Abstract
la crescita secondaria dello stelo in alberi e formazione del legno associato sono significativi sia dal punto di vista biologico e commerciali. Tuttavia, relativamente poco si sa circa il controllo molecolare che governa il loro sviluppo. Questo è in parte dovuto alla fisica, risorse e limitazioni di tempo spesso associato con lo studio dei processi di crescita secondari. Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati coinvolge sia parte di pianta o di tutto il sistema impianto sia legnoso e specie vegetali non legnose. Tuttavia, le domande circa la loro applicabilità per lo studio dei processi di crescita secondaria dello stelo, la riluttanza di alcune specie e l'intensità di lavoro sono spesso proibitivi per medie e applicazioni ad alta produttività. Inoltre, se si considerano la formazione di sviluppo gambo e legno secondario i tratti specifici sotto inchiesta potrebbero diventare solo misurabile fine del ciclo di vita di un albero, dopo diversi anni di crescita. In queste sfide alternativa in vivo protocols sono stati sviluppati, chiamato indotta somatica Analisi settoriale, che comporta la creazione di settori dei tessuti somatici transgenici direttamente nella secondaria dello stelo della pianta. Lo scopo di questo protocollo è quello di fornire un mezzo efficace, semplice e relativamente veloce generare transgenico tessuti vegetali secondaria per il gene e caratterizzazione funzionale promotore che può essere utilizzato in una varietà di specie di albero. I risultati qui presentati indicano che i settori staminali secondarie transgenici possono essere creati in tutti i tessuti vivi e di tipi di cellule nel secondario steli di una varietà di specie arboree e che il legno caratteristiche morfologiche e pattern di espressione promotore di secondaria steli può essere facilmente valutata facilitare medio-alta caratterizzazione funzionale di throughput.
Introduction
Albero deriva comprendono una notevole quantità di pianeti biomassa e sono di grande importanza biologica, culturale e commerciale. Secondaria steli creare habitat, fornendo risorse e rifugio per molte altre forme di vita. Forniscono molti altri servizi per gli ecosistemi in cui vivono e agiscono come risorsa rinnovabile per la produzione di legname, polpa e carta e altri prodotti di legno e non legnosi. sviluppo gambo secondario e più specificamente formazione del legno è regolata dal sistema molecolare complessa che regolano lo sviluppo di specifici tipi cellulari, la composizione biochimica delle loro pareti cellulari e come sono disposte a formare tessuti e organi. Dissezione delle basi molecolari di sviluppo secondaria dello stelo e la formazione del legno è confuso da molti fattori tra cui la variabilità delle proprietà del legno e staminali all'interno e tra le steli, lunghi tempi di generazione, out-crossing sistemi di accoppiamento, alta eterozigosi, alto carico genetico, dormienza stagionale, lungo maturoperiodi stabilimento tratto e la dimensione fisica pura e semplice di alberi maturi. Come risultato, comprensione dello sviluppo stelo secondaria rispetto alla conoscenza dettagliata della maggior parte degli altri aspetti del controllo molecolare di sviluppo delle piante, è ancora nella sua infanzia.
Un certo numero di tecniche in vitro sono stati utilizzati per studiare e comprendere lo sviluppo secondaria dello stelo, in particolare il legno e la formazione della parete cellulare secondaria. Questi protocolli prevedono l'utilizzo di piante intere o sistemi parte pianta, dove vengono creati sia piante transgeniche o cellule secondaria specifici o tessuti si trasformano per lo studio di aspetti specifici di legno e / o sviluppo secondaria dello stelo 1. Le piante transgeniche possono essere recuperati trasformazione post genetico da una vasta gamma di tessuti vegetali e tipi di cellule, tuttavia, il progresso è lento, soprattutto nell'analisi tratti di fibra di legno a causa di lunga rigenerazione e stelo tempi di maturazione (dell'ordine di anni), alta tecnica e Deman lavorods, bassa produttività dei geni candidati, nonché difficoltà di moltiplicazione alcune specie di piante legnose. Tecniche simili sono state sviluppate nel sistema modello non legnoso, come Arabidopsis che superare con successo alcune di queste limitazioni, ma non tutti i tipi di cellule staminali secondarie un presente in questi steli e le caratteristiche legate alla stagionalità o la longevità non può essere studiato in tali specie 2. In alternativa, i sistemi Parte della pianta, come ad esempio Pinu s radiata callo culture 3 riducono i tempi associati. Questi metodi sono tuttavia limitati allo studio di un tipo di cellula singola e soffrono vincoli simili come osservato per esperimenti in vitro. Allo stesso modo, le culture staminali apicali 4 coinvolgono espianti staminali intere hanno mostrato risultati promettenti, ma ancora non sono state applicate per lo studio di geni o promotori di interesse specifici. Più recentemente, un protocollo alternativo coinvolge colture di radici pelose è stato sviluppato per eucalypts ed è stato correttamenteapplicato 5, tuttavia, questo metodo richiede ancora nella coltivazione in vitro, coinvolge radici secondarie, piuttosto che i gambi e fino ad oggi si è limitato a una singola specie di alberi.
Induced analisi di settore somatica (ISSA), come descritto qui, è stato sviluppato per superare alcuni di questi problemi fornendo un mezzo per un throughput elevato strumento di screening funzionale dei geni e promotori con presunti ruoli in formazione del legno e lo sviluppo del tessuto secondaria dello stelo. ISSA è una trasformazione e di screening sistema in vivo che è stato sviluppato per ridurre il tempo necessario per produrre cellule transgeniche e tessuti in uno stelo secondaria intatta superando lavoro, limitazioni tecniche e throughput abitualmente utilizzati metodi in vitro. I protocolli descritti consentono la creazione simultanea di centinaia di settori tissue trasformati indipendentemente e cellule secondaria steli entro un breve periodo di tempo, nelle specie arboree e tessuto di interesse senza gvariazione Enetic e / o ambientale in tempi relativamente brevi e costo del lavoro basso. ISSA vivo tecniche in sono stati descritti per la secondaria dello stelo 6 e Bud 7 tessuti e da allora sono stati raffinati in tessuto secondaria dello stelo attraverso studi di geni e / o promotori coinvolti nella differenziazione cambiale e comprendono: tubulina (TUB) 8, fasciclin simile Arabinogalactan ( FLA) 9, cellulosa sintasi (CESA) 10, parete cellulare associato dominio nac secondaria (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e veramente interessante nuovo gene (RING) H2 proteina 13. Questi studi sono stati condotti in secondaria steli di piante di pioppo e eucalipto e forniti approfondimenti morfologia delle cellule, la chimica della parete cellulare e l'espressione genica.
I protocolli descritti qui hanno lo scopo di riunire l'esperienza di unND conoscenze acquisite attraverso lo sviluppo e l'applicazione di ISSA da una serie di studi pubblicati e non pubblicati negli ultimi dieci anni. Essi si concentrano sulla trasformazione in vivo dei tessuti staminali secondarie 6 e si concentrano su studi che coinvolgono clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus così come 11 Eucalyptus globulus x cloni camaldulensis. Questo documento prende ricercatori attraverso il protocollo dalla coltivazione di piante e batteri, la trasformazione dei tessuti staminali, la crescita e la raccolta di tessuto, identificazione di cellule e tessuti transgenici, preparazione per le valutazioni fenotipiche e metodi per la raccolta e l'analisi dei dati. Mentre le tecniche sono state applicate con successo per misurare la composizione monosaccharide parete cellulare anche 9,11, a causa di limitazioni di spazio, questo documento si concentra sulle tecniche utilizzate per la cella di misura e la morfologia dei tessuti e comprensione dei modelli di espressione genica in v secondariaSME soltanto. Di conseguenza, il protocollo come descritto è adatto a coloro che desiderano acquisire ulteriori approfondimenti sul ruolo e / o l'espressione dei geni legati alla secondaria steli con un basso costo, tecnicamente facile e medio-metodo di throughput elevato.
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Protocol
1. Preparazione di materiale vegetale
- Prima della sperimentazione, sollevare nuove piantine delle specie arboree preferito dal seme o taglio e crescere albero / s fino al diametro dello stelo nella zona destinata sperimentazione è di circa 1 cm di diametro.
Nota: Il tempo necessario può variare a causa di tassi di crescita delle piante, pertanto consentono tra tre a nove mesi per questo passo.
2. Creazione vettore binario
- Condurre il lavoro da questa sezione per sezione 7 in un laboratorio o in serra, dove Agrobacterium tumefaciens possono essere manipolati e che adeguati dispositivi di protezione individuale prescritti per il laboratorio viene utilizzato.
- Preparare un vettore binario contenente sia un gene di interesse o knockdown cassette sovraespressione e β-glucuronidasi (GUS) gene reporter cassetta o un promotore di interesse fusa a un gene GUS seconda del tipo di studio.
Nota: Ci sono un certo numero di binario vettore backbones che possono essere di provenienza commercio o attraverso le reti di ricerca, nonché numerose tecniche disponibili per inserire i geni e promotori di interesse in vettori binari. Nel contesto di questo protocollo è fino allo sperimentatore di prendere la decisione su come creare un vettore binario. - Trasforma vettore binario in un ceppo disarmato di A. tumefaciens utilizzando elettroporazione o shock termico 14 e memorizzare in modo appropriato fino al momento della sperimentazione.
- Ripetere il passaggio 2.2 per qualsiasi positivo e / o controlli negativi.
Nota: I controlli negativi dovrebbero includere un vettore binario contenente alcun gene di interesse per un gene di interesse e di studio una GUS promoterless per un promotore di studi di interesse. Controllo positivo per un promotore di studio di interesse dovrebbe includere un mosaico del cavolfiore 35S Virus promotore (CaMV35S) fuso con un reporter GUS.
3. Preparazione di A. tumefaciens per l'inoculazione
- Almeno una settimana prima experimentation, prendere una piccola quantità (circa 1 ml) di A. Agrobacterium preparata durante la fase 2.2 e 2.3 e diffondere sottilmente su terreno LB agar separato con 14 piastre contenenti antibiotici appropriati per la selezione di batteri. Crescere a 28 ° C in un incubatore a formare piccole colonie e quindi memorizzare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
- 48 ore prima della sperimentazione, trasferimento di una colonia di A. tumefaciens da ciascuna piastra in separati 50 ml vite superiore provette contenenti 5 ml di pre-riscaldato (28 ° C) mezzi LB 14 contenente antibiotici appropriati per la selezione batterica e agitata a 200 rpm in un incubatore agitatore per circa 48 ore a 28 ° C fino miscela è molto nuvoloso.
- Tra 4-6 ore prima inoculazione di steli di piante (sezione 4) aggiungere 1 ml di LB / A. Agrobacterium composto in un fresco 50 ml a vite tubo superiore contenente 19 ml (1:20 diluizione) di fresco caldo (28 ° C) mezzi LB con antibiotici appropriati perselezione batterica. Se la densità ottica (OD) a 600 nm (OD 600, come misurato mediante spettroscopia) è superiore a 0,1, diluire ulteriormente con caldo LB finché questo è realizzato.
- Posizionare diluita LB / A. tumefaciens miscela indietro sulla incubatore shaker e agitare alle stesse condizioni (200 rpm, 28 ° C) fino a OD 600 è compreso tra 0,4-0,6 e rimuovere.
- Centrifuga LB / A. miscela Agrobacterium per 15 minuti a 1000 xg e 4 ° C.
- Il liquido sovrastante e risospendere immediatamente A. Agrobacterium pellet in 1 ml di raffreddato supporti MS 15, trasferimento a 2 ml provetta e memorizzare sul ghiaccio fino al momento per l'inoculazione (sezione 4). Questa soluzione viene indicata come inoculo Media.
4. L'inoculazione di Stelo con A. Agrobacterium
- Inizia la sperimentazione durante la tarda primavera o all'inizio dell'estate utilizzando impianti creati nella sezione 1 che hanno un cambium attiva e in rapida crescita. Una buona diagnostica per unattiva e veloce cambium crescita è che il floema può essere facilmente sfogliato dal xilema.
- Trova un tratto rettilineo chiara del gambo vicino alla base della pianta e rimuovere eventuali foglie e rami.
- Usando un bisturi affilato (preferibilmente n ° 11) o lama di rasoio, creare da 1 cm 'finestra cambial' 2 in una chiara sezione del gambo con l'introduzione di due verticali incisione parallelo attraverso il floema di 20 mm di lunghezza e una 5 mm a parte poi un taglio orizzontale che collega i due tagli verticali alla loro estremità basale.
- Peel striscia floema creato da incisione alto esposizione del tessuto xilema sviluppo e aggiungere sufficiente Inoculation media dal punto 3.6 per bagnare la superficie del xilema sviluppare esposto con una pipetta (tipicamente 5-10 microlitri). reinserire immediatamente la striscia floema.
- Associare la striscia floema allo stelo saldamente con Parafilm.
- Ripetere i passaggi 4.2 al 4.5 per tutte le finestre cambiale aggiuntivi per il gene (s) o promoter (s) di interesse creandony finestre nuova cambiale almeno 1 cm sopra o sotto altre finestre cambiale e ad un 90 ° di offset.
- La procedura completa 4.2 a 4.5 per i vettori di controllo positivo e negativo (punto 2.4), verificando che ogni vettore viene aggiunto lo stesso stelo di ciascun impianto utilizzato nell'esperimento.
- Monitorare la crescita stelo di diametro periodicamente e raccolto per il saggio GUS (sezione 5) quando la crescita radiale di almeno 5 mm è stata osservata in steli.
Nota: La quantità di crescita radiale necessaria dipende dalla quantità di tessuto per l'analisi a valle.
5. La raccolta per GUS istologico Assay
- Excise la 'finestra di cambiale' dal gambo di rimuovere qualsiasi tessuto che non fa parte di una nuova crescita all'interno della finestra cambiale.
- Per gli studi relativi a maturare xilema e floema morfologia delle cellule / tessuti, sbucciare la floema dal xilema.
- Per gli studi in cui è richiesta la zona cambiale di rimanere pattern di espressione intatte o promotore devono essere valutareed, fetta finestra cambial trasversalmente con una lama di rasoio o altra lama affilata in dischi di tra 0,5 e 1 mm di spessore.
- Posizionare tessuti finestra cambiale trasformati in 14 ml rotondi tubi inferiori e lavare due volte in tampone fosfato 0,1 M a pH 7 14. Assicurarsi che il tessuto sia completamente sommerso, rimane in soluzione per almeno cinque minuti e tutta la soluzione in eccesso viene rimosso al termine del il secondo risciacquo.
- Aggiungere 5 ml di GUS reattivo (0.5 mM X-Gluc (acido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucuronico), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 v / v, 0,5 mM di potassio ferricianuro (III), 0,05 mM ferrocianuro di potassio (II), si porta a volume finale con 0,1 mM tampone fosfato pH 7;. vedere Hawkins et al 16) in ogni provetta. Se il tessuto non è completamente sommerso, aggiungere ulteriori reagente GUS.
- Incubare le provette per 10 minuti a 55 ° C al buio.
- Incubare le provette per un ulteriore 12-16 h su una incubatore shaker a 37 ° C al buiocon agitazione (tra 30 e 60 rpm) per consentire la miscelazione.
- Dopo la rimozione da agitatore incubatore controllare in modo casuale il pH del GUS reagente in un piccolo sottoinsieme di tubi utilizzando la carta di tornasole con un intervallo di pH 0-7.
- Se uno qualsiasi dei tubi hanno un pH inferiore a 6 poi etichettare. Continuare a controllare il resto dei tubi per confermare pH ed etichettare se il pH è di 6 o inferiore.
Nota: I campioni con un pH inferiore a 6 potrebbero non essere adatti per l'analisi. Questi campioni devono essere esclusi da ulteriori analisi.
- Se uno qualsiasi dei tubi hanno un pH inferiore a 6 poi etichettare. Continuare a controllare il resto dei tubi per confermare pH ed etichettare se il pH è di 6 o inferiore.
- Decantare GUS reagenti e sostituirlo con sufficiente etanolo al 70% per coprire il tessuto.
- Conservare a 4 ° C fino al momento dell'uso.
6. Individuazione di transgenici Tissue
- Utilizzando pinze, togliere tutto dalla finestra tessuto cambiale da un tubo e posto in piccolo vassoio o un piatto di Petri per consentire la visualizzazione microscopica.
- Utilizzando un microscopio da dissezione tra 1X e l'ingrandimento 4X, identificare e coincidere il numero di cellule o tessutiche hanno una brillante colorazione blu. cellule colorate blu o tessuti sono indicati come un settore da questo punto in poi. li coincidere nei seguenti modi.
- Per i campioni in cui il floema è stato rimosso (fase 5.1.1), contare il numero di settori nei tessuti cambial trova sulla superficie del xilema sviluppo (settore cambial, Figura 1a).
- Per i campioni che sono stati tagliati in dischi (fase 5.1.2), contare i settori numero trovato nei diversi tipi di cellule o di tessuti (Figura 1b, 1c, 1d). I settori possono essere trovati nei seguenti tipi di tessuto: il periderm (settore periderm, figura 1e), floema (settore Floema, Figura 1F), tessuto cambiale Settore Parenchima (settore cambiale, Figura 1g, 1h, 1I), parenchima ferita (Wound, Figura 1j) e tyloses (settore Tylose, Figura 1k).
- Durante microscopica unVALUTAZIONE garantire che entrambi i lati di un disco sono stati visti e che i settori che si verificano tra due dischi sono abbinati in modo che i numeri non sono sovrastimati.
- Posizionare i settori solo il tessuto contenente indietro nel tubo contenente il 70% di etanolo e conservare fino al momento.
- Ripetere il passaggio 6,1-6,3 per eventuali finestre aggiuntive cambiale tra cui il controllo positivo e / o negativo.
- Calcolare l'efficienza media di trasformazione per ogni tipo di settore per ciascun gene o promotore di interesse e controlli separatamente dividendo il numero totale di settori per il numero totale di 1 cm 2 finestre cambiale per ricavare un numero medio di Trasformazione Eventi per cm 2 di Cambium inoculato (ATScm -2).
- Passare al punto 7.2 e 8 per l'analisi dei pattern di espressione promotore e passo 7.1, 7.2 o 7.3 per le tecniche per valutare la morfologia delle cellule e dei tessuti nel tessuto cambiale.
7. Analisi diCellule e tessuti Morfologia in tessuto cambiale
Nota: Qui di seguito sono una selezione di tecniche che sono state utilizzate con successo per l'analisi di ISSA deriva campioni.
- Analisi dell'area xilema cellule, zona lumen, spessore della parete cellulare e la zona della parete cellulare mediante microscopia elettronica a scansione (SEM).
Nota: Questo protocollo richiede minima preparazione del campione e consente relativamente elevato throughput di analisi di settore relative alle caratteristiche morfologiche descritte.- Da questo punto in poi si prega di assicurare camice, occhiali e guanti vengono utilizzati ogni volta che il tessuto legnoso viene gestita e trattata.
- Identificare un settore cambial per l'analisi e fare un'incisione di circa 0,5 mm su entrambi i lati di esso utilizzando un'unica lama di rasoio per creare un disco (Figura 2a).
- Tagliare il tessuto xilema eccesso lasciando 1 mm circa di tessuto xilema sul lato tangenziale del settore (figura 2b).
- attentoly tagliato trasversalmente attraverso il centro del settore utilizzando un doppio bordo fresco lametta (figura 2c).
- Fare due ulteriori incisioni poco profonde radiali sul piano trasversale entrambi i lati del settore per delimitare il tessuto transgenico (figura 2d). Come GUS colorazione non penetra in profondità nei tessuti seguire i file radiali di cellule su entrambi i lati del tessuto macchiato trovato in superficie cambiale.
- Fissare preparato faccia settore cambial fino alla fase di un pin di stub SEM montaggio con del nastro conduttivo SEM (Figura 2e) e tenere a essiccatore fino al momento della visualizzazione SEM.
- Ripetere i punti 7.1.2 a 7.1.6 per eventuali ulteriori settori, tra cui quelli del controllo negativo.
- Utilizzando un SEM in una modalità di basso vuoto (energia 5 kV, Spot 3,0 nm), visualizzare e scattare foto di cellule / tessuti all'interno del settore, nonché il cellule / tessuti direttamente adiacente al settore (figura 2f). La quantità di ingrandimentodipende dalle caratteristiche di interesse. Per le fibre xilema, 2,000X è adatto (Figura 2G).
- Una volta che un settore cambiale è stata visualizzata e fotografie scattate ad un ingrandimento del caso, misurare xilema cellule / tessuti caratteristiche morfologiche di interesse utilizzando l'immagine software di misura.
- Per l'analisi statistica, si impegnano a coppie analisi multiple utilizzando appaiati t-test per confrontare la differenza tra morfologica misurata nel settore transgenico e l'adiacente non transgenici cellule di controllo / tessuto (misurata entro 0,5 mm dal bordo settore) per ciascun settore per stabilire un p -valore.
- Ripetere il passaggio 7.1.10 per il controllo negativo.
- Nei casi in cui il controllo positivo mostra un p-valore basso (α <0.05), calcolare la differenza tra il transgenico e adiacente cellule non transgeniche / tessuto per un tratto morfologico. Utilizzare questo 'valore di differenza' in un t-test spaiato per confrontare l'effetto del gene di interesse con il negative di controllo per determinare un valore p.
- analisi istochimica di modelli cellulari cambial / morfologia dei tessuti o di espressione promotore in cellule staminali / tessuti utilizzando la microscopia ottica.
Nota: Mentre più in termini di tempo, questo metodo consente più opzioni di analisi, compresi gli aspetti della dinamica cambiale, per esempio, larghezza cambial così come modelli di espressione promotore. Inoltre, se non è possibile accedere ad un SEM, questo protocollo può essere usato come alternativa a passo 7.1.- Settore Excise di interesse utilizzando lama di rasoio e alcuni tessuti circostanti come piccoli blocchi (non superiore a 1 mm 3) e posto direttamente in 1-3 ml di etanolo al 100% in una provetta con tappo a vite per almeno 2 giorni a 4 ° C su un agitatore. Preparare il blocchetto in modo che consentirà la superficie di interesse per essere utilizzati da un microtomo.
- Ripetere l'operazione per tutti i settori aggiuntive, tra cui quelli del controllo negativo.
- Rimuovere il liquido e sostituire con 25% di etanolo: 75% miscela bianco LR per 2 giorni mantenendo condizioni.
- Ripetere il passaggio 7.2.3 con il 50% di etanolo: 50% LR bianco, il 25% di etanolo: 75% LR bianco e poi, infine, due volte con 100% LR bianco.
- Mettere piccolo blocco in Incorporare stampo con la superficie di interesse allineati alle estremità corta e con attenzione coprire con fresca LR bianco e polimerizzare secondo le istruzioni del produttore.
- Tagliare 5 sezioni micron dalla superficie di interesse su un microtomo rotativo e montare su un vetrino. Utilizzare safranina O (0,01%) colorazione di visualizzare parete cellulare e / o di altre caratteristiche.
- Aggiungere mezzi di montaggio, inserire un vetrino e lasciare solidificare durante la notte.
- Vista al microscopio ottico tra immagine cattura 100X e 600X ingrandimento e la.
- Cattura caratteristiche morfologiche da immagini utilizzando software di misura di immagine.
- Per l'analisi statistica dei caratteri morfologici quantitativi, seguire su dal punto 7.1.10.
- Per l'analisi qualitativa dei caratteri morfologici,confrontare e descrivere i modelli osservati per il gene o il promotore di interessi e il negativo e / o controllo positivo.
- Analisi di microfibril Angle (AMF) in fibre macerata utilizzando la luce Microscopia.
- Excise transgenico xilema tessuto direttamente da un settore e da tessuto non transgenico ad essa adiacente (entro 0,5 mm Figura 2h) e posto in separati provette da 1,5 ml. Ripetere l'operazione per tutti i settori aggiuntive, tra cui quelli del controllo negativo.
- Completare le fasi 7.3.3 a 7.3.5 in una cappa aspirante.
- Aggiungere 250 ml di acqua ossigenata e 250 ml di acido acetico glaciale ad ogni provetta.
- Posizionare il tubo in blocco di calore a 90 ° C per 2 ore in cappa.
- Rimuovere il tessuto da tubi ed accuratamente risciacquo con acqua distillata almeno due volte.
- Utilizzando un mezzo di montaggio acqua solubile, montare il tessuto su un vetrino e prendere in giro a parte con pinze taglienti prima di apporre un vetrino.
- vistasotto una luce microscopio e catturare le immagini delle singole fibre a un ingrandimento maggiore di 400X.
- Per determinare l'angolo microfibril di fibre, misurare l'angolo tra le aperture pozzo e / o striature parete cellulare e l'asse lungo della fibra (Figura 2i) utilizzando immagine software di misura.
- Per l'analisi statistica, seguire su dal punto 7.1.10.
8. Analisi di promotore pattern di espressione
- Analisi di promotore pattern di espressione nei tessuti secondaria dello stelo.
- Coincidere la frequenza di ogni tipo settore per il promotore di interesse così come i controlli positivi e negativi, come indicato nel passaggio 6.2.2.
- Confrontare la frequenza dei vari tipi di settore per il promotore di interesse con il controllo positivo con test chi quadrato per stabilire p-value. Ulteriori analisi di specificità delle cellule / tessuto può essere effettuata utilizzando passo 7.2 come richiesto.
- Se più di un promotoredi interesse è indagato quindi ripetere questo paragone fare analisi tra tutti i promotori di interesse e del controllo positivo.
- Se settori o blu colorazione sono osservate nel controllo negativo quindi aggiungere questo all'analisi o abbandonare seconda misura o se si sospetta una colorazione endogena (vedi la discussione).
- Analisi di promotore pattern di espressione durante lo sviluppo cambiale derivativo e differenziazione.
- Utilizzando un microscopio da dissezione, visualizzare tutti i settori cambiale (Figura 1g, 1h, 1i) individuati nel passaggio 6.2 e determinare la presenza / assenza di colorazione blu in tre tipi tessuti derivati dal cambium; floema (P), lo sviluppo di xilema (X1) o tessuto xilematico sviluppato (X2) (vedi Figura 3a).
- Secondo passo 8.1.2, confrontare la frequenza di presenza / assenza di GUS colorazione nelle regioni P, X1 e X2 di promotore di interest con il controllo positivo con test chi-quadrato per stabilire p-value. Ulteriori analisi di specificità delle cellule / tessuto può essere effettuata utilizzando passo 7.2 come richiesto.
- Vedere i punti 8.1.2.1 e 8.1.2.2 per ulteriori considerazioni.
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Representative Results
Usando questo protocollo sono stati indicati tutti i tipi di cellule staminali e tessuti secondari dal vivo per essere suscettibile di A. tumefaciens trasformazioni e sono stati definiti in tipi di settore in base al tipo di cellule inizialmente trasformato ed è conseguente modello di crescita di sviluppo. Tipi settore includono periderm, floema, cambiale, parenchima delle ferite e Tylose (figura 1b, 1c, 1d) e possono essere trovati in posizioni coerenti descrivono nel resto di questo paragrafo. Un settore periderm comprende un gruppo di cellule trasformate trova esclusivamente nel periderm e non si estende nel floema (Figura 1e). Un settore floema può essere trovato in varie località tra lo strato di avvio e la periderm, però, non si estende in questi tessuti circostanti (Figura 1f). Un settore cambial è composto da tessuti trasformati xilema / Cambium / floema derivati dal trantrasforma- di iniziale cambial e può verificarsi in tre modelli distinti: i) settore 'pieno' cambiale, trasformato cellule xilema / cambial / floema che si estendono dal confine del tessuto della ferita parenchima attraverso lo xilema e cambiale zona al tessuto floema contenente sia ray e cellule fusiformi o elementi ray solo (Figura 1g), ii) 'perso iniziale' settore cambial, una variante del settore completa cambial dove un iniziale è stata persa dallo strato di avvio lasciando xilema speculare e settori floema ed uno strato di avvio non trasformata (Figura 1h), e iii) 'xilema solo' settore cambial, trasformato tessuto xilema estende dal confine del tessuto avvolto parenchima a lunghezza variabile nel tessuto neoformato xylogenic ma senza mai raggiungere lo strato di avvio (Figura 1i). settore Una ferita parenchima contiene trasformato cellule parenchima ferita trovati sia come una cellula o di gruppi di cellule individuali, spesso in fil radialeES, situato tra il bosco preesistente e del tessuto xilematico di nuova formazione (Figura 1 undecies). Un settore Tylose composto da tyloses vasi trasformati trovati all'interno del bosco preesistente (Figura 1k).
I dati di efficienza di trasformazione rappresentativi sia dei geni e promotore di studi di interesse così come i loro controlli positivi è presentato in Tabella 1 e Tabella 2. I dati sono stati tratti da due ampi studi condotti attraverso lo stesso periodo di tempo (da dicembre ad aprile) negli stessi genotipi di eucalipto e di pioppo su due anni consecutivi che coinvolge un numero di geni formazione del legno e promotori di interesse. Focalizzazione sui controlli positivi dal promotore di studi di interesse (Tabella 2), il tipo di tessuto più sensibili alla A. trasferimento tumefaciens T-DNA è tessuti cambiale con circa il 60% e il 40% dei settori individuati nel eucalipti e di pioppo, rispettivamente,essendo settori cambiale. In eucalipti, il prossimo più abbondante tipo settore è ferita parenchima al 35%, mentre le altre tipologie di settore avevano tutti i valori ATScm -2 di sotto del 5%. In pioppi, il successivo più abbondante tipo settore è avvolto parenchima al 20% seguita da floema al 15%, mentre il resto dei tipi settore sono stati trovati con frequenza inferiore a 5%. Una maggiore probabilità di trovare un settore in una finestra cambial nonché un maggior numero di settori cambiale individuati sono tipici in cui il protocollo buccia floema viene utilizzato (Tabella 1, punto 5.2.1) a causa della capacità di colorazione e la possibilità di visualizzare la intera area del cambio.
Durante lo sviluppo di questi protocolli alcune variabili sono state esplorate nell'ambito di prove di ottimizzazione protocollo. Questi concentrazione batterica incluso nel inoculazione Media, tipo di supporto del inoculazione Media, aggiunta di Acetosyringone all'inoculazione di media, l'età dei tessuti e A. ceppo Agrobacterium così come il tempo di inoculazione e genotipo. Settore cambial ATScm -2 dati di questi studi è riportata nella Tabella 3 e Tabella 4. La maggior parte delle variabili indagato, quando alterati, portano a variazioni cambial ATScm -2 in entrambe le specie e inclusi in particolare aumentando la concentrazione di batteri nel Inoculation media, uso di MS in inoculazione dei media e la scelta di A. ceppo Agrobacterium. Inoltre, il tempo di inoculazione e albero genotipo ha mostrato differenze significative nella eucalypts con inoculazioni a inizio estate che mostrano maggiore ATScm -2, mentre i cloni di eucalipto SG21 e SG44 hanno mostrato maggiore cambiale ATScm -2, 41.6 e 40.4, rispettivamente, rispetto ad altri, in tutti i mesi combinati.
Dimensione media settore cambial varia e dipende dalla quantità della sua crescita tangenziale e radiale in una finestra cambial. In un subcampione di 53 settori di pioppo, coltivate per circa 4 mesi, la larghezza della tangenziale di settori al cambium varia tra 0,09 e 0,58 millimetri con una media di 0,27 mm mentre la crescita radiale attraverso finestre cambiale a distanza 0,7-2,2 mm, con una media di 1.35 mm. La combinazione di questi forniti tra 0,063 millimetri 2 ei 1.276 mm 2 di tessuto transgenici per l'analisi. In un altro sottocampione di 188 settori della stessa specie, in cui è stata osservata tra 1,5-4 mm di crescita radiale attraverso la finestra cambiale più di circa 5 mesi, la messa settore media è stata di 72 mg (Tabella 5).
La quantità di tessuto transgenico creato ha dimostrato di fornire cellule e / o tessuti di effettuare misurazioni morfologiche e per lo studio dell'attività promoter sufficienti. Ad esempio, l'influenza di tre Eucalyptus grandis FLA su una serie di fibra xilema caratteri morfologici 9 era ex esplorata in cloni di eucalipto e ha rivelato i possibili ruoli per EgrFLA2 nella determinazione del MAE e EgrFLA1 in determinazione dimensione della cella (Tabella 6). Inoltre, i modelli di espressione di Eucalyptus grandis promotore del gene CESA nello xilema sviluppo (X1), xilema sviluppato (X2) e floema (P) i tessuti 10 identificati significativamente diversi modelli di espressione tra EgrCESA1, 2, 3, e EgrCESA4, 5, 7 in eucalipto steli. In questa analisi, EgrCESA1, 2, 3 hanno dimostrato di essere espressa in primo luogo nello sviluppo del tessuto xilematico mentre EgrCESA4, 5, 7 hanno dimostrato di essere espressa sia in xilema sviluppo e il tessuto floema (Figura 3b, tabella 7). Tutti i promotori EgrCESA hanno mostrato significativamente diversi modelli di espressione per il controllo positivo (CaMV35S promotore) (Tabella 7).
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Figura 1:. Tipi settori transgenici (a) i settori cambiale come visto sulla superficie del xilema esposta dopo l'elaborazione utilizzando il protocollo buccia floema (fase 5.2.1). Dischi mostrano una gamma di tipi di settore sulla superficie trasversale di in pioppo (b) e eucalipto (c) steli dopo l'elaborazione utilizzando il protocollo taglio trasversale (fase 5.2.2). (D) Schema della gamma di soluzioni di settore trovato in pianta steli. Esempi di settore periderm (e), settore floema (f), il settore 'pieno' cambiale (g), 'perso iniziale' settore cambiale (h), 'xilema solo' settore cambiale (i), settore parenchima ferita (j) e settore Tylose (k) in pioppo. frecce nere indicano dove si trovano più piccolo settore di dimensioni. Tutte le barre di scala = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Preparazione di settori cambiale per l'analisi morfologica al SEM e al microscopio ottico (a) Asportazione di settore disco contenente. (B) del disco tagliato per rimuovere il tessuto in eccesso. Taglio attraverso superficie trasversale del settore transgenico (c). (D) introduzione di due tagli radiali per assistere nel localizzare il tessuto transgenico in SEM. (E) Tissue montato su un perno SEM utilizzando nastro conduttivo. (F) Rappresentazione della regione transgeniche e tessuti non transgenici che dovrebbe essere ripreso per l'analisi. (G) tipica immagine di cellule fibra xilema e raggi catturati a 2,000X ingrandimento. (h (I) fibra macerato visto sotto microscopio ottico raffigurante l'angolo del box e / o striature parete cellulare e all'asse lungo della cella. freccia nera indica l'apertura fossa. Barre di scala = AF, h = 1 mm, G, I = 20 micron. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Analisi e risultati del gene pattern di espressione promotore di derivati cambiale (a) Rappresentazione della P (floema), X1 (sviluppo xilema) e X2 (xilema sviluppato) le regioni.. (B) I risultati indicano proporzione di P, X1 e X2 colorazione in settori cambiale da un processo che coinvolge una serie di CESA Eucalyptus Grandis trasformato in steli di ibridi di eucalipto. I dati provenienti da Creux et al. 10. n = numero di settori valutati. Barra di scala = 0,5 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| specie arboree | tipo di vettore | Numero di geni di interesse utilizzato | Numero totale delle finestre creato | Numero totale di finestre in cui è stato individuato un settore (%) | Cambial ATScm -2 cambial (in Windows, dove è stato identificato un settore) |
| Ibridi Eucalyptus globulus x camaldulensis (totale di tre cloni) | Controllo positivo (I geni di interesse) | 1 (solo GUS) | 96 | 97% | 45.1 (1.5) |
| Geni di interesse | 20 | 630 | 92% | 46.1 (2.2) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Controllo positivo (geni di interesse) | 1 (solo GUS) | 110 | 74% | 10.8 (1.5) |
| Geni di interesse | 20 | 700 | 81% | 14.6 (0.8) |
Tabella 1:. Tipica cambial ATScm -2 per il controllo positivo e geni di interesse figure sono state provenienti da studi effettuati nell'arco di due anni consecutivi nella stessa eucalipto e cloni di pioppo utilizzando una serie di geni e il floema protocollo buccia di raccolta (fase 5.2. 1). valori di errore standard tra parentesi. </ P>
| specie arboree | tipo di vettore | Numero di promotore / geni | Numero totale delle finestre creato | Numero totale di finestre in cui è stato individuato un settore (%) | ATScm -2 tutti i settori | ATScm -2 periderm | ATScm -2 Floema | ATScm -2 cambial | ATScm -2 ferita Parenchima | ATScm -2 Tylose |
| Eucalyptus globulus x camal- ibridi dulensis (totale di tre cloni) | controllo positivo | <(Solo GUS) td> 1118 | 63% | 25.74 (2.35) | 0.24 (0.07) | 0.89 (0.19) | 15,7 (1.71) | 8.84 (1.4) | 0.07 (0.03) | |
| Promotori di interesse | 28 | 1050 | 31% | 14.67 (1.77) | 0,02 (0,01) | 0.05 (0.01) | 13.79 (1.75) | 0,78 (0,21) | 0,03 (0,01) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | controllo positivo | 1 (solo GUS) | 110 | 54% | 12.37 (1.77) | 0,22 (0,07) | 1,85 (0,29) | 5.07 (0.6) | 2.78 (0.75) | 0,29 (0,53) |
| Promotori di interesse | 28 | 990 | 26% | 8.28 (1.18) | 0.16 (0.04) | 0,9 (0,09) | 6.67 (1.16) | 0.27 (0.07) | 0,28 (0,11) |
Tabella 2:. Settore tipico ATScm -2 per il controllo positivo e promotori di interesse figure sono state provenienti da studi effettuati nell'arco di due anni consecutivi nella stessa eucalipto e cloni di pioppo utilizzando una serie di sequenze di promotore e il protocollo disco di raccolta (fase 5.2. 2). I valori ATScm -2 sono stati ottenuti dalle finestre, dove un settore è stato identificato solo. Valori di errore standard tra parentesi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
| Specie | Prova | trattamento Descrizione | Numero di finestre in trattamento | |
| globulus Eucalyptus | La concentrazione di A. tumefaciens in inoculazione media | Risospesi in 25 ml di MS | 10 | 1.4 (0.62) |
| Risospeso in 5 ml MS | 10 | 1,6 (0,72) | ||
| Risospeso in 1 ml di MS (di controllo) | 10 | 2.4 (1.16) | ||
| Tipo di supporto in inoculazione media | LIBBRE | 10 | 0,4 (0,22) | |
| MS (di controllo) | 10 | 2.4 (1.16) | ||
| L'aggiunta di Acetosyringone dell'inoculazione media | con Acetosyringone | 11 | 0,9 (0,37) | |
| Senza Acetosyringone (controllo) | 11 | 0,6 (0,64) | ||
| Età dei tessuti staminali inoculato | 6 mesi (Control) | 11 | 1,1 (0,66) | |
| 18 mesi | 11 | 1,8 (0,95) | ||
| A. tumefaciens ceppo | AGL1 (controllo) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0.1 (0.1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0.6 (0.4) | ||
| Populus alba 'pyramidalis' | La concentrazione di A. tumefaciens nei media | Risospesi in 25 ml di MS | 10 | 2.2 (0.55) |
| Risospeso in 5 ml MS | 10 | 2,7 (0,63) | ||
| Risospeso in 1 ml di MS (di controllo) | 10 | 5.1 (1.58) | ||
| Il tipo di carta utilizzato per l'inoculazione staminali | LIBBRE | 10 | 2,8 (0,71) | |
| MS (di controllo) | 10 | 5.1 (1.58) | ||
| L'aggiunta di Acetosyringone dell'inoculazione media | con Acetosyringone | 11 | 0,3 (0,14) | |
| Senza Acetosyringone (controllo) | 11 | 0,5 (0,25) | ||
| Età dei tessuti staminali inoculato | 6 mesi (di controllo) | 11 | 1,5 (0,33) | |
| 18 mesi | 11 | 1,5 (0,63) | ||
| A. tumefaciens ceppo | AGL1 (controllo) | 20 | 8.1 (2) | |
| C58 | 20 | 12.5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11.1 (2) |
Tabella 3: cambial valori per una serie di variabili indagato nell'ambito di percorsi di ottimizzazione di protocollo ATScm -2. Le variabili sono state studiate in un clone di pioppo e una serie di eucalipto globulus individui in un certo numero di anni con cambiale ATScm -2 dati presentati. finestre cambial sono state raccolte utilizzando il protocollo disco di raccolta (fase 5.2.2). valori di errore standard tra parentesi.
| Eucalyptus globulus x camaldulensis clone ID | Numero di finestre cambiale per ogni mese | Cambial ATScm -2 tarda primavera (novembre) l'inoculazione | Cambial ATScm -2 inizio estate (dicembre) inoculazione | Cambial ATScm -2 metà estate (gennaio) inoculazione | Cambial ATScm -2 fine estate (febbraio) inoculazione | Cambial ATScm -2 all'inizio dell'autunno (marzo)Inoculazione | Cambial ATScm -2 tutti i mesi combinati |
| SG5 | 10 | 15,7 (7,8) | 50,7 (13,7) | 10.5 (5.1) | 30.7 (4.4) | 16.8 (6.3) | 24.9 (4.3) |
| SG6 | 10 | 6.1 (3.1) | 38.5 (15.1) | 4.5 (1.7) | 14,5 (3,3) | 27.6 (8.4) | 18.3 (4) |
| SG13 | 10 | 28,4 (6,7) | 41.8 (9.1) | 16.1 (7) | 29.3 (5.2) | 19.8 (4.3) | 27.1 (3.1) |
| SG18 | 10 | 6.7 (2.9) | 18.3 (6.7) | 17,4 (3,4) | 19.2 (6.1) | 18.1 (6.3) | 15.5 (2.4) |
| SG21 | 10 | 38.7 (14.3) | 77 (17.5) | 23,9 (5,7) | 27.5 (6.9) | 40.7 (13.5) | 41.6 (6) |
| SG35 | 10 | 23.5 (10.2) | 42.8 (12.2) | 7.6 (2.5) | 17.6 (4.3) | 31.3 (4.6) | 24.6 (3.8) |
| SG37 | 10 | 19.7 (8) | 55.2 (14.5) | 7.4 (1.8) | 35 (10.4) | 15.9 (4.5) | 26,6 (3,8) |
| SG39 | 10 | 12.5 (2.4) | 23.6 (6.3) | 6,9 (3) | 26.3 (8.1) | 7.3 (2.3) | 15.5 (2.6) |
| SG40 | 10 | 24.8 (11) | 24.5 (6.8) | 14 (5.6) | 35,6 (6,1) | 19.9 (4.2) | 23.8 (3.2) |
| SG44 | 10 | 22.3 (3.4) | 63 (29,3) | 9.8 (2.6) | 52.5 (10.3) | 54,3 (15) | 40.4 (7.4) |
| SG46 | 10 | 15.3 (5.2) d> | 63,9 (20,1) | 23.6 (4) | 22.5 (4.8) | 17,4 (4,9) | 28.5 (5.1) |
| Mensile cambiale ATScm -2 | 19.9 (5) | 45.3 (9.1) | 12,6 (2,8) | 27,8 (4,5) | 24 (5.1) |
Tabella 4:. L'influenza del genotipo e del tempo di inoculazione su ATScm cambial -2 in cloni di eucalipto dieci finestre sono stati introdotti ogni mese per la stagione di crescita a 10 diversi cloni di Eucalyptus globulus x camaldulensis che sarebbero state tutte raccolte a maggio. Dati mensili è presentato per ciascun genotipo con un ATScm mensile e genotipica media complessiva -2 presentato anche. finestre cambial sono state raccolte utilizzando il protocollo floema buccia di raccolta (fase 5.2.1). valori di errore standard tra parentesi.es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
| Numero delle piante | Numero di settori cambiale asportato | Massa totale di tutti i settori (mg) | Massa media dei settori (mg) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1.460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4.460 | 172 |
| 5 | 15 | 1.320 | 88 |
| 6 | 22 | 2.490 | 113 |
| 7 | 19 | 1.720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Totale | 188 | 13.550 | 72 |
Tabella 5:. Di massa tipica di un settore cambial 45 finestre attraverso nove stabilimenti sono stati studiati in pioppo per determinare la massa media di un settore e raccolte utilizzando il protocollo disco di raccolta (fase 5.2.2). Le piante sono state coltivate per 5 mesi e la crescita radiale attraverso una finestra cambiale era tra i 1-4 mm.
| Morph- tratto meto- | GUS solo (controllo positivo) | Tessuto non transgenici (solo GUS) | P-value | Gene di interesse 1 (FLA1) | Tessuto non transgenici (FLA1) | P-value | Gene di interesse 2 (FLA2) | Tessuto non transgenici (FLA2) | P-value | Gene di interesse 3 (FLA3) | Tessuto non transgenici (FLA3) | P-value |
| Spessore parete cellulare medio (micron) * | 1.81 (0.1) | 1.65 (0.1) | 0,2692 | 1.47 (0.14) | 1,55 (0,12) | 0,6403 | 1.65 (0.13) | 1,78 (0,13) | 0,4839 | 1.59 (0.12) | 1.63 (0.11) | 0,8254 |
| Muro Area cellulare medio (micron 2) * | 69.1 (4.74) | 60,7 (2.03) | 0,1229 | 64.1 (15.68) | 59,9 (9.79) | 0,5004 | 61.6 (3.4) | 65 (3.96) | 0,5182 | 61,9 (3.56) | 61.5 (3.16) | 0,9438 |
| Area cellulare medio (micron 2) * | 115,9 (11.01) | 99.9 (5.1) | 0,2041 | 124,4 (6,1) | 108 (4.36) | 0,0445 | 110,8 (8.45) | 111.3 (9.06) | 0,9671 | 108,5 (4.43) | 103 (3.07) | 0,3204 |
| Area Lumen media (micron 2) * | 46.9 (7.55) | 39.2 (4.89) | 0,407 | 60,2 (5.28) | 48,1 (4.46) | 0,0991 | 49,2 (7.56) | 46.3 (7.5) | 0,7882 | 46,6 (3.31) | 41.5 (3.9) | 0,3264 |
| Media microfibril Angle (O) # | 24,3 (0,75) | 24.2 (0.45) | 0,8648 | 22.3 (0.82) | 22,7 (0,7) | 0,5664 | 23,7 (0.55) | 26.6 (0.5) | 0.0001 | 26 (0.88) | 27,2 (0,72) | 0,0903 |
Tabella 6:. Misurazioni morfologia ISSA fibra derivata dalla gene di studio di interesse Confronto di parete cellulare fibra, le dimensioni delle cellule e le misure di AMF prese da fibre transgenici provenienti da eucalipto cloni globulus x camaldulensis steli trasformato con Eucalyptus grandis file FLA (EgrFLA1, 2, 3) e controllo positivo (GUS solo) con le fibre di controllo transgeniche non adiacenti. I dati provenienti da MacMillan et al. 9. * Indica processo ha coinvolto la misurazione di 10 fibre in 10 settori (totAl di 100 fibre). # Indica prova prevedeva la misurazione del 5 fibre in 20 settori (totale di 100 fibre). α <0.05 mostrato in grassetto. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS solo (controllo positivo) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2.839 | 8,856 | 9,976 | 9.18 | 29,165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12,008 | 11,363 | 30,234 | |||
| EgrCESA3 | 15,151 | 16,123 | 15,488 | 37,791 | |||
| EgrCESA4 | 4.852 | 0,108 | 46,858 | ||||
| EgrCESA5 | 3.275 | 11,278 | |||||
| EgrCESA7 | 36,082 | ||||||
| GUS solo (controllo positivo) |
Tabella 7: Chi 2 valori derivati dal confronto dei modelli di espressione promotore in derivati cambiale Chi 2 analisi confrontando la presenza / assenza di GUS colorazione in P, X1 e X2 regione dei derivati cambiale. tra i sei Eucalyptus grandis CESA promotori dei geni sequenze (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) e il controllo positivo (GUS solo). I dati provenienti da Creux et al. 10. α <0.05 mostrato in sottolineatura.
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Discussion
Il protocollo ISSA è un metodo relativamente semplice ed efficiente per la creazione di tessuti staminali transgeniche in specie di alberi nel giro di pochi mesi per l'analisi dei geni e promotori di interesse coinvolti in legno e stelo formazione. Poco sforzo, al di là di mantenere in vita le piante, è necessario far crescere transgenico tessuti staminali dopo l'inoculazione, che è in contrasto con i metodi in vitro in cui è necessario vasta coltura per mantenere il tessuto o le piante, dove la produzione di legno può durare fino a anni per iniziare o dove un vero e proprio gambo secondario non è stato creato 1. ISSA ha anche dimostrato di essere applicabile ad una vasta gamma di specie arboree, tra specie del genere di Populus, eucalipto e Pinus 6 nonché acacia e Corymbia (dati non mostrati) dove molto poco, se del caso, di ottimizzazione deve ricavare tessuti transgenici. Utilizzando questo metodo, è quindi possibile studiare un numero ogeni F o promotori di interesse nella maggior parte delle specie di interesse. Inoltre, il protocollo può essere utilizzato da solo o in combinazione con più ampiamente usato in tecniche in vitro in cui più geni possono essere studiati utilizzando ISSA in primo luogo di identificare i potenziali candidati a portare avanti a più coinvolti metodi in vitro.
Gli esempi descritti dimostrano che i settori sufficienti possono essere creati per effettuare analisi valle da solo un piccolo numero di finestre cambiale transgenici. Con valori ATScm -2 di 46,1 in eucalipto e 14,6 in pioppo solo uno o due finestre cambiale sarebbero sufficienti per indagare su un singolo tratto in quanto è possibile aggiungere numerose finestre ad uno stelo singolo impianto o replicare su numerose piante. In pratica, tuttavia, non tutte le finestre cambiale portano alla creazione di un settore cambial che può essere utilizzato (vedi Tabella 1, Tabella 2) come la dimensione dei settori può variare, sono generalmente piccolee nei casi può essere situato in prossimità di ogni altro limitando il loro utilizzo per l'analisi a valle. Inoltre, il gene di interesse può influire sulla vitalità cellulare 12 o altri aspetti dello sviluppo delle cellule potenzialmente risultanti in completa assenza di settori transgenici per uno specifico gene di interesse. Si consiglia pertanto di puntare sempre per un maggior numero di finestre di quanto potrebbe essere necessario per l'analisi. Simile cautela dovrebbe essere applicato quando si utilizza ISSA per gli studi di promotore come una significativa variabilità può essere previsto con poco / debole o nessuna espressione osservata in alcuni casi (Tabella 2). Tuttavia, non è stato dimostrato per essere utilizzato con successo per l'analisi 10 un numero minore di settori, soli 6. Questi risultati mostrano che gli esperimenti abbastanza modeste che coinvolgono solo un piccolo numero di finestre possono portare ad approfondimenti significativi in funzione del gene e attività del promotore.
Dal punto di vista di analisi, la vicinanza di transgenIC e non transgenico tessuti fornisce un potente strumento per identificare le piccole ma significative differenze nei tratti tra i geni di interesse. Cellule e tessuti campione direttamente adiacenti l'uno all'altro sono dello stesso sfondo genotipica e sono stati influenzati dalle stesse condizioni ambientali riducendo il numero di variabili indipendenti e semplificare l'analisi statistica richiesta. Dal punto di vista di campionamento, analisi accendere ISSA dati derivati da esperimenti multipli (ad esempio, Tabella 6), ha mostrato che un minor numero di misurazioni per settore, ad esempio, lo spessore della parete cellulare di 3-5 cellule per settore, e misurando un numero maggiore di settori, ad esempio, 20-25 settori di un gene di interesse, fornisce una strategia di campionamento più efficiente e statisticamente robusto. Ogni settore rappresenta un evento di trasformazione indipendente o 'linea' di cellule con l'analisi statistica svolta determinare l'effetto media di più eventi di trasformazionecoinvolge il gene di interesse. Allo stesso modo, la capacità di trasformare tutti i tessuti staminali offre l'opportunità di studiare l'espressione di promotori d'interesse, su tutto il territorio dello stelo e più precisamente durante la differenziazione cambio. protocolli ISSA descritti qui forniscono una pipeline affidabile e validato dalla creazione del tessuto transgenico attraverso la raccolta di campioni, la raccolta e l'analisi dei dati per il tessuto e la morfologia delle cellule e per modelli di espressione promotore.
Nella maggior parte dei casi, i settori sono il risultato della trasformazione di una singola cellula, che attraverso la divisione cellulare può aver dato luogo ad una serie di cellule e tessuti derivati. Ad esempio, un settore cambial nasce dalla trasformazione di una singola cella che POST avvolto recupero diventa un iniziale cambial che a sua volta si divide periclinally e anticlinally per creare un settore estende fino dalla ferita originale nel floema. In questi casi, l'iniziale trasformata è stata mantenutaall'interno del cambium fino al momento della raccolta e una variante 'full' si osserva, invece, dove questa iniziale viene persa dallo strato cambiale durante la crescita radiale e sostituito da un allora non trasformato vicina cellulare attraverso 'cellule' invasione ', un' variante perso iniziale 'sarà il risultato. Al fine di assicurare la corretta classificazione dei tipi di settore e per assistere con l'interpretazione dei risultati è fortemente raccomandato che la familiarizzazione con caratteristiche anatomiche di risposte di sviluppo staminali e ferite secondarie siano requisiti preliminari per l'analisi dei risultati ISSA. Inoltre, si consiglia test regolari del pH del reagente GUS (vedi punto 5.6). Un pH basso (ad esempio, sotto 6) può portare alla attivazione di beta glucuronidases endogeni (GUS) il fusto della pianta che possono mascherare la reale portata di un settore o di portare alla identificazione dei falsi positivi. Quando ciò si sospetta, si raccomanda che questi campioni essere esclusi da ulteriori analisi. Il protocollo GUS reagenteaffidabile applicati negli studi qui esposti per alleviare problemi potenziali con attività GUS endogena è stato adattato da Hawkins et al. (2002) 16 e utilizza passaggi chiave aggiuntive, tra due lavaggi con tampone fosfato equilibrare campioni a pH 7, e un trattamento termico a 55 ° C per 10 minuti per destabilizzare l'attività endogena GUS 17,18. GUS permeabilità reagente è limitato ed è responsabile di un minor numero di settori essere identificati utilizzando il protocollo disco trasversale rispetto al protocollo buccia floema.
Tutte le specie trialed hanno dimostrato di essere sensibili alla trasformazione del tessuto cambial. Tuttavia, sono state osservate differenze significative nella ATScm -2 sia tra e all'interno genere e specie. Analogamente, il ceppo di A. tumefaciens e il tempo / stagione di inoculazione possono influenzare ATScm -2. Si suggerisce che intraprendere alcuni test preliminari di queste variabili nel speciES e genotipi sotto inchiesta prima della grande scala l'adozione del protocollo. Teoricamente non vi è alcun limite per l'età o la dimensione di steli a cui ISSA potrebbe essere applicata fino a quando vi è un cambium crescita attiva. inoculo Tuttavia, per facilità di trattamento a valle dei settori tissue transgeniche si raccomanda steli di circa 1 cm di diametro.
ISSA non è senza i suoi limiti. Le dimensioni relativamente ridotte di settori tissue transgeniche attualmente limita metodi fenotipizzazione valle e quindi solo un numero limitato di tali metodi sono stati solitamente usata finora. Questi metodi sono focalizzati principalmente sulla caratterizzazione morfologica come sopra così come semi stima quantitativa dei monosaccaridi composizione nella parete cellulare secondaria come indicato nell'introduzione 9,11. Con l'avvento e la raffinatezza delle nuove tecnologie per l'analisi raffinata scala di materiali biologici vi è un ulteriore potenziale per lo sviluppo ulteriore fenotipizzazionetubazioni per i settori Issa, ad esempio in parete cellulare analisi composizionale. Resta difficile, tuttavia, effettuare quantitative, settore per settore, espressione genica basata acido ribonucleico (RNA) e di proteine studi e / o identificare e propagare ISSA derivato cellule transgeniche tramite coltura in vitro per l'analisi aggiuntiva dovuta alla natura distruttiva del saggio GUS . Alcuni geni reporter fluorescenti e la stampa dei tessuti sono stati trialed per quantificare l'RNA dai singoli settori, ma ad oggi questi approcci non sono stati utilizzati con successo per le medie e throughput screening ad alto contenuto di operazioni di routine. Inoltre, le tecniche transgeniche non trialed fino ad oggi, come RNAi potrebbero complicare l'analisi in cui l'espressione GUS e down-regolazione del gene bersaglio non possono co-localizzare.
Mentre ci sono alcune limitazioni attuali, l'incorporazione di tecnologie nuove ed emergenti e metodi analitici sono suscettibili di superare questi limiti, migliorando ulteriormente il ruolo di ISSA unmedio sa di alta protocollo di throughput per sezionare la natura molecolare complessa di differenziazione cambial, lo sviluppo del legno e arginare la formazione.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
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