectores de control positivo y negativo (paso 2.4), lo que garantiza que cada vector se añade a la misma raíz de cada planta usada en el experimento.
- Controlar el crecimiento del tallo de diámetro periódicamente y la cosecha para el ensayo de GUS (sección 5) cuando el crecimiento radial de al menos 5 mm se ha observado en los tallos.
Nota: La cantidad de crecimiento radial necesaria depende de la cantidad de tejido necesario para el análisis aguas abajo.
5. La cosecha para GUS histológico Ensayo
- Impuestos Especiales de la "ventana cambial 'del tallo eliminación de cualquier tejido que no forma parte de un nuevo crecimiento dentro de la ventana del cambium.
- Para los estudios relativos a madurar xilema y morfología de las células / tejidos del floema, pelar el floema del xilema.
- Para los estudios de los que se requiere la zona cambial permanecer patrones de expresión intactos o promotor se van a evaluared, cortar la ventana cambial transversalmente usando una cuchilla de afeitar u otra cuchilla afilada en forma de discos de entre 0,5 y 1 mm de espesor.
- Coloque los tejidos de la ventana del cambium procesados en 14 ml redondas tubos de fondo y enjuague dos veces en tampón fosfato 0,1 M a pH 7 14. Asegúrese de que el tejido está completamente sumergido, permanece en solución durante al menos cinco minutos y el exceso de solución se elimina al final de el segundo enjuague.
- Añadir 5 ml de reactivo de GUS (0,5 mM X-gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico), EDTA 10 mM, 0,5% X-100 v / v, potasio Triton 0,5 mM ferricianuro (III), ferrocianuro de potasio 0,05 mM (II), hasta el volumen final con 0.1 mM de tampón de fosfato de pH 7; ver. Hawkins et al 16) a cada tubo. Si el tejido no está completamente sumergida, añadir el reactivo de GUS adicional.
- Incubar los tubos durante 10 min a 55 ° C en la oscuridad.
- Incubar los tubos para un adicional 12 a 16 h en un incubador agitador a 37 ° C en la oscuridadusando agitación suave (entre 30 y 60 rpm) para permitir la mezcla.
- Tras la retirada de la incubadora agitador verificar al azar el pH del reactivo de GUS en un pequeño subconjunto de tubos con papel de tornasol con un rango de pH 0-7.
- Si cualquiera de los tubos tienen un pH inferior a 6 a continuación, etiquetarlos. Continuar para comprobar el resto de los tubos que confirmar pH y la etiqueta si el pH es 6 o menos.
Nota: Las muestras con un pH inferior a 6 pueden no ser adecuados para el análisis. Estas muestras tienen que ser excluidos del análisis adicional.
- Si cualquiera de los tubos tienen un pH inferior a 6 a continuación, etiquetarlos. Continuar para comprobar el resto de los tubos que confirmar pH y la etiqueta si el pH es 6 o menos.
- Decantar reactivo GUS y reemplazar con suficiente etanol al 70% para cubrir el tejido.
- Almacenar a 4 ° C hasta que se necesite.
6. Identificación de Transgenic Tissue
- Con unas pinzas, sacar todo el tejido cambial la ventana de un tubo y colocar en pequeña bandeja o placa de Petri para permitir la visualización microscópica.
- El uso de un microscopio de disección entre 1X y 4X de aumento, identificar y contar el número de células o tejidosque tienen una coloración azul brillante. Las células teñidas de azul o tejidos se conocen como un sector desde este punto en adelante. Cuenta de ellos en las siguientes maneras.
- Para muestras en las que el floema se ha eliminado (paso 5.1.1), cuente el número de sectores en el tejido cambial encuentra en la superficie del xilema en desarrollo (sector cambial, Figura 1a).
- Para las muestras que han sido cortadas en discos (etapa 5.1.2), contar los sectores número encontrado en los diferentes tipos de células o tejidos (Figura 1b, 1c, 1d). Sectores se pueden encontrar en los siguientes tipos de tejido: la peridermis (sector Peridermo, la figura 1e), el floema (sector del floema, Figura 1f), el tejido cambial (sector cambial, Figura 1g, 1h, 1i), el parénquima de la herida (herida parénquima Sector, Figura 1j) y en las tílides (sector Tylose, Figura 1k).
- Durante una microscópicaEVALUACIÓN asegurar que ambos lados de un disco han sido consultados y que los sectores que se producen a través de dos discos están emparejados de modo que los números no son exagerados.
- Coloque sectores sólo el tejido que contiene de nuevo en el tubo que contiene 70% de etanol y almacenar hasta que se necesiten.
- Repita el paso 6.1 a 6.3 de las ventanas del cambium adicionales, incluyendo el control positivo y / o negativo.
- Calcular el promedio de eficiencia de transformación para cada tipo de sector para cada gen o promotor de interés y los controles por separado dividiendo el número total de sectores por el número total de 1 cm 2 ventanas del cambium para derivar una Cantidad promedio de transformación de Eventos por cm 2 de Cambium inoculado (ATScm -2).
- Continúe con el paso 7.2 y 8 para el análisis de los patrones de expresión del promotor y del paso 7.1, 7.2 o 7.3 para técnicas para evaluar la morfología del tejido celular y en el tejido cambial.
7. Análisis deMorfología de células y tejidos en el tejido cambial
Nota: la siguiente son una selección de técnicas que se han utilizado con éxito para el análisis de ISSA deriva muestras.
- Análisis de área de xilema célula, área de la luz, el espesor de la pared celular y el área de la pared celular usando microscopía electrónica de barrido (SEM).
Nota: Este protocolo requiere una preparación mínima de la muestra y permite un relativamente alto rendimiento de análisis del sector en relación con los rasgos morfológicos descritos.- A partir de este paso adelante, por favor asegúrese de bata de laboratorio, gafas protectoras y guantes se utilizan cada vez está siendo manejado y tratado tejido leñoso.
- Identificar un sector cambial para el análisis y hacer una incisión de aproximadamente 0,5 mm a cada lado de ella utilizando una única cuchilla de afeitar borde para crear un disco (Figura 2a).
- Se quita el exceso de tejido xilema dejando aproximadamente 1 mm de tejido xilema en el lado tangencial del sector (Figura 2b).
- CuidadosoLy cortada transversalmente a través del centro del sector utilizando una hoja de afeitar de doble filo fresco (Figura 2c).
- Hacer dos incisiones poco profundas radiales adicionales en el plano de cada lado de sector transversal para demarcar el tejido transgénico (Figura 2d). Como GUS tinción no penetrará profundamente en el tejido a lo largo de seguir los archivos radiales de células a cada lado del tejido manchado que se encuentra en la superficie del cambium.
- Coloque la cara sector cambial preparado hasta el escenario de un talón de pasador de montaje usando SEM SEM cinta conductora (Figura 2e) y mantener en el desecador hasta que sea necesario para la visualización SEM.
- Repita los pasos 7.1.2 a 7.1.6 para todos los sectores adicionales, incluyendo los del control negativo.
- El uso de un SEM en un modo de bajo vacío (energía de 5 kV, el clavo 3,0 nm), visualizar y tomar fotos de las células / tejidos dentro del sector, así como las células / tejidos directamente adyacente al sector (Figura 2f). La cantidad de magnificacióndepende de las características de interés. Para las fibras del xilema, 2,000x es adecuado (Figura 2g).
- Una vez que un sector de la cambial se ha visualizado y fotografías tomadas con un aumento de su caso, medir xilema de células / tejidos rasgos morfológicos de interés utilizando el software de medición de imagen.
- Para el análisis estadístico, realizar múltiples parejas análisis utilizando pruebas t pareadas para comparar la diferencia entre morfológica medida en el sector de transgénicos y los no transgénicos control de las células / tejidos adyacentes (medida a menos de 0,5 mm del borde de sector) para cada sector para determinar una p -valor.
- Repita el paso 7.1.10 para el control negativo.
- En los casos en que el control positivo muestra un bajo valor de p (α <0,05), calcular la diferencia entre la transgénico y adyacente células no transgénicas / tejido para un rasgo morfológico. Utilice este "valor de la diferencia 'en una prueba t no pareada para comparar el efecto del gen de interés con la negative control para determinar un valor de p.
- El análisis histoquímico de los patrones de células del cambium / o morfología de los tejidos de expresión promotor en las células madre / tejidos, utilizando microscopía de luz.
Nota: Si bien el consumo de más tiempo, este método permite más opciones de análisis que incluyen aspectos de la dinámica del cambium, por ejemplo, anchura cambial, así como los patrones de expresión promotor. Además, si no puede acceder a un SEM, este protocolo se puede utilizar como una alternativa para el paso 7.1.- Sector de los impuestos especiales de interés utilizando hoja de afeitar y parte del tejido circundante como pequeños bloques (no mayor de 1 mm 3) y colocarla directamente en 1-3 ml de etanol al 100% en un vial de muestra con tapón de rosca durante al menos 2 días a 4 ° C en un agitador. Preparar el pequeño bloque de una manera que permitirá la superficie de interés que se accede por un microtomo.
- Repita el procedimiento con otros sectores, incluidos los de control negativo.
- Eliminar el líquido y reemplazar con 25% de etanol: 75% mezcla blanca LR durante 2 días, manteniendo las condiciones.
- Repita el paso 7.2.3 con etanol al 50%: 50% blanco LR, etanol al 25%: 75% LR blanca y finalmente dos veces con blanco LR 100%.
- Coloque pequeño bloque de Incorporación de molde con la superficie de interés alineado con el extremo corto y cubrir cuidadosamente con blanco fresco LR y polimerizar de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Cortar 5 micras secciones de la superficie de interés en un micrótomo rotatorio y montar en un portaobjetos de vidrio. Utilice safranina O (0,01%) tinción para visualizar la pared celular y / o otras características.
- Añadir medio de montaje, coloque una hoja de cubierta y permita que se asiente durante la noche.
- Ver bajo un microscopio de luz entre la imagen de captura de 100X y 600X aumentos y.
- Captar los caracteres morfológicos de las imágenes utilizando el software de medición imagen.
- Para el análisis estadístico de los rasgos morfológicos cuantitativos, una continuación de la etapa 7.1.10.
- Para el análisis cualitativo de los rasgos morfológicos,comparar y describir los patrones observados para el gen o el promotor de interés y el negativo y / o control positivo.
- Análisis de microfibrillas de ángulo (MFA) en las fibras triturados mediante microscopía de luz.
- Impuestos Especiales transgénico xilema tejido directamente de un sector, así como de los tejidos no transgénicos adyacente a ella (a menos de 0,5 mm, la figura 2h) y el lugar en distintos tubos de 1,5 ml. Repita el procedimiento con otros sectores, incluidos los de control negativo.
- Complete los pasos 7.3.3 a 7.3.5 en una campana de humos.
- Añadir 250 l de peróxido de hidrógeno y 250 l de ácido acético glacial a cada tubo.
- Coloque el tubo en el bloque térmico a 90 ° C durante 2 horas en la campana de humos.
- Extraer tejido de tubos y enjuagar cuidadosamente con agua destilada al menos dos veces.
- El uso de un medio de montaje soluble en agua, montar el tejido sobre un portaobjetos de vidrio y desmenuzar con pinzas cortantes antes de fijar una hoja de cubierta.
- Verbajo un microscopio de luz y de captura de imágenes de fibras individuales con una ampliación mayor de 400X.
- Para determinar el ángulo de microfibrillas de fibras, medir el ángulo entre las aberturas de pozo y / o estriaciones de la pared celular y el eje largo de la fibra (figura 2i) utilizando software de medición imagen.
- Para el análisis estadístico, una continuación de la etapa 7.1.10.
8. Análisis de patrones de expresión del promotor
- Análisis del promotor de patrones de expresión en los tejidos del tronco secundario.
- Tally la frecuencia de cada tipo de sector para el promotor de interés, así como los controles positivos y negativos como se ha indicado en el paso 6.2.2.
- Comparar la frecuencia de los diferentes tipos sector para el promotor de interés con el control positivo mediante pruebas de Chi-cuadrado para establecer los valores de p. Un análisis más detallado de la especificidad de la célula / tejido puede llevarse a cabo mediante el punto 7.2 como se requiere.
- Si más de un promotorde interés está siendo investigado luego repetir esta comparación entre la toma de análisis de todos los promotores de interés y el control positivo.
- Si se observan sectores o tinción con azul en el control negativo a continuación, añadir esto al análisis o abandonar dependiendo de la extensión o si se sospecha tinción endógena (ver Discusión).
- Análisis de los patrones de expresión de promotor Durante cambial Desarrollo Derivada y diferenciación.
- El uso de un microscopio de disección, visualizar todos los sectores del cambium (Figura 1g, 1h, 1i) identificados en la etapa 6.2 y determinar la presencia / ausencia de tinción con azul en tres tipos tejidos derivados del cambium; el floema (P), el desarrollo de xilema (X1) o tejido xilema desarrollado (X2) (véase la figura 3a).
- Como en el paso 8.1.2, comparar la frecuencia de presencia / ausencia de tinción de GUS en las regiones P, X1 y X2 de promotor de interest con el control positivo mediante pruebas de Chi-cuadrado para establecer los valores de p. Un análisis más detallado de la especificidad de la célula / tejido puede llevarse a cabo mediante el punto 7.2 como se requiere.
- Consulte los pasos 8.1.2.1 y 8.1.2.2 de consideraciones adicionales.
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Representative Results
El uso de este protocolo todos los tipos de células y tejidos del tallo secundarias en vivo han demostrado ser susceptibles a A. tumefaciens transformaciones y se han definido en tipos de sector basándose en el tipo de célula inicialmente transformada y que el patrón de crecimiento posterior desarrollo. Tipo de sector incluyen peridermis, floema, cambium, el parénquima de la herida y tilosa (Figura 1b, 1c, 1d) y se pueden encontrar en lugares consistentes describen en el resto de este párrafo. Un sector peridermis se compone de un grupo de células transformadas se encuentra exclusivamente en la peridermis y nunca se extiende en el floema (Figura 1e). Un sector floema se puede encontrar en varios lugares entre la capa de iniciación y la peridermis, sin embargo, nunca se extiende dentro de estos tejidos circundantes (Figura 1f). Un sector cambial se compone de los tejidos del xilema / cambium / floema transformadas derivadas de transformation de inicial cambial y puede ocurrir en tres modelos distintos: i), células de xilema / cambial / floema transformadas sector cambial 'completo' que se extienden desde el límite del tejido del parénquima de la herida a través de la zona de xilema y cambial al tejido del floema que contiene tanto los rayos y células fusiformes o elementos rayos solamente (Figura 1G), ii) el sector cambial 'inicial perdida', una variante del sector cambial completo en el que una inicial se ha perdido en la capa de iniciación dejando xilema de espejos y sectores del floema y una capa de iniciación no transformada (Figura 1h), y iii) 'xilema sólo "sector cambial, transformado tejido xilema que se extiende desde el límite del tejido parénquima herida para longitudes variables en el tejido recién formado xylogenic pero sin llegar nunca a la capa de iniciador (Figura 1i). Un sector parénquima herida contiene transforma las células del parénquima de la herida que se encuentran, ya sea como una célula o grupo de células individuales, a menudo en fil radialES, situado entre el pre-existente de madera y el tejido recién formado xilema (Figura 1j). Un sector tilosa compuesto por vasos tílides transformadas se encuentran dentro de la madera preexistente (Figura 1k).
Datos de eficiencia de transformación representativos de ambos genes y promotor de estudios de interés, así como sus controles positivos se presentan en la Tabla 1 y la Tabla 2. Los datos se han elaborado a partir de dos grandes ensayos llevados a cabo a través del mismo período de tiempo (diciembre-abril) en los mismos genotipos de eucalipto y el álamo en dos años sucesivos que implica una serie de genes formación de la madera y promotores de interés. Centrándose en los controles positivos a partir del promotor de los estudios de interés (Tabla 2), el tipo de tejido más susceptibles a A. transferencia tumefaciens T-ADN es los tejidos del cambium con aproximadamente 60% y 40% de los sectores identificados en eucaliptos y álamo respectivamentesiendo los sectores del cambium. En los eucaliptos, el siguiente tipo más abundante parénquima sector está herida en el 35%, mientras que los otros tipos sector todos tenían valores ATScm -2 por debajo del 5%. En álamos, el siguiente más abundante tipo sector se enrolla parénquima en 20%, seguido de floema en 15% mientras que el resto de los tipos del sector se encuentra a una frecuencia por debajo de 5%. Una mayor probabilidad de encontrar un sector en una ventana cambial, así como un mayor número de sectores del cambium identificados son típicos cuando se utilice el protocolo de cáscara de floema (Tabla 1, la etapa 5.2.1) debido a la capacidad para la tinción y la posibilidad de visualizar la toda la zona del cambium.
Durante el desarrollo de estos protocolos de un número de variables fueron exploradas como parte de los ensayos de optimización de protocolo. Estos concentración bacteriana incluido en la inoculación de medios, tipo de papel utilizado en la inoculación de medios, además de Acetosiringona a la inoculación de medios, la edad del tejido y A. cepa de Agrobacterium tumefaciens, así como momento de la inoculación y el genotipo. Sector cambial ATScm -2 datos de estos ensayos se presentan en la Tabla 3 y la Tabla 4. La mayoría de las variables investigadas, cuando se alteran, conducen a cambios en cambial ATScm -2 en ambas especies y se incluye, en particular, el aumento de la concentración de bacterias en la inoculación medios de comunicación, el uso de la EM en la inoculación de medios y la elección de A. cepa de Agrobacterium. Además, el tiempo de la inoculación y el árbol genotipo mostró diferencias significativas en los eucaliptos con inoculaciones a principios de verano que muestran mayor ATScm -2 mientras que los clones de eucaliptos SG21 y SG44 mostraron mayor cambial ATScm -2, 41,6 y 40,4, respectivamente, en comparación con los demás a través de todos los meses combinados.
el tamaño promedio del sector cambial es variable y depende de la cantidad de su crecimiento radial y tangencial en una ventana cambial. En una submuestra de 53 sectores en el álamo, cultivadas durante aproximadamente 4 meses, la anchura tangencial de sectores en el cambium varió entre 0,09 y 0,58 mm con un promedio de 0,27 mm mientras que el crecimiento radial a través de las ventanas del cambium a distancia 0,7-2,2 mm con un promedio de 1,35 mm. Cuando se combinan, estos siempre entre 0.063 mm y 1.276 mm 2 2 de tejido transgénico para su análisis. En otra submuestra de 188 sectores de la misma especie, donde se observó entre 1,5-4 mm de crecimiento radial a través de la ventana de cambial más de aproximadamente 5 meses, el sector de la masa promedio fue de 72 mg (Tabla 5).
La cantidad de tejido transgénico creado se ha demostrado que proporcionar células y / o tejidos para llevar a cabo mediciones morfológicas, así como para el estudio de la actividad promotora suficiente. Por ejemplo, la influencia de tres Eucalyptus grandis FLAs en un número de fibras de xilema rasgos morfológicos 9 era ex explorado en los clones de eucaliptos y puso de manifiesto las posibles funciones de EgrFLA2 en la determinación de la AM y EgrFLA1 en la determinación del tamaño celular (Tabla 6). Además, los patrones de expresión de Eucalyptus grandis promotor del gen CESA en el xilema en desarrollo (X1), xilema desarrollado (X2) y el floema (P) Los tejidos 10 identificados significativamente diferentes patrones de expresión entre EgrCESA1, 2, 3, y EgrCESA4, 5, 7 en los tallos de eucalipto. En este análisis, EgrCESA1, 2, 3, se mostró a ser expresada principalmente en el desarrollo de los tejidos del xilema mientras EgrCESA4, 5, 7, se mostró a ser expresado tanto en el xilema y floema en desarrollo (Figura 3b, Tabla 7). Todos los promotores EgrCESA mostraron significativamente diferentes patrones de expresión con el control positivo (promotor 35S de CaMV) (Tabla 7).
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Figura 1:. Transgénicas tipos sectores (a) sectores cambial tal como se ve en la superficie del xilema expuesta después de procesar utilizando el protocolo de cáscara de floema (paso 5.2.1). Los discos que muestran una amplia gama de tipos de sector en la superficie transversal de álamo en (b) y eucalipto (c) los tallos después de procesar utilizando el protocolo de corte transversal (paso 5.2.2). (D) Diagrama esquemático de la gama de tipos de sector que se encuentra en tallos de las plantas. Ejemplos de sector de la peridermis (e), el sector del floema (f), el sector cambial 'completa' (g), 'perdido inicial "sector cambial (h),' xilema única" sector cambial (i), el sector del parénquima de la herida (j) y tilosa sector (k) en el álamo. Las flechas negras indican dónde se encuentra el sector de menor tamaño. Todas las barras de escala = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2:. Preparación de los sectores del cambium para el análisis morfológico utilizando SEM y microscopía de luz (a) La escisión del sector de disco que contiene. (B) El disco recortado para eliminar el exceso de tejido. Cortar a través de la superficie transversal del sector transgénico (c). (D) La introducción de dos cortes radiales para ayudar en la localización del tejido transgénico bajo SEM. (E) de tejido montada en un pin de SEM utilizando cinta conductora. (F) Representación de la región de transgénicos y no transgénicos tejidos que deben ser fotografiada para su análisis. (G) Imagen típica de células de las fibras del xilema y rayas capturados con un aumento de 2,000x. (h (I) fibra Macerado observa bajo el microscopio de luz representa el ángulo de los pozos y / o estriaciones de la pared celular y al eje longitudinal de la célula. Negro flecha indica la apertura de boxes. Las barras de escala = AF, h = 1 mm, g, i = 20 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis y resultados de la expresión génica de promotor de patrones derivados del cambium (a) Representación de la P (floema), X1 (xilema en desarrollo) y X2 (xilema) desarrollado regiones.. (B) Los resultados que indican la proporción de P, X1 y X2 tinción en los sectores del cambium de un ensayo que incluyó una serie de CESA Eucalyptus grandis transforma en tallos de híbridos de eucalipto. Los datos suministrados por Creux et al. 10. n = número de sectores evaluados. Barra de escala = 0,5 mm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Las especies de árboles | tipo de vector | Número de genes de interés utilizado | Número total de ventanas creado | Número total de ventanas donde se identificó un sector (%) | Cambial ATScm -2 cambial (en las ventanas donde se identificó un sector) |
| Híbridos de Eucalyptus globulus x camaldulensis (un total de tres clones) | Control positivo (Los genes de interés) | 1 (sólo GUS) | 96 | 97% | 45,1 (1,5) |
| Los genes de interés | 20 | 630 | 92% | 46,1 (2,2) | |
| Populus alba 'piramidal' | Control positivo (Los genes de interés) | 1 (sólo GUS) | 110 | 74% | 10,8 (1,5) |
| Los genes de interés | 20 | 700 | 81% | 14,6 (0,8) |
Tabla 1:. ATScm cambial típica -2 para el control positivo y los genes de interés figuras son proveídos por estudios llevados a cabo durante dos años consecutivos en la misma eucalipto y clones de álamo mediante una amplia gama de genes y el protocolo de recolección de cáscara de floema (paso 5.2. 1). los valores de error estándar entre paréntesis. </ P>
| Las especies de árboles | tipo de vector | Número de promotor / genes | Número total de ventanas creado | Número total de ventanas donde se identificó un sector (%) | ATScm -2 todos los sectores | ATScm -2 Peridermo | ATScm -2 floema | Cambial ATScm -2 | ATScm -2 herida parénquima | ATScm -2 Tylose |
| Eucalyptus globulus x camal- dulensis híbridos (un total de tres clones) | Control positivo | <td> 1 (GUS solamente)118 | 63% | 25,74 (2,35) | 0,24 (0,07) | 0,89 (0,19) | 15,7 (1,71) | 8,84 (1,4) | 0,07 (0,03) | |
| Los promotores de interés | 28 | 1050 | 31% | 14,67 (1,77) | 0,02 (0,01) | 0,05 (0,01) | 13,79 (1,75) | 0,78 (0,21) | 0,03 (0,01) | |
| Populus alba 'piramidal' | Control positivo | 1 (sólo GUS) | 110 | 54% | 12,37 (1,77) | 0,22 (0,07) | 1,85 (0,29) | 5,07 (0,6) | 2,78 (0,75) | 0,29 (0,53) |
| Los promotores de interés | 28 | 990 | 26% | 8,28 (1,18) | 0,16 (0,04) | 0,9 (0,09) | 6,67 (1,16) | 0,27 (0,07) | 0,28 (0,11) |
Tabla 2:. ATScm sector típico -2 para el control positivo y promotores de interés figuras son proveídos por estudios llevados a cabo durante dos años consecutivos en la misma eucalipto y clones de álamo utilizando una serie de secuencias de promotor y el protocolo de recolección del disco (paso 5.2. 2). Los valores ATScm -2 se derivaron de las ventanas donde se identificó sólo a un sector. Los valores de error estándar entre paréntesis. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
| Especies | Juicio | tratamiento Descripción | Número de ventanas en el tratamiento | |
| Eucalyptus globulus | La concentración de A. tumefaciens en la inoculación de medios | Resuspendió en 25 ml MS | 10 | 1,4 (0,62) |
| Resuspendió en 5 ml MS | 10 | 1,6 (0,72) | ||
| Resuspendió en 1 ml MS (control) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| tipo de medio de inoculación de medios | LB | 10 | 0,4 (0,22) | |
| MS (control) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| La adición de Acetosiringona a la inoculación de medios | con Acetosiringona | 11 | 0,9 (0,37) | |
| Sin Acetosiringona (control) | 11 | 0,6 (0,64) | ||
| Edad del tejido del tallo inoculado | 6 meses (control) | 11 | 1,1 (0,66) | |
| 18 meses | 11 | 1,8 (0,95) | ||
| Cepa de A. tumefaciens | AGL1 (control) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0,1 (0,1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0,6 (0,4) | ||
| Populus alba 'piramidal' | La concentración de A. tumefaciens en medios | Resuspendió en 25 ml MS | 10 | 2,2 (0,55) |
| Resuspendió en 5 ml MS | 10 | 2,7 (0,63) | ||
| Resuspendió en 1 ml MS (control) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| Tipo de medio utilizado para la inoculación del tallo | LB | 10 | 2,8 (0,71) | |
| MS (control) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| La adición de Acetosiringona a la inoculación de medios | con Acetosiringona | 11 | 0,3 (0,14) | |
| Sin Acetosiringona (control) | 11 | 0,5 (0,25) | ||
| Edad del tejido del tallo inoculado | 6 meses (control) | 11 | 1,5 (0,33) | |
| 18 meses | 11 | 1,5 (0,63) | ||
| Cepa de A. tumefaciens | AGL1 (control) | 20 | 8,1 (2) | |
| C58 | 20 | 12,5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11,1 (2) |
Tabla 3: ATScm -2 valores cambial para una serie de variables investigadas como parte del protocolo de optimización de rutas. Las variables fueron investigados en un clon de álamo y una gama de Eucalyptus globulus individuos a través de un número de años con cámbiales ATScm -2 datos presentados. ventanas cambial se recogieron usando el protocolo de la cosecha del disco (paso 5.2.2). los valores de error estándar entre paréntesis.
| Eucalyptus globulus x clon camaldulensis ID | Número de ventanas cámbiales por cada mes | Cambial ATScm -2 Final de la primavera (noviembre) Inoculación | Cambial ATScm -2 Temprano (diciembre) Inoculación de verano | Cambial ATScm -2 mediados de verano (enero) Inoculación | Cambial ATScm -2 El final del verano (febrero) Inoculación | Cambial ATScm -2 principios de otoño (Marzo)Inoculación | Cambial ATScm -2 todos los meses combinados |
| SG5 | 10 | 15,7 (7,8) | 50,7 (13,7) | 10,5 (5,1) | 30,7 (4,4) | 16,8 (6,3) | 24,9 (4,3) |
| CE 6 | 10 | 6,1 (3,1) | 38,5 (15,1) | 4,5 (1,7) | 14,5 (3,3) | 27,6 (8,4) | 18.3 (4) |
| SG13 | 10 | 28,4 (6,7) | 41,8 (9,1) | 16,1 (7) | 29,3 (5,2) | 19,8 (4,3) | 27,1 (3,1) |
| SG18 | 10 | 6,7 (2,9) | 18,3 (6,7) | 17,4 (3,4) | 19,2 (6,1) | 18,1 (6,3) | 15,5 (2,4) |
| SG21 | 10 | 38,7 (14,3) | 77 (17.5) | 23,9 (5,7) | 27,5 (6,9) | 40,7 (13,5) | 41.6 (6) |
| SG35 | 10 | 23,5 (10,2) | 42,8 (12,2) | 7,6 (2,5) | 17,6 (4,3) | 31,3 (4,6) | 24,6 (3,8) |
| SG37 | 10 | 19,7 (8) | 55,2 (14,5) | 7,4 (1,8) | 35 (10.4) | 15,9 (4,5) | 26,6 (3,8) |
| SG39 | 10 | 12,5 (2,4) | 23,6 (6,3) | 6.9 (3) | 26,3 (8,1) | 7.3 (2.3) | 15,5 (2,6) |
| SG40 | 10 | 24,8 (11) | 24,5 (6,8) | 14 (5.6) | 35,6 (6,1) | 19,9 (4,2) | 23,8 (3,2) |
| SG44 | 10 | 22,3 (3,4) | 63 (29.3) | 9,8 (2,6) | 52,5 (10,3) | 54,3 (15) | 40,4 (7,4) |
| SG46 | 10 | 15,3 (5,2) d> | 63,9 (20,1) | 23,6 (4) | 22,5 (4,8) | 17,4 (4,9) | 28,5 (5,1) |
| Mensual cambial ATScm -2 | 19,9 (5) | 45,3 (9,1) | 12,6 (2,8) | 27,8 (4,5) | 24 (5.1) |
Tabla 4:. Influencia del genotipo y el momento de la inoculación en ATScm cambial -2 en clones de eucaliptos Diez ventanas se introdujeron cada mes durante la temporada de crecimiento de 10 diferentes clones de Eucalyptus globulus x camaldulensis, todos fueron cosechadas en mayo. Datos mensuales se presenta para cada genotipo con un ATScm mensual y genotípica promedio general -2 presentado también. ventanas del cambium se recogieron usando el protocolo de recolección de cáscara de floema (paso 5.2.1). los valores de error estándar entre paréntesis.en / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
| Número de plantas | Número de sectores del cambium extirpó | Masa total de todos los sectores (g) | Masa media de los sectores (g) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1.460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4.460 | 172 |
| 5 | 15 | 1,320 | 88 |
| 6 | 22 | 2,490 | 113 |
| 7 | 19 | 1,720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Total | 188 | 13.550 | 72 |
Tabla 5:. Masa típica de un sector cambial 45 ventanas a través de nueve plantas se investigaron en el álamo para determinar la masa media de un sector y se cosecha usando el protocolo de recolección del disco (paso 5.2.2). Las plantas se cultivaron durante 5 meses y el crecimiento radial a través de una ventana cambial fue de entre 1-4 mm.
| Morph- rasgo gico | GUS solamente (control positivo) | Tejido no transgénico (sólo GUS) | P-valor | Gen de interés 1 (FLA1) | El tejido no transgénico (FLA1) | P-valor | Gen de interés 2 (FLA2) | El tejido no transgénico (FLA2) | P-valor | 3 gen de interés (FLA3) | El tejido no transgénico (FLA3) | P-valor |
| Promedio Móvil de pared (micras) * | 1,81 (0,1) | 1,65 (0,1) | 0.2692 | 1,47 (0,14) | 1,55 (0,12) | 0.6403 | 1,65 (0,13) | 1,78 (0,13) | 0.4839 | 1,59 (0,12) | 1,63 (0,11) | 0.8254 |
| Promedio Móvil Área de pared (m 2) * | 69.1 (4.74) | 60,7 (2,03) | 0,1229 | 64,1 (15,68) | 59.9 (9.79) | 0.5004 | 61,6 (3,4) | 65 (3.96) | 0.5182 | 61,9 (3,56) | 61,5 (3,16) | 0.9438 |
| Zona media de la célula (m 2) * | 115.9 (11.01) | 99,9 (5,1) | 0.2041 | 124,4 (6,1) | 108 (4.36) | 0,0445 | 110.8 (8.45) | 111.3 (9.06) | 0.9671 | 108.5 (4.43) | 103 (3.07) | 0.3204 |
| Área de la luz media (m 2) * | 46.9 (7.55) | 39,2 (4,89) | 0,407 | 60.2 (5.28) | 48,1 (4,46) | 0,0991 | 49,2 (7,56) | 46,3 (7,5) | 0.7882 | 46.6 (3.31) | 41,5 (3,9) | 0.3264 |
| Promedio de microfibrillas de ángulo (O) # | 24,3 (0,75) | 24,2 (0,45) | 0.8648 | 22,3 (0,82) | 22,7 (0,7) | 0.5664 | 23,7 (0,55) | 26,6 (0,5) | 0.0001 | 26 (0.88) | 27,2 (0,72) | 0.0903 |
Tabla 6:. Mediciones morfología ISSA fibra derivada de gen de estudio interés Comparación de la pared celular de la fibra, el tamaño celular y mediciones del AMF tomadas de fibras transgénicas procedentes de eucalipto clones globulus x camaldulensis tallos transformó con Eucalyptus grandis FLA (EgrFLA1, 2, 3) y control positivo (sólo GUS) con las fibras de control transgénicos no adyacentes. Los datos suministrados por MacMillan et al. 9. * Indica que el ensayo incluyó la medición de 10 fibras en el sector 10 (totAl de 100 fibras). # Indica ensayo incluyó la medición de 5 fibras en 20 sectores (un total de 100 fibras). α <0,05 se muestra en negrita. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS solamente (control positivo) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2.839 | 8.856 | 9,976 | 9.18 | 29.165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12.008 | 11.363 | 30.234 | |||
| EgrCESA3 | 15.151 | 16.123 | 15.488 | 37.791 | |||
| EgrCESA4 | 4.852 | 0,108 | 46.858 | ||||
| EgrCESA5 | 3.275 | 11.278 | |||||
| EgrCESA7 | 36.082 | ||||||
| GUS solamente (control positivo) |
Tabla 7: Chi 2 valores derivados de la comparación de los patrones de expresión promotor en derivados del cambium Chi2 análisis comparando la presencia / ausencia de tinción GUS en P, X1 y X2 región de los derivados del cambium. entre seis Eucalyptus grandis CESA promotores de genes secuencias (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) y el control positivo (GUS solamente). Los datos suministrados por Creux et al. 10. α <0.05 se muestra en subrayado.
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Discussion
El protocolo de ISSA es un método relativamente sencillo y eficaz para la creación de tejidos del tallo transgénicas en las especies de árboles en el espacio de unos pocos meses para el análisis de genes y promotores de interés que participan en la madera y el vástago de formación. , Más allá de mantener vivas las plantas, se requiere poco esfuerzo para crecer tejido del tallo transgénico después de la inoculación, que contrasta con los métodos in vitro donde se requiere un extenso cultivo para mantener el tejido o plantas, donde la producción de madera puede tardar hasta años para iniciar o cuando un cierto secundaria del vástago no se crea 1. ISSA también se ha demostrado que es aplicable a una amplia gama de especies de árboles, incluyendo las especies en el género de Populus, Eucalyptus y Pinus 6, así como acacia y Corymbia (datos no mostrados) en la que muy poco, si lo hay, se requiere la optimización de derivar tejido transgénico. Usando este método, por lo tanto, es posible investigar un número of genes o promotores de interés en la mayoría de las especies de interés. Además, el protocolo puede ser utilizado por sí solo o en conjunción con más ampliamente utilizado en técnicas in vitro que múltiples genes pueden ser investigados mediante la AISS en primera instancia para identificar potenciales candidatos para sacar adelante a participar más en métodos in vitro.
Los ejemplos descritos muestran que los sectores suficientes pueden ser creados para llevar a cabo el análisis aguas abajo de sólo un pequeño número de ventanas del cambium transgénicos. Con los valores de -2 ATScm 46.1 y 14.6 de eucalipto en álamo sólo una o dos ventanas cámbiales serían suficientes para investigar un solo rasgo, ya que es posible añadir numerosas ventanas de un solo tallo de la planta o replicar en numerosas plantas. En la práctica, sin embargo, no todas las ventanas del cambium conducen a la creación de un sector cambial que puede ser utilizado (ver Tabla 1, Tabla 2) como el tamaño de los sectores puede variar, por lo general son pequeñosy en los casos puede estar situada en estrecha proximidad entre sí lo que limita su uso para el análisis de aguas abajo. Además, el gen de interés puede tener un impacto sobre la viabilidad celular 12 u otros aspectos del desarrollo de las células que potencialmente resulta en la ausencia completa de sectores transgénicos para un gen de interés específico. Por ello es recomendable para apuntar siempre a un mayor número de ventanas que podrían ser necesarios para el análisis. Similar se debe tener precaución cuando se utiliza la AISS para los estudios de promotor como una variabilidad significativa se puede esperar con poco / débil o ninguna expresión observada en algunos casos (Tabla 2). Sin embargo, un número más pequeño de sectores, tan poco como 6, se ha demostrado que ser utilizado con éxito para el análisis 10. Estos resultados muestran que los experimentos bastante modestos que implican sólo un pequeño número de ventanas pueden conducir a una mejor aproximación a la función de genes y la actividad del promotor.
Desde una perspectiva de análisis, la proximidad del transgenic y no transgénico tejido proporciona una poderosa herramienta para identificar pequeñas pero significativas diferencias en los rasgos entre los genes de interés. Las células y los tejidos muestreados directamente adyacentes entre sí son del mismo fondo genotípica y han sido influenciados por las mismas condiciones ambientales que reducen el número de variables independientes y simplificar el análisis estadístico requerido. Desde una perspectiva de toma de muestras, análisis de potencia en ISSA deriva los datos de varios experimentos (por ejemplo, Tabla 6), se ha demostrado que un número menor de mediciones por sector, por ejemplo, el espesor de pared celular de 3-5 células por sector, y la medición de un número mayor de sectores, por ejemplo, 20-25 sectores para un gen de interés, proporciona una estrategia de muestreo más eficiente y estadísticamente robusto. Cada sector representa un evento de transformación independientes o "línea" de las células con el análisis estadístico llevado a cabo para determinar el efecto promedio de múltiples eventos de transformaciónque implica el gen de interés. Del mismo modo, la capacidad de transformar todos los tejidos del tallo ofrece la oportunidad de estudiar la expresión de promotores de interés, a través de todo el tallo y más concretamente durante la diferenciación cambium. ISSA protocolos descritos aquí proporcionan una tubería fiable y validado a partir de la creación de tejido transgénico a través de la recolección de muestras, recolección y análisis de datos para el tejido y la morfología celular y de los patrones de expresión promotor.
En la mayoría de casos, los sectores son el resultado de la transformación de una sola célula, que a través de la división celular puede haber dado lugar a una serie de células y tejidos derivados. Por ejemplo, un sector cambial surge de la transformación de una sola célula que publicar la herida se convierte en una recuperación inicial del cambium que a su vez se divide periclinally y anticlinally para crear un sector que se extiende hasta el final de la herida original en el floema. En estos casos, se mantuvo la inicial transformadodentro del cambium hasta el momento de la cosecha y una variante de "completo" que se observa, sin embargo, en este inicial se pierde de la capa de cambium durante el crecimiento radial y reemplazado por un entonces no transformada vecina celular a través de "célula-invasión", un " variante inicial perdido 'será el resultado. Con el fin de garantizar la correcta clasificación de los tipos de sector y para ayudar con la interpretación de los resultados, se recomienda encarecidamente que la familiarización con las características anatómicas del tallo y de desarrollo de la herida respuestas secundarias son requisitos previos para el análisis de los resultados de la AISS. Además, se recomienda el análisis regular de el pH del reactivo de GUS (véase el paso 5.6). Un pH bajo (por ejemplo, inferior a 6) puede conducir a la activación de la beta glucuronidasas endógenos (GUS) en el tallo de la planta que pueden enmascarar el verdadero alcance de un sector o conducir a la identificación de falsos positivos. Cuando esto se sospecha, se recomienda que estas muestras sean excluidos de un análisis más detallado. El protocolo reactivo GUSaplicadas de forma fiable en los estudios descritos aquí con el fin de aliviar los problemas potenciales con actividad GUS endógena fue adaptado de Hawkins et al. (2002) 16 y utiliza pasos clave adicionales, incluyendo dos enjuagues con tampón de fosfato de equilibrar las muestras a pH 7, y un tratamiento térmico a 55 o C durante 10 minutos para desestabilizar la actividad GUS endógena 17,18. GUS reactivo permeabilidad también es limitado y es responsable de un menor número de sectores ser identificados utilizando el protocolo de disco transversal en comparación con el protocolo de cáscara de floema.
Todas las especies de Code Factory han demostrado ser susceptibles a la transformación del tejido cambial. Sin embargo, se han observado diferencias significativas en la ATScm -2 entre y dentro de género y especie. Del mismo modo la cepa de A. tumefaciens y el tiempo / temporada de la inoculación pueden influir ATScm -2. Se sugiere que la realización de algunas pruebas preliminares de estas variables en la especificacióny genotipos es objeto de la investigación antes de la adopción a gran escala del protocolo. En teoría no hay límite a la edad o el tamaño de los tallos a los que ISSA podría aplicarse siempre que hay un cambium en crecimiento activo. inoculación Sin embargo, para facilidad de procesamiento aguas abajo de los sectores de tejidos transgénicos se recomienda deriva de aproximadamente 1 cm de diámetro.
ISSA no está exento de limitaciones. El tamaño relativamente pequeño de sectores de tejidos transgénicos actualmente restringe métodos de fenotipado aguas abajo y en consecuencia sólo un número limitado de tales métodos se han utilizado rutinariamente hasta la fecha. Estos métodos se centran principalmente en la caracterización morfológica tal como se describe anteriormente, así como estimación cuantitativa semi de monosacáridos composición en la pared celular secundaria como se ha señalado en la introducción 9,11. Con el advenimiento y el perfeccionamiento de nuevas tecnologías para el análisis de escala fina de material biológico existe un mayor potencial para desarrollar el fenotipo adicionallas tuberías de los sectores de la AISS, por ejemplo, en el análisis de composición de la pared celular. Sigue siendo difícil, sin embargo, para llevar a cabo cuantitativa, sector por sector, la expresión génica a base de ácido ribonucleico (ARN) y proteínas estudios y / o identificar y propagar ISSA deriva células transgénicas a través de cultivo in vitro para el análisis adicional debido a la naturaleza destructiva del ensayo GUS . Algunos genes indicadores fluorescentes y la impresión de tejidos se han ensayado para cuantificar el ARN de los sectores individuales, pero hasta la fecha estos enfoques no han sido utilizados con éxito para el medio a cribado de alto rendimiento en la operación de rutina. Además, las técnicas transgénicas no Code Factory que hasta la fecha como RNAi podrían complicar el análisis, donde la expresión de GUS y la baja regulación de los genes diana pueden no co-localizar.
Si bien hay algunas limitaciones actuales, la incorporación de tecnologías nuevas y emergentes y los métodos analíticos son propensos a superar estas limitaciones, mejorando aún más el papel de un ISSAsa medio de protocolo de alto rendimiento para la disección de la naturaleza molecular de la diferenciación compleja cambial, desarrollo de la madera y el tallo formación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
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