Summary
Fremgangsmåder er påvist for isoleringen af sinusknude myocytter (SAMS) fra voksne mus for patch clamp elektrofysiologi eller billeddannende undersøgelser. Isolerede celler kan anvendes direkte eller kan opretholdes i kultur for at tillade ekspression af proteiner af interesse, såsom genetisk indkodede reportere.
Abstract
Sinusknude myocytter (SAM) fungere som de naturlige pacemaker i hjertet, indleder hvert hjerteslag ved at generere spontane aktionspotentialer (APS). Disse pacemaker APs afspejler koordineret aktivitet af talrige membranstrømme og intracellulært calcium cykling. Men de præcise mekanismer, der driver spontan pacemaker aktivitet i SAM forblive undvigende. Akut isolerede SAM er en væsentlig forberedelse til eksperimenter for at dissekere den molekylære basis for cardiac pacemaking. Imidlertid har den utydelige anatomi, kompleks mikrodissektion, og pedantisk enzymatiske fordøjelse betingelser forhindret udbredt anvendelse af akut isolerede SAM. Derudover metoder var ikke tilgængelige indtil for nylig at tillade mere langsigtet kultur af SAM til proteinekspression studier. Her giver vi en trin-for-trin-protokol og video demonstration til isolering af SAM fra voksne mus. Fremgangsmåde demonstreres også for opretholdelse voksne mus SAM in vitro og for Express godtpå af eksogene proteiner via adenoviral infektion. Akut isoleret og dyrket SAM fremstillet via disse metoder er egnede til en række forskellige elektrofysiologiske og billeddannende undersøgelser.
Introduction
Pacemaker myocytter i sinoatrialt knude af hjertet (sinoatriale myocytter, "SAM") generere spontane, rytmiske aktionspotentialer (APS), der udbreder gennem myokardiet at indlede hvert hjerteslag. Forsøg under anvendelse akut isoleret SAM fra mange arter har været afgørende for belysning af mekanismer, der bidrager til frembringelsen af pacemakeren aktivitet. SAM er højt specialiserede cardiomyocytter der afviger væsentligt fra deres modparter i atrial og ventrikulær myocardium i form af morfologi, funktion og protein udtryk. Kendetegnet for spontane APs i SAM er en spontan depolarisering under diastole, der driver membranpotentialet til tærsklen for at udløse den næste AP 1,2. Denne "pacemaker potentiale" afhænger af koordineret aktivitet af mange forskellige membran strømninger herunder "funny nuværende" (I f), T- og L-type calcium strømninger, og natrium-calcium veksler current (I NCX), som drives af Ca2 + frigivelse fra reticulum 3,4.
Mens akut isoleret muse SAM'er er en væsentlig eksperimentel forberedelse til studiet af pacemaking, kan isoleringen af SAM fra mus være en udfordrende metode til at vedtage fordi utydelig anatomi og lille størrelse af muse SAN kræver en nuanceret mikrodissektion og den kombinerede enzymatiske og mekaniske dissociation af cellerne kræver omhyggelig optimering.
Vi giver her en detaljeret video demonstration af en protokol, der er blevet brugt til at isolere SAM fra voksne mus for patch clamp optagelser 5-8. Til vores viden, er der ikke sådan visuel demonstration fra nogen anden kilde. Desuden er en ny metode demonstreret ved hvilken isoleret SAM fra voksne mus kan opretholdes in vitro i adskillige dage, hvilket tillader indførelsen af proteiner, genetisk indkodedereportermolekyler eller RNAi via adenoviral infektion 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg fra University of Colorado Anschutz Medical Campus. Standardprotokollen nedenfor er blevet optimeret ved hjælp C57BL / 6J mus på 2-3 måneder gamle.
1. Forbered Løsning Aktier og forsyninger i Advance forsøgsplanlægning
BEMÆRK: Se Materialer Table for nødvendigt udstyr og forsyninger.
- Forbered 1 L hver af følgende opløsninger som angivet i tabel 1: Komplet Tyrodes, Lav Ca 2+ / Mg 2+ Tyrodes, modificeret Kraft-Brühe (KB) Solution, og bovint serumalbumin (BSA) opløsning. Brug ultrarent filtreret deioniseret vand i alle løsninger. Opdel hver løsning i 50 ml portioner og opbevares ved 20 ° C i op til seks måneder. Optø individuelle portioner umiddelbart før forsøg, og gemme i op til én uge ved 46; C.
- Forbered 50 ml 10 mM NaCl og 1,8 mM CaCl2 Tilpasning Løsning ved opløsning NaCl og CaCl2 i ultrarent filtreret deioniseret vand (tabel 1). Opbevar ved stuetemperatur i op til seks måneder.
- Forbered 4,75 enzymaktivitet enhed (U) portioner af elastase afpipetteres mikrocentrifugerør. Opbevar ved 4 ° C i op til tre måneder.
- Forbered 375 ug alikvoter (i ultrarent H2O) collagenase-proteaseenzym blanding afpipetteres mikrofugerør. Opbevares ved -20 ° C i op til tre måneder.
- Forbered to brand-poleret Pasteur-pipetter, en for væv overførsel (~ 1,5 mm endelige åbning diameter, Figur 1Aiv og Figur 1C) og en til dissociation (~ 2 mm i diameter, Figur 1Aiii og figur 1C).
- Score Pasteur pipetter med et glas cutter og snap langs score for at frembringe en åbning lidt større end den ønskede størrelse. Brand-polish den afskårne ende af hver pipette til ~ 30-60 sek over en lille flamme på en bunsenbrænder til frembringelse af en tyk poleret væg og en åbning af den ønskede diameter. Sørg for brand-poleret åbning er fri for revner eller skarpe kanter.
- Forbered to dissektion retter ved tilsætning ~ 25 ml siliconeelastomer blandedes ifølge producentens anvisninger til hver 100 mm petriskål (Figur 1ai og figur 1b). Tillad at hærde ved stuetemperatur i 48 timer.
- For kultur only: forberede 25-50 ml hver Plating Medium og Kultur Medium pr Tabel 2 Store i op til to uger ved 4 ° C..
2. Forbered Løsninger til brug på Dag Cell Isolation
BEMÆRK: Følgende beløb er for isolering af sinoatriale myocytter fra en mus.
- Tilsættes 2,5 ml Low Ca2 + / Mg2 + Tyrodes (pH 6,9) til hvert af tre små, rundbundet kultur rørs. Rørene anbringes i 35 ± 1 ° C vandbad.
- Tilsættes 2,5 ml Low Ca2 + / Mg2 + Tyrodes til én stor rundbundet kultur rør. Til dette rør, tilsættes 1 alikvot (4,75 U) elastase og en aliquot (375 ug) collagenase-proteaseenzym blanding. Swirl at blande. Anbring røret i 35 ± 1 ° C vandbad.
- Tilsættes 2,5 ml KB medium til tre yderligere små rundbundet kultur rør og et ekstra stort, rundbundet kultur rør. Rørene anbringes i 35 ± 1 ° C vandbad.
- Tilføj ~ 7 ml BSA-opløsning til en stor rundbundet kultur rør. Holde dette rør ved stuetemperatur.
- Anbring 20-40 ml komplet Tyrodes opløsning i et 50 ml bægerglas (fig 1Aii). Tilsæt 10 USP / ml heparin, hvirvel at blande, og placer bægeret i 35 ± 1 ° C vandbad.
3. Forbered Yderligere løsninger og materialer for dyrkede celler (Spring disse trin for Akut isolerede celler)
- I en steril vævskultur hætte, placere to 12 mm runde dækglas per mus i individuelle brønde i en plade med 24 brønde.
BEMÆRK: Pladen 24 godt bruges, fordi brøndene er en bekvem størrelse, der tjener til at begrænse den mængde for efterfølgende virusinfektioner. - Pipette ca. 200 pi af en 100 ng / ml opløsning af muselaminin fortyndet i sterilt phosphatbufret saltvand (PBS) på hver dækglas.
- Inkuber dækglas med laminin for varigheden af isolationen (mindst 1 time) i en inkubator ved 37 ° C.
- Pre-opvarmer udpladningsmedium og dyrkningsmedium (fra trin 1.7 og tabel 3) til 37 ° C.
4. sinoatrialt Node Isolation
- I stinkskab, placere en mus i et kammer af en to-kammer kasse og bedøver med ~ 200 pi flydende isofluran indføres via en vatpind i det andet kammer. Bekræft anæstesi (normalt inden for ~ 30-60 sek) med en tå knivspids. Aflivmus ved cervikal dislokation.
BEMÆRK: Et tomt 1 ml pipettespids boks kan anvendes til at danne to-kammerboksen; vende stativet på hovedet i kassen for at skabe det separate rum til isofluran at forhindre musen fra at kontakte det direkte. - Fjern skind fra brystet med en saks og transekt brystkassen at eksponere brysthulen brug af eksterne væv pincet (figur 1Aviii) og dissektion saks (Figur 1Avix). Badning brysthulen med ~ 2 ml varmet Komplet Tyrodes med Heparin ved hjælp af en overførsel pipette.
BEMÆRK: Fortsæt badning brysthulen når det er nødvendigt, tillader ikke forberedelse til at tørre ud. - Under et dissektionsmikroskop, forsigtigt fjerne lungerne og thymus ved hjælp af interne saks (Figur 1Avi) og dissektion pincet (Figur 1Avii).
- Under forsigtig holder hjertespidsen med de interne dissektion pincet, skåret omhyggeligt inferior vena cava og enOrta med de interne saks for at fjerne hjertet fra brysthulen. Overfør hjertet til en af silikone dissektion retter og bade med ~ 4 ml varmet hepariniseret Complete Tyrodes hjælp overførsel pipette.
- Orient hjertet, således at de posteriore fartøjer er synlige og opad, med dyrets højre atrium på eksperimentatorens højre og venstre atrium på eksperimentatorens venstre. Når orienterede, immobilisere hjertet ved at fastgøre gennem spidsen ind i silikone dissektion skålen.
- Find rillen mellem ventriklerne og atrierne (klar ring over ventriklerne).
- Brug af den interne dissektion saks, lave et snit i rillen, holder tættere til ventriklerne end atrierne. Skyl rillen og indsnit med yderligere varmet hepariniseret Komplet Tyrodes efter behov for at tillade et klart billede af atrierne og ventilerne. Fortsæt med at skære langs rillen til at adskille atrierne fra ventriklerne.
- Overfør atrievævet til den anden silikone dissektion fad og bade med ~ 3 ml varmet hepariniseret Komplet Tyrodes.
- Orient vævet, således at dyrets højre atrium er nu på eksperimentatorens venstre, og den venstre atrium er til højre.
BEMÆRK: Den højre atrium er mere gennemsigtig, mens den venstre atrium har mere af en mørk rød tone. - Pin vævet gennem ringere og overlegen vena cavae og højre og venstre atrium vedhæng, der strækker forberedelse forsigtigt. Fjern eventuelle resterende fedt eller andet væv for at give et klart billede af præparatet (være omhyggelig med at ikke skåret i den atrielle væg, da sinoatrialt node er ganske delikat og kan nemt blive beskadiget).
- Åbn den forreste væg af atrierne ved at skære gennem Venae cavae. Re-positionere benene efter behov for at visualisere interatrieseptum septum.
- Skåret langs interatriale septum at fjerne det venstre atrium. Re-pin forberedelse, der strækker sig forsigtigt.
- Fjern than højre atrium vedhæng og befri sinusknude ved at skære langs cristae terminalis, der vises som et mørkorange stribe grænser atrielle vedhæng.
- Re-pin nodal væv og skær den sideværts (vinkelret på crista terminalis) til at producere tre lige store strimler.
5. sinoatrialt Node fordøjelse
- Brug af den smalle brand-poleret pipette (fig 1Aiv), overføre tre strimler af sinusknude væv ind den første af tre små, rundbundet rør indeholdende 2,5 ml af lav Ca2 + / Mg2 + Tyrodes i 35 ± 1 ° C vandbad. Der inkuberes i 5 min.
- Overførsel vævsstrimler til den anden lille, rundbundet rør indeholdende 2,5 ml lavt Ca2 + / Mg2 + Tyrodes i 35 ± 1 ° C vandbad under anvendelse af samme smalle pipette. Vask væv strips ved forsigtig hvirvlende røret eller ved forsigtigt pipettering med den smalle pipette. Må ikke Invert røret.
- Overførsel vævsstrimler til den tredje lille, rundbundet rør indeholdende 2,5 ml lavt Ca2 + / Mg2 + Tyrodes, og gentag vasketrinnet beskrevet i trin 5.2.
- Overfør strips i store rundbundede rør indeholdende 2,5 ml af lav Ca2 + / Mg2 + Tyrodes med enzymer (elastase plus collagenase-protease blanding) i 35 ° C vandbad. Sørg for, at alle tre væv strips er til stede. Inkuber i 10-15 min ved 35 ± 1 ° C. Bland hver 5 min ved forsigtigt at hvirvle glasset. Må ikke vendes røret.
6. sinoatrialt Node myocyt Dissociation
- Efter enzymfordøjelse, bruge den smalle flammepoleret pipette til forsigtigt overføre vævsstrimler til den første lille, rundbundet rør indeholdende 2,5 ml KB-opløsning ved 35 ± 1 ° C. Vask væv ved forsigtigt at hvirvle glasset.
Bemærk: Tissue strips vises noget gennemskinnelige og kan klumpe sammen på ther punkt. Håndtag meget forsigtigt efter enzymatisk fordøjelse at undgå at miste celler. - Overfør vævet til den anden lille rundbundet rør indeholdende 2,5 ml KB ved 35 ± 1 ° C. Swirl forsigtigt at vaske.
- Overfør vævet til tredje lille rundbundet rør indeholdende 2,5 ml KB ved 35 ± 1 ° C. Swirl forsigtigt at vaske.
- Overfør vævet til den store, rundbundet rør indeholdende 2,5 ml KB ved 35 ± 1 ° C.
- Brug af større flammepoleret pipette (figur 1Aiii og figur 1C), dissociere cellerne i store rundbundede rør ved konstant triturering ved ca. 0,5-1 Hz i 5-10 min, idet man holder dissociation rør nedsænket i 35 ± 1 ° C vandbad og undgå indføring bobler i opløsningen.
Bemærk: Triturering varierer med diameteren af dissociation pipette og kraft pipettering. Tid bør justeres således, at de vævsstykker tilbage ved than ende af dissociation synes tynde, gennemsigtige og tjavsede. Hvis væv bevarer enhver farve, dissociation sandsynligvis være ufuldstændig. Frekvens (0,5-1 Hz) bestemmes af hånden. - Fjern rundbundet rør indeholdende dissocieret SAM fra vandbadet og ækvilibrere ved stuetemperatur i 5 min.
7. sinusknude Calcium Re-tilpasning (udføres ved stuetemperatur)
BEMÆRK: SAM bestemt til kultur eksperimenter bør udføres i et sterilt vævskultur hætte procedurerne i det følgende afsnit. Hvis SAM skal anvendes til akutte eksperimenter, er der ikke behov for at udføre disse trin i et sterilt miljø.
- Tilføj 75 pi NaCl / CaCl2 tilpasning opløsning (tabel 2). Swirl forsigtigt for at blande og inkuberes i 5 min.
- Tilføj 160 pi NaCl / CaCl2 tilpasning opløsning. Swirl forsigtigt for at blande og inkuberes i 5 min.
- Tilføj 390 pi BSA solution (tabel 2). Swirl forsigtigt for at blande og inkuberes i 4 min.
- Tilsættes 1,25 ml BSA-opløsning. Swirl forsigtigt for at blande og inkuberes i 4 min.
- Tilsættes 4,37 ml BSA-opløsning. Swirl forsigtigt for at blande og inkuberes i 4 min.
Bemærk: Den endelige koncentration af calcium vil være 1,8 mm. - Efter calcium re-tilpasning, indsamle SAM ved at tillade at bosætte ved hjælp af tyngdekraften til ~ 10 min eller ved centrifugering ved ~ 2000 xg i 3 min.
- For akut isolerede celler, forsigtigt fjerne og kassere ca. 5 ml af supernatanten ved hjælp af et glas Pasteur-pipette, efterlader celler i et volumen på ~ 2 ml. Opbevar disse celler ved stuetemperatur i op til ~ 8 hr til patch clamp optagelser.
- For dyrkede celler, fjerne så meget af supernatanten som muligt under anvendelse af en steril glas Pasteur-pipette. Resuspender cellepelleten i 1 ml forvarmet (37 ° C) udpladningsmedium (tabel 2).
8. Plating og Kultur sinoatrialt Myocytes (Spring til Akut isolerede celler)
- Fjern laminin løsning fra dækglas fra trin 3.3 med en Pasteur-pipette. Umiddelbart frø 500 pi (~ 50-100 celler) på hver laminin-overtrukne dækglas (fra trin 3).
BEMÆRK: kontraktile inhibitor 2,3-butandion monoxim (BDM) er inkluderet i plating og kultur medier for at forhindre sammentrækning, som forårsager nedslidning af celler 9. - Returnere plade med 24 brønde indeholdende nyligt podet SAM til inkubatoren og holdes ved 37 ° C i en atmosfære af 95% luft / 5% CO2. Tillad celler til at adhærere til dækglas i 4-6 timer i plating medier (tabel 2).
- Fjern forsigtigt udpladningsmedium under anvendelse af en steril Pasteur-pipette. Erstat med 500 pi per brønd af forvarmet (37 ° C) dyrkningsmedium (tabel 2).
9. Adenoviral transduktion af Voksen sinoatriale myocyt kulturer (Spring til Akut isolerede celler)
- Vurdere antallet af ceLLS pr dækglas umiddelbart før påføring adenovirus ved at tælle cellerne i et synsfelt under et mikroskop, justering for forstørrelse. Tæl alle celler, ikke bare SAM.
- Fortynd adenovirus i Medium 199 og justere fortyndingen for virustiteren således at anvendelsen af 1-10 pi er nødvendig for at opnå en endelig infektionsmultiplicitet (MOI) på 100 virale enheder per celle. Tilføj adenoviral opløsning dråbevis direkte på forgyldt SAM.
- Cellerne inkuberes med virus-holdige medium natten over (~ 12-14 timer). Derefter udveksles med frisk dyrkningsmedium. Opretholde celler i inkubator, skiftende dyrkningsmedium hver 48 timer, indtil der opnås den ønskede proteinekspression.
10. Funktionel Evaluering af Akut Isoleret, kulturperler SAM
BEMÆRK: Følgende protokol er et eksempel på funktionelle vurderinger af isolerede SAM hjælp af amphotericin perforeret-patch teknik til at optage både spontane ApS og jeg
- Forbered optagelsesløsninger som beskrevet i tabel 3.
- Forbered en stamopløsning på 20 mg / ml amphotericin-B i DMSO frisk på dagen for optagelsen. Hold lager ved stuetemperatur og beskyttet mod lys. Fortynd amphotericin-B lager i intracellulær opløsning til en slutkoncentration på 200 ug / ml umiddelbart før anvendelse. Bevar den endelige pipette løsning på is og beskytte mod lys.
BEMÆRK: amphotericin-holdige pipette løsning til eksperimenter bør fremstilles frisk hver time ved at fortynde en portion af stamopløsning i den intracellulære opløsning og vortexbehandling i mindst 1 min. - Overfør en alikvot af akut dissocierede SAM cellesuspension eller et fragment af dækglas bærer dyrkes SAM til en optagelse kammer indeholdende Tyrode-opløsning ved 35 ± 1 ° C. Perfundere celler med Tyrodes opløsning i mindst 2 minutter før elektrofysiologisk recordings at fjerne eventuelle BDM resterer fra dyrkningsmediet.
BEMÆRK: Spontane sammentrækninger bør være indlysende umiddelbart efter overførsel til Tyrodes løsning. SAM til optagelse kan identificeres ved en kombination af funktioner, herunder spontane kontraktile aktivitet, karakteristisk morfologi (f.eks., Figur 2), manglende riller, udtryk for HCN4 protein, tilstedeværelse af I f strøm, membran kapacitans <50 pF, og spontane APs med bølgeformer, der omfatter et diastolisk depolarisering fase og en langsom opadgående slag. - Brug borosilikatglas pipetter med modstande på 1,5-3,0 MQ, fyld spidsen med intracellulære løsning lacking amphotericin ved at dyppe i 10-30 sek. Derefter tilbage-fylde pipetten med amphotericin-holdige opløsning. Der skal fremkomme en GQ celle-vedhæftet segl så hurtigt som muligt. Hvis tætningen dannelse er vanskelig, forøge tip-fill tid.
BEMÆRK: Adgangen modstand bør løbende væreovervåges efter dannelsen af cellen-attached sæl, og optagelser bør kun påbegyndes efter at have indhentet en stabil adgang modstand <10 MQ. - For at optage spontane APs, skifte forstærkeren til hurtige strøm-clamp tilstand uden strøm injektion.
BEMÆRK: 1 nM isoproterenol er inkluderet i den ekstracellulære Tyrodes opløsning ved optagelse APs at stabilisere afbrændingstakten, som tidligere rapporteret 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De her beskrevne protokoller har tidligere været anvendt til at isolere spontant aktive SAM fra voksne mus, som er egnet til en række forskellige patch clamp-forsøg 5-8. Desuden protokollerne tillader isolerede SAM'er, som kan opretholdes i kultur i op til en uge. Genoverførsel til de dyrkede celler kan opnås via adenoviral infektion 9. Resultaterne præsenteres i dette afsnit stammer fra vores tidligere arbejde og vises her som eksempler på de særlige kendetegn ved akut isolerede og dyrkede SAM.
Som vist i figur 2, kan spontant aktive SAM'er opretholdes i kultur i op til 6 dage. De dyrkede celler bevarer en samlet morfologi, der er meget lig den for akut isolerede SAM'er var der ingen signifikante ændringer i den gennemsnitlige længde, bredde, tværsnitsareal eller membran kapacitans af dyrketceller sammenlignet med akut isolerede celler (figur 2B - E). Der var imidlertid nedslidning af antallet af levedygtige SAM over tid i kulturen. Det anbefales derfor, at kulturer fremstilles fra puljede celler fra flere dyr, hvis den eksperimentelle design kræver omfattende datasæt.
Et vigtigt mål i udviklingen af protokollen til dyrkning af sinoatriale myocytter fra voksne mus var at skabe et system, der ville tillade ekspression af eksogene proteiner i native cellulære sammenhæng voksen SAM. Et eksempel på denne type protein-ekspression er vist i figur 3 for tilfældet med celler co-inficeret med vira, der udtrykker de fluorescerende markørproteiner GFP og mCherry. Vi fandt, at proteinekspression var helt tydelig i løbet af 24 timer af adenoviral infektion, og var maksimal for testproteinerne inden 48 timer (figur 3). En viral MOI på 100 resulterede i næsten 100% inffdeling effektivitet uden tegn på cellulær toksicitet. I modsætning hertil transfektion under anvendelse lipid-baserede reagenser ikke producerede i nogen påviselig genoverførsel til voksen SAM'er, selv efter 72 timer 9.
Funktionel karakterisering via patch-clamp elektrofysiologi er kritisk for evaluering af både akut isoleret og dyrket SAM. 4A viser typiske strøm-clamp optagelser af spontane aktionspotentialer optaget fra akut isoleret eller dyrket SAM hjælp af amphotericin perforeret-patch optagelse konfiguration. Aktionspotentialet bølgeformer var ens i akut isoleret og dyrket SAM'er og der var ingen forskel i den gennemsnitlige AP afbrændingstakt (figur 4B).
Jeg f er et kendetegn for SAM'er og HCN4 kanaler, der producerer jeg f anvendes som immuncytokemiske markører ifølge den sinusknude. Deraf presence af I f i patch clamp optagelser kan bruges til at støtte tanken om, at cellerne er i virkeligheden SAM. Alle de spontant aktive akutte og dyrkede SAM beskrevet heri udviste også jeg f> 100 pA som svar på en 1 sek spændingstrin til -120 mV. For de repræsentative resultater vist her blev celler perfunderet med Tyrodes opløsning indeholdende 1 mM BaCI2 at blokere K + -strømme (tabel 3) og spændingen afhængighed af aktivering af I f blev analyseret ved 3 sek hyperpolarisering spændingstrin fra -60 til -160 mV fra et holdepotentiale på -50 mV, som vi har beskrevet tidligere 5-8. Strømtætheden blev evalueret som reaktion på 3 sek hyperpolarisering testimpulserne til -150 mV fra et holdepotentiale på -50 mV. Der var ingen signifikante forskelle i enten spænding afhængighed af aktivering af I f eller jeg f strømtæthed mellem akut isoleret og dyrket SAM (Figur 4C - D). Disse co-optagelser af spontane ApS og jeg f fra individuelle SAM kræver ca. 9 min i alt (herunder en 2 min indledende vask, 30-60 sek af spontane APs i strømtang tilstand, en 2 min løsning forandring, og ca. 5 min til indsamle tilstrækkelige spænding clamp data til beskrivelse af den spændingsdrevne afhængighed af aktivering af i f). Derfor illustrerer også vist i figur 4C data robustheden af præparatet celle.
Figur 1: Dissektion instrumenter til isolering og dissociation af muse SAMs (A) i to 10 cm petriskåle indeholdende ~ 25 ml hærdede silikoneelastomer... Hver ret er præinstalleret med 6-10 små dissektion pins til immobilisering væv. Ii. 100 ml bægerglas til at holde Komplet Tyrodes i 35 &# 176;... C vandbad iii Wide (~ 2 mm i diameter), brand-poleret dissociation pipette iv Smal (~ 1,5 mm i diameter) brand-poleret overførsel pipette v Plastic overførsel pipette til badning forberedelse med Komplet Tyrodes med... heparin. vi. Self-åbning mikro saks for interne skære procedurer. vii. Fin pincet (tip størrelse 0,06 x 0,02 mm) til intern væv manipulation. viii. tissue pincet, 5,5 i, 1 x 2 tænder til ekstern væv manipulation. ix. buede iris saks 4.3 i for eksterne opskæring procedurer. (B) Close-up foto fremhæve små dissektion stifter placeret i dissektion fad. (C) Close-up foto fremhæve brand-poleret smal transfer pipette (til venstre) og brand-poleret bred åbning pipette for mekanisk findeling (til højre). Klik her for at se et større version af dette tal.
. Figur 2: Akut isoleret og dyrkede SAM er morfologisk skelnes A:. Bright field billeder af repræsentative SAM enten umiddelbart efter isolering (akut) eller efter 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer, eller 6 dage in vitro B - D : gennemsnitlig (± SEM) maksimale længde, bredde og tværsnitsareal for akut isoleret versus 48 timer dyrket SAM E:. Gennemsnitlig (± SEM) membran kapacitans fra spænding-clamp optagelser fra akut isoleret eller dyrket SAM. Alle sammenligninger er ikke signifikant: p> 0,05 vs. akut. Tilpasset fra henvisning 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Adenoviral ekspression af exogene proteiner i dyrkede SAM'er Bright felt og epifluorescerende billeder af repræsentative dyrket SAM'er der er blevet inficeret ved en MOI på 100 for adenovira, der udtrykker eGFP (grøn) og mCherry (rød), enten ved 24 eller 48 timer efter. dobbelt infektion. Scale bar = 20 um. Gengivet fra henvisning 9.
Figur 4: Elektrofysiologiske karakterisering af dyrkede SAM A:. Repræsentative nuværende clamp optagelser fra akut isoleret (sort) eller dyrkede (grå) SAM i Tyrodes opløsning indeholdende 1 nM isoproterenol. Scale barer: 40 mV, 100 ms B:. Gennemsnitlig (± SEM) øjeblikkeligfiring frekvens hos akut isoleret (sort, n = 6) eller 48 timer dyrket (grå; n = 14) SAM'er C:. Normaliseret gennemsnit (± SEM) konduktans spænding relationer for I f i akut isoleret (sort, n = 8) eller dyrket (grå, n = 14) SAM Inlays:.. repræsentative nuværende familier fra akut (sort) eller dyrkede (grå) SAM fremkaldt af 3 sek hyperpolarisering test impulser fra -60 til -160 mV i 10 intervaller mV D: Average ( ± SEM) i f strømtæthed ved -150 mV i akut isoleret (sort, n = 7) og dyrket (grå, n = 8) SAM. Tilpasset fra henvisning 9. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Komplet Tyrode s | lav Ca2 + / Mg2 + Tyrodes | KB Medium | BSA-opløsning | NaCl / CaCl2 Tilpasning Solution | |
| NaCl | 140 | 140 | 140 | 10 | |
| KCI | 5.4 | 5.4 | 25 | 5.4 | |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.2 | 10 | 1.2 | |
| HEPES | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| glukose | 5,55 | 18.5 | 20 | 5,55 | |
| MgCl2 | 1 | 1 | |||
| CaCl2 | 1.8 0,066 | 1.8 | 1.8 | ||
| taurin | 50 | 20 | |||
| BSA | 1 mg / ml | 1 mg / ml | 1 mg / ml | ||
| K-glutamat | 100 | ||||
| K-aspartat | 10 | ||||
| MgSO4 | 2 | ||||
| kreatin | 5 | ||||
| EGTA | 0.5 | ||||
| pH justeret til | 7,4 med NaOH | 6,9 med NaOH | 7,2 med KOH | 7,4 med NaOH |
Tabel 1:. Dissociation løsninger Kompositioner af løsninger, der anvendes i dissociation af sinoatriale node myocytter. Koncentrationer er angivet i mm mindre andet fremgår.
| udpladningsmedium | dyrkningsmedium | |
| Media199 | grundlag | grundlag |
| 2,3-butandion monoxim (BDM) | 10 mM | 10 mM |
| Kalvefosterserum (FBS) | 5% | - |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,1 mg / ml | |
| Insulin | 10 ug / ml | |
| transferrin | 5.5 ug / ml | |
| Selen | 5 ng / ml | |
| Penicillin | 100 U / ml | 100 U / ml |
| streptomycin | 100 mg / ml | 100 mg / ml |
Tabel 2: Plating og dyrkningsopløsninger Sammensætninger af opløsninger, der anvendes til plettering og kultur sinusknude myocytter..
| Tyrodes | PP Intracellulær | |
| NaCl | 140 | 5 |
| KCI | 5.4 | 135 |
| Kh 2 PO 4 | 1.2 | |
| HEPES | 5 | 10 |
| glukose | 5,55 | |
| MgCl2 1 | 1 | |
| CaCl2 | 1.8 | 0,1 |
| EGTA | 10 | |
| Mg-ATP | 4 | |
| Amphotericin-B | 200 ug / ml efter behov | |
| isoproterenol | 1 nM efter behov | |
| pH justeret til | 7,4 med NaOH | 7,2 med KOH |
Tabel 3: Elektrofysiologiske optagelsesløsninger Sammensætninger af ekstracellulær (Tyrodes) og intracellulære (PP) opløsninger, der anvendes til amphotericin perforeret-patch optagelser fra sinusknude myocytter..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikel præsenterer detaljerede protokoller for isolering og dyrkning af fuldt differentierede sinoatriale node myocytter fra voksne mus. Isoleringen protokol pålideligt producerer spontant aktive mus SAM egnede til enten øjeblikkelig elektrofysiologisk analyse eller efterfølgende kultur. Lignende protokoller er blevet rapporteret af mange andre grupper (f.eks se referencer 11,12,10,13-17). Men vores protokol for opretholdelse voksne mus SAM in vitro bevarer den karakteristiske morfologi, spontan aktivitet, og elektrofysiologiske egenskaber af cellerne og giver mulighed for adenoviral afgivelse af proteiner 9.
For ændring og fejlfinding af de protokoller, skal bemærkes nogle kritiske trin. Den første kritiske faktor er en betydelig masse-til-lot variation i aktiviteten af de enzymer (trin 1.4), som dramatisk kan ændre antallet og kvaliteten af SAM'er isoleret i et givet preparation. Denne variabilitet er især tilfældet for elastase, som typisk kræver lotspecifikke optimering, hvor koncentrationen og eksponeringstider bør bracketing i løbet af adskillige præparater (ofte foretages parallelt) for at maksimere antallet af celler og sundhed. Nogle protokoller til isolering af SAM fra forskellige arter anvender individuelle collagenase og protease-enzymer i stedet for collagenase-protease enzym blanding i denne protokol. Imidlertid parti til parti variation for hver af disse enzymer er relativt højt (svarende til den i elastase), hvilket nødvendiggør gentagne runder af co-optimering. Enzymet blanding giver mere sammenhæng på tværs partier og kræver færre optimering trin.
En anden kritisk, og ikke nærliggende, faktor for fejlfinding SAM isolation er integriteten af brand-poleret glas dissociation pipette (figur 1C). Hvis fælgen af pipetten indeholder nogen skarpe kanter, revner eller akkumuleret cellular snavs, kan den mekaniske triturering trin beskadige cellerne, hvilket resulterer i calcium toksicitet. Branden-poleret dissociation pipette bør udskiftes mindst hver 2 måneders regelmæssig brug, eller når som helst, at cellen udbyttet eller kvaliteten falder markant i løbet af flere præparater.
Timingen og den kraft af den mekaniske dissociation er en tredje afgørende skridt til fejlfinding isolation protokollen. Den findeling kræver langsom (ca. 0,5-1 Hz), men insisterende turbulens i 5-10 min. Hurtigere satser og reducerede tider kunne også anvendes, men det er vigtigt at undgå at indføre bobler eller generere skum i opløsningen. Når sinoatriale node prøverne er fuldt dissocierede, bør de resterende væv strips synes tjavsede og hvid farve; subtile pink-ish farve indikerer ufuldstændig findeling. Når undersøgt på 200-400X forstørrelse, celler fra optimalt forberedt prøver har glatte cellemembraner, mens celle membRanes fra over-fordøjet eller over-findelt prøver har en kraterfuld og tværstribede udseende. Hos raske celler, er sammentrækninger iagttaget primært som subtil trækninger af enderne af cellerne. Bølger af sammentrækning er et tegn på beskadigede celler, som kan observeres at kontrahere kraftigt i kort tid, før Balling-up. En krakket dissociation pipette er den mest almindelige årsag til denne celleskader. I prøver, som har været under-fordøjet eller under-findelt, celler er til stede som klumper eller aggregater i stedet for enkelte celler, og kan iagttages et betydeligt antal kontraherende SAM i de resterende væv bidder.
Hver bruger skal individuelt optimere dissociation. Selvom den enzymatiske fordøjelse og mekaniske dissociationshastigheder gange bør begge justeres, anbefales det indledningsvis at holde den enzymatiske fordøjelse tidskonstant mens modificere dissociation tid. Yderligere finjustering er hovedsageligt afhængig af brugerens evne til at genkende enppearance af væv stykker tilbage ved afslutningen af findeling - når brikkerne er tjavsede og hvidlig i farven, så findeling bør stoppes. Optimering er også nødvendigt at optage variationer i sinusknude der ledsager forskelle i alder, køn, eller stamme af mus. F.eks dissociation af celler fra ældre dyr 7 kræver reduktion i både enzymatisk fordøjelse og mekanisk dissociation gange. Som en generel retningslinje, et typisk præparat fra en 2-3 måneder gamle mandlige C57BL / 6 mus udbytter omtrent 50-200 levedygtig SAMS, hvoraf måske 5-10 held kan patch-fastspændt i en god dags session, afhængigt af forsøgene . Udbyttet er betydeligt (~ 30%) lavere, når ældre mus anvendes 7.
Succesen af kulturen protokollen bygger også på et par vigtige skridt. Fremmest succes af en primær cellekultur kræver en høj kvalitet dissociation, som beskrevet ovenfor. Det anbefales thved akut isolerede præparation celle optimeres før du forsøger at opretholde cellerne i kultur. En anden kritisk faktor for dyrkede celler ligger i udvælgelsen af celler til elektrofysiologiske optagelser. For de bedste resultater, bør dyrkede SAM udvalgt til optagelser udviser spontane sammentrækninger umiddelbart efter udvaskning af BDM-holdige dyrkningsmedium. En langsom indsættende spontane sammentrækninger upon udvaskning af BDM er et tegn på usunde celler.
SAM dyrkningssystem har nogle begrænsninger, især den meget lille størrelse af muse SAN. Mens de metoder, demonstreret her tillader tilstrækkeligt celle numre til elektrofysiologiske og billeddiagnostiske undersøgelser, den begrænsede mængde væv udelukker biokemiske analyser af dyrkede SAM. En anden begrænsning ved teknikken er, at SAM skal dyrkes i nærværelse af den reversible myosin ATPase inhibitor, BDM. Dette er en potentiel bekymring, fordi BDM har andre cellulære virkninger, herunderikke-specifik phosphataseaktivitet, inhibering af kardial transkriptionsfaktorer 19, og inhibering af natriumkanaler, calciumkanaler og ryanodine receptorer 20. Imidlertid viser dataene, at BDM har minimale virkninger på de morfologiske og elektrofysiologiske egenskaber af SAM analyseret her.
I fremtidige anvendelser, forekommer det sandsynligt, at de metoder beskrevet her kunne tilpasses til fremstilling af SAM-kulturer fra større pattedyr. I kombination med adenoviral genoverføring, kunne sådanne kulturer tillade genetiske manipulationer af pacemaking i store dyremodeller. Evnen til at indføre proteiner af interesse tilvejebringer også til fremtidige anvendelser, hvor genetisk indkodede reportermolekyler kan anvendes til at probe intracellulære signalveje i SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 |
References
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D.
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
