Abstract
crescimento do caule secundário em árvores e formação da madeira associada são significativos tanto a partir de perspectivas biológicas e comerciais. No entanto, pouco se sabe sobre o controle molecular que regula o seu desenvolvimento. Isto é em parte devido à física, recursos e limitações de tempo, muitas vezes associada ao estudo dos processos de crescimento secundários. Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados envolvendo qualquer parte da planta ou planta inteira em sistema tanto espécies lenhosas e plantas não-lenhosas. No entanto, as perguntas sobre a sua aplicabilidade para o estudo dos processos de crescimento secundária da haste, a recalcitrância de determinadas espécies e intensidade de trabalho são muitas vezes proibitivos para médias e aplicações de alto débito. Além disso, quando se olha para a formação de desenvolvimento do caule e madeira secundário as características específicas sob investigação só poderia tornar-se mensurável no final do ciclo de vida de uma árvore depois de vários anos de crescimento. Em resposta a estes desafios alternativa in vivo protocols foram desenvolvidos, com o nome Induced Somatic Análise Sectorial, que envolvem a criação de setores de tecidos somáticos transgênicos diretamente no secundária da haste da planta. O objectivo do presente protocolo é o de proporcionar um meio eficiente, simples e relativamente rápido para a criação de tecido de planta transgénica secundário para o gene e o promotor de caracterização funcional que pode ser utilizado numa gama de espécies de árvores. Os resultados aqui apresentados mostram que os sectores secundária da haste transgénicas podem ser criados em todos os tecidos vivos e de tipos de células em hastes secundárias de uma variedade de espécies de árvores e que a madeira características morfológicas como também os padrões de expressão do promotor em hastes secundárias pode ser facilmente avaliada facilitar média a alta caracterização funcional de transferência.
Introduction
Árvore de caules compreendem uma quantidade significativa de biomassa planetas e são de grande importância biológica, cultural e comercial. Hastes secundárias criar habitat, fornecendo recursos e abrigo para muitas outras formas de vida. Eles oferecem muitos outros serviços aos ecossistemas que habitam e agem como um recurso renovável para a produção de madeira, papel e celulose e outros produtos madeireiros e não-madeireiros. desenvolvimento secundária da haste e, mais especificamente, a formação da madeira é regulada pelo sistema complexo molecular que regulam o desenvolvimento de tipos específicos de células, a composição bioquímica das suas paredes celulares e como eles estão dispostos para formar tecidos e órgãos. Dissecando a base molecular do desenvolvimento secundária da haste e formação da madeira é confundida por muitos fatores, incluindo a variabilidade das propriedades da madeira e tronco dentro e entre as hastes, longos tempos de geração, sistemas de Cruzamento de acasalamento, alta heterozigosidade, alta carga genética, dormência sazonal, a longo maduroperíodos estabelecimento traço e o tamanho físico absoluto de árvores maduras. Como resultado, a compreensão do desenvolvimento secundária da haste em relação ao conhecimento detalhado da maioria dos outros aspectos do controle molecular do desenvolvimento da planta, ainda está em sua infância.
Um número de técnicas in vitro têm sido utilizados para estudar o desenvolvimento e compreender secundária da haste, em especial de madeira e a formação da parede celular secundária. Esses protocolos envolvem a utilização de sistemas de parte de planta ou planta inteira, em que ou as plantas transgénicas são criadas ou células ou tecidos específicos secundários são transformados para o estudo de aspectos específicos de madeira e / ou desenvolvimento de uma haste secundária. As plantas transgénicas podem ser recuperados transformação pós genética a partir de uma ampla variedade de tecidos de plantas e tipos de células, no entanto, o progresso é lento, especialmente quando se analisa os traços de fibras de madeira devido à longa regeneração e haste tempos de maturação (na ordem de anos), alta técnica e Deman de trabalhods, baixa taxa de transferência de genes candidatos, bem como dificuldades na propagação de algumas espécies de plantas lenhosas. Técnicas similares têm sido desenvolvidos no sistema de modelo não-lenhoso, como Arabidopsis que com sucesso superar algumas destas limitações, mas nem todos os tipos de células-tronco secundárias um presente nestes caules e caracteres relacionados à sazonalidade ou a longevidade não pode ser estudada em tais espécies 2. Alternativamente, sistemas de parte da planta, tais como Pinu s radiata calos 3 reduzir os prazos associados. Estes métodos são, no entanto restringida ao estudo de um tipo de célula individual e sofrem restrições semelhantes como observado em experiências in vitro. Da mesma forma, as culturas-tronco apicais 4 envolvendo explantes-tronco inteiros mostraram-se promissores, mas ainda não foram aplicadas para o estudo de genes ou promotores de interesse específicos. Mais recentemente, um protocolo alternativo envolvendo culturas de raízes peludas tem sido desenvolvido para o eucalipto e tem sido êxitoaplicada 5, no entanto, este método ainda requer cultivo in vitro, envolve raízes secundárias em vez de hastes e até hoje ela é limitada a uma única espécie de árvore.
Induzida análise do sector somáticas (ISSA), conforme descrito aqui, foi desenvolvido para superar alguns desses problemas fornecendo um meio de alto rendimento ferramenta de triagem funcional para genes e promotores com papéis suspeitos na formação da madeira e desenvolvimento do tecido secundária da haste. ISSA é uma transformação e rastreio sistema in vivo que foi desenvolvido para reduzir o tempo necessário para a produção de células transgénicas e o tecido de uma haste secundária intacta, enquanto a superação de trabalho, limitações técnicas e taxa de transferência de rotina usado em métodos in vitro. Os protocolos aqui descritos permitem a criação simultânea de centenas de sectores tecido transformado de forma independente e células em hastes secundárias dentro de um curto período de tempo, nas espécies de árvores e tecido de interesse sem gvariação enetic e / ou ambiental dentro de prazos relativamente curtos e de baixo custo de trabalho. ISSA em técnicas in vivo foram primeiramente descrita por secundária da haste 6 e botão 7 tecidos e desde então foi refinado no tecido secundária da haste através de estudos de genes e / ou promotores envolvidos na diferenciação cambial e incluem: tubulina (TUB) 8, a fasciclina-like arabinogalactan ( FLA) 9, sintase celulose (CESA) 10, célula domínio NAC associada a parede secundária (SND2) 11, ARBORKNOX (ARK1) 12 e realmente proteína interessante novo gene (ANEL) H2 13. Estes estudos foram realizados no secundário caules de plantas de álamo e de eucalipto e fornecidos insights sobre a morfologia das células, química da parede celular e expressão gênica.
Os protocolos descritos aqui têm a intenção de reunir a experiência de umnd conhecimento adquirido através do desenvolvimento e aplicação de ISSA de uma série de estudos publicados e não publicados durante a última década. Eles se concentram na transformação in vivo de tecidos secundária da haste 6 e concentrar-se em estudos envolvendo clone Populus alba 'pyramidalis', Eucalyptus globulus, bem como 11 Eucalyptus camaldulensis clones globulus x. Este documento leva pesquisadores através do protocolo a partir do cultivo de plantas e bactérias, a transformação de tecidos do caule, crescimento e colheita de tecido, de identificação das células transgénicas e tecidos, de preparação para as avaliações fenotípicas e métodos para a recolha e análise de dados. Embora as técnicas de sucesso têm sido aplicados para medir a composição monosaccharide parede celular também 9,11, devido a limitações de espaço, este documento concentra-se em técnicas utilizadas para medir celular e morfologia do tecido e compreender os padrões de expressão de genes em r secundárioems somente. Assim, o protocolo como descrito é ideal para quem procura obter mais insights sobre o papel e / ou expressão de genes ligados ao secundário hastes usando um baixo custo, tecnicamente fácil, e médio e método de alto rendimento.
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Protocol
1. Preparação de material vegetal
- Antes da experimentação, levantar novas mudas das espécies de árvores preferenciais a partir de sementes ou o corte e crescer árvore / s até que o diâmetro da haste na área destinada para a experimentação é de aproximadamente 1 cm de diâmetro.
Nota: O tempo necessário pode variar devido a, por conseguinte, as taxas de crescimento de plantas permitem que entre três a nove meses para esta etapa.
2. Binário Vector Creation
- Realizar trabalhos a partir desta secção para secção 7 em um laboratório ou estufa onde Agrobacterium pode ser manuseado e que os equipamentos de protecção individual adequados prescritos para o laboratório é usado.
- Preparar um vector binário contendo ou um gene de interesse ou knockdown cassete sobre-expressão e uma cassete do gene repórter β-glucuronidase (GUS) ou um promotor de interesse fundida com um gene de GUS, dependendo do tipo de estudo.
Nota: Há uma série de BAC vector bináriokbones que podem ser obtidos comercialmente ou através de redes de investigação, bem como inúmeras técnicas disponíveis para inserir genes e promotores de interesse em vetores binários. No âmbito deste protocolo é até o experimentador para tomar a decisão sobre como criar um vetor binário. - Transformar vetor binário para uma estirpe desarmada de A. tumefaciens utilizando eletroporação ou calor choque 14 e armazenar adequadamente até que sejam necessários para a experimentação.
- Repita o passo 2.2 para qualquer positiva e / ou controlos negativos.
Nota: Os controlos negativos devem incluir um vetor binário que contém nenhum gene de interesse para um gene de interesse de estudo e uma GUS sem promotor para um promotor de estudo juros. controle positivo para um promotor de estudos interesse deve incluir um mosaico da couve 35s vírus promotor (CaMV35S) fundido a um repórter GUS.
3. Preparação de A. tumefaciens para inoculação
- Pelo menos uma semana antes da experimentation, dê uma pequena quantidade (cerca de 1 ul) de A. tumefaciens preparada durante o passo 2.2 e 2.3 e espalhada pouco em meio LB separado com agar 14 placas contendo antibióticos apropriados para a seleção bacteriana. Crescer a 28 ° C em uma incubadora para formar colónias pequenas e, em seguida, armazenar a 4 ° C até ser necessário.
- 48 horas antes da experimentação, transferir uma colónia de A. Agrobacterium a partir de cada placa em separado, a 50 ml de parafuso superior tubos contendo 5 ml de pré-aquecido (28 ° C) meio LB 14 contendo os antibióticos apropriados para a selecção bacteriana e agitar a 200 rpm num incubador agitador de tapete durante aproximadamente 48 horas a 28 ° C até mistura é muito nebuloso.
- Entre 4-6 horas antes da inoculação de caules de plantas (secção 4) adicionar 1 ml de LB / A. mistura Agrobacterium em um fresco 50 ml parafuso tubo superior contendo 19 ml (diluição de 1:20) de fresco quente (28 ° C) media LB com os antibióticos apropriados paraselecção bacteriano. Se a densidade óptica (DO) a 600 nm (OD 600, tal como medido por espectroscopia) é superior a 0,1, ainda mais dilua com LB quente até que isto é conseguido.
- Coloque diluída LB / A. mistura Agrobacterium para trás no incubador agitador e agitar sob as mesmas condições (200 rpm, 28 ° C) até DO600 está entre 0,4-0,6 e remover.
- Centrífuga LB / A. Agrobacterium mistura durante 15 min a 1000 xg e 4 ° C.
- Decantar o líquido e ressuspender imediatamente A. Agrobacterium pellet em 1 ml de refrigeração meio MS 15, a transferência para 2 ml microtubo e armazenar em gelo até ser necessário para inoculação (secção 4). Esta solução é referida como inoculação mídia.
4. A inoculação de Caule com A. Agrobacterium
- Comece a experimentação durante o final da primavera ou início do verão usando plantas criadas na seção 1 que têm um câmbio ativo e em crescimento rápido. Um bom para um diagnósticocâmbio crescimento activo e rápido é que o floema pode ser facilmente descascada do xilema.
- Encontrar um trecho reto clara do tronco perto da base da planta e remover quaisquer folhas e ramos.
- Usando um bisturi afiado (de preferência, N ° 11) ou a lâmina de barbear, criar de 1 cm 'janela cambial' 2 numa secção de haste clara mediante a introdução de dois incisão vertical paralelo através do floema de 20 mm de comprimento e um 5 milímetros à parte, em seguida, uma corte horizontal que liga os dois cortes verticais na sua extremidade de base.
- Descasque a tira criada pelo floema incisão para cima, expondo o tecido do xilema desenvolvimento e adicionar suficiente Meios de inoculação a partir do passo 3.6 para molhar a superfície do xilema desenvolvimento exposta usando uma pipeta (tipicamente 5-10 ul). recoloque imediatamente a tira floema.
- Vincular a tira floema para o tronco firmemente com Parafilm.
- Repita os passos de 4,2 a 4,5 para todas as janelas do câmbio adicionais para o gene (s) ou promotor (s) de interesse a criação de umNY New cambiais janelas menos 1 cm acima ou abaixo de outras janelas do câmbio e com um 90 ° offset.
- Complete as etapas de 4,2 a 4,5 para os vetores de controlo positivo e negativo (passo 2.4), assegurando que cada vetor é adicionado à mesma raiz de cada planta utilizada no experimento.
- Monitorar o crescimento da haste diâmetro periodicamente e colheita para ensaio de GUS (seção 5), quando o crescimento radial de pelo menos 5 mm foi observado em hastes.
Nota: A quantidade de crescimento radial necessário é dependente da quantidade de tecido necessário para análise a jusante.
5. Colheita por GUS histológica Assay
- Excise a "janela cambial 'a partir do tronco de remover qualquer tecido que não faz parte de um novo crescimento dentro da janela de cambial.
- Para os estudos relativos a amadurecer xilema e morfologia das células / tecidos do floema, descasque o floema do xilema.
- Para os estudos em que a zona cambial é obrigado a permanecer intactas ou os padrões de expressão de promotor são para ser avaliarEd, a fatia de janela cambial transversalmente usando uma lâmina de barbear ou outra lâmina afiada em discos de entre 0,5 e 1 mm de espessura.
- Coloque tecidos janela do câmbio transformados em 14 ml redondos tubos inferiores e lavar duas vezes em tampão de fosfato 0,1 M a pH 7 14. Assegurar que o tecido está completamente submerso, permanece em solução durante pelo menos cinco minutos, e toda a solução em excesso é removido no final do a segunda lavagem.
- Adicionam-se 5 ml de reagente de GUS (mm x-gluc 0,5 (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-glucurónico), 10 mM de EDTA, 0,5% de Triton X-100 v / v, de potássio 0,5 mM ferricianeto (III), 0,05 mM de ferrocianeto de potássio (II), fez-se o volume final com 0,1 mM de tampão fosfato de pH 7.; ver Hawkins et al 16) para cada tubo. Se o tecido não está completamente submerso, adicione o reagente GUS adicional.
- Incubar os tubos durante 10 min a 55 ° C no escuro.
- Incubar os tubos para uma nova 12-16 horas numa incubadora com agitação a 37 ° C no escuroutilizando agitação suave (entre 30 e 60 rpm) para permitir a mistura.
- Após remoção a partir incubador agitador vá aleatoriamente o pH do reagente de GUS em um pequeno subconjunto dos tubos usando papel de tornassol com uma gama de pH 0-7.
- Se qualquer um dos tubos tem um pH abaixo de 6, em seguida identificá-los. Continue a verificar o restante dos tubos para confirmar o pH e rotular se o pH é de 6 ou abaixo.
Nota: As amostras com um pH inferior a 6 podem não ser adequadas para a análise. Estas amostras devem ser excluídos da análise posterior.
- Se qualquer um dos tubos tem um pH abaixo de 6, em seguida identificá-los. Continue a verificar o restante dos tubos para confirmar o pH e rotular se o pH é de 6 ou abaixo.
- Decantar reagente GUS e substituir com suficiente de etanol a 70% para cobrir o tecido.
- Armazenar a 4 ° C até ser necessário.
6. Identificação de Tecido Transgenic
- Utilizando uma pinça, retire todo o tecido janela cambial de um tubo e coloque na bandeja pequena ou placa de Petri para permitir a visualização microscópica.
- Usando um microscópio de dissecação entre 1X e uma ampliação de 4X, identificar e contar o número de células ou tecidosque têm uma coloração azul brilhante. Azul células ou tecidos manchados são referidos como um sector a partir deste ponto em diante. Tally-los das seguintes maneiras.
- Para amostras onde o floema tem sido removidos (passo 5.1.1), contar o número de sectores em tecido cambial encontrada na superfície do xilema desenvolvimento (sector cambial, Figura 1a).
- Para as amostras que foram cortados em discos (passo 5.1.2), contar os sectores número encontrado nos diferentes tipos de células ou de tecidos (Figura 1b, 1c, 1d). Sectores podem ser encontrados nos seguintes tipos de tecidos: o periderme (sector periderme, Figura 1E), floema (sector floema, Figura 1F), tecido cambial Sector parênquima (sector Cambial, Figura 1g, 1h, 1I), o parênquima de feridas (de feridas, Figura 1-J) e em tilos (sector Tylose, Figura 1k).
- Durante microscópica umaAVALIAÇÃO garantir que ambos os lados de um disco ter sido visto e que setores que ocorrem em dois discos são combinados de modo que os números não são superestimados.
- Coloque sectores somente o tecido contendo de volta para o tubo contendo 70% de etanol e armazenamento até serem necessários.
- Repita o passo 6.1 a 6.3 para quaisquer janelas cambiais adicionais, incluindo o controlo positivo e / ou negativo.
- Calcule a eficiência média de transformação para cada tipo de sector para cada gene ou promotor de interesse e os controles separadamente pela divisão do número total de setores pelo número total de 1 cm 2 janelas cambiais para obter um número médio de eventos de transformação por cm 2 de Cambium inoculadas (ATScm -2).
- Avance para o passo 7.2 e 8 para análise dos padrões de expressão do promotor e do passo 7.1, 7.2 ou 7.3 para técnicas para avaliar celular e morfologia do tecido no tecido cambial.
7. Análise deCelular e Tecidual Morfologia em tecido cambial
Nota: Estes são uma variedade de técnicas que têm sido usadas com êxito para a análise de amostras ISSA derivado.
- Análise da área xilema celular, área de lumen, espessura da parede celular e área de parede celular usando microscopia eletrônica de varredura (MEV).
Nota: Este protocolo requer preparação da amostra mínima e permite relativamente alta taxa de transferência de análise sectorial relativa às características morfológicas descritas.- A partir desta etapa em diante certifique jaleco, proteção para os olhos e as luvas são utilizadas sempre tecido lenhoso está sendo manuseados e tratados.
- Identificar um sector cambial para análise e fazer uma incisão de aproximadamente 0.5 mm para ambos os lados do mesmo, utilizando uma única lâmina de borda de lâmina para criar um disco (Figura 2a).
- Aparar tecido do xilema excesso deixando aproximadamente, 1 mm de tecido do xilema para o lado tangencial do sector (Figura 2b).
- CuidadoLY cortado transversalmente através do centro do sector usando uma lâmina de barbear de borda dupla fresco (Figura 2c).
- Fazer duas incisões radiais adicionais raso no plano de cada lado transversal do sector para demarcar o tecido transgénico (Figura 2d). Como coloração de GUS não penetram profundamente no tecido acompanhar os ficheiros de células radiais para ambos os lados do tecido manchado encontrada na superfície do câmbio.
- Anexar rosto sector cambial preparado até à fase de um pino de suporte de SEM montagem usando SEM fita condutora (Figura 2e) e manter em dessecador até ser necessário para a visualização SEM.
- Repita os passos 7.1.2 a 7.1.6 para todos os setores adicionais, incluindo os do controle negativo.
- Usando um SEM em um modo de baixo vácuo (energia 5 kV, spot 3,0 nm), visualizar e tirar fotos de células / tecido dentro do sector, bem como a células / tecidos diretamente junto do sector (Figura 2F). A quantidade de ampliaçãoestá dependente das características de interesse. No caso das fibras do xilema, 2,000X é adequado (Figura 2G).
- Uma vez que um sector cambial foi visualizado e fotografias tiradas com uma ampliação apropriado, medir xilema de células / tecidos características morfológicas de interesse usando software de medição de imagem.
- Para a análise estatística, realizar múltiplos pares análises usando testes t pareados para comparar a diferença entre morfológica medida no sector transgênicos e as adjacentes não-transgênico células controle / tecido (medido no espaço de 0,5 mm de borda sector) para cada setor para determinar um p -valor.
- Repita o passo 7.1.10 para o controlo negativo.
- Nos casos em que o controlo positivo mostra um p-valor baixo (α <0,05), calcular a diferença entre o transgénico e adjacente células não transgénicas / tecido para uma característica morfológica. Utilizar esta 'valor de diferença' em um teste t desemparelhado para comparar o efeito do gene de interesse com o negative controlo para determinar um valor de p.
- histoquímica dos padrões de morfologia celular cambial / tecido ou de expressão promotor-tronco células / tecidos utilizando microscopia de luz.
Nota: Apesar de mais demorado, este método permite mais opções de análise, incluindo aspectos da dinâmica do câmbio, por exemplo, largura cambial, bem como padrões de expressão promotor. Além disso, se não for possível aceder a um SEM, este protocolo pode ser utilizado como uma alternativa para o passo 7.1.- Sector especial de consumo de interesse utilizando lâmina de barbear e algum tecido circundante como pequenos blocos (não superior a 1 mm3) e lugar directamente em 1-3 ml de etanol a 100% em um frasco de amostras com tampa de rosca por pelo menos 2 dias a 4 ° C num agitador. Prepara-se o pequeno bloco de uma forma que vai permitir que para a superfície de interesse para ser acedido por um micrótomo.
- Repita o procedimento para todos os setores adicionais, incluindo os do controle negativo.
- Remover o líquido e substituir com 25% de etanol: 75% de mistura de LR branco durante 2 dias, mantendo condições.
- Repita o passo 7.2.3 com 50% de etanol: 50% de brancos LR, 25% de etanol: 75% LR branco e, finalmente, duas vezes, com 100% de brancos LR.
- Coloque pequeno bloco na Incorporação Mold com a superfície de interesse alinhado à extremidade curta e cuidadosamente cobrir com branco LR fresco e polimerização de acordo com as instruções do fabricante.
- Corte de 5 mm seções da superfície de juros sobre um micrótomo rotativo e montar em uma lâmina de vidro. Use coloração safranina O (0,01%) para visualizar parede celular e / ou outras características.
- Adicione meios de montagem, coloque uma lamela e deixar solidificar durante a noite.
- Vista sob um microscópio de luz entre a imagem de captura de 100X e 600X ampliação e.
- Capturar características morfológicas de imagens que usam software de medição de imagem.
- Para a análise estatística de traços morfológicos quantitativos, no seguimento da etapa 7.1.10.
- Para a análise qualitativa de características morfológicas,comparar e descrever padrões observados para o gene ou promotor de interesse e o negativo e / ou controlo positivo.
- Análise de microfibrila Angle (MFA) em Fibras macerado Usando Microscopia de Luz.
- Especial de consumo transgénico xilema tecido directamente a partir de um sector, bem como a partir de tecido não-transgénica adjacente à mesma (dentro de 0,5 mm, A Figura 2 h) e no lugar separadas tubos de 1,5 ml. Repita o procedimento para todos os setores adicionais, incluindo os do controle negativo.
- Complete as etapas 7.3.3 a 7.3.5 em um exaustor.
- Adicionar 250 ul de peróxido de hidrogénio e 250 ul de ácido acético glacial a cada tubo.
- Coloque o tubo num bloco de calor a 90 ° C durante 2 h em hotte.
- Remover o tecido a partir de tubos e cuidadosamente lavar com água destilada pelo menos duas vezes.
- Usando um meio de montagem solúvel em água, montagem de tecido sobre uma lâmina de vidro e provocar uma separação com uma pinça afiada antes de aposição uma lamela.
- Visãosob um microscópio de luz e capturar as imagens das fibras individuais a ampliação superior a 400X.
- Para determinar o ângulo de microfibrilas de fibras, medir o ângulo entre as aberturas de poço e / ou estrias da parede celular e o eixo longo da fibra (Figura 2i) utilizando software de medição da imagem.
- Para a análise estatística, surgem na sequência do passo 7.1.10.
8. Análise de Promotor padrões de expressão
- Análise do promotor de padrões de expressão em tecidos secundária da haste.
- Tally a frequência de cada tipo de sector para o promotor de interesse, bem como os controlos positivos e negativos como observado na etapa 6.2.2.
- Comparar a frequência dos diferentes tipos do setor para o promotor de interesse com o controlo positivo utilizando testes de qui-quadrado para estabelecer valores de p. Uma análise mais aprofundada da especificidade de células / tecidos podem ser realizadas usando o passo 7.2, conforme necessário.
- Se mais do que um promotorde interesse está sendo investigado em seguida, repita esta comparação tomada de análise entre todos os promotores de interesse e do controlo positivo.
- Se sectores ou coloração azul são observadas no controlo negativo, em seguida, adicione à análise ou abandonar dependendo da amplitude ou se coloração endógena é suspeito (ver discussão).
- Análise dos padrões de expressão do promotor Durante Desenvolvimento Derivative Cambial e Diferenciação.
- Usando um microscópio de dissecação, visualizar todos os sectores do câmbio (Figura 1G, 1H, 1i) identificados na etapa 6.2 e determinar a presença / ausência de coloração azul em três tipos de tecidos derivados do câmbio vascular; o floema (P), o desenvolvimento de xilema (X1) ou do tecido do xilema desenvolvido (X2) (ver Figura 3a).
- Como por etapa 8.1.2, comparar a frequência de presença / ausência de coloração GUS nas regiões P, X1 e X2 de promotor de interest com o controlo positivo utilizando testes de qui-quadrado para estabelecer valores de p. Uma análise mais aprofundada da especificidade de células / tecidos podem ser realizadas usando o passo 7.2, conforme necessário.
- Veja os passos 8.1.2.1 e 8.1.2.2 para considerações adicionais.
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Representative Results
Usando este protocolo todos os tipos de células estaminais e de tecidos vivos secundárias têm sido mostrados para ser susceptíveis a A. tumefaciens e transformações foram definidos em tipos sector com base no tipo de células inicialmente transformada e que o padrão de crescimento subsequente desenvolvimento. Tipos sector incluem periderme, floema, cambial, parênquima de feridas e tilose (Figura 1b, 1c, 1d) e podem ser encontrados em locais consistentes descrevem no restante do presente parágrafo. Um sector compreende periderme de um grupo de células transformadas encontradas exclusivamente na periderme e nunca se estende para o floema (Figura 1E). Um sector floema pode ser encontrado em vários locais entre a camada iniciadora e o periderme, no entanto, nunca se estende para estes tecidos circundantes (Figura 1F). Um sector cambial é composta de tecidos do xilema / câmbio / floema transformadas derivadas de transformation de inicial cambial e pode ocorrer em três padrões distintos: i), células do xilema / cambial / floema transformadas sector cambial 'completo' que se prolongam a partir do limite do tecido da ferida parênquima através da zona de xilema e cambial ao tecido do floema contendo tanto ray e células fusiformes ou elementos ray só (Figura 1G), ii) 'perdeu inicial «sector cambial, uma variante do sector cambial completo onde uma inicial foi perdida a partir da camada de iniciação deixando xilema espelhado e setores do floema e uma camada de iniciação não transformada (Figura 1h), e iii) 'xilema apenas "sector do câmbio, o tecido transformado xilema que se estende a partir do limite da ferida do tecido parênquima para comprimentos variáveis no tecido xylogenic recém-formado, mas nunca atingir a camada de iniciação (Figura 1-I). Um setor ferida parênquima contém transformado células do parênquima ferida encontrados tanto como uma célula ou grupos de células individuais, muitas vezes em fil radialES, localizado entre a madeira pré-existente e tecidos do xilema recentemente formada (Figura 1j). Um Sector tilose composta por tilos embarcação transformadas encontrados dentro da madeira pré-existente (Figura 1-K).
Dados de eficiência de transformação é representativo, tanto do gene e o promotor de estudos de interesse, bem como os seus controlos positivos são apresentadas na Tabela 1 e Tabela 2. Os dados foram desenhados a partir de dois grandes ensaios realizados através do mesmo período de tempo (dezembro-abril) nas mesmas genótipos de eucalipto e álamo em dois anos sucessivos envolvendo um número de genes formação da madeira e promotores de interesse. Focando controlos positivos a partir do promotor de interesse estudos (Tabela 2), o tipo de tecido mais susceptíveis a A. transferência tumefaciens T-DNA é tecidos cambiais com cerca de 60% e 40% dos sectores identificados no eucalipto e álamo, respectivamentesendo os sectores do câmbio. Em eucaliptos, o próximo tipo sector mais abundante é enrolado parênquima em 35%, enquanto os outros tipos do setor todos tinham valores ATScm -2 abaixo de 5%. Em choupos, o próximo tipo sector mais abundante é enrolada parênquima a 20% seguido de floema em 15% enquanto que o restante dos tipos sector foram encontradas com uma frequência inferior a 5%. A maior probabilidade de encontrar um sector de uma janela cambial, bem como um maior número de sectores do câmbio identificados são típicos em que o protocolo de casca de floema é utilizada (Tabela 1, o passo 5.2.1), devido à capacidade para a coloração e a possibilidade de visualizar o toda a área do câmbio.
Durante o desenvolvimento destes protocolos de um número de variáveis foram explorados como parte de ensaios de optimização protocolo. Estes concentração bacteriana incluídas na inoculação de mídia, tipo de mídia usado na inoculação de mídia, além de acetoseringona à inoculação Media, idade de tecido e A. estirpe Agrobacterium, bem como tempo de inoculação e genótipo. Sector cambial ATScm -2 dados destes ensaios são apresentados na Tabela 3 e Tabela 4. A maioria das variáveis investigadas, quando alterado, conduzir a alterações na ATScm cambial -2 em ambas as espécies e são, em especial o aumento da concentração de bactérias na inoculação media, uso de MS na mídia inoculação e escolha de A. estirpe Agrobacterium. Além disso, o tempo de inoculação e árvore genótipo mostraram diferenças significativas em eucaliptos com inoculações no início do verão que mostram maior ATScm -2 enquanto clones de eucalipto SG21 e SG44 apresentaram maior cambial ATScm -2, 41,6 e 40,4, respectivamente, em comparação com os outros em todos os meses combinados.
O tamanho médio do sector cambial varia e é dependente da quantidade do seu crescimento tangencial e radial numa janela cambial. Numa subamostra de 53 sectores em choupo, cultivadas durante cerca de quatro meses, a largura tangencial de sectores no câmbio variou entre 0,09 e 0,58 mm, com uma média de 0,27 mm, enquanto o crescimento radial através janelas do câmbio foram entre 0,7 e 2,2 milímetros com uma média de 1,35 milímetros. Quando combinados, estes fornecido entre 0,063 mm2 e 1,276 mm2 de tecido transgénico para análise. Em outra sub-amostra de 188 sectores na mesma espécie, onde entre 1,5-4 mm de crescimento radial através da janela cambial foi observada ao longo de aproximadamente 5 meses, a massa de sector médio foi de 72 ug (Tabela 5).
A quantidade de tecido transgénico criado foi mostrado para fornecer células e / ou tecido para efectuar medições morfológicas, bem como para o estudo de actividade promotora suficiente. Por exemplo, a influência de três Eucalyptus grandis FLAs em um número de fibras do xilema características morfológicas 9 foi ex plored em clones de eucalipto e revelou possíveis papéis para EgrFLA2 na determinação do MFA e EgrFLA1 na determinação do tamanho da célula (Tabela 6). Além disso, os padrões de expressão de Eucalyptus grandis promotor do gene CESA no xilema desenvolvimento (X1), xilema desenvolvido (X2) e floema (P) tecidos 10 identificados padrões de expressão significativamente diferentes entre EgrCESA1, 2, 3, e EgrCESA4, 5, 7 em eucalipto hastes. Nesta análise, EgrCESA1, 2, 3 foram mostrados para ser expresso principalmente no desenvolvimento do tecido do xilema enquanto EgrCESA4, 5, 7, foram mostradas para ser expresso tanto em desenvolvimento e tecido do xilema floema (Figura 3b, Tabela 7). Todos os promotores EgrCESA mostraram significativamente diferentes padrões de expressão para o controlo positivo (promotor CaMV35S) (Tabela 7).
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Figura 1:. Sectores transgénicos tipos (a) sectores cambial como visto na superfície do xilema exposto após o processamento utilizando o protocolo de casca de floema (passo 5.2.1). Os discos mostram uma gama de tipos de sector na superfície transversal de choupo em (b) e o eucalipto (c) decorre após o processamento utilizando o protocolo de corte transversal (passo 5.2.2). (D) Diagrama esquemático da gama de tipos de sector encontrada em hastes da planta. Exemplos de sector periderme (e), o setor floema (f), o setor cambial 'cheio' (g), 'perdeu inicial "setor cambial (h),' xilema apenas" sector cambial (i), o setor parênquima ferida (j) e sector tilose (k) em choupo. Setas pretas indicam onde menor do sector porte estão localizados. Todas as barras de escala = 1 mm.iles / ftp_upload / 54553 / 54553fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2:. Preparação de setores do câmbio para análise morfológica utilizando SEM e microscopia de luz (a) Excisão do setor disco contendo. (B) Disco aparado para remover o excesso de tecido. Corte transversal através da superfície do sector transgénico (c). (D) Introdução de dois cortes radiais para ajudar na localização do tecido transgénico em MEV. (E) de tecido montada sobre um pino de SEM utilizando fita condutiva. (F) representação da região de tecidos transgénicos e não transgénicos que deve ser fotografada para análise. (G) Imagem típica de células de fibra xilema e raios capturados na 2,000X ampliação. (h (I) fibra macerada vista sob microscopia de luz que descreve o ângulo dos poços e / ou estrias na parede celular e o eixo longitudinal da célula. seta preta indica pit abertura. Barras de escala = af, h = 1 mm g, i = 20 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Análise e resultados de gene padrões de derivativos cambiais expressão promotor (a) representação do P (floema), X1 (xilema em desenvolvimento) e X2 (xilema desenvolvido) regiões.. (B) Os resultados indicam proporção de P, X1 e X2 coloração em sectores do câmbio de um teste envolvendo uma gama de CESA Eucalyptus grandis transformado em hastes de híbridos de eucalipto. Os dados provenientes de Creux et al. 10. n = número de setores avaliados. Barra de escala = 0,5 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| espécies de árvores | tipo Vector | Número de genes de interesse usado | Número total de janelas criado | Número total de janelas onde foi identificado um setor (%) | Cambial ATScm -2 cambial (em janelas onde foi identificado um sector) |
| Híbridos de Eucalyptus globulus x camaldulensis (total de três clones) | Controle Positivo (Genes de interesse) | 1 (apenas GUS) | 96 | 97% | 45,1 (1,5) |
| Genes de interesse | 20 | 630 | 92% | 46,1 (2,2) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Controle positivo (Genes de interesse) | 1 (apenas GUS) | 110 | 74% | 10,8 (1,5) |
| Genes de interesse | 20 | 700 | 81% | 14,6 (0,8) |
Tabela 1:. Cambial ATScm típica -2 para o controlo positivo e genes de interesse Figuras foram provenientes de estudos realizados ao longo de dois anos consecutivos na mesma eucalipto e clones de álamo utilizando uma gama de genes e do protocolo de colheita de casca de floema (passo 5.2. 1). valores de erro padrão entre parênteses. </ P>
| espécies de árvores | tipo Vector | Número de promotor / genes | Número total de janelas criado | Número total de janelas onde foi identificado um setor (%) | ATScm -2 todos os setores | ATScm -2 periderme | ATScm -2 floema | ATScm -2 cambial | ATScm -2 ferida parênquima | ATScm -2 Tylose |
| Eucalyptus globulus x camal- híbridos dulensis (total de três clones) | Controle positivo | <td> 1 (GUS apenas)118 | 63% | 25,74 (2,35) | 0,24 (0,07) | 0,89 (0,19) | 15,7 (1,71) | 8,84 (1,4) | 0,07 (0,03) | |
| Promotores de interesse | 28 | 1050 | 31% | 14.67 (1.77) | 0,02 (0,01) | 0,05 (0,01) | 13,79 (1,75) | 0,78 (0,21) | 0,03 (0,01) | |
| Populus alba 'pyramidalis' | Controle positivo | 1 (apenas GUS) | 110 | 54% | 12,37 (1,77) | 0,22 (0,07) | 1,85 (0,29) | 5,07 (0,6) | 2,78 (0,75) | 0,29 (0,53) |
| Promotores de interesse | 28 | 990 | 26% | 8,28 (1,18) | 0,16 (0,04) | 0,9 (0,09) | 6,67 (1,16) | 0,27 (0,07) | 0,28 (0,11) |
Tabela 2:. ATScm sector típica -2 para o controlo positivo e promotores de interesse Figuras foram provenientes de estudos realizados ao longo de dois anos consecutivos na mesma eucalipto e clones de álamo utilizando uma gama de sequências do promotor e do protocolo de colheita do disco (passo 5.2. 2). Valores ATScm -2 foram derivados de janelas, onde um setor só foi identificado. Valores de erro padrão entre parênteses. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
| Espécies | Tentativas | tratamento Descrição | Número de janelas em tratamento | |
| Eucalyptus globulus | Concentração de A. tumefaciens em meios Inoculação | Ressuspensas em 25 ml de MS | 10 | 1,4 (0,62) |
| Ressuspensas em 5 ml de MS | 10 | 1,6 (0,72) | ||
| Ressuspensas em 1 ml de MS (controlo) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| tipo de mídia na inoculação de mídia | LIBRA | 10 | 0,4 (0,22) | |
| MS (controlo) | 10 | 2,4 (1,16) | ||
| A adição de aceto-siringona à inoculação Meios | com acetoseringona | 11 | 0,9 (0,37) | |
| Sem acetoseringona (controle) | 11 | 0,6 (0,64) | ||
| Idade de tecido do caule inoculados | 6 meses (controeu) | 11 | 1,1 (0,66) | |
| 18 meses | 11 | 1,8 (0,95) | ||
| A. tumefaciens | AGL1 (controle) | 18 | 0 (0) | |
| C58 | 18 | 0,1 (0,1) | ||
| LBA4404 | 18 | 0,6 (0,4) | ||
| Populus alba 'pyramidalis' | Concentração de A. tumefaciens em meios | Ressuspensas em 25 ml de MS | 10 | 2,2 (0,55) |
| Ressuspensas em 5 ml de MS | 10 | 2,7 (0,63) | ||
| Ressuspensas em 1 ml de MS (controlo) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| Tipo de mídia usado para inoculação-tronco | LIBRA | 10 | 2,8 (0,71) | |
| MS (controlo) | 10 | 5,1 (1,58) | ||
| A adição de aceto-siringona à inoculação Meios | com acetoseringona | 11 | 0,3 (0,14) | |
| Sem acetoseringona (controle) | 11 | 0,5 (0,25) | ||
| Idade de tecido do caule inoculados | 6 meses (controle) | 11 | 1,5 (0,33) | |
| 18 meses | 11 | 1,5 (0,63) | ||
| A. tumefaciens | AGL1 (controle) | 20 | 8,1 (2) | |
| C58 | 20 | 12,5 (2) | ||
| LBA4404 | 20 | 11,1 (2) |
Tabela 3: Cambial ATScm -2 valores para uma série de variáveis investigadas como parte de trilhas de otimização de protocolo. As variáveis foram investigadas em um clone de álamo e uma gama de indivíduos de Eucalyptus globulus através de um número de anos com cambiais ATScm -2 dados apresentados. janelas cambiais foram colhidas utilizando o protocolo de colheita do disco (passo 5.2.2). valores de erro padrão entre parênteses.
| Eucalyptus globulus x ID clone camaldulensis | Número de janelas cambiais para cada mês | Cambial ATScm -2 final da primavera (novembro) Inoculação | Cambial ATScm -2 início do verão (dezembro) Inoculação | Cambial ATScm -2 Mid Summer (janeiro) Inoculação | Cambial ATScm -2 fim do verão (fevereiro) Inoculação | Cambial ATScm -2 Early Autumn (março)Inoculação | Cambial ATScm -2 todos os meses combinados |
| SG5 | 10 | 15,7 (7,8) | 50,7 (13,7) | 10,5 (5,1) | 30,7 (4,4) | 16,8 (6,3) | 24,9 (4,3) |
| SG6 | 10 | 6,1 (3,1) | 38,5 (15,1) | 4,5 (1,7) | 14,5 (3,3) | 27,6 (8,4) | 18,3 (4) |
| SG13 | 10 | 28,4 (6,7) | 41,8 (9,1) | 16,1 (7) | 29,3 (5,2) | 19,8 (4,3) | 27,1 (3,1) |
| SG18 | 10 | 6,7 (2,9) | 18,3 (6,7) | 17.4 (3.4) | 19,2 (6,1) | 18.1 (6.3) | 15,5 (2,4) |
| SG21 | 10 | 38,7 (14,3) | 77 (17,5) | 23,9 (5,7) | 27,5 (6,9) | 40,7 (13,5) | 41,6 (6) |
| SG35 | 10 | 23,5 (10,2) | 42,8 (12,2) | 7,6 (2,5) | 17,6 (4,3) | 31,3 (4,6) | 24,6 (3,8) |
| SG37 | 10 | 19,7 (8) | 55,2 (14,5) | 7,4 (1,8) | 35 (10,4) | 15,9 (4,5) | 26,6 (3,8) |
| SG39 | 10 | 12,5 (2,4) | 23,6 (6,3) | 6,9 (3) | 26,3 (8,1) | 7,3 (2,3) | 15,5 (2,6) |
| SG40 | 10 | 24,8 (11) | 24,5 (6,8) | 14 (5.6) | 35,6 (6,1) | 19.9 (4.2) | 23,8 (3,2) |
| SG44 | 10 | 22.3 (3.4) | 63 (29,3) | 9,8 (2,6) | 52,5 (10,3) | 54,3 (15) | 40,4 (7,4) |
| SG46 | 10 | 15,3 (5,2) d> | 63,9 (20,1) | 23,6 (4) | 22,5 (4,8) | 17,4 (4,9) | 28,5 (5,1) |
| Mensal Cambial ATScm -2 | 19,9 (5) | 45,3 (9,1) | 12,6 (2,8) | 27,8 (4,5) | 24 (5,1) |
Tabela 4:. Influência do genótipo e do momento da inoculação em ATScm cambial -2 em clones de eucalipto Dez janelas foram introduzidas a cada mês através da estação de crescimento para 10 diferentes clones de Eucalyptus globulus x camaldulensis que foram todos colhidos em maio. Dados mensais é apresentado para cada genótipo com uma ATScm mensal e genotípica média geral -2 apresentou também. janelas cambiais foram colhidas utilizando o protocolo de colheita de casca de floema (passo 5.2.1). valores de erro padrão entre parênteses.es / ftp_upload / 54553 / 54553tbl4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
| Número de plantas | Número de setores cambiais excisadas | Massa total de todos os setores (mg) | Massa média dos setores (mg) |
| 1 | 11 | 750 | 68 |
| 2 | 19 | 1.460 | 77 |
| 3 | 21 | 160 | 8 |
| 4 | 26 | 4.460 | 172 |
| 5 | 15 | 1320 | 88 |
| 6 | 22 | 2490 | 113 |
| 7 | 19 | 1720 | 91 |
| 8 | 30 | 830 | 28 |
| 9 | 25 | 360 | 14 |
| Total | 188 | 13.550 | 72 |
Tabela 5:. Massa típica de um sector 45 do câmbio janelas em nove plantas foram investigados em choupo para determinar a massa média de um sector e colhidas utilizando o protocolo de colheita do disco (passo 5.2.2). As plantas foram cultivadas durante 5 meses e o crescimento radial através de uma janela cambial era entre 1-4 mm.
| Morph- traço ological | GUS somente (controle positivo) | Tecido não-transgênica (somente GUS) | P-valor | Gene de interesse 1 (FLA1) | Tecido não-transgênica (FLA1) | P-valor | Gene de interesse 2 (FLA2) | Tecido não-transgênica (FLA2) | P-valor | Gene de interesse 3 (FLA3) | Tecido não-transgênica (FLA3) | P-valor |
| Celular média Espessura da parede (mm) * | 1,81 (0,1) | 1,65 (0,1) | 0,2692 | 1,47 (0,14) | 1,55 (0,12) | 0,6403 | 1,65 (0,13) | 1,78 (0,13) | 0,4839 | 1,59 (0,12) | 1,63 (0,11) | 0,8254 |
| Área de parede celular média (uM 2) * | 69.1 (4,74) | 60,7 (2,03) | 0,1229 | 64,1 (15,68) | 59,9 (9,79) | 0,5004 | 61.6 (3.4) | 65 (3,96) | 0,5182 | 61,9 (3,56) | 61,5 (3,16) | 0,9438 |
| Área celular média (uM 2) * | 115,9 (11,01) | 99,9 (5,1) | 0,2041 | 124,4 (6,1) | 108 (4,36) | 0,0445 | 110,8 (8,45) | 111,3 (9,06) | 0,9671 | 108,5 (4,43) | 103 (3,07) | 0,3204 |
| Área Lumen média (mm 2) * | 46,9 (7,55) | 39,2 (4,89) | 0,407 | 60,2 (5,28) | 48,1 (4,46) | 0,0991 | 49,2 (7,56) | 46,3 (7,5) | 0,7882 | 46,6 (3,31) | 41,5 (3,9) | 0,3264 |
| Média microfibrila Ângulo (O) # | 24,3 (0,75) | 24,2 (0,45) | 0,8648 | 22,3 (0,82) | 22,7 (0,7) | 0,5664 | 23,7 (0,55) | 26,6 (0,5) | 0,0001 | 26 (0,88) | 27,2 (0,72) | 0,0903 |
Tabela 6:. ISSA fibra medições morfologia derivado do gene de estudo interesse Comparação da parede celular da fibra, o tamanho das células e medições de AMF tomadas a partir de fibras transgénicos provenientes de Eucalyptus clones globulus x camaldulensis caules transformados com Eucalyptus grandis FLAs (EgrFLA1, 2, 3) e controlo positivo (apenas GUS) com as fibras de controlo não transgénicas adjacentes. Os dados provenientes de MacMillan et al. 9. * Indica julgamento envolveu a medição de 10 fibras em 10 sector (totai de 100 fibras). # Indica julgamento envolveu a medição de 5 fibras em 20 setores (total de 100 fibras). α <0,05 exibidas em negrito. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.
| EgCESA1 | EgCESA2 | EgCESA3 | EgCESA4 | EgCESA5 | EgCESA7 | GUS somente (controle positivo) | |
| EgrCESA1 | 0,708 | 2.839 | 8,856 | 9.976 | 9.18 | 29,165 | |
| EgrCESA2 | 1.11 | 12,008 | 11,363 | 30,234 | |||
| EgrCESA3 | 15.151 | 16,123 | 15,488 | 37,791 | |||
| EgrCESA4 | 4,852 | 0,108 | 46,858 | ||||
| EgrCESA5 | 3.275 | 11,278 | |||||
| EgrCESA7 | 36,082 | ||||||
| GUS somente (controle positivo) |
Tabela 7: Chi 2 valores derivados de comparação de padrões de expressão promotor em derivativos cambiais Chi 2 análise comparando a presença / ausência de coloração GUS em P, X1 e X2 região de derivativos cambiais. entre seis Eucalyptus grandis CESA sequências de promotores de genes (EgrCESA 1, 2, 3, 4, 5, 7) e controle positivo (GUS apenas). Os dados provenientes de Creux et al. 10. α <0,05 mostrado na sublinhado.
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Discussion
O protocolo ISSA é um método relativamente simples e eficiente para a criação de tecidos estaminais transgénicas em espécies de árvores, no espaço de alguns meses por análise de genes e promotores de interesse envolvido na madeira e haste formação. Pouco de esforço, além de manter as plantas vivas, é necessária a crescer tecido do caule transgênica após a inoculação, que está em contraste com métodos in vitro em que é necessária extensa cultura de manter tecido ou plantas, onde a produção de madeira pode levar até anos para iniciar ou onde um verdadeiro secundária da haste não é criado um. ISSA também tem sido mostrado para ser aplicável a uma ampla gama de espécies de árvore, incluindo as espécies no género de Populus, Eucalyptus 6, bem como a acácia e Corymbia (dados não mostrados), em que muito pouco, se algum, a optimização é necessária para derivar tecido transgénico. Usando este método, é possível, portanto, para investigar um certo número ógenes F ou promotores de interesse na maioria das espécies de interesse. Além disso, o protocolo pode ser usado sozinho ou em conjunto com mais amplamente utilizado em técnicas in vitro em que vários genes podem ser investigados usando ISSA em primeira instância para identificar potenciais candidatos para levar para a frente a mais envolvidos em métodos in vitro.
Os exemplos descritos mostram que os sectores suficientes podem ser criados para realizar análises a jusante a partir de apenas um pequeno número de janelas do câmbio transgénicos. Com valores ATScm -2 de 46,1 em eucalipto e 14,6 em apenas uma ou duas janelas cambiais álamo seria suficiente para investigar uma única característica, pois é possível adicionar várias janelas para uma única haste da planta ou replicar em diversas plantas. Na prática, no entanto, nem todas as janelas do câmbio levar à criação de um sector cambial que podem ser utilizadas (ver Tabela 1, Tabela 2) como o tamanho dos sectores pode variar, eles são geralmente pequenase em casos pode ser localizado em estreita proximidade uns dos outros limita a sua utilização para a análise a jusante. Além disso, o gene de interesse pode ter impacto sobre a viabilidade celular 12 ou outros aspectos do desenvolvimento de células potencialmente resultando na completa ausência de sectores transgénicos para um determinado gene de interesse. Por isso, é aconselhável sempre apontar para um maior número de janelas que podem ser necessários para a análise. Cuidado similar deve ser aplicada quando se utiliza ISSA para estudos de promotor como variabilidade significativa pode ser esperado com pouco / fraca ou nenhuma expressão observada em alguns casos (Tabela 2). No entanto, um menor número de sectores, tão pouco quanto 6, têm sido mostrados para ser utilizado com êxito para a análise 10. Estes resultados mostram que as experiências bastante modestos envolvendo apenas um pequeno número de janelas pode levar a descobertas significativas na função do gene e a actividade do promotor.
A partir de uma perspectiva de análise, a proximidade de transgénicaic e não-transgênica tecido fornece uma ferramenta poderosa para identificar pequenas mas significativas diferenças nos traços entre os genes de interesse. Células e tecidos amostrados diretamente adjacentes uns aos outros são do mesmo fundo genotípica e foram influenciados pelas mesmas condições ambientais, reduzindo o número de variáveis independentes e simplificar a análise estatística necessária. A partir de uma perspectiva de amostragem, a análise do poder de ISSA derivado de dados de experiências múltiplas (por exemplo, Tabela 6), foi demonstrado que um número menor de medições por sector, por exemplo, espessura da parede celular de 3-5 células por sector, e a medição de um número maior de sectores, por exemplo, 20-25 sectores de um gene de interesse, proporciona uma estratégia de amostragem mais eficiente e estatisticamente robusta. Cada setor representa um evento de transformação independente ou "linha" de células com a análise estatística realizada determinar o efeito médio de múltiplos eventos de transformaçãoenvolvendo o gene de interesse. De igual modo, a capacidade de transformar todos os tecidos do caule fornece uma oportunidade para estudar a expressão de promotores de interesse ao longo de toda a haste e, mais especificamente, durante a diferenciação de câmbio. protocolos ISSA descritos aqui fornecem um gasoduto confiável e validada a partir da criação do tecido transgénico até a colheita de amostras, recolha e análise de dados para o tecido e morfologia celular e para padrões de expressão promotor.
Na maioria dos casos, os sectores são o resultado da transformação de uma única célula, que através da divisão celular pode ter dado origem a uma série de derivados de células e tecidos. Por exemplo, um sector cambial decorre da transformação de uma única célula que o pós ferida recuperação torna-se uma inicial cambial que por sua vez divide periclinally e anticlinally para criar um setor que se estende por todo o caminho da ferida original no floema. Nestes casos, a inicial transformada foi mantidadentro do câmbio até o momento da colheita e uma variante 'cheio' é observado, no entanto, onde este inicial é perdido a partir da camada cambial durante o crescimento radial e substituído por um, então não transformada vizinha celular através de "célula-invasão", um " perdeu variante inicial "será o resultado. A fim de assegurar a correcta classificação de tipos de setor e para ajudar com a interpretação dos resultados é altamente recomendável que a familiarização com características anatômicas de respostas de desenvolvimento do caule e feridas secundárias são condições prévias para a análise dos resultados da AISS. Além disso, o teste regular do pH do reagente de GUS é aconselhado (veja o passo 5.6). Um pH baixo (por exemplo, inferior a 6) pode levar à activação da p-glucuronidases endógenos (GUS) no caule da planta, que podem mascarar a verdadeira medida de um sector ou levar à identificação de falsos positivos. Quando este é suspeita, recomenda-se que estas amostras de ser excluídos de análises posteriores. O protocolo de reagente de GUSaplicados de forma fiável, os estudos descritos aqui, a fim de aliviar problemas potenciais com actividade de GUS endógena foi adaptado de Hawkins et al. (2002) 16 e utiliza as principais etapas adicionais, incluindo duas lavagens com tampão de fosfato-se equilibrar as amostras a pH 7, e um tratamento térmico a 55 O C durante 10 minutos, para desestabilizar a actividade de GUS endógena 17,18. GUS reagente permeabilidade também é limitado e é responsável por menos sectores sendo identificados usando o protocolo de disco transversal em comparação com o protocolo de casca de floema.
Todas as espécies testadas mostraram-se suscetíveis a transformação do tecido cambial. No entanto, diferenças significativas na ATScm -2 entre e dentro de gêneros e espécies foram observadas. Da mesma forma a estirpe de A. Agrobacterium e tempo / época da inoculação pode influenciar ATScm -2. Sugere-se que a realização de alguns testes preliminares destas variáveis na especificidadees e genótipos sob investigação antes da adopção maior escala do protocolo. Teoricamente não há limite para o tamanho ou a idade de hastes ao qual ISSA poderia ser aplicada, desde que haja um câmbio em crescimento activo. inoculação No entanto, para facilidade de processamento a jusante dos sectores dos tecidos transgénicos recomenda-se hastes de cerca de 1 cm de diâmetro.
ISSA não é sem suas limitações. O tamanho relativamente pequeno de setores de tecidos transgénicos restringe actualmente métodos fenotípicos jusante e, consequentemente, apenas um número limitado de tais métodos têm sido rotineiramente utilizado até à data. Estes métodos estão focados principalmente na caracterização morfológica como descrita acima, bem como estimativa semiquantitativa da composição dos monossacarídeos na parede celular secundária como observado na introdução 9,11. Com o advento e aperfeiçoamento de novas tecnologias para a análise fina escala de materiais biológicos não há mais potencial para desenvolver fenotipagem adicionalcondutas para setores Issa, por exemplo, na análise da composição da parede celular. Continua a ser difícil, no entanto, para executar quantitativa, sector a sector, a expressão genética base de ácido ribonucleico (RNA) e proteínas estudos e / ou identificar e propagar ISSA derivados de células transgênicas através da cultura in vitro para análise adicional devido a natureza destrutiva do ensaio de GUS . Alguns genes repórter fluorescentes e impressão de tecido foram testadas para quantificar RNA de setores individuais, mas até agora estas abordagens não têm sido utilizados com sucesso por meio de triagem de alto rendimento em operação de rotina. Além disso, técnicas transgênicas não testadas até à data, tais como RNAi poderia complicar a análise onde a expressão GUS e para baixo-regulação do gene alvo pode não co-localizados.
Embora existam algumas limitações atuais, incorporação de tecnologias novas e emergentes e métodos analíticos são susceptíveis de ultrapassar estas limitações, aumentando ainda mais o papel da ISSA umsa médio e protocolo de alto rendimento para dissecar a natureza molecular complexo de diferenciação cambial, o desenvolvimento de madeira e colmo formação.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plants | NA | NA | Please consult local nursery suppliers for plants as needed |
| Agrobacterium strain | NA | NA | There are many possible avenues to obtain Agrobactrium strains. We suggest you follow up within your local research community as there may be restrictions in obtaining the bacteria in your country and region. |
| Binary vector (gene and promoter) | NA | NA | We have developed a range of vectors to suite the ISSA protocol using a the Gateway Recombinase system. This include overexpression, RNAi knockouts and promoter fusion vectors based on modified pCAMBIA vectors and happy to provide as needed. In addition, there are many vectors avialable to the research community. |
| LB media | Sigma | L3022 | The same product could be sourced from another company |
| LB media with agar | Sigma | L2897 | A like product could be sourced from another company |
| Antibiotics | Sigma | NA | The catalog number will be dependent on the antibiotic you require as a range of antibiotic are used for bacterial selection in binary vectors. This product could be sourced from a range of companies |
| 50 ml Screw top tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | The same product could be sourced from another company |
| 2 ml Microtube | Watson Bio Lab | 132-620C | The same product could be sourced from another company |
| MS Media | Sigma | M9274 | The same product could be sourced from another company |
| Scalpel blade no. 11 | Sigma | S2771 | The same product could be sourced from another company |
| Parafilm "M" | Bemis | PM996 | This is the best product to use to bind the cambial window post creation |
| 14 ml round bottom tubes | Thermo Scientific | 150268 | The same product could be sourced from another company |
| EDTA | Sigma | E6758 | The same product could be sourced from another company |
| Triton | Sigma | X100 | The same product could be sourced from another company |
| X-Gluc | X-GLUC direct | You will need to go to the website to order - http://www.x-gluc.com/index.html | |
| Potassium Ferricyanide(III) | Sigma | 244023 | The same product could be sourced from another company |
| Potassium Ferrocyanide(II) | Sigma | P9387 | The same product could be sourced from another company |
| Litmus paper | Sigma | WHA10360300 | The same product could be sourced from another company |
| Single edge razor blade | ProSciTech | L055 | The same product could be sourced from another company |
| Double edge razor blade | ProSciTech | L056 | The same product could be sourced from another company |
| SEM Pin Stub | ProSciTech | GTP16111 | The same product could be sourced from another company |
| Sample vial with screw cap | ProSciTech | L6204 | The same product could be sourced from another company |
| Ethanol | sigma | E7023 | The same product could be sourced from another company |
| LR white | ProSciTech | C025 | The same product could be sourced from another company |
| Embedding Mould | ProSciTech | RL090 | We recommend this variety, however there are plenty of options available |
| Water Soulable mounting media | ProSciTech | IA019 | One example of a mounting media that could be used however other options do exist and could be explored. |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | A like product could be sourced from another company |
| Glacial acetic acid | Sigma | A9967 | A like product could be sourced from another company |
| Safranin O | ProSciTech | C138 | A like product could be sourced from another company |
| Quanta Environmental Scanning Electron Microscope | FEI | This is the instrument used at part of this study but any other SEM that has a low vacuum mode could be utilised | |
| ImageJ imaging software | can be sourced from the following URL http://rsbweb.nih.gov/ij/ |
References
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