Summary
Metoder demonstreres for isolering av sinusknute muskelceller (SAMS) fra voksen mus for patch clamp elektrofysiologi eller bildediagnostikk. Isolerte celler kan brukes direkte eller kan holdes i kultur for å tillate ekspresjon av proteiner av interesse, slik som genetisk er kodet for pressen.
Abstract
Sinusknute muskelceller (Sams) fungere som de naturlige pacemaker for hjertet, initiere hvert hjerteslag ved å generere spontane aksjonspotensialer (APS). Disse pacemaker APs reflektere koordinert aktivitet av mange membran strømninger og intracellulær kalsium sykling. Men de nøyaktige mekanismene som driver spontan pacemaker aktivitet i Sams forblir unnvikende. Akutt isolerte Sams er en viktig forberedelse for eksperimenter for å dissekere den molekylære grunnlaget for hjerte pacemaking. Imidlertid har utydelig anatomi, kompleks mikrodisseksjon, og pirkete enzymatiske fordøyelsen forholdene hindret utbredt bruk av akutt isolert Sams. I tillegg metodene var ikke tilgjengelig før nylig å tillate mer langsiktig kultur for Sams for protein expression studier. Her gir vi en steg-for-steg-protokollen og video demonstrasjon for isolering av Sams fra voksne mus. En fremgangsmåte er også vist for å holde voksen mus Sams in vitro og for expressipå av eksogene proteiner via adenovirus infeksjon. Akutt isolert og dyrket Sams fremstilt via disse metodene er egnet for en rekke av elektrofysiologiske og bildediagnostikk.
Introduction
Pacemaker muskelceller i sinusknute av hjertet (sinoatriell muskelceller, "Sams") generere spontane, rytmiske aksjonspotensialer (APS) som forplanter seg gjennom hjertemuskelen å initiere hvert hjerteslag. Eksperimenter med akutt isolert Sams fra mange arter har vært avgjørende for belysning av mekanismer som bidrar til generering av pacemakeren aktivitet. Sams er høyt spesialiserte cardiomyocytes som skiller seg vesentlig fra sine kolleger i atrial og ventrikulære myokard i form av morfologi, funksjon, og protein uttrykk. Kjennetegnet av spontane APs i Sams er en spontan depolarisering under diastolen som driver membranpotensialet til terskelen for å utløse neste AP 1,2. Denne "pacemaker potensial" avhenger koordinert aktivitet av mange forskjellige membran strømninger inkludert "morsomme dagens" (jeg f), T- og L-type kalsiumstrømmer, og natrium-kalsium leren Current (I NCX), som er drevet av Ca 2+ utgivelse fra sarkoplasmatisk retikulum 3,4.
Mens akutt isolerte mus Sams er en viktig eksperimentell forberedelse for studiet av pacemaking, kan isoleringen av Sams fra mus være en krevende metode for å ta i bruk fordi den utydelig anatomi og lille størrelsen på mus SAN krever en nyansert mikrodisseksjon og den kombinerte enzymatisk og mekanisk dissosiering av cellene krever omhyggelig optimalisering.
Vi gir her en detaljert video demonstrasjon av en protokoll som har blitt brukt til å isolere Sams fra voksen mus for patch clamp opptak 5-8. Så vidt vi vet, er det ingen slike visuell demonstrasjon tilgjengelig fra noen annen kilde. I tillegg er en ny fremgangsmåte demonstrert i isolert som Sams fra voksen mus kan bli opprettholdt in vitro i flere dager, for derved å tillate innføring av proteiner, genetisk kodedereporter molekyler eller RNAi via adenovirus infeksjon 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyr prosedyrer ble utført i henhold til protokoller godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité ved University of Colorado Anschutz medisinske høyskole. Den standard protokoll nedenfor er optimalisert ved hjelp av mannlige C57BL / 6J mus på 2-3 måneders alder.
1. Forbered Løsning Aksjer og hage i forkant av eksperimenter
MERK: Se Materialer tabell for nødvendig utstyr og forsyninger.
- Forbered en L hver av følgende løsninger som angitt i tabell 1: Complete Tyrodes, lav Ca 2+ / Mg 2+ Tyrodes, modifisert Kraft-Brühe (KB) Solution, og Bovine Serum Albumin (BSA) Solution. Bruk av ultrarent filtrert deionisert vann for alle løsninger. Del hver løsning i 50 ml porsjoner og oppbevares ved 20 ° C i inntil seks måneder. Tine individuelle porsjoner rett før eksperimenter, og lagre i opptil én uke på fire6 C.
- Fremstille 50 ml 10 mM NaCl og 1,8 mM CaCl2 Bearbeidelse løsning ved oppløsning av NaCl og CaCl2 i ultrarent filtrert deionisert vann (tabell 1). Oppbevar ved romtemperatur i opptil seks måneder.
- Forbered 4,75 enzymaktivitet enhet (U) aliquoter av elastase ved pipettering inn i mikrofugerør. Oppbevar ved 4 ° C i opptil tre måneder.
- Forbered 375 mikrogram porsjoner (i ultrarent H 2 O) av kollagenase-protease enzym blanding ved å pipettere til mikrofugerør. Oppbevares ved -20 ° C i inntil tre måneder.
- Forbered to brann polert Pasteur pipetter, en for vev transfer (~ 1,5 mm endelige åpningsdiameter, Figur 1Aiv og figur 1C) og én for dissosiasjon (~ 2 mm diameter, Figur 1Aiii og figur 1C).
- Resultat Pasteur pipetter med et glass cutter og knipse langs score for å produsere en åpning litt større enn ønsket størrelse. Brann-Polsk den avskårne enden av hver pipette for ~ 30-60 sek over en lav flamme på en Bunsen-brenner for å produsere en tykk polert vegg og en åpning av den ønskede diameter. Sørg for at brann-polert åpningen er fri for sprekker eller ujevnheter.
- Forbered to disseksjon retter ved å legge til ~ 25 ml silikon blandet i henhold til produsentens anvisninger til hver 100 mm petriskål (figur 1Ai og Figur 1b). Tillat å herde ved romtemperatur i 48 timer.
- For kultur bare: forberede 25-50 ml hver plating Medium og dyrkingsmedium som per Tabell 2 Store for inntil to uker ved 4 ° C..
2. Forbered Solutions skal brukes på Day of Cell Isolation
MERK: Følgende beløp er for isolering av sinoatriell muskelceller fra en mus.
- Legg 2,5 ml av lav Ca2 + / Mg2 + Tyrodes (pH 6,9) til hver av tre små rundbunnet dyrkningsrørs. Plasser rørene i 35 ± 1 ° C vannbad.
- Legg 2,5 ml lav Ca 2+ / Mg 2+ Tyrodes til en stor rund bunn kultur tube. Til dette rør, tilsett en aliquot (4,75 U) elastase og en aliquot (375 mikrogram) kollagenase-protease-enzym blanding. Swirl å blande. Plasser røret på 35 ± 1 ° C vannbad.
- Legg 2,5 ml KB Medium tre ekstra små, rundbunnet kultur rør og en ytterligere stor, rund bunn dyrkningsrør. Plasser rørene i 35 ± 1 ° C vannbad.
- Legg ~ 7 ml av BSA-oppløsning til en stor bunn dyrkningsrør. Hold dette røret ved romtemperatur.
- Plasser 20-40 ml Complete Tyrodes løsning i et 50 ml begerglass (figur 1Aii). Tilsett 10 USP / ml heparin, virvel å blande, og legger begeret i 35 ± 1 ° C vannbad.
3. Forbered Andre Solutions og Materials for dyrkede celler (hoppe over disse trinnene for Akutt isolerte celler)
- I et sterilt vev kultur hette, plassere to 12 mm runde dekkglass per mus i individuelle brønner i en 24-brønns plate.
MERK: 24 brønns plate blir brukt fordi brønnene er en passende størrelse, som tjener til å begrense det volum for etterfølgende virusinfeksjoner. - Pipetter ca. 200 pl av en 100 ng / ml oppløsning av mus laminin fortynnet i steril fosfatbufret saltløsning (PBS) på hver dekkglass.
- Inkuber Dekkglass med laminin for varigheten av den isolasjon (minst 1 time) i en inkubator ved 37 ° C.
- Pre-varme den Plating Medium Dyrkningsmedium (fra trinn 1.7 og tabell 3) til 37 ° C.
4. sinusknute Isolation
- I et avtrekksskap, plassere en mus i et kammer av en to-kammer boksen og bedøve med ~ 200 mL væske isofluran introdusert via en bomullspinne i det andre kammeret. Bekreft anestesi (vanligvis innen ~ 30-60 sek) med en tå klype. avlivemus ved cervikal dislokasjon.
MERK: En tom 1 ml pipette boksen kan brukes til å danne to-kammerboks; snu stativet opp ned i boksen for å skape den eget rom for den isofluran for å hindre at muse kommer i kontakt med det direkte. - Fjern pels fra brystet med saks og transektet brystkassen å eksponere brysthulen ved hjelp av eksterne vev tang (Figur 1Aviii) og disseksjon saks (Figur 1Avix). Bade i brysthulen med ~ 2 ml varmet Komplett Tyrodes med Heparin ved hjelp av en overføring pipette.
MERK: Fortsett badebrysthulen når det er nødvendig, tillater ikke forberedelse til å tørke ut. - Under en dissekere mikroskop, forsiktig fjerne lungene og thymus bruk av interne saks (Figur 1Avi) og disseksjon tang (Figur 1Avii).
- Mens forsiktig holder toppen av hjertet med de interne disseksjon tang, må du kutte vena cava inferior og enOrta med de interne saks for å fjerne hjertet fra brysthulen. Overfør hjertet til en av de silikon disseksjon retter og bade med ~ 4 ml heparinisert varmet Complete Tyrodes ved hjelp av overførings pipette.
- Orienter hjertet slik at de bakre skipene er synlige og vendt opp, med dyrets høyre atrium på eksperimentators høyre og venstre atrium på eksperimentator venstre. Når orientert, immobilisere hjertet ved å feste gjennom apex inn silikon disseksjon parabolen.
- Finn sporet mellom ventriklene og atriene (klart ring ovenfor ventriklene).
- Ved hjelp av de interne disseksjon saks, gjør et snitt på sporet, holder nærmere ventriklene enn atriene. Skyll groove og snittet med ekstra varme heparinisert Komplett Tyrodes som nødvendig for å tillate et klart syn på atriene og ventilene. Fortsett å kutte langs sporet for å skille atriene fra ventriklene.
- Overfør atrial vev til andre silikon disseksjon rett og bade med ~ 3 ml varmet heparinisert Komplett Tyrodes.
- Orienter vev slik at dyrets høyre atrium er nå på eksperimentators venstre og venstre atrium er på høyre side.
MERK: Den høyre atrium er mer gjennomsiktig, mens venstre atrium har mer av en mørk rød tone. - Pin vev gjennom dårligere og superior vena cavae og høyre og venstre atrial vedheng, strekke forberedelse forsiktig. Fjern eventuelle gjenværende fett eller annet vev for å tillate et klart syn av preparatet (være nøye med å ikke skjære i atrial veggen, som sinusknute er ganske delikat og kan lett bli skadet).
- Åpne fremre vegg av atriene ved å skjære gjennom Vena Cava. Re-plassere pinnene som er nødvendig for å visualisere interatrial septum.
- Skjær langs interatrial septum å fjerne venstre atrium. Re-pin forberedelse, strekke forsiktig.
- Fjern than rett atrial vedheng og frigjøre sinusknute ved å kutte langs cristae termin, som vises som en mørk oransje strek grenser til atrial vedheng.
- Re-pin nodal vev og skjær den sidelengs (vinkelrett på crista termin) til å produsere tre like store strimler.
5. sinusknute Fordøyelse
- Ved hjelp av den smale flammebehandlet pipette (figur 1Aiv), overfører de tre strimler av sinusknute vev inn i det første av tre små rundbunnet rør inneholdende 2,5 ml av lav Ca2 + / Mg2 + Tyrodes på 35 ± 1 ° C vannbad. Inkuber i 5 min.
- Overføring vev strimler til den andre lille, med rund bunn inneholdende 2,5 ml lav Ca2 + / Mg2 + Tyrodes på 35 ± 1 ° C vannbad, ved å bruke den samme smale pipette. Vask vev strimler ved forsiktig virvlende røret eller ved forsiktig pipettering med den smale pipette. Ikke Invert røret.
- Overføring vev strips til tredje liten, rund bunn rør som inneholder 2,5 ml lav Ca 2+ / Mg 2+ Tyrodes, og gjenta vasketrinnet beskrevet i trinn 5.2.
- Overføring av strimler, og i stor rund bunn inneholdende 2,5 ml av lav Ca2 + / Mg2 + Tyrodes med enzymer (elastase pluss kollagenase-protease blanding) i 35 ° C vannbad. Sørg for at alle tre vev strimler er til stede. Inkuber i 10-15 min ved 35 ± 1 ° C. Bland hvert 5 min med forsiktig virvlende røret. Ikke snu røret.
6. sinusknute myocyte Dissosiasjon
- Etter at enzymoppslutning, bruker smal flamme-polert pipette for å overføre forsiktig vevet strimlene til den første lille, med rund bunn inneholdende 2,5 ml KB oppløsning ved 35 ± 1 ° C. Vask vev ved forsiktig virvlende røret.
Merk: Tissue strimler vises noe gjennomsiktig og kan klumpe seg sammen på ther poenget. Håndtak veldig forsiktig etter enzymatisk fordøyelse for å unngå å miste celler. - Overfør vevet til den andre liten rund bunn inneholdende 2,5 ml KB ved 35 ± 1 ° C. Swirl forsiktig å vaske.
- Overfør vevet til den tredje liten rund bunn inneholdende 2,5 ml KB ved 35 ± 1 ° C. Swirl forsiktig å vaske.
- Overfør vevet til den store, rund bunn inneholdende 2,5 ml KB ved 35 ± 1 ° C.
- Bruke større flammepolert pipette (figur 1Aiii og figur 1C), distansere cellene i den store rundbunnet rør av konstant finmaling på ca 0,5-1 Hz for 5-10 min, ta vare å holde dissosiasjon rør nedsenket i 35 ± 1 ° C vannbad, og for å unngå innføring av bobler inn i oppløsningen.
Merk: Utgnidning Tiden varierer med diameteren av dissosiasjon pipette og styrken av pipettering. Tid bør justeres slik at vevet stykker resterende ved than enden av dissosiasjon vises tynn, gjennomsiktig og ujevne. Hvis vev beholder en hvilken som helst farge, er den dissosiasjon sannsynlig å være ufullstendig. Frekvens (0,5-1 Hz) bestemmes for hånd. - Fjern rund bunn inneholdende dissosierte Sams ut av vannbadet og i likevekt ved romtemperatur i 5 min.
7. sinusknute Kalsium Re-tilpasning (utføres ved romtemperatur)
MERK: For Sams bestemt for kultur eksperimenter, skal prosedyrene i neste avsnitt skal utføres i et sterilt vev kultur hette. Dersom Sams skal brukes for akutte eksperimenter, er det ikke nødvendig å utføre fremgangsmåten i et sterilt miljø.
- Legg 75 ul av NaCl / CaCl2 tilpasning oppløsning (tabell 2). Swirl forsiktig for å blande og inkuberes i 5 min.
- Legg 160 mL av NaCl / CaCl 2 tilpasning løsning. Swirl forsiktig for å blande og inkuberes i 5 min.
- Legg 390 mL av BSA solution (tabell 2). Swirl forsiktig for å blande og inkuberes i 4 min.
- Legg 1,25 ml BSA løsning. Swirl forsiktig for å blande og inkuberes i 4 min.
- Legg 4,37 ml BSA løsning. Swirl forsiktig for å blande og inkuberes i 4 min.
Merk: Den endelige konsentrasjonen av kalsium vil være 1,8 mm. - Etter kalsium re-tilpasning, samle Sams ved å tillate å bosette av tyngdekraften for ~ 10 min eller ved sentrifugering ved ~ 2000 xg i 3 min.
- For akutt isolerte celler, fjern forsiktig og kastes ca. 5 ml av supernatanten ved hjelp av et glass Pasteur pipette, slik at cellene i et volum på ~ 2 ml. Lagre disse cellene ved romtemperatur i opp til ~ 8 timer for patch clamp opptak.
- For dyrkede celler, fjerne så mye av supernatanten som mulig ved hjelp av en steril glass Pasteur pipette. Resuspender cellepelleten i 1 ml forvarmet (37 ° C) pletteringsmedium (tabell 2).
8. Plating og kultur sinoatriell Myocytes (Hopp for Akutt isolerte celler)
- Fjern laminin løsning fra Dekk fra trinn 3.3 med en Pasteur pipette. Umiddelbart frø 500 mikroliter (~ 50-100 celler) på hver laminin-belagt dekkglass (fra trinn 3).
MERK: kontraktile inhibitor 2,3-butandionmonoksim (BDM) er inkludert i plating og kultur media for å hindre sammentrekning, noe som fører til slitasje av celler 9. - Returnere den 24-brønners plate inneholdende nylig utsådd Sams til inkubatoren og vedlikeholde ved 37 ° C i en atmosfære av 95% luft / 5% CO2. Tillat celler å følge dekk i 4-6 timer i plating media (tabell 2).
- fjerne Plating Medium forsiktig med en steril Pasteur pipette. Bytt ut med 500 mL per brønn av forvarmet (37 ° C) Kultur Medium (tabell 2).
9. Adenoviral Transduksjon av Voksen sinoatriell myocyte kulturer (Hopp for Akutt isolerte celler)
- Anslå antall cells pr dekkglass umiddelbart før påføring adenovirus ved telling av cellene i et synsfelt under et mikroskop, justert for forstørrelse. Tell alle celler, ikke bare Sams.
- Fortynn adenovirus i Medium 199 og justerer fortynningen for den virale titer, slik at anvendelse av 1-10 ul er nødvendig for å oppnå en endelig multiplisitet av infeksjon (MOI) på 100 virale enheter per celle. Legg adenovirus løsning i dråpevis direkte på belagt Sams.
- Inkuber cellene med virusinneholdende medium over natten (~ 12-14 timer). Deretter utveksler med friskt kulturmedium. Opprettholde celler i kuvøse, endre dyrkningsmedium hver 48 time, inntil ønsket protein uttrykket oppnås.
10. Funksjonell Evaluering av Akutt Isolert eller Cultured Sams
MERK: Følgende protokoll er et eksempel på funksjonelle vurderinger av isolerte Sams hjelp av amfotericin perforert-patch teknikk for å spille inn både spontane APs og jeg
- Forbered opptaksløsninger som beskrevet i tabell 3.
- Fremstille en stamløsning av 20 mg / ml amfotericin-B i DMSO frisk på dagen for opptaket. Hold lager ved romtemperatur og beskytte mot lys. Fortynn amfotericin-B lager i intracellulær oppløsning til en endelig konsentrasjon på 200 pg / ml før bruk. Opprettholde den endelige pipette løsning på is og beskytte mot lys.
MERK: amfotericin holdige pipette-løsning for eksperimenter bør fremstilles frisk hver time ved fortynning av en alikvot av stamløsningen inn i det intracellulære løsning og virvling i minst 1 min. - Overføre en alikvot av akutt dissosiert SAM cellesuspensjon eller et fragment av glass dekkglass som bærer dyrket Sams i et registreringskammer inneholdende Tyrodes oppløsning ved 35 ± 1 ° C. Perfuse celler med Tyrodes løsning i minst 2 minutter før elektro recordings for å fjerne eventuell gjenværende BDM gjenværende fra kulturmediet.
MERK: Spontane sammentrekninger bør være tydelig umiddelbart etter overføring til Tyrode løsning. Sams for opptak kan identifiseres ved en kombinasjon av funksjoner, inkludert spontane kontraktile aktivitet, karakteristisk morfologi (f.eks., Figur 2), mangel på striper, uttrykk for HCN4 protein, tilstedeværelse av jeg f strøm, membran kapasitans <50 PF, og spontane APs med bølgeformer som inkluderer en diastolisk depolarisering fase og en langsom upstroke. - Ved hjelp av borsilikatglass pipetter med motstander 1,5-3,0 Megohm, fylle tuppen med intracellulære løsning mangler amfotericin ved å dyppe for 10-30 sek. Deretter tilbake-fyller pipetten med amfotericin-inneholdende løsning. En GΩ celle-bundet tetning skal oppnås så raskt som mulig. Hvis forseglingen formasjonen er vanskelig, øke tip-fill tid.
MERK: Tilgangen motstand bør være kontinuerligovervåkes etter dannelsen av celle festet segl, og opptakene skal bare påbegynnes etter å få en stabil tilgang motstand på <10 Megohm. - For å ta opp spontane APs, slår forsterkeren til rask strøm-klemme modus uten strøm injeksjon.
MERK: 1 nM isoproterenol er inkludert i det ekstracellulære Tyrodes oppløsning ved opptak av aksesspunkter for å stabilisere avfyringshastigheten, som tidligere rapportert 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Protokollene er beskrevet her tidligere har blitt benyttet for å isolere spontant aktive Sams fra voksne mus som er egnet for en rekke forskjellige patch clamp studier 5-8. I tillegg protokollene tillater isolerte Sams som kan opprettholdes i kultur i opptil en uke. Genoverføring inn i de dyrkede celler kan bli oppnådd via adenoviral infeksjon 9. Resultatene som presenteres i dette avsnittet kommer fra vårt tidligere arbeid og er vist her som eksempler på hva som kjennetegner akutt isolerte og kultur Sams.
Som vist i figur 2, kan spontant aktive Sams bli opprettholdt i kultur i opp til 6 dager. De dyrkede celler beholde en samlet morfologi som er svært lik den av akutt isolerte Sams, uten vesentlige endringer i den midlere lengde, bredde, tverrsnittsareal, eller membran kapasitans dyrket-celler sammenlignet med akutt isolerte celler (Figur 2B - E). Det var imidlertid slitasje av antall levedyktige Sams over tid i kultur. Derfor anbefales det at kulturer fremstilles fra sammenslåtte celler fra flere dyr dersom den eksperimentelle design krever omfattende datasett.
Et viktig mål i utviklingen av protokollen for kultur sinoatriell muskelceller fra voksen mus var å lage et system som ville tillate uttrykk for eksogene proteiner i den innfødte cellulære sammenheng med voksen Sams. Et eksempel på denne type protein uttrykk er vist i figur 3 for tilfelle av celler som er infisert med virus som uttrykker fluorescerende markørproteiner GFP og mCherry. Vi fant at proteinekspresjon var tydelig i løpet av 24 timer av adenovirus-infeksjon, og var maksimal for test proteiner i 48 timer (figur 3). En viral MOI på 100 resulterte i nesten 100% infection effektivitet med ingen bevis for cellulær toksisitet. I motsetning til dette, transfeksjon ved hjelp av lipid-baserte reagenser mislyktes i å fremstille i en hvilken som helst detekterbar genoverføring inn i voksen Sams, selv etter 72 timer 9.
Funksjonell karakterisering via patch-clamp elektrofysiologi er kritisk for evaluering av både akutt isolert og kultivert Sams. 4A viser typiske strømklem opptak av spontane aksjonspotensialer registrert fra akutt isolert eller kultivert Sams hjelp av amfotericin perforert-patch opptak konfigurasjon. Aksjonspotensialet bølgeformer som var tilsvarende i akutt isolert og dyrket Sams, og det var ingen forskjell i gjennomsnittlig AP avfyring frekvens (figur 4B).
Jeg f er et kjennetegn på Sams og HCN4 kanaler som produserer jeg f brukes som immunocytokjemiske markører for sinusknute. Derav presence av jeg f i patch clamp opptak kan brukes til å støtte ideen om at cellene er faktisk Sams. Alle de spontant aktive akutte og dyrkede Sams beskrevet heri også oppviste I f> 100 pA som reaksjon på en 1 sek spenningstrinn til -120 mV. For de representative resultater som er vist her, ble celler perfusert med Tyrodes oppløsning inneholdende 1 mM bacl 2 for å blokkere K + strømmer (Tabell 3) og spenningen avhengighet av aktivering av If ble analysert ved 3 sek hyperpolariserer spenningstrinn -60 til -160 mV fra et holdingselskap potensiale på -50 mV, som vi tidligere har beskrevet 5-8. Strømtettheten ble evaluert i respons til 3 sek Hyperpolarizing test pulser til -150 mV fra et holdepotensial på -50 mV. Det var ingen signifikante forskjeller i enten den spennings avhengighet av aktivering av I f or jeg f strømtetthet mellom akutt isolert og dyrket Sams (Figur 4C - D). Disse co-innspillinger av spontane APs og jeg f fra individuelle Sams kreve ca 9 min totalt (inkludert en 2 min første vask, 30-60 sek av spontane APs i strømtang modus, en 2 min løsning endring, og ca 5 min til samle tilstrekkelig spenning klemme data for å beskrive den spennings avhengighet av aktivering av i f). Derav data vist i Figur 4C illustrerer også hvor robust cellen forberedelse.
Figur 1: Disseksjonskurs instrumenter for isolasjon og dissosiasjon av mus Sams (A) i to 10 cm petriskåler som inneholder ~ 25 ml herdet silikonelastomer... Hver tallerken er forhåndslastet med 6-10 små disseksjon nålene for å immobilisere vev. Ii. 100 ml begerglass for å holde Komplett Tyrodes i 35 &# 176;... C vannbad iii Wide (~ 2 mm diameter), brann-polert dissosiasjon pipette iv Narrow (~ 1,5 mm diameter) flammepolert overføringspipetten v plast overføringspipetten for bading forberedelse med Komplett Tyrode er med... heparin. VI. self-åpning mikro saks for interne skjære prosedyrer. vii. fin pinsett (tips størrelse 0,06 x 0,02 mm) for innvendig vev manipulasjon. viii. tissue tang, 5,5 i, 1 x 2 tenner for ekstern vev manipulasjon. ix. buet iris saks 4,3 i for eksterne skjære prosedyrer. (B) Close-up bilder utheving små disseksjon pins plassert i disseksjon parabolen. (C) Close-up bilder utheving flammepolert smal overføringspipetten (til venstre) og brann-polert bred åpning pipette for mekanisk gniing (til høyre). Klikk her for å se et større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Akutt isolert og dyrket Sams er ikke skilles morfologisk A:. Lysfelt bilder av representative Sams enten umiddelbart etter isolering (akutt), eller etter 24 timer, 48 timer, 72 timer, 96 timer, eller 6 dager in vitro B - D : gjennomsnitt (± SEM) maksimal lengde, bredde og tverrsnittsareal for akutt isolert versus 48 timer kultivert Sams E:. Gjennomsnittlig (± SEM) membran kapasitans fra voltage-clamp opptak fra akutt isolert eller kultivert Sams. Alle sammenligninger er ikke signifikante: p> 0,05 vs. akutt. Tilpasset fra referanse 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Adenoviral uttrykk for eksogene proteiner i dyrkede Sams Bright feltet og epifluorescent bilder av representative kultivert Sams som har blitt infisert med en MOI på 100 for adenoviruses uttrykker EGFP (grønn) og mCherry (rød), enten på 24 eller 48 timer etter. dobbel infeksjon. Scale bar = 20 mikrometer. Gjengitt fra referanse 9.
Figur 4: Elektro karakterisering av kultivert Sams A:. Representative nåværende klemme opptak fra akutt isolert (sort) eller kultivert (grå) Sams i Tyrode løsning som inneholder en nM isoproterenol. Skala barer: 40 mV, 100 msek B:. Gjennomsnittlig (± SEM) momentantavfyring frekvens hos akutt isolert (svart; n = 6) eller 48 timer kultivert (grå; n = 14) Sams C:. Normalisert gjennomsnitt (± SEM) konduktans-spenningsforhold for I f i akutt isolert (svart; n = 8) eller kultivert (grå; n = 14) Sams innfellinger:.. representative aktuelle familier fra akutt (svart) eller kultur (grå) Sams utløst av 3 sek hyperpolariserer Testpulsene -60 til -160 mV i trinn på 10 mV D: Gjennomsnittlig ( ± SEM) i f-strømtettheten ved -150 mV i akutt isolert (svart; n = 7) og dyrket (grå; n = 8) Sams. Tilpasset fra referanse 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| komplett Tyrode s | lav Ca 2+ / Mg 2+ Tyrodes | KB Medium | BSA Oppløsning | NaCl / CaCl 2 Adaptation Solution | |
| NaCl | 140 | 140 | 140 | 10 | |
| KCl | 5.4 | 5.4 | 25 | 5.4 | |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.2 | 10 | 1.2 | |
| HEPES | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| glukose | 5,55 | 18.5 | 20 | 5,55 | |
| MgCl2 | 1 | 1 | |||
| CaCl2 | 1.8 0,066 | 1.8 | 1.8 | ||
| taurin | 50 | 20 | |||
| BSA | 1 mg / ml | 1 mg / ml | 1 mg / ml | ||
| K-glutamat | 100 | ||||
| K-aspartat | 10 | ||||
| MgSO4 | 2 | ||||
| kreatin | 5 | ||||
| EGTA | 0.5 | ||||
| pH ble justert til | 7,4 med NaOH | 6,9 med NaOH | 7,2 med KOH | 7,4 med NaOH |
Tabell 1:. dissosiasjon løsninger Komposisjoner av løsninger som brukes i dissosiasjon fra sinusknute muskelceller. Konsentrasjoner er oppgitt i mm, unntatt der det er angitt.
| plating Medium | kultur Medium | |
| Media199 | utgangspunkt | utgangspunkt |
| 2,3-butandionmonoksim (BDM) | 10 mm | 10 mm |
| Føtalt bovint serum (FBS) | 5% | - |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | 0,1 mg / ml | |
| Insulin | 10 ug / ml | |
| transferrin | 5,5 ug / ml | |
| selen | 5 ng / ml | |
| Penicillin | 100 U / ml | 100 U / ml |
| streptomycin | 100 mg / ml | 100 mg / ml |
Tabell 2: platekledning og kultur løsninger Komposisjoner av løsninger som brukes for plating og kultur av sinusknute muskelceller..
| Tyrodes | PP Intracellulær | |
| NaCl | 140 | 5 |
| KCl | 5.4 | 135 |
| Kh 2 PO 4 | 1.2 | |
| HEPES | 5 | 10 |
| glukose | 5,55 | |
| MgCl2 1 | 1 | |
| CaCl2 | 1.8 | 0.1 |
| EGTA | 10 | |
| Mg-ATP | 4 | |
| Amfotericin-B | 200 ug / ml etter behov | |
| isoproterenol | 1 nM etter behov | |
| pH ble justert til | 7,4 med NaOH | 7,2 med KOH |
Tabell 3: Elektro innspillingen løsninger Komposisjoner av ekstracellulært (Tyrodes) og intracellulær (PP) løsninger som brukes for amfotericin perforert-patch opptak fra sinusknute muskelceller..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dette notatet presenterer detaljerte protokoller for isolering og kultur av fullt differensierte sinusknute muskelceller fra voksne mus. Isolasjon protokollen gir pålitelig spontant aktive mus Sams egnet for enten umiddelbar elektrofysiologisk analyse eller etterfølgende kultur. Lignende protokoller har blitt rapportert av mange andre grupper (se for eksempel referanser 11,12,10,13-17). Imidlertid vår protokoll for å holde voksen mus Sams in vitro bevarer den karakteristiske morfologi, spontan aktivitet, og elektrofysiologiske egenskapene til cellene og gjør det mulig for adenoviral levering av proteiner 9.
For modifikasjon og feilsøking av protokollene, bør noen viktige skritt noteres. Den første kritiske faktoren er en betydelig masse-til-mange variasjoner i aktiviteten av oppslutnings enzymer (trinn 1.4), som kan dramatisk endre antallet og kvaliteten av Sams isolert i et gitt preparasjon. Denne variasjonen er spesielt sant for elastase, som typisk krever mye spesifikke optimalisering, hvor konsentrasjonen og eksponeringstider bør eksponeringer i løpet av flere preparater (ofte gjort i parallell) for å maksimalisere cellenummer og helse. Noen protokoller for isolering av Sams fra ulike arter bruke individuelle collagenase og protease enzymer i stedet for kollagenase-protease enzym blanding i denne protokoll. Imidlertid er det mange-til-mange variasjoner for hver av disse enzymene relativt høy (lik som elastase), nødvendiggjør gjentatte runder med co-optimalisering. Enzymet blanding gir mer konsistens på tvers av mange og krever færre optimalisering trinn.
En annen kritisk, og ikke nærliggende, faktor for feilsøking av SAM isolasjon er integriteten til brann-polert glass dissosiasjon pipette (figur 1C). Hvis kanten av pipetten inneholder noen skarpe kanter, sprekker eller akkumulert cellular rusk, kan den mekaniske utgnidning trinnet skade cellene, noe som resulterer i kalsium toksisitet. Brannen polert dissosiasjon pipette bør skiftes minst hver 2 måneder med regelmessig bruk, eller når som helst at cellen utbytte eller kvalitet avtar markert i løpet av flere preparater.
Tidspunktet og kraften av den mekaniske dissosiasjon er en tredje avgjørende skritt for feilsøking av isolasjon protokollen. Den finmaling krever langsom (ca. 0,5-1 Hz), men kraftig turbulens i 5-10 min. Raskere priser og redusert tider kan også anvendes, men det er viktig å unngå innføring av bobler eller generering av skum i oppløsningen. Når sinusknute prøvene har vært fullt dissosiert, bør de gjenværende vev strimler vises pistrete og hvit i fargen; subtil rosa-ish farge indikerer ufullstendig finmaling. Når undersøkt ved 200-400X forstørrelse, celler fra optimalt forberedt prøvene har glatte cellemembraner, mens celle medlRanes fra over-fordøyd eller over-gnidd prøvene har et krater og tverrstripet utseende. I friske celler, blir kontraksjoner observert primært som subtil rykning av endene av cellene. Bølger av sammentrekning er et tegn på skadede celler, som kan observeres til kontrakt kraftig i en kort tid, før balling-up. En sprukket dissosiasjon pipette er den vanligste årsaken til slike celleskade. I prøver som har vært under-fordøyd eller under-utgnidd, celler er til stede som klumper eller aggregater i stedet for enkeltceller, og et betydelig antall for å pådra Sams kan observeres i de gjenværende vev biter.
Hver bruker må individuelt optimalisere dissosiasjon. Selv om den enzymatiske fordøyelse og mekanisk dissosiasjon tider bør begge justeres, anbefales det først å holde den enzymatiske fordøyelse tidskonstant, mens den endrer dissosiasjon tid. Ytterligere finjustering bygger hovedsakelig på brukerens å gjenkjenne en mulighetppearance av vevet stykkene igjen ved gjennomføring av triturering - når bitene er ujevne og hvitaktig farge, og deretter utgnidning bør stoppes. Optimalisering er også nødvendig for å imøtekomme variasjoner i sinusknute som følger forskjeller i alder, kjønn, eller stamme av mus. For eksempel, dissosiasjon av celler fra eldre dyr 7 krever reduksjon i både enzymatisk oppslutning og mekanisk dissosiasjon ganger. Som en generell retningslinje, en typisk preparat fra en 2-3 måneder gammel mannlig C57BL / 6 mus gir omtrent 50-200 levedyktig SAMS, hvorav kanskje 5-10 kan være vellykket patch-klemmes på en god dag sesjon, avhengig av eksperimentene . Utbyttet er betydelig (~ 30%) lavere når eldre mus brukes 7.
Suksessen av kulturen protokollen er også avhengig av noen viktige skritt. Fremst, suksessen av en primær cellekultur krever en høy kvalitet dissosiasjon, som diskutert ovenfor. Det anbefales thved akutt isolerte cellepreparat optimaliseres før forsøker å opprettholde cellene i kultur. En annen kritisk faktor for dyrkede celler ligger i valget av celler for elektrofysiologiske opptak. For best resultat, bør kultur Sams valgt for opptak stille spontane sammentrekninger umiddelbart ved utvasking av BDM holdig dyrkingsmedium. En langsom utbruddet av spontane sammentrekninger ved utvasking av BDM er et tegn på usunn celler.
SAM kultursystemet har noen begrensninger, særlig den meget lille størrelsen på mus SAN. Mens metodene vist her gir mulighet for tilstrekkelig celle tall for elektrofysiologiske og bildediagnostikk, den begrensede mengden vev utelukker biokjemiske analyser av kultivert Sams. En annen begrensning av teknikken er at Sams må være dyrket i nærvær av den reversible myosin ATPase-inhibitor, BDM. Dette er et potensielt problem fordi BDM har andre cellulære effekter, inkludertikke-spesifikk fosfatase-aktivitet, inhibering av hjertetranskripsjonsfaktorer 19, og hemming av natriumkanaler, kalsiumkanaler og ryanodine reseptorer 20. Men dataene viser at BDM har minimal effekt på morfologiske og elektrofysiologiske egenskapene til Sams analysert her.
I fremtidige anvendelser, virker det sannsynlig at metodene som er skissert her kan tilpasses for å forberede SAM kulturer fra større pattedyr. I kombinasjon med adenovirus genoverføring, kan slike kulturer tillate genetiske manipulasjoner av pacemaking i store dyremodeller. Evnen til å innføre proteiner av interesse tilveiebringer også for fremtidige anvendelser hvor genetisk kodede reportermolekyler kan anvendes for å sondere intracellulære signalveier i Sams.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 |
References
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D.
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
