Summary
Metoder demonstreras för isolering av sinusknutan myocyter (SAMS) från vuxna möss för patch clamp elektrofysiologiska eller avbildning studier. Isolerade celler kan användas direkt eller kan hållas i odling för att tillåta uttryck av proteiner av intresse, såsom genetiskt kodade reportrar.
Abstract
Sinusknutan myocyter (SAM) fungerar som naturliga pacemaker i hjärtat, initiera varje hjärtslag genom att generera spontana aktionspotentialer (APS). Dessa pacemaker AP återspeglar den samordnade aktiviteten hos ett flertal membranströmmar och intracellulär kalcium cykling. de exakta mekanismerna som driver spontan pacemaker aktivitet i SAM förblir dock svårfångade. Akut isolerade SAM är en viktig förberedelse för experiment för att dissekera den molekylära grunden för hjärtPaceMaking. Dock har den oklara anatomi, komplexa microdissection, och petiga enzymatisk spjälkning förhållanden förhindras utbredd användning av akut isolerade SAM. Dessutom metoder var inte tillgängliga förrän nyligen att tillåta längre sikt kultur av SAM för proteinexpressionsstudier. Här ger vi en steg-för-steg-protokollet och video demonstration för isolering av SAM från vuxna möss. En metod visas också för att upprätthålla vuxen mus SAM in vitro och för expressipå av exogena proteiner via adenoviral infektion. Akut isolerade och odlade SAM framställda via dessa metoder är lämpliga för en mängd olika elektrofysiologiska och avbildningsstudier.
Introduction
Pacemaker myocyter i sinusknutan av hjärtat (sinoatriala myocyter "SAM") genererar spontana, rytmisk aktionspotentialer (APS) som propagerar genom hjärtmuskeln för att initiera varje hjärtslag. Experiment som använder akut isolerade SAM från många arter har varit avgörande för att belysa mekanismer som bidrar till uppkomsten av pacemakeraktivitet. SAM är högt specialiserade hjärtmuskelceller som skiljer sig avsevärt från sina motsvarigheter i förmak och kammare hjärtmuskeln i fråga om morfologi, funktion och proteinuttryck. Det kännetecknande för spontana AP i SAM är en spontan depolarisation under diastole som driver membranpotentialen till tröskeln för att utlösa nästa AP 1,2. Denna "pacemaker potential" beror på den samordnade aktiviteten av många olika membranströmmar inklusive "rolig nuvarande" (I f), T- och L-typ kalciumströmmar och natrium-kalcium-växlar current (I NCX), som drivs av Ca2 + frisättning från sarkoplasmatiska retiklet 3,4.
Medan akut isolerad mus SAM är en viktig experimentell förberedelse för studier av Pacemaking, kan isolering av SAM från möss vara en utmanande metod för att anta eftersom otydlig anatomi och liten storlek mus SAN kräver en nyanserad microdissection och den kombinerade enzymatiska och mekaniska dissociation av cellerna kräver noggrann optimering.
Vi erbjuder här en detaljerad video demonstration av ett protokoll som har med framgång använts för att isolera SAM från vuxna möss för patch clamp inspelningar 5-8. Så vitt vi vet, det finns ingen sådan visuell demonstration tillgängligt från någon annan källa. Dessutom är en ny metod visats i vilken isolerades SAM från vuxna möss kan upprätthållas in vitro under flera dagar, varigenom införandet av proteiner, genetiskt kodadereportermolekyler eller RNAi via adenoviral infektion 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes i enlighet med protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén vid University of Colorado Anschutz Medical Campus. Standardprotokollet nedan har optimerats med hjälp av manliga C57BL / 6J-möss av 2-3 månaders ålder.
1. Förbered lösning Lager och tillbehör i förväg av experiment
OBS: Se Material Tabell för nödvändig utrustning och förnödenheter.
- Förbereda ett L var och en av följande lösningar såsom anges i tabell 1: Komplett Tyrodes, låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes, Modified Kraft-Brühe (KB) Lösning, och bovint serumalbumin (BSA) -lösning. Använd ultrarent filtrerat avjoniserat vatten för alla lösningar. Dela upp varje lösning i 50 ml alikvoter och förvara vid 20 ° C i upp till sex månader. Tina individuella alikvoter omedelbart före experimenten, och lagra i upp till en vecka vid 46; C.
- Förbered 50 ml av 10 mM NaCl och 1,8 mM CaCl2 Anpassning Lösning genom upplösning av NaCl och CaCl2 i ultrarent filtrerat avjoniserat vatten (tabell 1). Förvara i rumstemperatur i upp till sex månader.
- Förbered 4,75 enzymaktivitet enhet (U) portioner av elastas genom att pipettera i mikrofugrör. Förvara vid 4 ° C i upp till tre månader.
- Förbered 375 mikrogram alikvoter (i ultrarent H2O) kollagenas-proteasenzym blandning genom att pipettera i mikrofugrör. Förvara vid -20 ° C under upp till tre månader.
- Förbered två brandpolerade Pasteur pipetter, en för vävnadsöverföring (~ 1,5 mm slutlig öppningsdiameter; Figur 1Aiv och figur 1C) och en för dissociation (~ 2 mm diameter; Figur 1Aiii och figur 1C).
- Resultat Pasteur pipetter med en glasskärare och knäppa längs poängen för att producera en öppning något större än önskad storlek. Brand-Polska den avskurna ändan av varje pipett för ~ 30-60 sek över en låga på en bunsenbrännare för att producera en tjock polerad vägg och en öppning av önskad diameter. Se till att brand polerad öppning är fri från sprickor eller ojämna kanter.
- Förbered två dissektion rätter genom att lägga ~ 25 ml silikonelastomeren blandas enligt tillverkarens anvisningar till varje 100 mm petriskål (Figur 1ai och Figur 1B). Låt härda vid rumstemperatur under 48 h.
- För kultur endast: förbereda 25-50 ml vardera Plating Medium och odlingsmedium enligt tabell 2 saker upp till två veckor vid 4 ° C..
2. Förbered Lösningar för att användas på dagen av cellisolering
OBS: Följande belopp är för isolering av sinoatriellt myocyter från en mus.
- Tillsätt 2,5 ml låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes (pH 6,9) till var och en av tre små, rundbottnad odlingsrörets. Placera rören i 35 ± 1 ° C vattenbad.
- Tillsätt 2,5 ml låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes till en stor rundbottnad odlingsröret. Till detta rör, tillsätt en alikvot (4,75 U) elastas och en alikvot (375 | j, g) kollagenas-proteasenzymet blandningen. Snurra för att blanda. Placera röret i 35 ± 1 ° C vattenbad.
- Tillsätt 2,5 ml av KB Medium till tre ytterligare små, runda bottnad odlingsrör och en extra stor, rundbottnad odlingsrör. Placera rören i 35 ± 1 ° C vattenbad.
- Lägg ~ 7 ml BSA-lösning till en stor bottnad odlingsröret. Håll detta rör vid rumstemperatur.
- Placera 20-40 ml Complete Tyrodes lösning i en 50 ml bägare (Figur 1Aii). Lägg 10 USP / ml heparin, virvla runt för att blanda och placera bägaren i 35 ± 1 ° C vattenbad.
3. Förbered ytterligare lösningar och material för odlade celler (hoppa över dessa steg för Akut isolerade celler)
- I en steril vävnadsodling huva, placera två 12 mm runda täckglas per mus in i individuella brunnar i en 24-brunnsplatta.
OBS: 24 brunnar används eftersom brunnarna är en lämplig storlek, som tjänar till att begränsa volymen för efterföljande virusinfektioner. - Pipettera cirka 200 fil av en 100 ng / ml lösning av muslaminin utspädd i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) på varje täckglas.
- Inkubera täckglas med laminin för varaktigheten av isolering (minst 1 timme) i en inkubator vid 37 ° C.
- Pre-warm den Plating Medium och odlingsmedium (från steg 1,7 och tabell 3) till 37 ° C.
4. sinusknutan Isolering
- I en kemisk dragskåp, placera en mus i en kammare i en två-kammarlåda och söva med ~ 200 l flytande isofluran infördes via en bomullspinne i den andra kammaren. Bekräfta anestesi (vanligen inom ~ 30-60 sek) med en tå nypa. avlivamusen genom cervikal dislokation.
OBS: En tom 1 ml pipettspets fält kan användas för att bilda den två-kammarboxen; vrid rack upp och ner i rutan för att skapa separata fack för isofluran för att hindra musen från att kontakta det direkt. - Ta bort päls från bröstet med sax och transekt bröstkorg för att exponera brösthålan med hjälp av externa vävnads pincett (Figur 1Aviii) och dissektion sax (Figur 1Avix). Bada brösthålan med ~ 2 ml värmde Komplett Tyrodes med heparin med hjälp av en pipett.
OBS: Fortsätt bad brösthålan när det behövs, inte tillåter beredningen torka ut. - Under ett dissektionsmikroskop, försiktigt bort lungorna och tymus med hjälp av interna sax (Figur 1Avi) och dissektion pincett (Figur 1Avii).
- Medan försiktigt håller spetsen av hjärtat med de interna dissektion pincett, skär försiktigt nedre hålvenen och aorta med de interna sax för att ta bort hjärtat från brösthålan. Överföra hjärtat att en av de silikon dissektion rätter och bada med ~ 4 ml värmdes hepariniserat Complete Tyrodes använda överföringspipett.
- Orient hjärtat så att de bakre fartygen är synliga och uppåt, med djurets högra förmaket på försöks högra och vänstra förmaket på försöks vänstra. När orienterade, immobilisera hjärtat genom att fästa genom spetsen i silikon dissektion skålen.
- Leta reda på spåret mellan kamrarna och förmaken (klar ring ovanför kamrarna).
- Med hjälp av interna dissektion sax, gör ett snitt på spåret, hålla närmare kamrarna än förmaken. Spola spåret och snittet med ytterligare värmas hepariniserat komplett Tyrodes som behövs för att möjliggöra en klar bild av förmaken och ventilerna. Fortsätta att klippa längs spåret för att separera förmaken från kamrarna.
- Överför förmaksvävnaden till den andra silikon dissektion skålen och bada med ~ 3 ml värmde hepariniserat komplett Tyrodes.
- Orient vävnaden så att djurets högra förmaket är nu på den som utför experimentet vänstra och vänster förmak är till höger.
OBS! Höger förmak är mer transparent, medan den vänstra förmak har mer av en mörk röd ton. - Nåla fast vävnaden genom lägre och högre vena cavae och höger och vänster förmak bihang, som sträcker beredningen försiktigt. Ta bort eventuella kvarvarande fett eller annan vävnad för att ge en tydlig bild av preparatet (vara noga med att inte skära in i förmaksväggen, som sinusknutan är ganska känslig och kan lätt skadas).
- Öppna den främre väggen av förmaken genom att skära genom hålven. Åter placera stift som behövs för att visualisera interatrial septum.
- Skär längs interatrial septum för att ta bort vänster förmak. Åter stift preparatet, som sträcker sig försiktigt.
- ta bort than i höger förmak bihang och befria sinusknutan genom att skära längs cristae termin, som visas som en mörkorange strimma gränsar förmakets bihang.
- Åter stift nodal vävnad och skär den i sidled (vinkelrätt mot crista termin) för att producera tre lika stora remsor.
5. sinusknutan Uppslutning
- Genom att använda den smala brand-polerat pipett (fig 1Aiv), överför de tre remsor av sinusknutan vävnad in i den första av tre små, rundbottnad rör innehållande 2,5 ml av låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes i 35 ± 1 ° C vattenbad. Inkubera i 5 min.
- Överföringsvävnadsband på den andra lilla rund rör innehållande 2,5 ml låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes i 35 ± 1 ° C vattenbad med samma smala pipetten. Tvätta vävnadsremsor av försiktig rotering av röret eller genom att försiktigt pipettera med den smala pipetten. Inte Invert röret.
- Överföringsvävnadsband på den tredje liten, rund botten rör innehållande 2,5 ml låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes och upprepa tvättsteget som beskrivs i steg 5,2.
- Överför remsor i den stora rundbottnad rör innehållande 2,5 ml låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes med enzymer (elastas plus kollagenas-proteas blandning) i 35 ° C vattenbad. Se till att alla tre vävnadsremsor är närvarande. Inkubera under 10-15 minuter vid 35 ± 1 ° C. Blanda var 5 min genom att försiktigt snurra röret. Vänd inte röret.
6. sinusknutan myocyt Dissociation
- Till följd av enzymdigerering, använder den smala brand-polerat pipett för att försiktigt överföra vävnadsband på den första lilla, rundbottnad rör innehållande 2,5 ml KB-lösning vid 35 ± 1 ° C. Tvätta vävnad genom att försiktigt snurra röret.
Obs: Vävnadsremsor visas något genomskinligt och kan klumpa ihop sig på thär punkt. Hantera mycket försiktigt efter enzymatisk spjälkning att undvika att förlora celler. - Överföra vävnaden till den andra lilla rundbottnad rör innehållande 2,5 ml KB vid 35 ± 1 ° C. Snurra försiktigt för att tvätta.
- Överföra vävnaden till den tredje lilla rundbottnad rör innehållande 2,5 ml KB vid 35 ± 1 ° C. Snurra försiktigt för att tvätta.
- Överföra vävnaden till den stora, rundbottnad rör innehållande 2,5 ml KB vid 35 ± 1 ° C.
- Använda större brand-polerat pipett (Figur 1Aiii och figur 1C), dissociera cellerna i den stora rundbottnad röret genom konstant pulverisering vid ca 0,5-1 Hz för 5-10 min, var noga med att hålla dissociation röret nedsänkt i 35 ± 1 ° C vattenbad och för att undvika att införa bubblor i lösningen.
Notera: Triturering tiden varierar med diametern hos dissociation pipett och kraft pipettering. Tid bör justeras så att vävnaden bitar kvar vid tHan slutet av dissociation verkar tunn, transparent och stripig. Om vävnad behåller valfri färg, kommer sannolikt att vara ofullständig dissociation. Frekvens (0,5-1 Hz) bestäms för hand. - Ta bort rundbottnad rör innehållande dissocierade SAM från vattenbadet och låt jämvikta vid rumstemperatur under 5 min.
7. sinusknutan Kalcium Re-anpassning (utförs vid rumstemperatur)
OBS: För SAMs avsedda för odlingsförsök, bör instruktionerna i följande avsnitt utföras i en steril vävnadsodling huva. Om SAM ska användas vid akuta experiment, finns det ingen anledning att utföra dessa steg i en steril miljö.
- Lägga 75 ul NaCl / CaCl2 anpassning lösning (Tabell 2). Snurra försiktigt för att blanda och inkubera under 5 min.
- Lägg 160 | il NaCl / CaCl2 anpassning lösning. Snurra försiktigt för att blanda och inkubera under 5 min.
- Lägg 390 pl BSA solution (tabell 2). Snurra försiktigt för att blanda och inkubera under 4 min.
- Lägg 1,25 ml BSA-lösning. Snurra försiktigt för att blanda och inkubera under 4 min.
- Lägga 4,37 ml av BSA-lösning. Snurra försiktigt för att blanda och inkubera under 4 min.
Obs: Den slutliga koncentrationen av kalcium kommer att vara 1,8 mM. - Efter kalcium återanpassning, samla SAM genom att sedimentera genom gravitation för ~ 10 min eller genom centrifugering vid ~ 2000 xg i 3 min.
- För akut isolerade celler, försiktigt bort och kasta omkring 5 ml av supernatanten med hjälp av en glas pasteurpipett, lämnar celler i en volym av ~ 2 ml. Lagra dessa celler vid rumstemperatur i upp till ~ 8 h för patch clamp inspelningar.
- För odlade celler, ta bort så mycket av supernatanten som möjligt med hjälp av en steril glas pasteurpipett. Resuspendera cellpelleten i 1 ml förvärmd (37 ° C) Plating Medium (tabell 2).
8. Plating och kultur sinoatriellt Myocyter (Hoppa för Akut isolerade celler)
- Ta laminin lösning från täck från steg 3,3 med en pasteurpipett. Omedelbart utsäde 500 | j, l (~ 50-100 celler) på varje laminin-belagda täckglas (från steg 3).
OBS: Den kontraktila inhibitorn 2,3-butandion monoxim (BDM) ingår i de plätering och odlingsmedia för att förhindra kontraktion, vilket orsakar nötning av celler 9. - Returnera 24-brunnsplatta innehållande nyligen ympade SAM till inkubatorn och hålls kvar vid 37 ° C i en atmosfär av 95% luft / 5% CO2. Låt cellerna att vidhäfta till täckglas för 4-6 h i plätering media (tabell 2).
- Försiktigt bort Plätering medium med en steril pasteurpipett. Ersätt med 500 pl per brunn av förvärmda (37 ° C) odlingsmedium (tabell 2).
9. adenovirala Transduktion av sex sinoatrial myocyt Kulturer (Hoppa för Akut isolerade celler)
- Uppskatta antalet cells per täck omedelbart före applicering av adenovirus genom att räkna cellerna i ett synfält i mikroskop, justering för förstoring. Räkna alla celler, inte bara SAM.
- Späd adenovirus i Medium 199 och justera utspädning för virustiter, så att tillämpningen av 1-10 | j, l krävs för att uppnå en slutlig infektionsmultiplicitet (MOI) av 100 virala enheter per cell. Lägga adenoviral lösning droppvis direkt på pläterade SAM.
- Inkubera celler med virusinnehållande mediet över natten (~ 12 till 14 h). Sedan byta med färskt odlingsmedium. Bibehålla celler i inkubator, ändra odlingsmedium varje 48 timmar, tills önskat proteinuttryck erhålls.
10. Funktionell utvärdering av Akut Isolerad eller odlade SAMs
OBS: Följande protokoll är ett exempel på funktionella bedömningar av isolerade SAM med hjälp av amfotericin perforerade-patch teknik för att spela in både spontana AP och jag
- Förbered inspelningslösningar som beskrivs i tabell 3.
- Bered en stamlösning av 20 mg / ml amfotericin-B i DMSO färskt på dagen för inspelningen. Håll lager vid rumstemperatur och skyddas mot ljus. Späd amfotericin-B-lager i intracellulär lösning till en slutlig koncentration av 200 ug / ml strax före användning. Bibehålla den slutliga pipetten lösningen på is och skyddas mot ljus.
OBS: amfotericin innehållande pipett lösning för försök bör beredas på nytt varje timme genom att späda en alikvot av stamlösningen in i den intracellulära lösningen och vortexa under minst 1 min. - Överför en alikvot av akut dissocierade SAM cellsuspensionen eller ett fragment av glas täck bär odlade SAM till en inspelning kammare innehållande Tyrodes lösning vid 35 ± 1 ° C. BEGJUTA celler med Tyrodes lösning under minst 2 min före elektrofysiologisk recordings för att avlägsna eventuellt kvarvarande BDM kvar från odlingsmediet.
OBS: Spontana kontraktioner torde vara uppenbart omedelbart efter överföring till Tyrodes lösning. SAM för inspelning kan identifieras genom en kombination av funktioner, inklusive spontan kontraktil aktivitet, karakteristisk morfologi (t ex., Figur 2), brist på räfflor, uttryck av HCN4 protein, närvaron av If ström, membran kapacitans <50 pF och spontana AP med vågformer som inkluderar ett diastoliskt depolarisation fas och en långsam uppåtgående slag. - Använda borosilikatglas pipetter med motstånd av 1,5-3,0 MQ, fylla spetsen med intracellulära lösning som saknar amfotericin genom att doppa för 10-30 sekunder. Sedan tillbaka fylla pipetten med amfotericin innehållande lösningen. En GΩ cell fäst tätning bör erhållas så snabbt som möjligt. Om förseglingen bildning är svårt, öka spetsfyllningstiden.
OBS: Åtkomst motstånd bör vara kontinuerligtövervakas efter bildandet av cell bifogade tätning och inspelningar bör endast påbörjas efter att en stabil resistans <10 MQ tillgång. - För att spela in spontana AP, koppla förstärkaren till snabba strömklämma läge med ingen ström injektion.
OBS: 1 nM isoproterenol är inkluderad i den extracellulära Tyrodes lösning vid inspelning åtkomstpunkter för att stabilisera eldhastighet, såsom tidigare rapporterats 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De protokoll som beskrivs här har tidigare använts för att isolera spontant aktiv SAM från vuxna möss som är lämplig för en mängd olika patch clampundersökningar 5-8. Dessutom protokollen tillåter isolerade SAM som kan upprätthållas i kultur för upp till en vecka. Genöverföring in i de odlade cellerna kan åstadkommas via adenoviral infektion 9. De resultat som presenteras i detta avsnitt kommer från vårt tidigare arbete och visas här som exempel på egenskaperna hos akut isolerade och odlade SAM.
Såsom visas i figur 2, kan spontant aktiva SAM upprätthållas i odling under upp till sex dagar. De odlade cellerna behålla en övergripande morfologi som är mycket lik den av akut isolerade SAM, med några betydande förändringar i den genomsnittliga längd, bredd, tvärsnittsarea, eller membran kapacitans odladeceller jämfört med akut isolerade celler (Figur 2B - E). Det fanns dock attrition av antalet livsdugliga SAM med tiden i odling. Därför rekommenderas det att kulturer framställas från poolade celler från flera djur om experimentell design kräver omfattande datamängder.
Ett viktigt mål för att utveckla protokollet för odling av sinoatriellt myocyter från vuxna möss var att skapa ett system som gör det möjligt för uttryck av exogena proteiner i den nativa cellulära sammanhang vuxen SAM. Ett exempel på denna typ av proteinuttryck visas i figur 3 för fallet med celler samtidigt infekterade med virus som uttrycker de fluorescerande markörproteiner GFP och mCherry. Vi fann att proteinuttryck var tydlig inom 24 h av adenoviral infektion, och var maximal för test proteiner inom 48 h (fig 3). En viral MOI av 100 resulterade i nästan 100% infvsnitt effektivitet utan några tecken på cellulär toxicitet. Däremot transfektion med användning av lipid-baserade reagens misslyckades med att producera någon påvisbar genöverföring i vuxen Sams, även efter 72 timmar 9.
Funktionell karakterisering via patch-clamp elektrofysiologi är kritisk för utvärdering av både akut isolerade och odlade SAM. Figur 4A visar typiska strömkläm inspelningar av spontana aktionspotentialer inspelade från akut isolerade eller odlade SAM med hjälp av amfotericin perforerade-patch inspelning konfiguration. Aktions potentiella vågformer var liknande hos akut isoleras och odlas SAM och det fanns ingen skillnad i den genomsnittliga AP eldhastighet (Figur 4B).
Jag f är ett kännetecken för SAM och HCN4 kanaler som producerar jag f används som immunocytokemiska markörer för sinusknutan. Därav presence av If i patch clamp inspelningar kan användas för att stödja idén att cellerna är i själva verket SAM. Alla de spontant aktiva akuta och odlade SAM beskrivs häri också uppvisade I f> 100 pA som svar på en 1 sek spänningssteg till -120 mV. För de representativa resultat som visas här, ades celler perfunderades med Tyrodes lösning innehållande 1 mM BaCl2 för att blockera K + -strömmar (tabell 3) och spänningsberoendet hos aktiveringen av If analyserades med 3 sek hyperpolariserande spänningssteg från -60 till -160 mV från en hållpotential av -50 mV, eftersom vi har tidigare beskrivits 5-8. Strömtätheten utvärderades som svar på 3 sek hyperpolariserande testpulser till -150 mV från en hållpotential av -50 mV. Det fanns inga signifikanta skillnader i antingen spänningsberoendet för aktivering av I f eller jag f strömtätheten mellan akut isolerade och odlade SAMs (Figur 4C - D). Dessa co-inspelningar av spontana AP och jag f från enskilda SAM kräver cirka 9 minuter totalt (inklusive en 2 min första tvätt, 30-60 sek spontana AP i strömtång läge, en 2 min lösning förändring, och ca 5 min till samla tillräckligt med spänning kläm data för att beskriva spänningsberoendet för aktivering av i f). Därav de data som visas i figur 4C visar också robustheten i cellpreparatet.
Figur 1: Dissektionsverktyg instrument för isolering och dissociation av mus SAM (A) I Två 10 cm petriskålar innehållande ~ 25 ml härdade silikonelastomeren... Varje maträtt är förladdad med 6-10 små dissektion stift för att immobilisera vävnad. Ii. 100 ml bägare för att hålla Komplett Tyrodes i 35 &# 176;... C vattenbad III Wide (~ 2 mm diameter), brand-polerat dissociation pipett iv Narrow (~ 1,5 mm i diameter) brand-polerad överföringspipett v plast överföringspipett för bad beredning med Komplett Tyrodes med... heparin. VI. Självöppnande öppnande~~POS=HEADCOMP mikro sax för interna skärförfaranden. vii. fin pincett (spetsstorlek 0,06 x 0,02 mm) för intern vävnad manipulation. viii. vävnads~~POS=TRUNC pincett, 5,5 i, 1 x 2 tänder för extern manipulation vävnad. ix. böjda iris sax 4,3 i externa skärförfaranden. (B) närbild foto lyfta små dissektion stift placeras i dissektion maträtt. (C) närbild foto lyfta brand polerad smal överföringspipett (till vänster) och brand-polerat bred öppning pipett för mekanisk triturering (höger). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
. Figur 2: Akut isolerade och odlade SAM är morfologiskt oskiljbara A:. Ljusa fält bilder representativa SAM antingen omedelbart efter isolering (akut) eller efter 24 timmar, 48 timmar, 72 timmar, 96 timmar eller 6 dagar in vitro B - D : genomsnittlig (± SEM) maximala längd, bredd och tvärsnittsarea för akut isolerad mot 48 timmar odlade SAM E:. Average (± SEM) membran kapacitans från spännings clamp inspelningar från akut isolerad eller odlade SAM. Alla jämförelser inte är betydande: p> 0,05 jämfört med akut. Anpassad från referens 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: adenoviral uttryck av exogena proteiner i odlade SAM Bright fält och epifluorescent bilder av representativa odlade SAM som har smittats vid en MOI av 100 för adenovirus som uttrycker EGFP (grön) och mCherry (röd), antingen på 24 eller 48 timmar efter. dubbel infektion. Skalstreck = 20 | im. Reproduceras från referens 9.
Figur 4: Elektro karakterisering av odlade SAM A:. Representativa Tång inspelningar från akut isolerade (svart) eller odlad (grå) SAM i Tyrodes lösning innehållande 1 nM isoproterenol. Skala barer: 40 mV, 100 ms B:. Average (± SEM) momentanbränning frekvens i akut isolerade (svart, n = 6) eller 48 timmar odlade (grå, n = 14) SAM C. Normaliserad genomsnittlig (± SEM) konduktans-spänningsförhållanden för If i akut isolerade (svart, n = 8) eller odlade (grå, n = 14) SAM inläggningar.. representativa aktuella familjer från akut (svart) eller odlade (grå) SAM framkallas av 3 sek hyperpolariserande testpulser från -60 till -160 mV i 10 mV steg D: Average ( ± SEM) i f strömtäthet på -150 mV i akut isolerade (svart, n = 7) och odlades (grå, n = 8) SAM. Anpassad från referens 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| komplett Tyrode s | låg Ca2 + / Mg2 + Tyrodes | KB Medium | BSA Lösning | NaCl / CaCl2 Anpassning Lösning | |
| NaCl | 140 | 140 | 140 | 10 | |
| KCl | 5,4 | 5,4 | 25 | 5,4 | |
| KH 2 PO 4 | 1,2 | 1,2 | 10 | 1,2 | |
| HEPES | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| glukos | 5,55 | 18,5 | 20 | 5,55 | |
| MgCl2 | 1 | 1 | |||
| CaCl2 | 1,8 0,066 | 1,8 | 1,8 | ||
| taurin | 50 | 20 | |||
| BSA | 1 mg / ml | 1 mg / ml | 1 mg / ml | ||
| K-glutamat | 100 | ||||
| K-aspartat | 10 | ||||
| MgSO 4 | 2 | ||||
| kreatin | 5 | ||||
| EGTA | 0,5 | ||||
| pH justerat till | 7,4 med NaOH | 6,9 med NaOH | 7,2 med KOH | 7,4 med NaOH |
Tabell 1:. Dissociation lösningar Kompositioner av lösningar som används i dissociationen av sinusknutan myocyter. Koncentrationer är angivna i mm om inget annat anges.
| plätering Medium | Kultur Medium | |
| Media199 | bas | bas |
| 2,3-butandion monoxim (BDM) | 10 mM | 10 mM |
| Fetalt bovint serum (FBS) | 5% | - |
| Bovint serumalbumin (BSA) | 0,1 mg / ml | |
| Insulin | 10 | j, g / ml | |
| transferrin | 5,5 | ig / ml | |
| Selen | 5 ng / ml | |
| Penicillin | 100 U / ml | 100 U / ml |
| Streptomycin | 100 mg / ml | 100 mg / ml |
Tabell 2: plätering och kulturlösningar Kompositioner av lösningar som används för plätering och kultur sinusknutan myocyter..
| Tyrodes | PP Intracellulär | |
| NaCl | 140 | 5 |
| KCl | 5,4 | 135 |
| Kh 2 PO 4 | 1,2 | |
| HEPES | 5 | 10 |
| glukos | 5,55 | |
| MgCl2 1 | 1 | |
| CaCl2 | 1,8 | 0,1 |
| EGTA | 10 | |
| Mg-ATP | 4 | |
| Amfotericin-B | 200 | j, g / ml som krävs för | |
| isoproterenol | 1 nM efter behov | |
| pH justerat till | 7,4 med NaOH | 7,2 med KOH |
Tabell 3: Elektrofysiologi inspelningslösningar Kompositioner av extracellulärt (Tyrodes) och intracellulära (PP) lösningar som används för amfotericin perforerade-patch inspelningar från sinusknutan myocyter..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta dokument presenterar detaljerade protokoll för isolering och odling av fullt differentierade sinusknutan myocyter från vuxna möss. Isoleringen protokoll på ett tillförlitligt sätt ger spontant aktiva mus SAM lämpliga för antingen omedelbar elektrofysiologiska analys eller efterföljande kultur. Liknande protokoll har rapporterats av många andra grupper (till exempel, se referenser 11,12,10,13-17). Emellertid våra protokoll för att upprätthålla vuxen mus SAM in vitro bevarar karakteristisk morfologi, spontan aktivitet, och elektrofysiologiska egenskaper hos cellerna och möjliggör adenoviral leverans av proteiner 9.
För modifiering och felsökning av protokollen bör några viktiga steg noteras. Den första kritiska faktorn är en betydande del till-lot variation i aktiviteten hos de enzymer (steg 1,4), vilket dramatiskt kan förändra antalet och kvaliteten på SAMs isolerade i en given FÖRBEREDELSEation. Denna variation är särskilt sant för elastas, som vanligtvis kräver mycket specifik optimering, i vilken de tider koncentration och exponeringstid skall gaff under loppet av flera preparat (ofta görs parallellt) för att maximera antalet celler och hälsa. Vissa protokoll för isolering av SAM från olika arter använda enskilda kollagenas och proteasenzymer istället för kollagenas-proteasenzymet blandning i det nuvarande protokollet. Dock är mycket till mycket variation för vart och ett av dessa enzymer ganska hög (liknande den i elastas), vilket nödvändiggör upprepade omgångar av co-optimering. Enzymet blandning ger mer konsekvens i partier och kräver färre optimeringssteg.
En andra kritisk, och icke närliggande faktor för felsökning av SAM isolering är integriteten hos brand polerat glas dissociation pipett (Figur 1C). Om kanten av pipetten innehåller några skarpa kanter, sprickor eller ackumulerade cellular skräp kan den mekaniska triturering steget skada cellerna, vilket resulterar i kalcium toxicitet. Branden-polerade dissociation pipett bör bytas minst vart 2 månaders regelbunden användning, eller när som helst att cell avkastningen eller kvalitet avtar kraftigt under loppet av flera preparat.
Tidpunkten och kraften av den mekaniska dissociation är ett tredje kritiskt steg för felsökning av isolering protokollet. Den finfördelning kräver långsam (cirka 0,5-1 Hz) men kraftfull turbulens för 5-10 min. Högre hastigheter och minskade tider skulle också kunna användas, men det är viktigt att undvika att införa bubblor eller genererar skum i lösningen. När sinusknutan proven har helt dissocierat, bör de återstående vävnadsremsor visas stripig och vit färg; subtila rosa-ish färg indikerar ofullständig finfördelning. Vid undersökning vid 200-400X förstoring, celler från optimalt förberedda prover har släta cellmembranen, medan cell MedlRanes från över omsatta eller över revs prover har en cratered och tvärstrimmig utseende. I friska celler, är sammandragningar observer primärt som subtila ryckningar i ändarna av cellerna. Vågor av kontraktion är ett tecken på skadade celler, som kan följas för att ingå avtal kraftigt under en kort tid, innan klump upp. En sprucken dissociation pipett är den vanligaste orsaken till en sådan cellskador. I prover som har varit under omsatta eller under revs, celler är närvarande som klumpar eller aggregat i stället för enskilda celler, och ett stort antal upphandlande SAM kan observeras i de återstående vävnads bitar.
Varje användare kommer att behöva individuellt optimera dissociation. Även den enzymatiska nedbrytning och mekaniska dissociation gånger bör båda justeras, rekommenderas att initialt hålla enzymatisk spjälkning tidskonstant samtidigt modifiera dissociation tid. Ytterligare finjustering bygger i huvudsak på användarens förmåga att känna igen enppearance av vävnadsbitar kvar vid slutförandet av rivning - när bitarna är stripig och vitaktig i färg, då finfördelning bör stoppas. Optimering är också nödvändigt för att tillgodose variationer i sinusknutan som åtföljer skillnader i ålder, kön, eller stam av möss. Till exempel, dissociation av celler från äldre djur 7 kräver minskning av både enzymatisk digestion och mekaniska dissociation gånger. Som en allmän riktlinje, en typisk framställning från en 2-3 månader gamla manliga C57BL / 6 mus utbyten ungefär 50-200 livskraftig Sams, av vilka kanske 5-10 kan framgångsrikt patch-fastspänt i en bra dag session, beroende på de experiment . Utbytet är betydligt (~ 30%) lägre när äldre möss används 7.
Framgången för kultur protokoll bygger också på några viktiga steg. Främst, framgången av en primär cellodling kräver en högkvalitativ dissociation, såsom diskuterats ovan. Det rekommenderas thvid akut isolerade cellberedningen optimeras innan man försöker att bibehålla cellerna i odling. En andra kritisk faktor för odlade celler ligger i valet av celler för elektrofysiologiska inspelningar. För bästa resultat bör odlade SAM som valts ut för inspelningar uppvisar spontana sammandragningar omedelbart efter urtvättning av BDM innehållande odlingsmedium. En långsamt insättande av spontana kontraktioner vid wash-out av BDM är ett tecken på sjuka celler.
SAM kultursystem har vissa begränsningar, notably mycket liten storlek av musen SAN. Medan de metoder som visat här möjliggör ett tillräckligt cellantal för elektrofysiologiska och avbildningsstudier, den begränsade mängd vävnad utesluter biokemiska analyser av odlade SAM. En annan begränsning hos tekniken är att SAM måste odlas i närvaro av den reversibla myosin ATPase-inhibitor, BDM. Detta är ett potentiellt problem eftersom BDM har andra cellulära effekter, inklusiveospecifik fosfatasaktivitet, hämning av hjärttranskriptionsfaktorer 19, och hämning av natriumkanaler, kalciumkanaler och ryanodinreceptorer 20. Men data visar att BDM har minimala effekter på de morfologiska och elektrofysiologiska egenskaper hos SAM analyseras här.
I framtida tillämpningar, verkar det troligt att de metoder som beskrivs här skulle kunna anpassas för att förbereda SAM kulturer från större däggdjur. I kombination med adenoviral genöverföring, kan sådana kulturer tillåta genetiska manipulationer av Pacemaking i stora djurmodeller. Möjligheten att införa proteiner av intresse ger också för framtida applikationer där genetiskt kodade reportermolekyler kan användas för att sondera intracellulära signalvägar i SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 |
References
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D.
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
