Abstract
Sekundäre Stengelwachstum in den Bäumen und die damit verbundenen Holzbildung sind signifikant sowohl von biologischen und wirtschaftliche Perspektiven. Jedoch relativ wenig über die molekularen Kontrolle bekannt, die ihre Entwicklung steuert. Dies ist zum Teil aufgrund physikalischer, Ressourcen- und Zeitbegrenzungen oft mit dem Studium der sekundären Wachstumsprozessen in Verbindung gebracht. Eine Reihe von in - vitro - Techniken verwendet wurden , sowohl in der holzigen und nicht holzigen Pflanzenarten entweder Pflanzenteil oder ganze Pflanze System beteiligt sind . Jedoch Fragen über ihre Anwendbarkeit für die Untersuchung der Nebenschaftwachstumsprozesse, die Widerspenstigkeit bestimmter Arten und Arbeitsintensität sind oft unerschwinglich für mittlere bis hohe Durchsatzanwendungen. Auch wenn an Nebenschaft Entwicklung und Holzbildung suchen die spezifischen untersuchten Merkmale könnten nur messbar werden spät in einem Baum des Lebenszyklus nach mehreren Jahren des Wachstums. In diesen Herausforderungen Alternative in vivo p Adressierungrotocols wurden entwickelt, mit dem Namen Induced Somatic Branchenanalyse, die die Schaffung von transgenen somatischen Gewebe Sektoren direkt in der Anlage Nebenschaft einzubeziehen. Das Ziel dieses Protokolls ist eine effiziente, einfach und relativ schnell Mittel zur Verfügung zu stellen transgene sekundären Pflanzengewebe für Gen und Promotor funktionelle Charakterisierung zu erstellen, die in einer Reihe von Baumarten verwendet werden können. Hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass transgene Nebenschaft Sektoren in allen lebenden Geweben und Zelltypen erstellt werden, in der Sekundär einer Vielzahl von Baumarten stammt, und dass Holz als auch morphologische Merkmale als Promotor-Expressionsmuster in sekundären leicht mittel bis hoch eingeschätzt werden können Stiele erleichtern Durchsatz funktionelle Charakterisierung.
Introduction
Baum stammt eine erhebliche Menge der Planeten Biomasse umfassen und sind von immenser biologische, kulturelle und wirtschaftliche Bedeutung. Sekundäre Stielen Lebensraum schaffen, indem sie Ressourcen und Schutz für viele andere Lebensformen bieten. Sie liefern viele andere Dienstleistungen für die Ökosysteme, die sie bewohnen und wirken als nachwachsender Rohstoff für die Produktion von Holz, Zellstoff und Papier und andere Holz- und Nichtholzprodukten. Nebenschaft Entwicklung und insbesondere Holzbildung von komplexen molekularen System geregelt wird, das die Entwicklung von spezifischen Zelltypen, die biochemische Zusammensetzung ihrer Zellwände regulieren und wie sie angeordnet sind Gewebe und Organe zu bilden. Sezieren die molekulare Basis von Sekundärstammentwicklung und Holzbildung wird von vielen Faktoren ab, einschließlich der Variabilität von Holz und Stamm Eigenschaften verwechselt innerhalb und zwischen den Stämmen, lange Generationszeiten, out-Kreuzung Paarungssysteme, hohe Heterozygotie, hohe genetische Belastung, saisonale dormancy, lange reifenMerkmal Einrichtung Zeiten und die schiere physische Größe von ausgewachsenen Bäumen. Als Ergebnis, das Verständnis der Nebenschaft Entwicklung in Bezug auf die genaue Kenntnis der meisten anderen Aspekte der molekularen Kontrolle der Pflanzenentwicklung, ist immer noch in den Kinderschuhen.
Eine Reihe von in vitro - Techniken verwendet wurden Nebenschaft Entwicklung, insbesondere Holz und sekundären Zellwandbildung zu untersuchen und zu verstehen. Diese Protokolle umfassen die Verwendung von ganzen Pflanze oder der Pflanzenteil Systemen, bei denen entweder transgene Pflanzen erzeugt werden oder spezifische Sekundärzellen oder Gewebe werden für die Untersuchung von spezifischen Aspekten der Holz transformiert und / oder sekundären Schaft Entwicklung 1. Transgene Pflanzen können Post genetische Transformation aus einer Vielzahl von Pflanzengeweben und Zelltypen jedoch wiederhergestellt werden, geht nur langsam voran, vor allem, wenn Züge Holzfasern aufgrund der langen Regenerations Analyse und Reifezeiten stammen (in der Größenordnung von Jahren), hohe technische und Arbeits demands, geringen Durchsatz von Kandidatengenen sowie Schwierigkeiten in einigen holzigen Pflanzenarten. Ähnliche Techniken wurden in nicht-holzigen Modellsystem wie Arabidopsis entwickelt , die erfolgreich einige dieser Einschränkungen zu überwinden, aber nicht alle sekundären Typen Stammzelle eine in diesen Stämmen und Eigenschaften der Saisonalität oder Langlebigkeit selbst können nicht in einer solchen Art 2 untersucht werden. Alternativ Anlagenteilsysteme, wie Pinu s radiata Kalluskulturen 3 die damit verbundenen Fristen zu reduzieren. Diese Verfahren sind jedoch auf die Untersuchung eines einzelnen Zelltyp beschränkt und leiden ähnliche Einschränkungen wie für in vitro Versuche festgestellt. In ähnlicher Weise wurden apikal Stammkulturen 4 beteiligt ganze Stamm Explantate gezeigt Versprechen , aber noch nicht für die Untersuchung spezifischer Gene oder Promotoren von Interesse angewendet wurden. In jüngster Zeit ist ein alternatives Protokoll Haarwurzelkulturen beteiligt hat für Eucalypten und wurde erfolgreich entwickelt5 angelegt, wobei dieses Verfahren beinhaltet jedoch in vitro - Kultivierung erfordert immer noch, eher zweitrangig Wurzeln als Stämme und es ist auf einer einzigen Baumart zu datieren.
Induzierte somatischen Sektoranalyse (IVSS), wurde wie hier beschrieben, entwickelt eine mittlere bis hohe Durchsatz funktionelle Screening-Tool, einige dieser Probleme zu überwinden, für Gene und Promotoren mit Verdacht auf Rollen in Holzbildung und Nebenschaftgewebe Entwicklung. ISSA ist ein in vivo - Transformation und Screening - System , das entwickelt wurde , um die Zeit zu reduzieren , genommen , um transgene Zellen und Gewebe in einem intakten sekundären Schaft erzeugen , während Arbeits überwinden, technischen und Durchsatzbeschränkungen von routinemßig in vitro - Methoden verwendet. Die Protokolle hier beschrieben ermöglichen die gleichzeitige Schaffung von Hunderten von unabhängig transformierten Gewebe Sektoren und Zellen in sekundären innerhalb einer kurzen Zeit stammt, in der Baumarten und Gewebe von Interesse ohne genetic und / oder Umweltvariation innerhalb relativ kurzer Zeitrahmen und niedrigen Arbeitskosten. IVSS in - vivo - Techniken wurden zunächst für Sekundär Schaft 6 und Knospe 7 Gewebe beschrieben und seitdem in Nebenschaftgewebe durch Studien von Genen und / oder Promotoren in cambial Differenzierung beteiligt verfeinert worden und umfassen: Tubulin (TUB) 8, Fasciclin artigen Arabinogalactan ( FLA) 9, Cellulose - Synthase (CESA) 10, sekundäre Zellwand-assoziierten nac Domain (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 und wirklich interessante neue Gen (RING) H2 - Protein 13. Diese Studien wurden in sekundären geführt stammt von Pappeln und Eukalyptus Pflanzen und Einblicke in die Zellmorphologie, Zellwand Chemie und Genexpression.
Die Protokolle hier beschriebenen sollen die Erfahrung ein zusammen zu bringennd gewonnenen Erkenntnisse durch die Entwicklung und Anwendung der IVSS aus einer Reihe von veröffentlichten und nicht veröffentlichten Studien im letzten Jahrzehnt. Sie konzentrieren sich auf die in - vivo - Transformation von Nebenschaftgewebe 6 und konzentrieren sich auf Studien mit Populus alba 'pyramidalis' Klon, Eucalyptus globulus sowie 11 Eucalyptus globulus x camaldulensis Klone. Dieses Dokument nimmt Forscher durch das Protokoll aus dem Anbau von Pflanzen und Bakterien, die Umwandlung von Stammzellen Gewebe, Wachstum und Ernte von Gewebe, die Identifizierung von transgenen Zellen und Geweben, die Vorbereitung auf phänotypische Einschätzungen und Verfahren zur Erhebung und Analyse von Daten. Während Techniken erfolgreich angewendet wurden Zellwand Monosaccharidzusammensetzung auch 9,11, aus Platzgründen zu messen, konzentriert sich dieses Dokument auf Techniken zur Messung der Zell- und Gewebemorphologie und das Verständnis von Genexpressionsmustern in sekundären st verwendetnur ems. Dementsprechend wird, wie das Protokoll zu denen weitere Einblicke in die Rolle und / oder Expression von Genen zur sekundären Stiele mit einem kostengünstigen, technisch einfach und mittlere bis hohe Durchsatzverfahren verknüpft zu gewinnen suchen geeignet skizziert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Herstellung von Pflanzenmaterial
- Vor dem Experimentieren, werfen neue Setzlinge der bevorzugten Baumarten aus Samen oder Schneiden und wachsen, bis der Durchmesser des Stammes in der Fläche, die für Experimente ist etwa 1 cm im Durchmesser Baum / s.
Hinweis: Die benötigte Zeit kann variieren aufgrund Pflanzenwachstumsraten daher zwischen drei bis neun Monaten für diesen Schritt zu ermöglichen.
2. Binary Vector Creation
- Führen Sie Arbeiten von diesem Abschnitt zu Abschnitt 7 in einem Labor oder Gewächshaus , wo Agrobacterium tumefaciens gehandhabt werden kann , und dass geeignete persönliche für das Labor vorgeschriebene Schutzausrüstung verwendet.
- Vorbereiten eines binären Vektor entweder ein interessierendes Gen Zuschlags oder Überexpression Kassette und einem β-Glucuronidase (GUS) -Reportergen Kassette oder einen Promotor von Interesse fusioniert mit einem GUS-Gen in Abhängigkeit von der Art der Studie enthält.
Hinweis: Es gibt eine Reihe von binären Vektor backbones, die im Handel oder durch Forschungsnetzwerke sowie zahlreiche Techniken zur Verfügung, zum Einfügen von Genen und Promotoren von Interesse in binäre Vektoren bezogen werden können. Im Rahmen dieses Protokolls ist es, den Experimentator, um die Entscheidung darüber zu treffen, wie einen binären Vektor zu erzeugen. - Trans binären Vektors in eine entwaffnete Stamm von A. tumefaciens unter Verwendung von Elektroporation oder Hitzeschock - 14 und entsprechend speichern , benötigt bis zum Experimentieren.
- Wiederholen Sie Schritt 2.2 für jede positive und / oder negative Kontrollen.
Hinweis: Negative Kontrollen einen binären Vektor enthalten sollte kein Gen von Interesse für ein Gen von Interesse Studie und ein promotor GUS für einen Promotor von Interesse Studie enthält. Positive Kontrolle für einen Promotor von Interesse Studie sollte ein Blumenkohlmosaikvirus-35S-Promotor (CaMV35S) umfassen mit einem GUS-Reporter fusioniert.
3. Herstellung von A. tumefaciens für die Inokulation
- Mindestens eine Woche vor der experimentation, nehmen Sie eine kleine Menge (ca. 1 & mgr; l) von A. tumefaciens vorbereitet während Schritt 2.2 und 2.3 und die Ausbreitung dünn auf separaten LB - Medium mit Agar 14 Platten mit geeigneten Antibiotika zur Bekämpfung von bakteriellen Auswahl. Wachsen bei 28 ° C in einem Inkubator kleinen Kolonien zu bilden, und dann bei 4 ° C bis benötigt.
- 48 Stunden vor dem Experiment zu übertragen , eine Kolonie von A. tumefaciens von jeder Platte in getrennte 50 ml mit Schraubverschluss Röhrchen 5 ml vorgewärmten (28 ° C) LB - Medium 14 mit geeigneten Antibiotika für bakterielle Selektion enthalten , und für etwa 48 Stunden bei 28 ° C bei 200 rpm auf einem Schüttelinkubator agitieren , bis Mischung ist sehr trüb.
- Zwischen 4-6 Stunden vor der Impfung von Pflanzenstängeln (Abschnitt 4) 1 ml der LB / A. tumefaciens Mischung in ein frisches 50 ml mit Schraubverschluss Röhrchen mit 19 ml (1:20 Verdünnung) von frischem warm (28 ° C) LB - Medium mit geeigneten Antibiotika fürBakterien Auswahl. Wenn die optische Dichte (OD) bei 600 nm (OD 600, wie durch Spektroskopie gemessen) oberhalb 0,1, verdünnt weiter mit warmem LB , bis dies erreicht ist.
- Legen verdünnt LB / A. tumefaciens Mischung wieder auf den Schüttelinkubator und schütteln unter den gleichen Bedingungen (200 Umdrehungen pro Minute, 28 ° C) , bis die OD 600 zwischen 0,4-0,6 und zu entfernen.
- Zentrifuge LB / A. tumefaciens Gemisch 15 min bei 1000 xg und 4 ° C.
- Dekantieren Flüssigkeit und sofort suspendieren A. tumefaciens Pellet in 1 ml MS - Medium 15 gekühlt, Transfer in 2 ml Mikroröhrchen und lagern auf Eis bis zur Inokulation (Abschnitt 4) erforderlich. Diese Lösung wird als Inoculation Medien.
4. Inokulation von Pflanzen mit A. Stem tumefaciens
- Starten Sie Experimentieren im späten Frühjahr oder im Frühsommer mit Pflanzen in Abschnitt 1 erstellt, die eine aktive und schnell wachsenden Kambium haben. Eine gute Diagnose für eineaktiv und schnell wachsenden Kambium ist, dass das Phloem von Xylem leicht abgezogen werden kann.
- Finden Sie einen klaren geraden Abschnitt der Stamm in der Nähe der Basis der Pflanze und entfernen Sie alle Blätter und Zweige.
- Mit einem scharfen Skalpell (vorzugsweise No. 11) oder einer Rasierklinge, erstellen Sie eine 1 cm 2 'cambial Fenster' in einem klaren Abschnitt des Schaftes durch zwei vertikalen , parallelen Einschnitt Einführung durch den Bast von 20 mm in der Länge und einem 5 mm auseinander dann eine horizontaler Schnitt, der die beiden vertikale Schnitte an ihrem Basisende verbindet.
- Ziehen Sie die Phloem Streifen erstellt von der Schnitt nach oben Aussetzen der Entwicklung Xylemgewebe und fügen Sie ausreichend Inokulation Medien aus Schritt 3.6 die Oberfläche des freiliegenden Entwicklung Xylem zu benetzen mit einer Pipette (in der Regel 5 bis 10 & mgr; l). Unmittelbar nach dem Phloem Streifen wieder einsetzen.
- Binden Sie das Phloem Streifen an den Stamm fest mit Parafilm.
- Wiederholen Sie die Schritte 4.2 bis 4.5 für alle weiteren cambial Fenster für das Gen (e) oder Promotor (en) von Interesse eine Schaffungny neue cambial Fenster mindestens 1 cm über oder unter anderen cambial Fenster und um 90 ° versetzt.
- Führen Sie die Schritte 4.2 bis 4.5 für die positiven und negativen Steuervektoren (Schritt 2.4) sicherzustellen, dass jeder Vektor auf den gleichen Stamm von jedem in dem Experiment verwendete Pflanze hinzugefügt wird.
- Monitor-Schaftdurchmesser Wachstum in regelmäßigen Abständen und Ernte für GUS-Test (Abschnitt 5), wenn das radiale Wachstum von mindestens 5 mm hat in Stämmen beobachtet.
Anmerkung: Die Menge der benötigten radialen Wachstum auf der Gewebemenge abhängig ist für nachgeschaltete Analyse erforderlich.
5. Ernten für GUS Histologische Assay
- Excise die "cambial Fenster" aus dem Stamm jedes Gewebe nicht Teil des neuen Wachstums im cambial Fenster zu entfernen.
- Für Studien im Zusammenhang Xylem zu reifen und Phloem Zell / Gewebemorphologie, schälen die Bast von Xylem.
- Für Studien, bei denen die cambial Zone intakt oder Promotor-Expressionsmuster bleiben erforderlich sind zu beurteilened, in Scheiben schneiden quer die cambial Fenster mit einer Rasierklinge oder einem anderen scharfen Messer in Scheiben zwischen 0,5 und 1 mm Dicke verwendet.
- Platzieren verarbeitet cambial Fenster Gewebe in 14 ml Rundbodenröhrchen und spülen zweimal in 0,1 M Phosphatpuffer bei pH 7 14. Stellen Sie sicher , dass das Gewebe vollständig eingetaucht wird, bleibt in Lösung für mindestens fünf Minuten lang und alle überschüssige Lösung wird am Ende entfernt von die zweite Spülung.
- 5 ml GUS-Reagens (0,5 mM X-Gluc (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-Glucuronsäure), 10 mM EDTA, 0,5% Triton X-100 v / v, 0,5 mM Kalium Ferricyanid (III), 0,05 mM Kaliumhexacyanoferrat (II), die mit 0,1 mM Phosphatpuffer , pH 7 bis Endvolumen up, vgl . Hawkins et al 16) in jedes Röhrchen. Wenn Gewebe nicht vollständig unter Wasser, fügen Sie weitere GUS-Reagenz.
- Die Röhrchen für 10 min bei 55 ° C im Dunkeln.
- Die Röhrchen für weitere 12-16 h auf einem Rüttler-Inkubator bei 37 ° C im DunkelnVerwendung von leichtem Schütteln (30 bis 60 rpm) für das Mischen zu ermöglichen.
- Nach der Entnahme aus Schüttelinkubator zufällig den pH-Wert der GUS-Reagens in einer kleinen Untergruppe von Rohren mit Lackmuspapier mit einem pH-Bereich 0-7.
- Wenn jede der Röhren einen pH-Wert unterhalb von 6 haben dann beschriften. Weiter um den Rest der Rohre zu prüfen, pH-Wert zu bestätigen und kennzeichnen, wenn pH-Wert 6 oder weniger beträgt.
Hinweis: Proben mit einem pH-Wert unter 6 kann nicht für die Analyse geeignet sein. Diese Proben sind von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden.
- Wenn jede der Röhren einen pH-Wert unterhalb von 6 haben dann beschriften. Weiter um den Rest der Rohre zu prüfen, pH-Wert zu bestätigen und kennzeichnen, wenn pH-Wert 6 oder weniger beträgt.
- Dekantieren GUS-Reagenz und ersetzen mit ausreichend 70% Ethanol Gewebe zu bedecken.
- Lagerung bei 4 ° C bis benötigt.
6. Identifizierung von transgenen Gewebe
- Mit einer Pinzette, nehmen Sie alle cambial Fenster Gewebe aus einem Rohr und in kleinen Schale oder Petrischale für die mikroskopische Visualisierung zu ermöglichen.
- Verwendung eines Präpariermikroskops zwischen 1X und 4-fache Vergrößerung, zu identifizieren und die Anzahl der Zellen oder Gewebe tallydass haben eine helle blaue Färbung. Blau gefärbte Zellen oder Gewebe werden als Sektor ab diesem Zeitpunkt bezeichnet. Tally sie auf folgende Weise.
- Für Proben , bei denen das Phloem (Schritt 5.1.1), zählen die Anzahl der Sektoren in cambial Gewebe auf der Oberfläche der Entwicklungs Xylem (cambial Sektor, Abbildung 1a) gefunden wurde entfernt.
- Bei Proben, die in Scheiben (Schritt 5.1.2) geschnitten wurden, die Anzahl Sektoren zählen in den verschiedenen Zell- oder Gewebetypen (Abbildung 1b, 1c, 1d) gefunden. Die periderm (Periderm Sektor, Abbildung 1e), Bast (Phloem Sektor, 1f), cambial Gewebe (kambiale Sektor, 1g, 1h, 1I), Wund Parenchym (Wound Parenchyma Sektor: Branchen können in den folgenden Gewebetypen gefunden werden Abbildung 1 j) und in Thyllen (Tylose Sektor, Abbildung 1k).
- Während mikroskopische aEURTEILUNG sicherzustellen, daß beide Seiten einer Scheibe angesehen worden sind, und dass die Sektoren, die sich über zwei Scheiben auftreten, werden so abgestimmt, dass die Zahlen nicht hoch genug eingeschätzt werden.
- Platzieren nur das Gewebe enthaltenden Sektoren zurück in das Röhrchen, das 70% Ethanol und zu speichern, bis sie benötigt.
- Wiederholen Sie Schritt 6.1 bis 6.3 für zusätzliche cambial Fenster einschließlich der positive und / oder negative Kontrolle.
- Berechnen Sie die durchschnittliche Transformationseffizienz für jeden Sektor Typ für jedes Gen oder Promotor von Interesse und den Kontrollen separat durch die Gesamtzahl der Sektoren durch die Gesamtzahl von 1 cm 2 cambial Fenster Dividieren einer durchschnittlichen Anzahl von Transformations - Events pro cm 2 von Cambium abzuleiten Die inokulierten (ATScm -2).
- Gehen 7.2 und 8 für die Analyse von Promotor-Expressionsmuster auf Schritt und 7.1, 7.2 oder 7.3 für Techniken Schritt Zell- und Gewebemorphologie in cambial Gewebe zu beurteilen.
7. Analyse vonZell- und Gewebemorphologie in kambiale Tissue
Hinweis: Im Folgenden eine Auswahl von Techniken, die erfolgreich für die Analyse von ISSA abgeleiteten Proben verwendet wurden.
- Analyse von Xylem Zellenbereich, Lumenfläche, Zellwanddicke und Zellwandbereich mittels Rasterelektronenmikroskopie (SEM).
Hinweis: Dieses Protokoll minimale Probenvorbereitung erfordert und ermöglicht eine relativ hohe Durchsatz von Sektoranalyse in Bezug auf die morphologische Merkmale beschrieben.- Von diesem Schritt vorwärts bitte sicherzustellen, Laborkittel, Schutzbrille und Handschuhe verwendet, wenn Holzgewebe wird bearbeitet und behandelt wird.
- Identifizieren eines cambial Sektor für die Analyse und einen Einschnitt machen etwa 0,5 mm auf beiden Seiten davon eine einzige Rasierklinge mit einer Scheibe (2a) zu erzeugen.
- Trim überschüssige Xylemgewebe wobei ungefähr 1 mm von Xylemgewebe zur tangentialen Seite des Sektors (Abbildung 2b).
- Vorsichtigly geschnitten quer durch das Zentrum des Sektors eine neue Doppel Rasierklinge (Abbildung 2c) verwendet wird .
- Machen Sie zwei weitere flache radiale Einschnitte auf der Querebene auf beiden Seiten der Sektor der transgenen Gewebe (Abbildung 2d) abgrenzen. Wie die GUS-Färbung entlang der radialen Dateien von Zellen auf beiden Seiten des gefärbten Gewebe nicht durchdringen wird tief in das Gewebe folgen an der cambial Oberfläche gefunden.
- Vorbereitet cambial Sektor Gesicht Bringen auffahren zu Stufe eines SEM Stiftstummel mit SEM leitfähiges Band (Abbildung 2e) und in Exsikkator halten , bis für SEM - Visualisierung benötigt.
- Wiederholen Sie die Schritte 7.1.2 für alle weiteren Sektoren 7.1.6 einschließlich der aus der Negativkontrolle.
- Mit Hilfe eines SEM in einem niedrigen Vakuum - Modus (Energie 5 kV, Spot 3.0 nm), zu visualisieren und Fotos von Zellen / Gewebe innerhalb des Sektors nehmen sowie die Zellen / Gewebe direkt neben dem Sektor (Abbildung 2f). Der Betrag der Vergrßerungist auf die Merkmale von Interesse abhängig. Für Xylemfasern ist 2,000X geeignet (Abbildung 2 g).
- Sobald ein cambial Sektor visualisiert und Fotografien an einer geeigneten Vergrößerung aufgenommen, messen Xylem Zell / Gewebe morphologische Merkmale von Interesse unter Verwendung von Bildmesssoftware.
- Für die statistische Analyse vornehmen mehrere paarweise Analysen gepaarte t-Tests unter Verwendung der Differenz zwischen morphologischen in dem transgenen Sektor und dem benachbarten nicht-transgenen Kontrollzellen / Gewebe (gemessen innerhalb von 0,5 mm von der Sektorrand) für jeden Sektor gemessene zum Vergleich p zu bestimmen, -Wert.
- Wiederholen Sie Schritt 7.1.10 für die Negativkontrolle.
- In Fällen, in denen die positive Kontrolle eine niedrige p-Wert zeigt (α <0,05), die Berechnung der Differenz zwischen den transgenen und nicht-transgenen benachbarten Zellen / Gewebe für eine morphologische Eigenschaft. Verwenden Sie dieses "Differenzwert" in einem ungepaarten t-Test, um die Wirkung des Gens von Interesse mit dem negat zu vergleichenive Steuerung einen p-Wert zu bestimmen.
- Die histochemische Analyse von cambial Zell / Gewebemorphologie oder Promotor-Expressionsmuster in Stammzellen / Gewebe Lichtmikroskopie.
Hinweis: Während mehr Zeit in Anspruch, ist diese Methode für weitere Analysemöglichkeiten einschließlich der Aspekte der cambial Dynamik ermöglicht, zB cambial Breite sowie Promotor - Expressionsmuster. Darüber hinaus, wenn nicht in der Lage eine SEM zuzugreifen, kann dieses Protokoll als Alternative für den Schritt 7.1 verwendet werden.- Verbrauchsektor von Interesse Rasierklinge und einige umgebende Gewebe als kleine Blöcke (nicht mehr als 1 mm 3) und direkt in 1-3 ml 100% igem Ethanol in einem Probenfläschchen mit Schraubverschluss für mindestens 2 Tage bei 4 ° C auf einem Schüttler. Bereiten Sie die kleinen Block in einer Weise, die für die interessierende Oberfläche ermöglicht durch ein Mikrotom zugegriffen wird.
- Wiederholen Sie dies für alle weiteren Sektoren einschließlich der aus der Negativkontrolle.
- Entfernen Sie Flüssigkeit und ersetzen mit 25% Ethanol: 75% LR weiße Mischung für 2 Tage aufrechterhalten Bedingungen.
- Wiederholen Sie Schritt 7.2.3 mit 50% Ethanol: 50% LR weiß, 25% Ethanol: 75% LR weiß und dann schließlich zweimal mit 100% LR weiß.
- Legen Sie kleine Block in Einbettform mit der Oberfläche von Interesse kurzen Ende ausgerichtet und sorgfältig abdecken mit frischem LR weiß und polymerisieren gemäß den Anweisungen des Herstellers.
- Schneiden Sie 5 um Abschnitte von der Oberfläche von Interesse auf einem Rotationsmikrotom und Montage auf einem Glasträger. Verwenden Sie Safranin O (0,01%) Färbung Zellwand sichtbar zu machen und / oder in anderen Funktionen.
- In Eindeckmedien, legen Sie ein Deckglas und lassen Sie über Nacht zu setzen.
- Blick unter einem Lichtmikroskop zwischen 100X und 600X Vergrößerung und Aufnahme-Bild.
- Erfassen Sie morphologische Merkmale von Bildern mit Bildmesssoftware.
- Für die statistische Analyse der quantitativen morphologische Merkmale, setzen Sie mit Schritt 7.1.10 auf.
- Für die qualitative Analyse von morphologischen Merkmalen,Vergleichen und beschreiben Muster für das Gen oder Promotor von Interesse beobachtet und die negative und / oder positive Kontrolle.
- Analyse von microfibril Winkel (MFA) in Mazerierte Fibers Mit Lichtmikroskopie.
- Excise transgenen Xylemgewebe direkt von einem Sektor sowie aus nicht-transgenen Gewebe neben sie (innerhalb von 0,5 mm, Abbildung 2h) und in getrennten 1,5 - ml - Röhrchen. Wiederholen Sie dies für alle weiteren Sektoren einschließlich der aus der Negativkontrolle.
- Führen Sie die Schritte 7.3.3 bis 7.3.5 in einem Abzug.
- Nach Eintragen von 250 & mgr; l Wasserstoffperoxid und 250 ul Eisessig zu jedem Röhrchen.
- Platzieren Sie Rohr in Wärmeblock bei 90 ° C für 2 Stunden in Abzug durchführen.
- Entfernen Gewebe aus Rohren und sorgfältig spülen mit destilliertem Wasser mindestens zweimal.
- Mit Hilfe eines wasserlöslichen Eindeckmedien montieren Gewebe auf einem Glasträger und necken auseinander mit scharfen Zange vor einem Deckglas zu befestigen.
- Aussichtunter einem Lichtmikroskop und die Aufnahmen von einzelnen Fasern bei einer Vergrößerung von mehr als 400-fache.
- Um microfibril Winkel von Fasern, messen den Winkel zwischen den Pit - Öffnungen und / oder Zellwand Riefen und der langen Achse der Faser (Abbildung 2i) unter Verwendung von Bildmesssoftware bestimmen.
- Für die statistische Analyse, setzen Sie mit Schritt 7.1.10 auf.
8. Analyse von Promoter Expressionsmuster
- Die Analyse der Promoter Expressionsmuster in Nebenschaftgeweben.
- Tally die Frequenz eines jeden Sektors Typ für den Promotor von Interesse sowie die positiven und negativen Kontrollen, wie in Schritt 6.2.2 notiert.
- Vergleichen Sie die Häufigkeit der verschiedenen Sektortypen für den Promotor von Interesse mit der positiven Kontrolle mittels Chi-Quadrat-Tests p-Werte zu schaffen. Eine weitere Analyse der Zell- / Gewebespezifität kann unter Verwendung von Schritt 7.2 wie erforderlich durchgeführt werden.
- Wenn mehr als ein Promotorvon Interesse wird dann wiederholen Sie diese Analyse so dass ein Vergleich zwischen allen Promotoren von Interesse und die positive Kontrolle untersucht.
- Wenn Sektoren oder Blaufärbung in der Negativkontrolle beobachtet werden , dann ist dies der Analyse hinzuzufügen , oder je nach Umfang verlassen oder wenn endogene Färbung vermutet wird (siehe Diskussion).
- Analyse von Promotor-Expressionsmuster während der kambiale Derivative Entwicklung und Differenzierung.
- Verwendung eines Binokular visualisieren alle cambial Sektoren (1g, 1h, 1i) identifiziert in Schritt 6.2 und bestimmen das Vorhandensein / Fehlen der blauen Färbung in drei Gewebe - Typen aus dem Kambium abgeleitet sind ; das Phloem (P), Xylem Entwicklung (X1) oder entwickelt Xylemgewebe (X2) (3a sehen).
- die Häufigkeit des Vorhandenseins / Fehlens von GUS-Färbung in den P, X1 und X2 Regionen des Promotors von int gemäß Schritt 8.1.2, zu vergleichen,erest mit der positiven Kontrolle mittels Chi-Quadrat-Tests p-Werte zu schaffen. Eine weitere Analyse der Zell- / Gewebespezifität kann unter Verwendung von Schritt 7.2 wie erforderlich durchgeführt werden.
- Siehe Schritte 8.1.2.1 und 8.1.2.2 für weitere Überlegungen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dieses Protokoll mit allen Live - Sekundär Stammzellen und Gewebetypen A. als anfällig erwiesen haben tumefaciens Transformationen und wurden in Sektortypen basierend auf dem Zelltyp zunächst umgewandelt und nachfolgende Entwicklungswachstumsmuster definiert. Sektor - Typen gehören periderm, Bast, cambial, Wund Parenchym und Tylose (Abbildung 1b, 1c, 1d) und kann hier gefunden werden in Einklang Standorten in den Rest dieses Absatzes zu beschreiben. A periderm Sektor besteht aus einer Gruppe von transformierten Zellen , die ausschließlich in der periderm gefunden und nicht in das Phloem (Figur 1e) erstreckt. A Phloem Sektor kann an verschiedenen Stellen zwischen der initiierenden Schicht und der periderm jedoch festgestellt werden, niemals in diese umgebende Gewebe erstreckt (Figur 1f). Ein cambial Sektor transformierter Xylem / Kambium / Phloem Gewebe besteht aus tran abgeleitetsformation von cambial Anfangs- und kann in drei unterschiedlichen Mustern auftreten: i) "voll" cambial Sektor verwandelte Xylem / cambial / Phloemzellen von der Grenze des Wund Parenchym Gewebe durch das Xylem und cambial Zone zum Phloemgewebe erstreckt sowohl ray enthält, und fusiform Zellen oder ray Elemente nur (1g), ii) "verlorenen Anfangs 'cambial Sektor, eine Variante des vollständigen cambial Sektor , in dem eine erste von der initiierenden Schicht verlassen gespiegelt Xylem und Phloem Sektoren und eine nicht transformierte initiierenden Schicht (Abbildung verloren wurde 1h) und iii) 'Xylem nur "cambial Sektor transformierte Xylemgewebe von der Grenze des Wund Parenchym Gewebe variable Längen in die neu gebildete Gewebe xylogenic erstreckt , jedoch nie die initiierende Schicht (Figur 1i) erreicht. Eine Wunde parenchyma Sektor enthält gewickelt Parenchymzellen als entweder eine einzelne Zelle oder eine Gruppe von Zellen, die oft in radialer fil gefunden umgewandeltes befindet sich zwischen der bereits vorhandenen Holz und neu Xylemgewebe gebildet (Abbildung 1 j). Ein Tylose Sektor von transformierten Schiff Thyllen innerhalb der bereits vorhandenen Holz (Abbildung 1k) gefunden umfasste.
Repräsentative Transformationseffizienz Daten für beide Gen und Promotor von Interesse Studien sowie deren positive Kontrollen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 dargestellt. Die Daten wurde von zwei großen Studien , die über den gleichen Zeitraum (Dez-Apr) in den gleichen Genotypen gezogen von Eukalyptus- und Pappel in zwei aufeinander folgenden Jahren eine Reihe von Holzbildung Gene und Promotoren von Interesse beteiligt sind. Die Fokussierung auf positive Kontrollen aus dem Promotor von Interesse Studien (Tabelle 2), die am anfälligsten Gewebetyp A. tumefaciens - T-DNA - Transfer ist cambial Gewebe mit ca. 60% und 40% der in Eukalypten und Pappel bestimmten Sektoren bzw.Sein cambial Sektoren. In Eucalypten, wird der nächste häufigste Art der Sektor Parenchym bei 35% gewickelt , während die anderen Sektortypen alle ATScm -2 Werte unter 5% aufwies. In Pappeln, wird der nächste am häufigsten Sektortyp Parenchym bei 20%, gefolgt von Phloem bei 15%, während der Rest der Sektortypen aufgewickelt bei einer Frequenz von weniger als 5% gefunden. Eine höhere Wahrscheinlichkeit , einen Sektor in einem cambial Fenster sowie eine größere Anzahl von Sektoren identifiziert cambial finden sind typisch , wo das Phloem peel - Protokoll (Tabelle 1, Schritt 5.2.1) , aufgrund der Fähigkeit zur Färbung und die Möglichkeit zur Visualisierung der verwendet wird , gesamte Fläche des Kambium.
Bei der Entwicklung dieser Protokolle eine Anzahl von Variablen wurden als Teil der Protokolloptimierungsversuchen untersucht. Dazu gehörten Bakterienkonzentration in Inokulation Medien, Medientyp verwendet in Inokulation Medien, Zugabe von Acetosyringone zu Inokulation Medien, Gewebe Alter und A. tumefaciens Stamm sowie Zeitpunkt der Inokulation und Genotyp. Kambiale Sektor ATScm -2 Daten aus diesen Versuchen sind in Tabelle 3 und Tabelle 4 dargestellt. Die Mehrzahl der Variablen untersucht, wenn verändert, in cambial ATScm zu Veränderungen führen -2 in beiden Spezies und enthalten insbesondere die Konzentration der Bakterien in der Inokulation zunehmenden Medien, die Verwendung von MS in der Inokulation Medien und Wahl von A. tumefaciens Stamm. Darüber hinaus Zeitpunkt der Inokulation und Baum Genotyp zeigten signifikante Unterschiede in der Eukalypten mit Impfungen im Frühsommer zeigt höhere ATScm -2 während eucalypt Klone SG21 und SG44 höhere cambial zeigte ATScm -2, 41.6 und 40.4, jeweils im Vergleich zu anderen in allen Monaten kombiniert.
Durchschnittliche cambial Sektorgröße variiert und hängt von der Menge der tangentialen und radialen Wachstum in einem cambial Fenster. In einem TeilProbe von 53 Sektoren in Pappel, für etwa 4 Monate, die tangentiale Breite der Sektoren im Kambium zwischen 0,09 und 0,58 mm mit einem Durchschnitt von 0,27 mm, während das radiale Wachstum über cambial Fenster reichten von 0,7 bis 2,2 mm mit einem Durchschnitt von 1,35 gezüchtet variiert mm. Wenn sie kombiniert werden , werden diese zwischen 0,063 mm 2 und 1,276 mm 2 transgener Gewebe für die Analyse bereitgestellt. In einem weiteren Teilprobe von 188 Sektoren , in derselben Art, wo zwischen 1,5-4 mm Radialwachstum in der cambial Fenster über ca. 5 Monate beobachtet wurde, betrug die durchschnittliche Sektormasse 72 & mgr; g (Tabelle 5).
Die Menge an transgenem Gewebe erstellt wurde ausreichend Zellen bereitzustellen gezeigt und / oder Gewebe morphologische Messungen vorzunehmen, sowie für die Untersuchung der Promotoraktivität. Zum Beispiel grandis der Einfluss von drei Eucalyptus FLAs auf einer Anzahl von Xylem Faser morphologische Merkmale 9 war ex plored in eucalypt Klone und enthüllt mögliche Rollen für EgrFLA2 in MFA Bestimmung und EgrFLA1 bei der Bestimmung der Zellgröße (Tabelle 6). Zusätzlich Muster der Expression von Eucalyptus grandis CESA Genpromotor in der Entwicklungs Xylem (X1), entwickelt Xylem (X2) und Phloem (P) Gewebe 10 identifiziert signifikant unterschiedliche Expressionsmuster zwischen EgrCESA1, 2, 3 und EgrCESA4, 5, 7 in eucalypt Stielen. In dieser Analyse EgrCESA1, 2, 3 wurden gezeigt bei der Entwicklung von Xylemgewebe werden in erster Linie zum Ausdruck , während EgrCESA4, 5, 7 wurden sowohl in der Entwicklung von Xylem und Phloem Gewebe (Abbildung 3b, Tabelle 7) ausgedrückt gezeigt werden. Alle EgrCESA Promotoren zeigten signifikant unterschiedliche Expressionsmuster mit der positiven Kontrolle (CaMV35S - Promotor) (Tabelle 7).
4553 / 54553fig1.jpg "/>
Abb . 1: Transgenic Sektoren Typen (a) kambiale Sektoren auf der Oberfläche des freiliegenden Xylem betrachtet nach der Verarbeitung des Phloem peel - Protokoll (Schritt 5.2.1) verwendet wird . Discs zeigt eine Reihe von Sektortypen auf Querfläche von in Pappel (b) und eucalypt (c) ergibt sich nach der Verarbeitung des Querschnitt Protokoll (Schritt 5.2.2) verwenden. (D) Schematische Darstellung des Bereichs der Sektortypen gefunden in Pflanzenstängel. Beispiele für periderm Sektor (e), Bast Sektor (f), "voll" cambial Sektor (g), "verlorenen Anfangs 'cambial Sektor (h)," Xylem nur "cambial Sektor (i), Wund parenchyma Sektor (j) und Tylose Sektor (k) in Pappel. Schwarze Pfeile zeigen an, wo kleinere Sektor befinden. Alle Maßstabsbalken = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Herstellung von cambial Sektoren für die morphologische Analyse unter Verwendung von SEM und Lichtmikroskopie (a) Excision der Scheibe enthält Sektor. (B) Disc getrimmten überschüssiges Gewebe zu entfernen. Schneiden durch Querfläche des transgenen Sektor (c). (D) Einführung von zwei radialen Einschnitte zu unterstützen in den transgenen Gewebe unter SEM Ortung. (E) Tissue auf einer SEM - Stift angebracht leitenden Band. (F) Darstellung der Region von transgenen und nicht-transgenen Gewebe , die für die Analyse abgebildet werden soll. (G) Typische Bild von Xylem Faser und Strahl erfasst Zellen bei 2,000X Vergrößerung. (h (I) Mazerierte Faser unter Lichtmikroskopie zeigt den Winkel der Pits eingesehen und / oder Zellwand Streifungen und zur langen Achse der Zelle. Der schwarze Pfeil zeigt an Grubenöffnung. Maßstabsbalken = af, h = 1 mm, g, i = 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3: Analyse und Ergebnisse der Genpromotor Expressionsmuster von cambial Derivate (a) Darstellung des P (Phloem), X1 (Entwicklungs Xylem) und X2 (entwickelt Xylem) Regionen.. (B) Ergebnisse anzeigt Anteil an P, X1 und X2 - Färbung in cambial Sektoren von einem Versuch eine Reihe von CESA Beteiligung Eucalyptus grandis umgewandelt in Stämme von eucalypt Hybriden. Die Daten stammen von Creux et al. 10. n = Anzahl der Sektoren bestimmt. Maßstabsbalken = 0,5 mm. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Baumarten | Vector Art | Anzahl der Gene von Interesse verwendet | Gesamtzahl der Fenster erstellt | Gesamtzahl der Fenster , in denen ein Sektor identifiziert wurde (%) | Kambiale ATScm -2 cambial (in Fenstern , in denen ein Sektor identifiziert wurde) |
| Eucalyptus globulus x camaldulensis Hybriden (insgesamt drei Klone) | Positive Kontrolle (Gene von Interesse) | 1 (GUS only) | 96 | 97% | 45.1 (1.5) |
| Gene von Interesse | 20 | 630 | 92% | 46.1 (2.2) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Positive Control (Gene von Interesse) | 1 (GUS only) | 110 | 74% | 10.8 (1.5) |
| Gene von Interesse | 20 | 700 | 81% | 14,6 (0,8) |
Tabelle 1:. Typische cambial ATScm -2 für die positive Kontrolle und Gene von Interesse Zahlen aus Studien stammen wurden in zwei aufeinander folgenden Jahren in der gleichen eucalypt unternommen und Pappelklone eine Reihe von Genen verwenden und das Phloem peel Harvesting - Protokoll (Schritt 5.2. 1). Standard-Fehlerwerte in Klammern. </ P>
| Baumarten | Vector Art | Anzahl der Promotor / Gene | Gesamtzahl der Fenster erstellt | Gesamtzahl der Fenster , in denen ein Sektor identifiziert wurde (%) | ATScm -2 alle Sektoren | ATScm -2 Periderm | ATScm -2 Phloem | ATScm -2 cambial | ATScm -2 Wound Parenchyma | ATScm -2 Tylose |
| Eucalyptus globulus x camal- dulensis Hybriden (insgesamt drei Klone) | Positive Kontrolle | <td> 1 (GUS only)118 | 63% | 25.74 (2.35) | 0,24 (0,07) | 0,89 (0,19) | 15,7 (1,71) | 8.84 (1.4) | 0,07 (0,03) | |
| Veranstalter von Interesse | 28 | 1050 | 31% | 14.67 (1.77) | 0,02 (0,01) | 0,05 (0,01) | 13.79 (1.75) | 0,78 (0,21) | 0,03 (0,01) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Positive Kontrolle | 1 (GUS only) | 110 | 54% | 12.37 (1.77) | 0,22 (0,07) | 1,85 (0,29) | 5,07 (0,6) | 2,78 (0,75) | 0,29 (0,53) |
| Veranstalter von Interesse | 28 | 990 | 26% | 8,28 (1,18) | 0,16 (0,04) | 0,9 (0,09) | 6,67 (1,16) | 0,27 (0,07) | 0,28 (0,11) |
Tabelle 2:. Typische Sektor ATScm -2 für die positive Kontrolle und Förderer von Interesse Die Zahlen wurden aus Studien in zwei aufeinander folgenden Jahren in der gleichen eucalypt und Pappelklone mit einer Reihe von Promotor - Sequenzen und die Disc Harvesting - Protokoll (Schritt 5.2 durchgeführt bezogen. 2). ATScm -2 - Werte wurden aus den Fenstern abgeleitet , wo ein Sektor nur identifiziert wurde. Standard - Fehlerwerte in Klammern. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
| Spezies | Versuch | Behandlung Beschreibung | Anzahl der Fenster in der Behandlung | |
| Eucalyptus globulus | Die Konzentration von A. tumefaciens in Inokulation Medien | in 25 ml MS resuspendierten | 10 | 1,4 (0,62) |
| in 5 ml MS resuspendierten | 10 | 1,6 (0,72) | ||
| Resuspendierte in 1 ml MS (Kontrolle) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| Medientyp in Inokulation Medien | PFUND | 10 | 0,4 (0,22) | |
| MS (Kontrolle) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| Die Zugabe von Acetosyringone zu Inokulation Medien | Mit Acetosyringone | 11 | 0,9 (0,37) | |
| Ohne Acetosyringone (Kontrolle) | 11 | 0,6 (0,64) | ||
| Alter der Stamm Gewebe geimpft | 6 Monate (control) | 11 | 1,1 (0,66) | |
| 18 Monate | 11 | 1,8 (0,95) | ||
| A. tumefaciens-Stamm | AGL1 (Kontrolle) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0,1 (0,1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0,6 (0,4) | ||
| Populus alba 'pyramidalis' | Die Konzentration von A. tumefaciens in Medien | in 25 ml MS resuspendierten | 10 | 2,2 (0,55) |
| in 5 ml MS resuspendierten | 10 | 2,7 (0,63) | ||
| Resuspendierte in 1 ml MS (Kontrolle) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| Medientyp für die Stamm Impfung verwendet | PFUND | 10 | 2,8 (0,71) | |
| MS (Kontrolle) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| Die Zugabe von Acetosyringone zu Inokulation Medien | Mit Acetosyringone | 11 | 0,3 (0,14) | |
| Ohne Acetosyringone (Kontrolle) | 11 | 0,5 (0,25) | ||
| Alter der Stamm Gewebe geimpft | 6 Monate (Kontrolle) | 11 | 1,5 (0,33) | |
| 18 Monate | 11 | 1,5 (0,63) | ||
| A. tumefaciens-Stamm | AGL1 (Kontrolle) | 20 | 8,1 (2) | |
| C58 | 20 | 12.5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11.1 (2) |
Tabelle 3: kambiale ATScm -2 Werte für eine Reihe von Variablen als Teil der Protokolloptimierung Wegen untersucht. Variablen wurden in einem Pappel - Klon und eine Reihe von Eucalyptus globulus Personen über eine Reihe von Jahren mit cambial ATScm -2 präsentierten Daten untersucht. Kambiale Fenster wurden mit dem Disc-Harvesting-Protokoll (Schritt 5.2.2) geerntet. Standard-Fehlerwerte in Klammern.
| Eucalyptus globulus x camaldulensis Klon ID | Anzahl der cambial Fenster für jeden Monat | Kambiale ATScm -2 Spätfrühling (November) Inokulation | Kambiale ATScm -2 Frühsommer (Dezember) Inokulation | Kambiale ATScm -2 Mid Summer (Januar) Inokulation | Kambiale ATScm -2 Spätsommer (Februar) Inokulation | Kambiale ATScm -2 Früher Herbst (März)Impfung | Kambiale ATScm -2 Alle Monate kombiniert |
| SG5 | 10 | 15,7 (7,8) | 50,7 (13,7) | 10.5 (5.1) | 30.7 (4.4) | 16.8 (6.3) | 24.9 (4.3) |
| SG6 | 10 | 6.1 (3.1) | 38,5 (15,1) | 4,5 (1,7) | 14.5 (3.3) | 27.6 (8.4) | 18,3 (4) |
| SG13 | 10 | 28.4 (6.7) | 41.8 (9.1) | 16,1 (7) | 29.3 (5.2) | 19.8 (4.3) | 27.1 (3.1) |
| SG18 | 10 | 6,7 (2,9) | 18.3 (6.7) | 17.4 (3.4) | 19.2 (6.1) | 18.1 (6.3) | 15.5 (2.4) |
| SG21 | 10 | 38,7 (14,3) | 77 (17.5) | 23.9 (5.7) | 27,5 (6,9) | 40,7 (13,5) | 41,6 (6) |
| SG35 | 10 | 23.5 (10.2) | 42,8 (12,2) | 7,6 (2,5) | 17.6 (4.3) | 31.3 (4.6) | 24.6 (3.8) |
| SG37 | 10 | 19,7 (8) | 55,2 (14,5) | 7,4 (1,8) | 35 (10,4) | 15.9 (4.5) | 26.6 (3.8) |
| SG39 | 10 | 12.5 (2.4) | 23.6 (6.3) | 6,9 (3) | 26.3 (8.1) | 7,3 (2,3) | 15.5 (2.6) |
| SG40 | 10 | 24,8 (11) | 24,5 (6,8) | 14 (5.6) | 35.6 (6.1) | 19.9 (4.2) | 23.8 (3.2) |
| SG44 | 10 | 22.3 (3.4) | 63 (29.3) | 9.8 (2.6) | 52.5 (10.3) | 54,3 (15) | 40,4 (7,4) |
| SG46 | 10 | 15.3 (5.2) d> | 63,9 (20,1) | 23,6 (4) | 22.5 (4.8) | 17,4 (4,9) | 28.5 (5.1) |
| Monatliche kambiale ATScm -2 | 19,9 (5) | 45.3 (9.1) | 12,6 (2,8) | 27.8 (4.5) | 24 (5.1) |
Tabelle 4:. Einfluss von Genotyp und Zeitpunkt der Inokulation auf cambial ATScm -2 in eucalypt Klone Zehn Fenster wurden jeden Monat über die Vegetationsperiode eingeführt zu 10 verschiedene Eucalyptus globulus x camaldulensis Klone , die alle Mai geerntet. Die monatlichen Daten wird für jeden Genotyp mit einem Gesamtdurchschnitt monatlich und genotypische ATScm präsentiert -2 ebenfalls vorgestellt. Kambiale Fenster wurden mit dem Phloem peel Harvesting-Protokoll (Schritt 5.2.1) geerntet. Standard-Fehlerwerte in Klammern.es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
| Werksnummer | Anzahl der cambial Sektoren ausgeschnitten | Gesamtmasse aller Sektoren (ug) | Durchschnittliche Masse Sektoren (ug) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4460 | 172 |
| 5 | 15 | 1.320 | 88 |
| 6 | 22 | 2490 | 113 |
| 7 | 19 | 1.720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Gesamt | 188 | 13550 | 72 |
Tabelle 5:. Typische Masse eines cambial Sektor 45 Fenster in neun Pflanzen wurden in Pappel untersuchten die durchschnittliche Masse eines Sektors zu bestimmen und geerntet mit der Scheibe Harvesting - Protokoll (Schritt 5.2.2). Die Pflanzen wurden für 5 Monate und die radiale Wachstum in einem cambial Fenster war zwischen 1-4 mm gewachsen.
| Morph- ological Charakterzug | GUS nur (positive Kontrolle) | Nicht-gentechnisch veränderten Gewebe (GUS nur) | P-Wert | Gene von Interesse 1 (FLA1) | Nicht-gentechnisch veränderten Gewebe (FLA1) | P-Wert | Gen von Interesse 2 (FLA2) | Nicht-gentechnisch veränderten Gewebe (FLA2) | P-Wert | Gen von Interesse 3 (FLA3) | Nicht-gentechnisch veränderten Gewebe (FLA3) | P-Wert |
| Durchschnittliche Zellwanddicke (um) * | 1,81 (0,1) | 1,65 (0,1) | 0,2692 | 1,47 (0,14) | 1,55 (0,12) | 0,6403 | 1,65 (0,13) | 1,78 (0,13) | 0,4839 | 1,59 (0,12) | 1,63 (0,11) | 0,8254 |
| Durchschnittliche Zellwandbereich (um 2) * | 69.1 (4.74) | 60,7 (2,03) | 0,1229 | 64,1 (15,68) | 59,9 (9,79) | 0,5004 | 61.6 (3.4) | 65 (3,96) | 0,5182 | 61,9 (3,56) | 61,5 (3,16) | 0,9438 |
| Durchschnittliche Zellenbereich (um 2) * | 115,9 (11.01) | 99.9 (5.1) | 0,2041 | 124.4 (6.1) | 108 (4,36) | 0,0445 | 110,8 (8,45) | 111,3 (9.06) | 0,9671 | 108,5 (4.43) | 103 (3,07) | 0,3204 |
| Durchschnittliche Lumenfläche (um 2) * | 46,9 (7,55) | 39,2 (4,89) | 0,407 | 60,2 (5,28) | 48,1 (4,46) | 0,0991 | 49,2 (7,56) | 46.3 (7.5) | 0,7882 | 46,6 (3,31) | 41.5 (3.9) | 0,3264 |
| Durchschnittliche microfibril Winkel (O) # | 24,3 (0,75) | 24,2 (0,45) | 0,8648 | 22,3 (0,82) | 22,7 (0,7) | 0,5664 | 23,7 (0,55) | 26,6 (0,5) | 0,0001 | 26 (0,88) | 27,2 (0,72) | 0,0903 |
Tabelle 6:. IVSS Messungen Fiber Morphologie abgeleitet von Gen von Interesse Studie Vergleich von Faserzellwand, Zellgröße und MFA Messungen aus transgenen Fasern stammen aus Eucalyptus globulus x camaldulensis Klone mit Eucalyptus transformierten Stämmen grandis FLAs (EgrFLA1, 2, 3) und Positivkontrolle (nur GUS) mit den benachbarten, nicht transgenen Kontrollfasern. Die Daten stammen von MacMillan et al. 9. * Zeigt Studie die Messung von 10 Fasern in 10 Sektor (tot beteiligtal von 100 Fasern). # Zeigt Studie die Messung von 5 Fasern in 20 Sektoren (insgesamt 100 Fasern) beteiligt. α <0,05 fett dargestellt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Tabelle anzuzeigen.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS nur (positive Kontrolle) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2,839 | 8,856 | 9,976 | 9.18 | 29,165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12,008 | 11,363 | 30,234 | |||
| EgrCESA3 | 15,151 | 16,123 | 15,488 | 37,791 | |||
| EgrCESA4 | 4,852 | 0,108 | 46,858 | ||||
| EgrCESA5 | 3,275 | 11,278 | |||||
| EgrCESA7 | 36,082 | ||||||
| GUS nur (positive Kontrolle) |
Tabelle 7: Chi 2 abgeleitete Werte aus dem Vergleich von Promotor - Expressionsmuster in cambial Derivate Chi 2 Analyse das Vorhandensein / Fehlen von GUS - Färbung in P, X1 und X2 Region cambial Derivate vergleicht. zwischen sechs Eucalyptus grandis CESA Gen - Promotoren - Sequenzen (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) und der positiven Kontrolle (GUS only). Die Daten stammen von Creux et al. 10. α <0,05 in unterstrichen gezeigt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Die IVSS-Protokoll ist ein relativ einfaches und effizientes Verfahren zur Erzeugung transgener Stamm Gewebe in Baumarten in den Raum von ein paar Monaten für die Analyse von Genen und Promotoren von Interesse an Holz beteiligt und Bildung einzudämmen. Wenig Aufwand, über Pflanzen am Leben zu erhalten, ist erforderlich , transgene Stammgewebe nach der Impfung zu wachsen, die in - vitro - Verfahren im Gegensatz steht , wo umfangreiche Kultivierung erforderlich ist , Gewebe oder Pflanzen zu erhalten, wo die Holzproduktion bis Jahre dauern kann beginnen oder wo eine echte Nebenschaft 1 nicht erstellt. ISSA hat auch zu einem breiten Spektrum von Baumarten, einschließlich der Arten in der Gattung Populus, Eukalyptus und Pinus 6 sowie Acacia und Corymbia anwendbar zu sein gezeigt worden (Daten nicht gezeigt) , wo nur sehr wenig, wenn überhaupt, Optimierung erforderlich ist , transgenen Gewebe ableiten. Mit diesem Verfahren ist es daher möglich, eine Zahl zu untersuchen of Gene oder Promotoren von Interesse bei den meisten Arten von Interesse. Ferner kann das Protokoll für sich allein oder in Verbindung mit mehr weit verbreitet in - vitro - Techniken , bei denen mehrere Gene IVSS untersucht werden kann in erster Linie nach vorn in - vitro - Methoden , um mehr erforderlichen Maßnahmen zu treffen potentielle Kandidaten zu identifizieren werden.
Die beschriebenen Beispiele zeigen, dass eine ausreichende Sektoren geschaffen werden können nachgeschaltete Analyse von nur einer kleinen Anzahl von transgenen cambial Fenster vorzunehmen. Mit ATScm -2 Werte von 46,1 in eucalypt und 14,6 in Pappel nur ein oder zwei cambial Fenster ausreichend wäre, einen einzigen Zug zu untersuchen , wie ist es möglich , zahlreiche Fenster zu einem einzigen Pflanzenstängel oder replizieren auf zahlreichen Pflanzen hinzuzufügen. In der Praxis führen jedoch nicht alle cambial Fenster zur Schaffung eines cambial Sektor, der verwendet werden kann als die Größe der Sektoren (Tabelle 1, Tabelle 2) variieren kann, sind sie im Allgemeinen kleinund in Fällen, in unmittelbarer Nähe zueinander ihre Verwendung für nachgeschaltete Analyse Begrenzung befinden. Zusätzlich kann das Gen von Interesse Auswirkungen auf die Lebensfähigkeit der Zellen 12 oder andere Aspekte der Zellentwicklung potentiell in vollständiger Abwesenheit von transgenen Sektoren für ein spezifisches Gen von Interesse resultiert. Es ist daher ratsam, immer eine größere Anzahl von Fenstern zielen, als es für die Analyse benötigt werden. Ähnliche Vorsicht sollte angewendet werden , wenn für die Promotorstudien IVSS Verwendung als signifikante Variabilität kann in einigen Fällen (Tabelle 2) beobachtet , die mit wenig / schwach oder gar kein Ausdruck zu erwarten. Jedoch eine kleinere Anzahl von Sektoren, so wenig wie 6, wurden erfolgreich eingesetzt Analyse 10 gezeigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass recht bescheiden Experimenten mit nur eine kleine Anzahl von Fenstern zu deutlichen Einblick in die Genfunktion und Promotoraktivität führen kann.
Aus einer Analyse Perspektive, die Nähe von transgenic und nicht-transgenen Gewebe stellt ein leistungsfähiges Werkzeug, kleine, aber bedeutsame Unterschiede in Züge zwischen den Genen von Interesse zu identifizieren. direkt benachbart zueinander sind von der gleichen genotypische Hintergrund abgetasteten Zellen und Geweben und von den gleichen Umgebungsbedingungen die Verringerung der Anzahl von unabhängigen Variablen und Vereinfachung der statistischen Analyse erforderlich beeinflusst. Aus einer Probenahme Perspektive abgeleitet Leistungsanalyse auf ISSA Daten aus mehreren Experimenten (beispielsweise Tabelle 6), daß eine kleinere Anzahl von Messungen pro Sektor gezeigt hat, zum Beispiel Zellwanddicke von 3-5 Zellen pro Sektor, und Messen einer größeren Anzahl Branchen, zum Beispiel 20 bis 25 Sektoren für ein Gen von Interesse, stellt eine effizientere und statistisch robust Probenahmestrategie. Jeder Sektor stellt einen unabhängigen Transformationsereignis oder "Linie" der Zellen mit der statistischen Analyse durchgeführt, die durchschnittliche Wirkung mehrerer Transformationsereignisse zu bestimmenBeteiligung des Gens von Interesse. Ebenso die Fähigkeit, alle Stamm Gewebe zu verwandeln bietet die Möglichkeit, die Expression von Promotoren von Interesse in der gesamten Stamm zu untersuchen und insbesondere während Kambium Differenzierung. ISSA Protokolle hier beschrieben bieten eine zuverlässige und validierte Pipeline von der Schaffung von transgenen Gewebe bis hin zur Gewinnung von Proben, Sammlung und Analyse von Daten für die Gewebe- und Zellmorphologie und nach Mustern Promotor die Expression.
In den meisten Fällen Sektoren sind das Ergebnis der Transformation einer einzelnen Zelle, die durch Zellteilung haben zu einer Reihe von Zellen und Geweben Derivat gegeben werden. Zum Beispiel ergibt sich ein cambial Sektor aus der Transformation von einer einzigen Zelle, die Wunde Erholung nach einem cambial Anfangs wird, die wiederum periclinally und anticlinally teilt einen Sektor erstreckt den ganzen Weg von der ursprünglichen Wunde in das Phloem zu schaffen. In diesen Fällen wurde der transformierte Anfangs gehaltenim Kambium bis zum Zeitpunkt der Ernte und eine "volle" Variante beobachtet wird, jedoch, wo diese erste von der cambial Schicht während der radialen Wachstum verloren und ersetzt durch eine nicht-transformierten Zelle benachbarten durch 'Zell-Invasion ", dann ein" verloren anfängliche "Variante wird das Ergebnis sein. Um eine korrekte Klassifizierung der Sektortypen zu gewährleisten und bei der Interpretation der Ergebnisse zu unterstützen, ist es dringend empfohlen, Einarbeitungs mit anatomischen Merkmalen des Nebenschaft Entwicklung und Wundreaktionen Voraussetzungen für die Analyse der IVSS Ergebnisse sein. Auch die regelmäßige Überprüfung des pH-Wertes des GUS-Reagenz wird empfohlen (siehe Schritt 5.6). Ein niedriger pH - Wert (beispielsweise unter 6) kann auf die Aktivierung von endogenem β-Glucuronidasen (GUS) in der Pflanzenstängel führen , die den wahren Umfang eines Sektors maskieren oder zur Identifizierung von Fehlalarmen führen. Wo dies vermutet wird, empfiehlt es sich, dass diese Proben aus der weiteren Analyse ausgeschlossen werden. Das GUS-Reagenz-Protokollzuverlässig angewendet in den hier um skizzierten Untersuchungen mögliche Probleme mit endogenen GUS - Aktivität zu lindern wurde von Hawkins et al angepasst. (2002) 16 und verwendet zusätzliche Schlüsselschritte einschließlich zwei Spülungen mit Phosphatpuffer Proben auf pH 7 äquilibriert, und die Wärmebehandlung bei 55 o C für 10 Minuten endogene GUS - Aktivität 17,18 zu destabilisieren. GUS Reagenz Permeabilität ist auch begrenzt, und ist verantwortlich für weniger Sektoren werden unter Verwendung der Querscheibe Protokoll identifiziert, verglichen mit dem Phloem peel-Protokoll.
Alle Arten haben gezeigt, trialed bis zur Transformation von cambial Gewebe anfällig sein. Jedoch signifikante Unterschiede in der ATScm -2 sowohl zwischen als auch innerhalb von Gattung und Art beobachtet. Ebenso ist der Stamm von A. tumefaciens und Zeit / Zeit der Impfung kann ATScm beeinflussen -2. Es wird vorgeschlagen, dass Unternehmen einige vorläufige Prüfung dieser Variablen in der Spezies und Genotypen untersuchten vor größerem Maßstab Annahme des Protokolls. Theoretisch gibt es keine Grenze für das Alter oder Größe der Stämme, auf die ISSA so lange angewendet werden könnte, da es eine aktiv wachsende Kambium ist. Jedoch zur Erleichterung der Weiterverarbeitung von transgenem Gewebe Sektoren wird empfohlen Besiedlungs Stielen von etwa 1 cm Durchmesser.
IVSS ist nicht ohne Einschränkungen. Die relativ geringe Größe der transgenen Gewebe Sektoren beschränkt derzeit nachgeschalteten Verfahren Phänotypisierung und folglich nur eine begrenzte Anzahl derartiger Verfahren routinemßig bisher verwendet wurden. Diese Verfahren werden hauptsächlich auf morphologischen Charakterisierung konzentriert wie oben als auch semiquantitative Schätzung der Monosaccharide Zusammensetzung in der Sekundärzellwand umrissen in Einführungs 9,11 festgestellt. Mit dem Aufkommen und Verfeinerung neuer Technologien für die Feinskalenanalyse von biologischen Materialien besteht weiteres Potenzial zusätzliche Phänotypisierung zu entwickelnPipelines für ISSA Sektoren, zum Beispiel in Zusammensetzungsanalyse Zellwand. Es bleibt jedoch schwierig, quantitative auszuführen, Sektor für Sektor, Ribonukleinsäure (RNA) auf der Basis der Genexpression und Proteinuntersuchungen und / oder zu identifizieren und zu verbreiten ISSA transgenen Zellen durch in - vitro - Kultivierung zur weiteren Analyse durch die zerstörerische Natur des GUS - Test abgeleitet . Einige fluoreszierendes Reportergene und Gewebedruck wurde RNA aus einzelnen Sektoren zu quantifizieren trialed aber bis heute haben diese Vorgehensweisen nicht erfolgreich für mittlere bis hohe Durchsatzscreening im Routinebetrieb eingesetzt. transgene Techniken nicht trialed bisher wie RNAi könnte weiter erschweren Analyse, wo die GUS-Expression und Herabregulation von Zielgen nicht kolokalisieren.
Zwar gibt es einige aktuelle Einschränkungen, Einbau von neuen und aufkommenden Technologien und Analyseverfahren sind wahrscheinlich diese Einschränkungen zu überwinden, die Rolle der IVSS eine Verbesserungsa mittlerem bis hohem Durchsatz-Protokoll für die komplexe molekulare Natur cambial Differenzierung sezieren, Holz Entwicklung und Bildung einzudämmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
- Spokevicius, A. V., Tibbits, J. F. G., Bossinger, G. Whole plant and plant part transgenic approaches in the study of wood formation - benefits and limitations. TPJ. 1 (1), 49-59 (2007).
- Chaffey, N. Wood formation in forest trees: from Arabidopsis to Zinnia. Trends Plant Sci. 4 (6), 203-204 (1999).
- Moller, R., McDonald, A. G., Walter, C., Harris, P. J. Cell differentiation, secondary cell-wall formation and transformation of callus tissue of Pinus radiata D. Don. Planta. 217 (5), 736-747 (2003).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Leitch, M. M., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated in vitro transformation of wood-producing stem segments in eucalypts. Plant Cell Rep. 23 (9), 617-624 (2005).
- Plasencia, A., et al. Eucalyptus hairy roots, a fast, efficient and versatile tool to explore function and expression of genes involved in wood formation. Plant Biotech J. , (2015).
- Van Beveren, K. S., Spokevicius, A. V., Tibbits, J., Wang, Q., Bossinger, G. Transformation of cambial tissue in vivo provides efficient means for Induced Somatic Sector Analysis (ISSA) and gene testing in stems of woody plants species. Funct Plant Biol. 33 (7), 629-638 (2006).
- Spokevicius, A. V., Van Beveren, K., Bossinger, G. Agrobacterium-mediated transformation of dormant lateral buds in poplar trees reveals developmental patterns in secondary stem tissues. Funct Plant Biol. 33 (2), 133-139 (2006).
- Spokevicius, A. V., et al. beta-tubulin affects cellulose microfibril orientation in plant secondary fiber cell walls. Plant J. 51 (4), 717-726 (2007).
- MacMillan, C. P., et al. The fasciclin-like arabinogalactan protein family of Eucalyptus grandis contains members that impact wood biology and biomechanics. New Phytol. 206 (4), 1314-1327 (2015).
- Creux, N. M., Bossinger, G., Myburg, A. A., Spokevicius, A. V. Induced somatic sector analysis of cellulose synthase (CesA) promoter regions in woody stem tissues. Planta. 237 (3), 799-812 (2013).
- Hussey, S. G., et al. SND2, a NAC transcription factor gene, regulates genes involved in secondary cell wall development in Arabidopsis fibers and increases fiber cell area in Eucalyptus. BMC Plant Biology. 11, (2011).
- Melder, E., Bossinger, G., Spokevicius, A. V. Overexpression of ARBORKNOX1 delays the differentiation of induced somatic sector analysis (ISSA) derived xylem fiber cells in poplar stems. Tree Genet. Genomes. 11 (5), (2015).
- Baldacci-Cresp, F., et al. PtaRHE1, a Populus tremula x Populus alba RING-H2 protein of the ATL family, has a regulatory role in secondary phloem fiber development. Plant J. 82 (6), 978-990 (2015).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning: A laboratory manual. , 3rd edn, Cold Springs Harbour Press. (2001).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Chaffey, N. The use of GUS histochemistry to visualise lignification gene expression in situ during wood formation. Wood formation in trees: Cell and Molecular Biology Techniques. , Taylor and Francis. 271-295 (2002).
- Hodal, L., Bochardt, A., Nielsen, J. E., Mattsson, O., Okkels, F. T. Detection, expression and specific elimination of endogenous beta-glucuronidase activity in transgenic and nontransgenic plants. Plant Sci. 87 (1), 115-122 (1992).
- Hansch, R., Koprek, T., Mendel, R. R., Schulze, J. An improved protocol for eliminating endogenous beta-glucuronidase background in barley. Plant Sci. 105 (1), 63-69 (1995).
