Summary
방법은 패치 클램프 전기 생리학 또는 이미징 연구를위한 성인 마우스의 동방 노드 근육 세포 (SAM을)의 분리를 위해 증명된다. 분리 된 세포를 직접 사용할 수 또는 부호화 유전자 리포터로서 관심 단백질의 발현을 허용하는 배양에서 유지 될 수있다.
Abstract
자발적인 활동 전위 (APS)를 생성하여 이길 각각의 마음을 개시 마음의 자연 페이스 메이커로 동방 노드 근육 세포 (SAM을) 행위. 이 페이스 메이커 AP는 다수의 막 전류와 세포 내 칼슘 자전거의 조정 활동을 반영합니다. 그러나 SAM을에서 자연 페이스 메이커 활동을 구동하는 정확한 메커니즘은 애매 남아있다. 급성 고립 된 SAM은 실험 심장 심장 박동의 분자 기초를 해부하기위한 필수적인 준비합니다. 그러나, 불명료 한 해부학, 복잡한 미세 절제, 그리고 몹시 신경을 쓰는 효소 소화 조건은 급성 고립 된 SAM의 광범위한 사용을 방지했다. 또한, 방법은 단백질 발현 연구에 SAM에의 장기 문화를 허용하는 최근까지 사용할 수 없었다. 여기에서 우리는 성인 쥐에서 SAM을의 분리를위한 단계별 프로토콜 및 비디오 데모를 제공합니다. 방법은 또한 시험 관내 및 expressi 위해 성체 마우스의 SAMs 유지를위한 입증되고아데노 바이러스 감염을 통해 외래 단백질에. 급성 격리 및이 방법에 의해 제조 배양 된 SAM은 전기 생리 및 이미징 연구의 다양한 적합하다.
Introduction
페이스 메이커의 심장의 동방 노드에서 근육 세포 (동방 근육 세포는, "SAM을")는 각각의 심장 박동을 시작 심근 통해 전파 자연, 리듬 활동 전위 (APS)를 생성합니다. 많은 종에서 급격하게 격리 된 SAM을 사용하여 실험 맥박 조정기 활동의 발생에 기여하는 메커니즘을 해명 필수적이었다. SAM을는 형태, 기능 및 단백질 발현의 관점에서, 심방 및 심실의 심근의 해당 실질적으로 상이 고도로 전문화 심근이다. SAM을 자발적 액세스 포인트들의 특징은 다음 AP 1,2 트리거 임계 막 전위를 구동 이완기 자발적인 탈분극이다. 이러한 "심박 전위"많은 상이한 "재미 전류"(I의 F)을 포함하여 막 전류 T- 및 L 형 칼슘 전류와 나트륨 - 칼슘 교환기 CURR의 활성에 따라 조정근질 세망 3,4에서 칼슘 방출에 의해 구동되는 엔트 (I NCX).
급성 고립 된 마우스 SAM을가 심장 박동의 연구에 필수적인 실험 준비를하는 동안 마우스 SAN의 불명료 한 해부학과 작은 크기가 미묘한 미세 절제와 결합 된 효소 및 기계를 필요로하기 때문에, 마우스에서 SAM을의 분리 채택하기 어려운 방법이 될 수 있습니다 세포의 분리주의 최적화가 필요합니다.
우리는 여기에 성공적으로 패치 클램프 녹음 5-8을위한 성인 마우스에서 SAM을 격리하는 데 사용 된 프로토콜의 상세한 비디오 데모를 제공합니다. 우리의 지식에, 다른 소스에서 사용 가능한 시각적 데모가 없습니다. 또한, 새로운 방법이 설명된다되는 성인 마우스로부터함으로써 유전자의 단백질의 도입을 허용하는, 수 일간 시험관 내에서 유지 될 수있는 SAM을 격리아데노 바이러스 감염 (9)을 통해 기자 분자 또는 RNAi의.
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Protocol
모든 동물의 절차는 콜로라도 앤 슈츠 의료 캠퍼스의 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다. 표준 프로토콜은 다음과 나이 2 ~ 3 개월 남성 C57BL / 6J 마우스를 사용하여 최적화되었습니다.
1. 실험의 사전에 솔루션 주식 및 용품 준비
참고 : 필요한 장비 및 소모품에 대한 자료 표를 참조하십시오.
- 전체 타이로드의, 저 칼슘 / 마그네슘 2+ 타이로드의, 수정 크래프트 - Brühe (KB) 솔루션 및 소 혈청 알부민 (BSA) 해결 방법 : 표 1에 나타낸 바와 같이 1 L 다음 솔루션의 각을 준비합니다. 사용 초순수 모든 솔루션을 탈 이온수를 여과 하였다. 최대 6 개월 동안 20 ° C에서 각각 50 ㎖ 씩에 솔루션 및 저장소를 나눈다. 바로 실험을하기 전에 각각의 분취 량을 해동, 1 주일에 최대 4에 대한 저장6; C.
- 초순수 여과 탈 이온수 (표 1)에 염화나트륨과 염화칼슘이 용해 된 10 mM의 NaCl과 1.8 mM의 CaCl2를 적응 용액 50 ㎖를 준비합니다. 최대 6 개월 동안 실온에서 보관하십시오.
- 의 microfuge 튜브에 피펫 팅에 의해 엘라 스타 제의 4.75 효소 활성 단위 (U) 분취 량을 준비합니다. 최대 세 달 동안 4 ° C에서 보관하십시오.
- 의 microfuge 튜브에 피펫 팅에 의해 콜라게나 프로테아제 효소 블렌드 (초순수 H 2 O)에 375 μg의 분취 량을 준비합니다. 최대 3 개월 -20 ° C에서 보관.
- (도 1Aiv 그림 1C ~ 1.5 mm 최종 개구 직경)과 해리 하나 (1 ~ 2 mm 직경도 1Aiii 그림 1C)이 화재 - 광택 파스퇴르 피펫, 조직 전송을 위해 하나를 준비합니다.
- 점수 파스퇴르 유리 커터 피펫 및 원하는 크기보다 약간 큰 개구를 생성하기 위해 상기 점수를 따라 스냅. 불두꺼운 벽 연마 원하는 직경의 개구를 생성하는 분젠 버너의 화염이 낮은 이상 ~ 30 ~ 60 초 동안 각각의 피펫의 절단 단부 -polish. 화재 연마 개방 균열이나 거친 가장자리 무료입니다 확인합니다.
- 추가하여 두 해부 요리를 준비 ~ 25 ml의 실리콘 엘라스토머 각각 100mm 페트리 접시에 제조업체의 방향 (그림 1Ai 및 그림 1B)에 따라 혼합. 48 시간 동안 실온에서 치료 할 수 있습니다.
- 문화에만 : ml의 25-50을 준비 각각의 도금 중간 및 표 2에 따라 문화 매체 스토어 2 주까지에서 4 ℃로합니다..
2. 준비 솔루션은 세포 분리의 날에 사용되는
주 : 다음 금액은 한 마우스에서 동방 근육 세포의 분리를위한 것입니다.
- 추가 2.5 낮은 칼슘 ml의 2 + 세 개의 작은, 둥근 바닥 문화 튜브의 각 / 마그네슘 2+ 타이로드의 (PH 6.9)에스. 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브.
- 저 칼슘 / 마그네슘 2+ 타이로드의 하나의 큰 둥근 바닥 문화 튜브의 2.5 ML을 추가합니다. 이 튜브에, 1 분취 (4.75 U) 엘라 스타 제와 하나의 나누어지는 (375 μg의) 콜라게나 프로테아제 효소의 조화를 추가합니다. 혼합 소용돌이 친다. 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브.
- 세 개의 추가 작은 둥근 바닥 문화 튜브와 하나의 추가 크고 둥근 바닥 문화 튜브에 KB 매체의 2.5 ML을 추가합니다. 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 넣어 튜브.
- 하나의 큰 바닥이 문화 튜브에 BSA 용액 ~ 7 ML을 추가합니다. 실온에서이 튜브를 유지합니다.
- 50 비이커 (그림 1Aii)에 완료 타이로드의 솔루션의 20 ~ 40 ml에 놓습니다. 혼합 10 USP / ㎖ 헤파린, 소용돌이를 추가하고 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에 비커를 놓습니다.
배양 된 세포는 (급성 고립 된 세포에 대해이 단계를 건너 뛰기) 3. 추가 솔루션 및 재료 준비
- 무균 조직 배양 후드에서 24 웰 플레이트의 각 우물에 마우스 당 두 개의 12mm 라운드 커버 글라스를 배치합니다.
참고 : 우물 후속 바이러스 감염의 볼륨을 제한하는 역할을 편리한 크기 때문에 24 웰 플레이트가 사용됩니다. - 피펫 각 커버 슬립 위에 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 희석 마우스 라미닌의 100 NG / ㎖ 용액 약 200 μL.
- 37 ° C의 배양기에서 분리 (적어도 1 시간)의 기간 동안 라미닌 커버 슬립을 부화.
- 사전 따뜻한 도금 매체와 문화 매체 37 ° C에 (단계 1.7 표 3에서).
4. 동방 노드 격리
- 화학 퓸 후드에서, 두 챔버 박스의 챔버 내에 마우스를 배치하고, 다른 챔버에 면봉을 통해 도입 ~ 200 ㎕의 액체를 이소 플루 란 마취. 발가락 핀치와 (보통 30 ~ 60 초 ~ 이내) 마취를 확인합니다. 안락사자궁 경부 전위로 마우스.
주 : 빈 1 ml의 피펫 팁 박스는 2 챔버 박스를 형성하는데 사용될 수있다; 직접 접촉 마우스를 방지하기 위해 이소 플루 란에 대한 별도의 구획을 만들기 위해 상자에 거꾸로 랙을 켭니다. - 외부 조직 포셉 (그림 1Aviii) 및 해부 가위 (그림 1Avix)를 사용하여 흉강을 노출 가위 및 횡단면 리브 케이지 가슴에서 모피를 제거합니다. ~ 2 ml의 헤파린이 전송 피펫을 이용하여 완전한 타이로드의 가온과 흉강을 목욕.
참고 : 필요한 경우 준비가 건조하는 것을 허용하지 않습니다, 목욕 흉강을 계속합니다. - 해부 현미경 하에서 조심스럽게 폐를 제거하고 내부 가위 (그림 1Avi) 및 해부 포셉 (그림 1Avii)를 사용하여 흉선.
- 부드럽게 내부 해부 집게로 마음의 정점을 잡고 조심스럽게 하대 정맥하고 A 컷내부 가위로 오르타는 흉강의 심장을 제거합니다. 실리콘 해부 요리 중 하나에 마음을 전송하고 ~ 4 ml를 완료 타이로드의가 전송 피펫을 사용하여 헤파린 따뜻해진와 목욕.
- 동양 심장 등의 후방 선박이 표시 및 실험자의 왼쪽에있는 동물의 실험자의 오른쪽 우심방과 좌심방으로,이 위를 향하도록되어있다. 지향되면, 실리콘 해부 접시에 정점을 고정하여 마음을 고정.
- 심실과 심방 (심실 위의 맑은 링) 사이의 홈을 찾습니다.
- 내부 해부 가위를 사용하여 심방보다 심실에 가까운 유지 홈에 절개를합니다. 추가 따뜻하게 헤파린 완료 타이로드가 같은 심방과 밸브의 밝은 전망을 허용하는 데 필요한의로 홈과 절개를 플래시합니다. 심실에서 심방을 분리 홈을 따라 절단 계속합니다.
- 두 번째 실리콘 해부 접시에 심방 조직을 전송하고 ~ 3ml를 완료 타이로드의를 헤파린 따뜻해진와 목욕.
- 오리엔트 동물의 우심방는 실험자의 왼쪽 이제 조직이되도록, 및 좌심방이 오른쪽이다.
참고 : 좌심방이 어두운 붉은 톤 이상을 보유하고있는 동안 우심방이 더 투명합니다. - 조심스럽게 준비 스트레칭, 하부 우수한 대정 cavae 오른쪽과 왼쪽 심방 부속을 통해 조직을 고정. 준비 (동방 노드가 아주 섬세하고 쉽게 손상 될 수있는, 심방 벽에 절단되지 않도록주의)을 명확하게 볼 수 있도록 남아있는 지방이나 기타 조직을 제거합니다.
- 대정맥을 통해 절단에 의해 심방의 앞쪽 벽을 엽니 다. 심방 중격를 시각화하기 위해 필요에 따라 핀을 다시하는 것은-놓습니다.
- 좌심방을 제거하기 위해 심방 중격을 따라 잘라. 부드럽게 스트레칭, 준비를 다시하는 것은-핀.
- t을 제거우심방 부속 그와 심방 부속 경계 어두운 오렌지 행진으로 나타나는의 cristae의 terminalis을 따라 절단하여 동방 노드를 무료로 제공됩니다.
- 마디 조직을 다시 핀과 세 개의 동일한 크기의 스트립을 생성합니다 (crista의 terminalis에 수직) 옆으로 잘라.
5. 동방 노드 소화
- 좁은 불을 광택 피펫 (그림 1Aiv)를 사용하여, 저 칼슘 2.5 ml에 포함 된 세 개의 작은, 둥근 바닥 튜브의 첫 번째로 동방 노드 조직의 세 개의 스트립을 전송 2+ / 마그네슘 2+ 타이로드의 35 ± 1 °의 C 물 목욕. 5 분 동안 품어.
- 2.5 ml의 낮은 칼슘이 포함 된 두 번째 작은 둥근 바닥 튜브로 전송 조직 스트립 2+ 같은 좁은 피펫을 사용하여 / 마그네슘 2+ 타이로드의 35 ± 1 ° C의 물을 욕조에. 부드러운가 튜브를 소용돌이 또는 부드럽게 좁은 피펫 피펫 팅하여 조직 스트립을 씻으십시오. 안 인버튜브에서 t.
- 2.5 ml의 낮은 칼슘을 함유하는 제 작고 둥근 바닥 튜브에 전송 조직 스트립 2+ ㎎ / 2+의 타이로드하고, 단계 5.2에 기재된 세정 공정을 반복한다.
- 저 칼슘 2.5 ml에 포함 된 큰 둥근 바닥 튜브에 전송 스트립 2+ / 마그네슘 2+ 타이로드의 35 ° C의 물을 욕조에있는 효소 (엘라 스타 플러스 콜라게나 - 단백질 분해 효소 혼합)와 함께. 세 조직 스트립이 있는지 확인합니다. 35 ± 1 ℃에서 10 ~ 15 분 동안 품어. 부드럽게 튜브를 소용돌이에 의해 매 5 분을 섞는다. 튜브를 반전하지 마십시오.
6. 동방 노드 심근 해리
- 효소 분해 후, 온화하게 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB 용액을 포함하는 제 작고 둥근 바닥 튜브에 조직 스트립 전송 좁은 화재 연마 피펫을 사용한다. 부드럽게 튜브를 소용돌이로 조직을 씻으십시오.
참고 : 조직 스트립이 약간 반투명 나타나고 번째에서 함께 응집 할 수있다포인트입니다. 세포 손실을 방지하는 효소 소화 한 후 매우 부드럽게 처리합니다. - 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB를 함유하는 제 2 미소 둥근 바닥 튜브에 조직을 옮긴다. 씻어 부드럽게 소용돌이.
- 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB 함유 세번째 작은 둥근 바닥 튜브에 조직을 옮긴다. 씻어 부드럽게 소용돌이.
- 35 ± 1 ℃에서 2.5 ml의 KB 함유 큰 둥근 바닥 튜브에 조직을 옮긴다.
- 돌보는, 약 0.5 Hz에서 5 ~ 10 분 동안 일정하게 분쇄하여 큰 둥근 바닥 튜브에 세포를 떼어 놓다, 더 큰 화재 연마 피펫 (그림 1Aiii 그림 1C)를 사용하면에 잠긴 해리 튜브를 유지하는 35 ± 1 ° C의 물을 욕조 및 솔루션에 거품을 도입 피하기 위해.
참고 : 분쇄 시간은 해리 피펫의 직경과 피펫의 힘에 따라 달라집니다. 조직 조각을 t로 남아 있도록 시간 조정되어야그는 해리의 끝은 얇고 투명하고 전경이 나타납니다. 조직이 어떤 색깔을 유지하는 경우, 분리가 불완전 할 가능성이 높습니다. 주파수 (0.5 Hz에서) 손에 의해 결정된다. - 수조로부터 해리 된 SAM을 함유하는 둥근 바닥 튜브를 제거하고 실온에서 5 분간 평형화.
제 동방 노드 칼슘 재 적응 (상온에서)
참고 : SAM을 문화 실험을 향하는를 들어, 다음 항목의 절차는 무균 조직 배양 후드에서 수행해야합니다. SAM을 급성 실험에 사용되는 경우, 무균 환경에서 이러한 단계를 수행 할 필요가 없다.
- 염화나트륨 / 염화칼슘이 적응 용액 (표 2)의 75 μl를 추가합니다. 혼합 5 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이.
- 염화나트륨 / 염화칼슘이 적응 용액 160 μl를 추가합니다. 혼합 5 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이.
- BSA 졸의 390 μl를 추가의 ution (표 2). 혼합 4 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이.
- BSA 용액의 1.25 ML을 추가합니다. 혼합 4 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이.
- BSA 용액의 4.37 ML을 추가합니다. 혼합 4 분 동안 품어 부드럽게 소용돌이.
참고 : 칼슘의 최종 농도가 1.8 mM의 것입니다. - 칼슘 재 적응 후, 3 분 ~ 2000 XG에 10 분 ~ 또는 원심 분리하여 중력에 의해 정착 할 수 있도록하여 SAM에를 수집합니다.
- 급성 고립 셀 부드럽게 ~ 2 ㎖를 세포 남겨 제거하고 유리 파스퇴르 피펫을 이용하여 상층 액의 약 5 mL를 버린다. 패치 클램프 녹음 최대 8 ~에 시간 동안 실온에서이 세포를 저장합니다.
- 배양 된 세포를 들어, 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 가능한 한 상등액의 정도를 제거합니다. 미리 예열 한 용액에 재현 탁 세포 펠렛 (37 ° C) 도금 중간 (표 2).
동방 묘 8. 도금 및 문화cytes (급성 고립 세포에 대한 건너 뛰기)
- 파스퇴르 피펫 단계 3.3에서 커버 슬립에서 라미닌 솔루션을 제거합니다. 즉시 (3 단계) 각 라미닌 - 코팅 커버 슬립 상에 500 μl를 (~ 50 ~ 100 셀) 시드.
참고 : 수축 억제제 2,3- 부탄 monoxime (BDM)은 셀 (9)의 마찰이 발생 수축을 방지하기 위해 도금과 문화 미디어에 포함되어 있습니다. - 인큐베이터를 새로 접종 된 SAM을 포함하는 24 웰 플레이트를 돌려 95 % 공기 / 5 % CO 2 분위기하에 37 ℃에서 유지한다. 세포가 도금 미디어에서 4-6 시간 (표 2)에 대한 커버 슬립을 준수 할 수 있습니다.
- 부드럽게 멸균 파스퇴르 피펫을 사용하여 도금 매체를 제거합니다. 미리 예열 (37 ° C) 문화 매체의 잘 당 500 μL (표 2)로 교체하십시오.
성인 동방 심근 문화의 9 아데노 바이러스 형질 도입 (급성 고립 된 세포에 대한 건너 뛰기)
- 가전의 수를 예측즉시 배율 조정, 현미경 시야에서 세포를 계수하여 아데노 바이러스를 적용하기 전에 커버 슬립 당 LLS. 모든 셀뿐만 아니라 SAM에를 계산합니다.
- 보통 199에서 아데노 바이러스를 희석하고 1-10 μL의 응용 프로그램이 셀 당 100 바이러스 단위의 감염의 최종 다양성 (MOI)를 달성하기 위해 필요하므로 바이러스 역가의 희석을 조정합니다. 직접 도금 SAM을 상에 적하 방식으로 아데노 바이러스 솔루션을 추가합니다.
- 바이러스 함유 배지 하룻밤 (~ 12 ~ 14 시간)와 세포를 품어. 그리고 신선한 배지로 교환합니다. 목적 단백질의 발현이 얻어 질 때까지, 배양 배지를 매 48 시간을 변경 배양기에서 세포를 유지한다.
급성 격리 또는 배양 SAM을 10. 기능 평가
참고 : 다음 프로토콜은 자연 AP와 나는 모두를 기록하는 천공 패치 기술을 암포 테리를 사용하여 격리 된 SAM의 기능 평가의 예입니다
- 표 3에 기록 된 바와 같이 용액을 준비한다.
- 녹화 일 신선한 DMSO에 20 ㎎ / ㎖의 암포 테리 신 B-원액을 준비한다. 실온에서 재고를 유지하고 빛으로부터 보호합니다. 200 UG의 최종 농도로 세포 내 용액에 암포 테리 신-B 주식을 희석는 / 그냥 사용하기 전에 ml로. 얼음에 최종 피펫 솔루션을 유지하고 빛으로부터 보호합니다.
참고 실험의 암포 테리 신 - 함유 피펫 용액은 적어도 1 분 동안 세포 용액 텍싱로 원액의 분취 액을 희석하여 신선한 시간당 제조되어야한다. - 의 분취 이동시켜 급성 SAM의 세포 현탁액을 35 ± 1 ℃에서의 타이로드 용액을 함유하는 기록 챔버로 배양 SAM에 담지 된 유리 커버 슬립의 단편 해리. 적어도 2 분 전에 전기 생리 recordin에 대한 타이로드의 솔루션 세포를 관류GS는 문화 매체에 남아있는 잔류 BDM를 제거합니다.
주 : 자발적인 수축 즉시 타이로드의 솔루션에 전송에 분명해야합니다. 기록 된 SAM 자발적인 수축 활성 특징 형태 (예.,도 2), 줄무늬 부족 HCN4 단백질의 발현, I f를 현재 존재 멤브레인 용량 <50 pF의, 자발적 AP를 포함하여 기능의 조합에 의해 식별 될 수있다 확장기 탈분극 상과 느린 상향 행정을 포함 파형과 함께. - 1.5-3.0 MΩ의 저항과 붕규산 유리 피펫을 사용하여, 세포 내 용액으로 끝을 작성은 10-30 초 동안 침지하여 암포 테리 부족. 그런 다음, 암포 테리 신 함유 용액에 피펫을 다시 채우기. GΩ 세포 부착 밀봉 가능한 한 신속하게 얻을 수 있습니다. 시일 형성이 곤란한 경우, 팁 - 충전 시간을 증가시킨다.
주 : 액세스 저항은 계속되어야한다셀에 연결된 실의 형성 다음 모니터링 및 녹음은 <10 MΩ의 안정된 접속 저항을 획득 한 후 시작해야합니다. - 자연 AP를 기록하려면, 전류가 주입 빠른 전류 클램프 모드로 앰프를 전환합니다.
주 : 앞서 열을보고, 연소율을 안정화 AP를 기록 할 때 1 나노 이소은 타이로드의 세포 외 용액에 포함된다.
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Representative Results
여기에 설명 된 프로토콜은 이전에 다른 패치 클램프 실험 5-8 다양한 적합한 성인 마우스로부터 자발적 활성 SAM을 분리하기 위해 사용되어왔다. 또한, 프로토콜 최대 1 주 동안 배양 유지할 수있다 절연 SAM을 허용한다. 배양 된 세포로의 유전자 전달은 아데노 바이러스 감염 9를 통해 달성 될 수있다. 이 절에서 제시된 결과는 이전 연구에서 파생과 급성 분리 및 배양 SAM을의 특성의 예로서 여기에 표시됩니다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 자발적 활성 SAM을 최대 6 일 동안 배양 유지할 수있다. 배양 된 세포를 유의 평균 길이, 폭의 변경, 단면적, 또는 배양의 막 커패시턴스, 급성 격리 된 SAM과 매우 유사한 전체 형태를 유지세포는 심하게 격리 세포 (- E 그림 2B)에 비해. 문화 시간에 가능한 SAM을 수의 감소는 그러나이 있었다. 따라서,이 실험 설계는 광범위한 데이터 집합을 요구하는 경우 문화가 여러 동물 풀링 세포에서 준비하는 것이 좋습니다.
성체 마우스의 동방 심근 세포의 배양을위한 프로토콜 개발의 주요 목적은 성인의 SAMs의 기본 셀룰러 환경에서 외인성 단백질의 발현을 허용하는 시스템을 구축 하였다. 단백질 발현이 유형의 예는 셀의 경우에 대해도 3에 도시 된 형광 마커 단백질 GFP 발현 및 mCherry 바이러스와 공동 감염. 우리는 단백질 발현은 아데노 바이러스 감염 24 시간 내에 불확실한 것을 발견하고, 48 시간 (그림 3)에서 테스트 단백질 최대이었다. (100)의 바이러스 성 MOI는 거의 100 % INF의 결과세포 독성의 증거와 ection 효율. 반면, 지질 계 시약을 사용하여 형질 감염도 9 72 시간 후, 성인의 SAM으로 검출 가능한 유전자 전달 생산할 못했다.
패치 클램프 전기 생리학을 통해 기능적 특성은 모두 심하게 격리 배양 SAM에.도 4a의 평가에 중요하다 암포 테리 신 천공 - 패치 기록 구성을 사용하여 급성 격리 또는 배양 된 SAM에서 기록 자발적인 활동 전위의 전형적인 전류 클램프 녹음을 보여줍니다. 활동 전위의 파형이 급격하게 분리 및 배양 된 SAM 비슷 하였다 평균 AP 소성 율 (도 4b)에는 차이가 없었다.
I f는 동방 노드의 면역 세포 마커로 사용되는 SAM을 내가 f를을 생산 HCN4 채널의 특징이다. 따라서 홍보패치 클램프 기록에서 I (F)의 esence는 세포의 SAMs 사실에 있다는 생각을지지하는데 사용될 수있다. 자발 활성 급성 및 배양 SAM을 모두 여기에 또한 -120 MV에 1 초 전압 단계에 대한 응답으로 나는 F> (100) 연평균 전시 설명했다. 여기에 표시된 대표 결과, 세포는 -60에서 -160에 3 초 hyperpolarizing 전압 단계로 평가 하였다 K + 전류 (표 3), I (F)의 활성화의 전압 의존성을 차단하는 1 mM의 BaCl 2를 포함하는 타이로드의 용액으로 관류 하였다 -50 MV의 유지 전위에서 MV는 등 우리는 이전에 5-8 설명했다. 전류 밀도는 -50 MV의 유지 전위에서 -150 MV 3 초 hyperpolarizing 테스트 펄스에 응답하여 평가 하였다. F I의 활성화의 전압 의존성 또는 급성 분리 및 배양 SAM을 (그림 4 사이의 전류 밀도 (F)의 I 중 하나에 유의 한 차이가 없었다C - D). 개별 SAM을에서 F 이러한 자연의 AP의 공동 녹음과 나는 2 분 초기 세척을 포함하여 총 약 9 분 (현재 클램프 모드에서 자연의 AP의 30 ~ 60 초, 2 분 솔루션의 변화를 요구하고, 약 5 분에 I F)의 활성화의 전압 의존성을 설명하기에 충분한 전압 클램프 데이터를 수집한다. 따라서,도 4c에 도시 된 데이터는 세포 제제의 안정성을 보여준다.
그림 1 : 마우스 SAM을의 분리 및 분리에 대한 해부 장치 (A) 난 ~ 실리콘 엘라스토머 치료 25 ml에 포함 된 두 10cm 배양 접시... 각각의 요리는 조직을 고정하기위한 6-10 작은 절개 핀과 함께 미리로드됩니다. II. 100 ㎖ 비이커를 35에서 전체 타이로드의 유지를 위해# 176;... C의 물을 욕조 III 와이드 (1 ~ 2 mm 직경), 화재 - 광택 해리 피펫 IV 좁은 (~ 1.5 mm 직경) 전체 타이로드의와 함께 목욕 준비를위한 화재 연마 전송 피펫 V 플라스틱 전송 피펫... 내부 조직 조작에 대한 헤파린. VI. 내부 절단 절차 마이크로 가위를 열고 자체. VII. 미세 집게 (팁 크기 0.06 X 0.02 mm). VIII. 조직 집게, 5.5, 외부 조직 조작을위한 1 × 2 이빨. IX. 곡선 홍채 가위 외부 절단 절차 4.3. 해부 접시에 배치 작은 절개 핀을 강조 (B) 근접 사진. 근접 사진의 기계적 분쇄 (오른쪽). 화재 연마 좁은 전송 피펫 (왼쪽)와 화재 - 광택 입이 큰 피펫 강조 (C) 여기를 클릭하세요 더 큰 버전?를 볼 수 있습니다이 그림의 N.
. 그림 2 : 급성 분리 배양 SAM을이 형태 학적으로 구별 할 수 없다 A :. 대표 SAM을 밝은 필드 이미지 중 하나를 즉시 분리 (급성) 후 또는 24 시간, 48 시간, 72 시간, 96 시간, 또는 체외 6 일 후 B - D : 평균 (± SEM) 최대 길이, 급성 48 시간 대 격리 배양 SAM을 E에 대한 폭과 단면적 :. (SEM ±) 평균 급성 격리 또는 배양 SAM을에서 전압 클램프 녹음에서 막 용량. 모든 비교는 중요하지 : 피> 0.05 대 급성. 참조 9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. eGFP는 (녹색) 및 mCherry (빨간색)를 발현하는 아데노 바이러스 100의 MOI에 감염된 배양 SAM에 밝은 필드와 대표 배양 SAM을의 epifluorescent 이미지에서 외래 단백질의 아데노 바이러스 표현 중 하나 (24) 또는 48 시간 후 이중 감염. 스케일 바는 20 μm의 =. 참조 9에서 재현.
그림 4 : 1 나노 이소을 포함하는 타이로드의 솔루션에서 심하게 격리 (검은 색)의 대표 전류 클램프 녹음 또는 배양 (회색) SAM에 :. 배양 된 SAM (A)의 전기 생리 특성. 스케일 바 : 40 MV, 100 밀리 초 B :. 평균 (± SEM) 순간급성 고립에 주파수를 발사 (검정, N = 6) 또는 48 시간 배양 (회색, N = 14) SAM에 C :. I에 대한 정규화 (SEM ±) 평균 전도 - 전압 관계를 심하게 고립에서 F (검정, N = 8) 또는 배양 (회색, N = 14) SAM에 인 세트 :.. 10 MV 단위로 -60에서 -160 MV에 3 초 hyperpolarizing 테스트 펄스에 의해 유발 급성 (검은 색) 또는 배양 (회색) SAM을 대표 현재 가족 D : 평균 ( ± SEM) 급성 (격리 블랙 -150 MV에서 I F 전류 밀도, N = 7)과 (배양 회색, N = 8) SAM에. 참조 9에서 적응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 전체 Tyrode의 | 저 칼슘 / 마그네슘 2+ 타이로드의 | KB 중간 | BSA 솔루션 | 염화나트륨 / 염화칼슘이 적응 솔루션 | |
| 염화나트륨 | (140) | (140) | (140) | (10) | |
| KCl을 | 5.4 | 5.4 | (25) | 5.4 | |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.2 | (10) | 1.2 | |
| HEPES | (5) | (5) | (5) | (5) | |
| 포도당 | 5.55 | 18.5 | (20) | 5.55 | |
| 의 MgCl 2 | 1 | 1 | |||
| 염화칼슘 (2) | 1.8 0.066 | 1.8 | 1.8 | ||
| 타우린 | (50) | (20) | |||
| BSA | 1 ㎎ / ㎖ | 1 ㎎ / ㎖ | 1 ㎎ / ㎖ | ||
| K-글루타메이트 | (100) | ||||
| K-아스 파르 테이트 | (10) | ||||
| 황산 | 이 | ||||
| 크레아틴 | (5) | ||||
| EGTA | 0.5 | ||||
| pH로 조정 | NaOH로 7.4 | NaOH로 6.9 | KOH 7.2 | NaOH로 7.4 |
표 1 :. 해리 솔루션 동방 노드 근육 세포의 분리에 사용되는 솔루션의 조성물. 농도가 언급 한 경우를 제외하고 밀리미터에 제시되어있다.
| 도금 중간 | 문화 매체 | |
| Media199 | 베이스 | 베이스 |
| 2,3- 부탄 monoxime (BDM) | 10 mM의 | 10 mM의 |
| 태아 소 혈청 (FBS) | 5 % | - |
| 소 혈청 알부민 (BSA) | 0.1 ㎎ / ㎖ | |
| 인슐린 | 10 μg의 / ㎖ | |
| 트랜스페린 | 5.5 μg의 / ㎖ | |
| 셀렌 | 5 NG / ㎖ | |
| 페니실린 | 100 U / ㎖ | 100 U / ㎖ |
| 스트렙토 마이신 | 100 ㎎ / ㎖ | 100 ㎎ / ㎖ |
표 2 : 도금 및 문화 솔루션 동방 노드 심근 세포의 도금과 문화에 사용되는 솔루션의 조성물..
| 타이로드의 | PP 세포 내 | |
| 염화나트륨 | (140) | (5) |
| KCl을 | 5.4 | (135) |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | |
| HEPES | (5) | (10) |
| 포도당 | 5.55 | |
| 의 MgCl 2 1 | 1 | |
| 염화칼슘 (2) | 1.8 | 0.1 |
| EGTA | (10) | |
| MG-ATP | 4 | |
| 암포 테리-B | / ml의 필요에 따라 200 μg의 | |
| 이소 | 1 nM의 필요에 따라 | |
| pH로 조정 | NaOH로 7.4 | KOH 7.2 |
표 3 : 전기 생리학 녹음 솔루션 세포의 조성물 동방 노드 근육 세포에서 암포 테리 신 천공 - 패치 녹음에 사용 (타이로드의)와 세포 내 (PP) 솔루션을 제공합니다..
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Discussion
이 논문은 성인 쥐에서 완전히 차별화 된 동방 노드 근육 세포의 분리 및 문화에 대한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 분리 프로토콜은 안정적으로 즉시 전기 생리 분석 또는 후속 문화 중 하나에 적합한 자연 활성 마우스 SAM에 생성됩니다. 유사한 프로토콜 (예를 들어, 참조 11,12,10,13-17 참조) 많은 다른 그룹에 의해보고되었다. 그러나, 체외에서 성인 마우스 SAM을 유지를위한 우리의 프로토콜은 특징적인 형태, 자발적인 활동 및 세포의 전기 생리 특성을 보존하고 단백질 9의 아데노 바이러스 전달을 위해 수 있습니다.
수정 및 프로토콜의 문제를 들어, 몇 가지 중요한 단계는 주목해야한다. 첫 번째 중요한 요소는 주어진 위해 준비 할 격리 극적 번호의 SAMs의 질을 바꿀 수있는 분해 효소 (1.4 단계)의 활성에 중요한 로트 가변성 인ATION. 이러한 변동은 전형적으로 세포 수 및 건강을 최대화하기 위해 많은 특정 최적화 된 농도 및 노출 시간 (종종 동시에 수행) 여러 제제에 걸쳐 다단계되어야 필요한 엘라에 특히 그러하다. 다양한 종에서 SAM을의 분리에 대한 몇 가지 프로토콜 대신 본 프로토콜의 콜라게나 프로테아제 효소 혼합물의 개별 콜라게나 제 및 프로테아제 효소를 사용합니다. 그러나, 이들 효소의 각각에 대한 로트 간 변동이 동시 최적화의 반복을 필요 발사 상당히 높은 (엘라 유사한)이다. 효소 혼합 제비에서 더 일관성을 제공 적은 최적화 단계가 필요합니다.
샘 분리 문제 해결을위한 중요한 두 번째, 그리고 암시 적, 인자는 화재 연마 유리 해리 피펫 (그림 1C)의 무결성이다. 피펫의 가장자리는 날카로운 모서리, 균열 또는 축적 다 포함되어있는 경우ellular 파편, 기계적 분쇄 공정 칼슘 독성의 결과로, 세포에 손상을 줄 수 있습니다. 화재 - 광택 해리 피펫은 정기적으로 사용, 2 개월 이상의 모든, 또는 셀 수율이나 품질이 여러 준비의 과정을 통해 현저하게 감소한다는 언제든지 교체해야합니다.
타이밍 및 기계적 해리의 힘은 분리 프로토콜 문제 해결을위한 세 번째 중요한 단계입니다. 분쇄 속도가 느린 (약 0.5 Hz에서)하지만 5 ~ 10 분 동안 강력한 난류가 필요합니다. 빠른 속도 감소 시간도 사용될 수 있지만, 기포를 도입하거나 용액에 거품이 발생하지 않도록하는 것이 중요하다. 동방 노드 샘플이 완전히 해리되었을 때, 남아있는 조직 스트립은 색상의 전경과 흰색 나타납니다; 미묘한 핑크 틱 색상이 완전 분쇄를 나타냅니다. 200-400X 배율로 관찰 할 때, 최적의 제조 세포 샘플에서 세포 MEMB 반면 부드러운 세포막을소화 오버 이상-분쇄 시료에서 ranes는 크레이터하고 줄 모양을 가지고있다. 건강한 세포에서 수축 셀의 단부 주로 미묘한 경련이 관찰된다. 수축의 파도 볼링 업하기 전에, 짧은 시간 동안 격렬하게 수축을 관찰 할 수 손상된 세포의 기호입니다. 금 해리 피펫은 세포 손상의 가장 흔한 원인이다. 소화 언더 또는 언더 분쇄왔다 샘플에서 세포 덩어리로서 존재하거나 대신 단셀 집계 신축의 SAMs의 상당수는 나머지 조직 덩어리로 관찰 될 수있다.
각 사용자는 개별적으로 분리를 최적화해야합니다. 소화 효소 및 기계적 해리 시간이 모두 조정해야하지만,이 해리 시간을 수정하는 동안 일정한 초기 효소 소화 시간을 유지하도록 권장한다. 추가적인 미세 조정 ㄱ 인식 할 수있는 사용자의 능력에 주로 의존분쇄의 완료시 나머지 조직 조각 ppearance - 피스는 전경 컬러로 희끄무레 한 후 분쇄 정지한다. 최적화는 마우스의 연령, 성별 또는 균주의 차이를 동방 동반 노드에서의 변화들을 수용 할 필요가있다. 예를 들어, 이전 동물 (7)에서 세포의 분리는 효소 소화 및 기계적 해리 번 모두 감소를 필요로한다. 아마도 5-10 성공적으로 패치 클램프, 좋은 하루의 세션에서 실험에 따라 될 수있는 일반적인 지침, 2-3 개월 된 수컷 C57BL / 6 마우스 수율 약 50 ~ 200 가능한 SAM을에서 전형적인 준비로서, . 수율은 이전 쥐 (7)를 사용하는 경우 상당히 (~ 30 %) 이하이다.
문화 프로토콜의 성공은 또한 몇 가지 주요 단계에 의존한다. 전술 한 바와 같이, 무엇보다도 주요 세포 배양의 성공은 고품질의 분리를 필요로한다. 그것은 번째 추천급성 절연 세포 제제에서 배양 세포를 유지하기 전에 최적화. 배양 된 세포에 대한 두 번째 중요한 요소는 전기 생리 레코딩을위한 세포의 선택에 달려있다. 최상의 결과를 얻으려면, 녹음 선택 배양 SAM을 즉시 BDM 함유 배지의 세척에 자발적 수축을 전시한다. BDM의 워시 아웃시 자연 수축의 느린 시작은 건강에 해로운 세포의 표시이다.
샘 문화 시스템은 몇 가지 제한 사항, 마우스 SAN의 가장 주목할만한 매우 작은 크기를 가지고있다. 여기에 입증 된 방법은 전기 생리 및 이미징 연구를위한 충분한 세포 수를 허용하지만, 조직의 제한된 양의 배양 SAM을 생화학 적 분석을 방해한다. 기술의 다른 제한은 SAM을 가역적 미오신 ATP 아제 억제제, BDM의 존재 하에서 배양되어야한다는 것이다. BDM을 포함한 다른 세포 효과를 갖기 때문 잠재적 관심사비특이적 포스파타제 활성은 심장 전사 억제 인자 (19), 및 나트륨 채널, 칼슘 채널 ryanodine 수용체 (20)의 억제. 그러나, 데이터는 BDM 여기서 분석 된 SAM의 형태 학적 및 전기 생리 특성에 미치는 효과를 가지고 있음을 보여준다.
장래의 응용에서, 여기에 설명 된 방법들은 더 큰 포유 동물에서 SAM 배양을 준비하도록 구성 될 수있는 것으로 보인다. 아데노 바이러스 유전자 전달과 함께, 이러한 문화는 큰 동물 모델에서 심장 박동의 유전자 조작을 허용 할 수 있습니다. 관심의 단백질을 도입하는 능력은 또한 유 전적으로 인코딩 된 리포터 분자의 SAMs의 세포 내 신호 전달 경로를 조사하는 데 사용될 수있는 미래의 애플리케이션에 제공한다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 |
References
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