Summary
Methoden worden gedemonstreerd voor de isolatie van de sinusknoop myocyten (SAM) van volwassen muizen voor patch clamp elektrofysiologie of imaging studies. Geïsoleerde cellen kunnen direct worden gebruikt of kunnen in kweek worden gehandhaafd expressie van eiwitten van belang, zoals genetisch gecodeerde reporters mogelijk.
Abstract
Sinusknoop myocyten (SAM) op te treden als de natuurlijke pacemaker van het hart, het initiëren van elke hartslag door het genereren van spontane actiepotentialen (AP). Deze pacemaker AP's weerspiegelen de gecoördineerde activiteit van de vele stromingen membraan en intracellulaire calcium fietsen. Maar de precieze mechanismen die spontane pacemaker activiteit rijden in SAM blijven ongrijpbaar. Acuut geïsoleerde SAMs een essentiële voorbereiding experimenten om de moleculaire basis van cardiale pacemaking ontleden. Echter, de onduidelijke anatomie, complex microdissectie en pietluttige enzymatische afbraak voorwaarden wijdverbreide gebruik van acuut geïsoleerde SAM voorkomen. Bovendien, methoden niet beschikbaar waren tot voor kort tot langere termijn de cultuur van SAM toe te staan voor eiwitexpressie studies. Hier geven we een stap-voor-stap protocol en video demonstratie voor de isolatie van monolagen van volwassen muizen. Een werkwijze is ook aangetoond voor behoud volwassen muis SAMs in vitro en expressieen van exogene eiwitten via adenovirale infectie. Acuut geïsoleerd en gekweekt monolagen bereid via deze werkwijzen zijn geschikt voor een verscheidenheid van elektrofysiologische en imaging studies.
Introduction
Pacemaker myocyten in de sinusknoop van het hart (sino-atriale myocyten "SAM") genereren spontane ritmische actiepotentialen (AP's) die zich voortplanten door het myocardium elke hartslag in te leiden. Experimenten met acuut SAMs geïsoleerd van vele soorten zijn essentieel voor opheldering van mechanismen die bijdragen tot het genereren van pacemaker activiteit. SAMs zijn zeer gespecialiseerde hartspiercellen die aanzienlijk verschillen van hun tegenhangers in de atriale en ventriculaire myocardium qua morfologie, functie en eiwitexpressie. Het kenmerk van spontane AP SAMs in een spontane depolarisatie tijdens diastole dat de membraanpotentiaal drijft drempelwaarden aan de volgende AP 1,2 veroorzaken. Deze "pacemaker potentieel" hangt af van de gecoördineerde activiteit van de vele verschillende stromingen membraan met inbegrip van de "funny huidige" (I f), T- en L-type calcium stromingen, en de natrium-calciumuitwisselaar current (I NCX), die wordt aangedreven door Ca2 + vrijstelling uit het sarcoplasmatisch reticulum 3,4.
Terwijl acuut geïsoleerde muis SAMs vormen een essentieel experimentele opstelling voor de studie van pacemaking, kan de isolatie van SAMs van muizen een uitdagende methode te nemen omdat de onduidelijke anatomie en de geringe afmetingen van de muis SAN een genuanceerd microdissectie en de gecombineerde enzymatische en mechanische vereist dissociatie van de cellen vereist een zorgvuldige optimalisatie.
Wij bieden hier een gedetailleerde video demonstratie van een protocol dat met succes is gebruikt om de SAM isoleren van volwassen muizen voor patch clamp opnames 5-8. Voor zover wij weten, is er geen dergelijke visuele bewijs beschikbaar uit een andere bron. Daarnaast wordt een nieuwe methode gedemonstreerd waarbij SAMs geïsoleerd uit volwassen muizen in vitro kan worden gehandhaafd gedurende enkele dagen, waardoor de introductie van eiwitten toelaten, genetisch gecodeerdereporter moleculen of RNAi via adenovirale infectie 9.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met protocollen door de Institutional Animal Care en gebruik Comite van de Universiteit van Colorado Anschutz Medical Campus goedgekeurd. Het standaardprotocol hieronder is geoptimaliseerd met gebruikmaking van mannelijke C57BL / 6J muizen van 2-3 maanden oud.
1. Bereid Solution Voorraden en Supplies in Advance of Experiments
OPMERKING: Raadpleeg Materialen Tabel voor de noodzakelijke apparatuur en benodigdheden.
- Bereid 1 L elk van de volgende oplossingen zoals vermeld in Tabel 1: Volledige Tyrode, Laag Ca2 + / Mg2 + Tyrode's Modified Kraft-Brühe (KB) oplossing, en runderserumalbumine (BSA) oplossing. Gebruik ultrapuur gefilterd gedemineraliseerd water voor alle oplossingen. Verdeel elke oplossing in 50 ml porties en bewaar bij 20 ° C gedurende tot zes maanden. Ontdooi aliquot onmiddellijk voor experimenten en opslaan gedurende maximaal één week op 46; C.
- Bereid 50 ml 10 mM NaCl en 1,8 mM CaCl 2 Aanpassing oplossing door oplossen NaCl en CaCl2 in ultrazuiver gefilterd gedeïoniseerd water (tabel 1). Bewaar bij kamertemperatuur gedurende maximaal zes maanden.
- Bereid 4,75 enzymunit (U) monsters van elastase door pipetteren in microfugebuizen. Bewaar bij 4 ° C gedurende maximaal drie maanden.
- Bereid 375 ug aliquots (in ultrapuur H 2 O) collagenase-protease mengsel pipetteren in microfugebuizen. Bewaar bij -20 ° C gedurende maximaal drie maanden.
- Bereid twee brand gepolijste Pasteur pipetten, een voor weefsel overdracht (~ 1,5 mm uiteindelijke openingsdiameter Figuur 1Aiv en figuur 1C) en een voor dissociatie (~ 2 mm diameter Figuur 1Aiii en figuur 1C).
- Score Pasteur pipetten met een glazen mes en snap langs de score een opening groter dan de gewenste grootte te produceren. Brand-Pools de cut einde van elke pipet voor ~ 30-60 sec boven een kleine vlam op een bunsenbrander tot een dikke gepolijste muur en een opening van de gewenste diameter te produceren. Zorg ervoor dat de brand gepolijst opening vrij is van scheuren of ruwe randen.
- Bereid twee dissectie gerechten door het toevoegen van ~ 25 ml siliconenelastomeer gemengd volgens de aanwijzingen van de fabrikant voor elke 100 mm petrischaal (Figuur 1ai en figuur 1B). Laten uitharden bij kamertemperatuur gedurende 48 uur.
- Voor cultuur alleen: bereiden 25-50 ml elk Plating Medium and Culture Medium volgens tabel 2 Store voor maximaal twee weken bij 4 ° C..
2. Bereid Solutions om gebruikt te worden op de dag van de Cel Isolatie
OPMERKING: De volgende bedragen zijn voor isolatie van sinoatrial myocyten van de ene muis.
- Voeg 2,5 ml Laag Ca2 + / Mg2 + Tyrode (pH 6,9) aan elk van drie kleine, rondbodem kweekbuiss. Plaats de buisjes in 35 ± 1 ° C waterbad.
- Voeg 2,5 ml van Low Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode om een grote ronde bodem cultuur buis. Om deze buis, voeg 1 portie (4,75 U) elastase en een aliquot (375 ug) collagenase-protease-enzym mengsel. Swirl te mengen. Plaats de buis in 35 ± 1 ° C waterbad.
- Voeg 2,5 ml KB Middelgrote tot drie extra kleine, ronde bodem cultuur buizen en een extra grote, ronde bodem cultuur buis. Plaats de buisjes in 35 ± 1 ° C waterbad.
- Voeg ~ 7 ml BSA oplossing voor een grote bottomed cultuur buis. Houd deze buis bij kamertemperatuur.
- Plaats 20-40 ml oplossing Compleet Tyrode in een 50 ml bekerglas (figuur 1Aii). Voeg 10 USP / ml heparine, werveling te mengen, en zet de beker in de 35 ± 1 ° C waterbad.
3. Bereid Extra Solutions en Materialen voor gekweekte cellen (Sla deze stappen voor acuut geïsoleerde cellen)
- In een steriele weefselkweek kap, plaats twee 12 mm ronde glazen dekglaasjes per muis in individuele putjes van een 24-wells plaat.
OPMERKING: De plaat met 24 putjes wordt gebruikt omdat de putjes een geschikte afmeting, die dient om het volume voor daaropvolgende virale infecties beperken. - Pipetteer ongeveer 200 ul van een 100 ng / ml oplossing van laminine muis verdund in steriele fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) op elk dekglaasje.
- Incubeer dekglaasjes met laminine voor de duur van de isolatie (minimaal 1 uur) in een incubator bij 37 ° C.
- Voorverwarmen het plaatmedium en kweekmedium (uit stap 1.7 en Tabel 3) tot 37 ° C.
4. sinusknoop Isolation
- In een chemische zuurkast, plaats een muis in een kamer van een twee-kamer doos en verdoven met ~ 200 ul vloeibare isofluraan ingebracht via een wattenstaafje in de andere kamer. Bevestig anesthesie (meestal binnen ~ 30-60 sec) met een teen knijpen. euthanaserenmuis door cervicale dislocatie.
Opmerking: Een lege 1 ml pipetpunt box kan worden gebruikt om de doos twee-kamer te vormen; zet het rek op zijn kop in het vak aan de apart vak te creëren voor de isofluraan om de muis te voorkomen dat rechtstreeks in contact te brengen. - Verwijder bont van de borst met een schaar en transect ribbenkast naar de borstholte met behulp van externe weefsel pincet (Figuur 1Aviii) en dissectie schaar (figuur 1Avix) bloot te leggen. Baden de borstholte met ~ 2 ml met heparine met behulp van een overdracht pipet opgewarmd Compleet Tyrode.
OPMERKING: Verder baden borstholte wanneer dat nodig is, niet toestaan dat de voorbereiding te drogen. - Onder een microscoop ontleden, verwijder voorzichtig de longen en thymus met behulp van interne schaar (figuur 1Avi) en dissectie pincet (Figuur 1Avii).
- Terwijl die zacht de apex van het hart met de interne dissectie pincet voorzichtig snijd de onderste vena cava en eenorta met de interne schaar om het hart van de borstholte te verwijderen. Breng het hart van een van de siliconen dissectie gerechten en baden met ~ 4 ml gehepariniseerd opgewarmd Volledige Tyrode met behulp van de pipet.
- Orient het hart zodanig dat het achterste schepen zijn zichtbaar en naar boven, met de rechter atrium van het dier aan de rechterkant van de experimentator en de linker atrium aan de linkerkant van de experimentator. Eenmaal georiënteerd immobiliseren het hart door pinning door de apex in de silicone dissectie gerecht.
- Zoek de groef tussen de ventrikels en de atria (wis ring boven de ventrikels).
- De interne dissectie schaar, een insnijding in de groef, waarbij dichterbij dan de ventrikels de atria. Spoel de groove en insnijding met extra opgewarmd gehepariniseerde Compleet Tyrode als nodig is om een duidelijk beeld van de atria en de kleppen mogelijk te maken. Verder langs de groef te snijden om de atria scheiden van de ventrikels.
- Breng de atriale weefsel om de tweede siliconen dissectie gerecht en baden met ~ 3 ml opgewarmd gehepariniseerde Compleet Tyrode.
- Orient het weefsel, zodat rechterboezem van het dier is nu aan de linkerkant van de experimentator, en de linker atrium is aan de rechterkant.
OPMERKING: De rechter atrium is transparanter, terwijl de linker atrium heeft meer van een donker rode tint. - Speld de weefsel door de lagere en bovenste holle ader en de rechter en linker atriale aanhangsels, strekken de bereiding zachtjes. Verwijder alle resterende vet of ander weefsel een duidelijk beeld van het preparaat (let op niet in de atriale wand snijden, de sinusknoop heel gevoelig en kunnen gemakkelijk worden beschadigd) toe.
- Open de voorste wand van de atria van het snijden door de holle ader. Re-positie van de pinnen als nodig is om de boezemtussenschot visualiseren.
- Knip langs de boezemtussenschot naar links atrium te verwijderen. Re-speld de voorbereiding, stretching voorzichtig.
- Verwijder thij gelijk hartoor en bevrijden de sinusknoop door te snijden langs de cristae terminalis, die verschijnt als een donker oranje streep grenst aan het hartoor.
- Re-speld de nodale weefsel en snijd het lateraal (loodrecht op de crista terminalis) tot drie even grote strips produceren.
5. sinusknoop Spijsvertering
- Met de smalle vuur gepolijste pipet (figuur 1Aiv), breng de drie stroken sinusknoop weefsel in de eerste van drie kleine, ronde bodem buis met 2,5 ml laag Ca2 + / Mg2 + Tyrode in de 35 ± 1 ° C waterbad. Incubeer gedurende 5 min.
- Overdracht weefselstrips de tweede kleine, ronde bodem buis met 2,5 ml laag Ca2 + / Mg2 + Tyrode in de 35 ± 1 ° C waterbad met dezelfde smalle pipet. Was het weefsel strips door voorzichtig zwenken de buis of door voorzichtig pipetteren met de smalle pipet. Niet invert de buis.
- Transfer weefsel strips naar de derde kleine, ronde bodem buis met 2,5 ml lage Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode, en herhaal de wasstap in stap 5.2 beschreven.
- Transfer strips in de grote ronde bodem buis met 2,5 ml van een lage Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode met enzymen (elastase plus collagenase-protease blend) in de 35 ° C waterbad. Zorg ervoor dat alle drie weefsel strips aanwezig zijn. Incubeer 10-15 minuten bij 35 ± 1 ° C. Meng elke 5 minuten onder voorzichtig schudden de buis. Niet keren de buis.
6. sinusknoop Myocyte Dissociatie
- Na enzymdigestie Gebruik de smalle vuur gepolijste pipet om de weefselstrips zacht overdracht aan de eerste kleine, ronde bodem buis met 2,5 ml KB-oplossing bij 35 ± 1 ° C. Was weefsel door voorzichtig schudden de buis.
Opmerking: Tissue strips zullen enigszins doorschijnend verschijnen en kunnen samenklonteren bij This punt. Behandel heel voorzichtig na enzymatische afbraak te voorkomen dat cellen. - Breng het weefsel aan de tweede kleine ronde bodem buis met 2,5 ml KB bij 35 ± 1 ° C. Roer voorzichtig te wassen.
- Breng het weefsel om de derde kleine ronde bodem buis met 2,5 ml KB bij 35 ± 1 ° C. Roer voorzichtig te wassen.
- Breng het weefsel om de grote, ronde bodem buis met 2,5 ml KB bij 35 ± 1 ° C.
- Met de grotere vuur gepolijste pipet (figuur 1Aiii en figuur 1C), dissociëren de cellen in de grote ronde bodem buis door trituratie constant op ongeveer 0,5-1 Hz gedurende 5-10 min, zorg ervoor dat de dissociatie buis ondergedompeld in het houden 35 ± 1 ° C waterbad en te voorkomen dat er luchtbellen in de oplossing.
Opmerking: Wrijven varieert met de diameter van de dissociatie pipet en de kracht van pipetteren. Tijd moet worden ingesteld, dat het weefsel delen die bij tHij eind van de dissociatie verschijnen dunne, transparante en piekerig. Als weefsel behoudt elke kleur, de dissociatie waarschijnlijk onvolledig zijn. Frequentie (0,5-1 Hz) wordt bepaald met de hand. - Verwijder ronde bodem buis met SAMs gedissocieerd uit het waterbad en equilibreren bij kamertemperatuur gedurende 5 min.
7. sinusknoop Calcium Re-aanpassing (uitgevoerd bij kamertemperatuur)
LET OP: Voor SAM voor cultuur experimenten bestemd, moeten de procedures in de volgende sectie worden uitgevoerd in een steriele weefselkweek kap. Als SAMs worden gebruikt voor acute experimenten, is het niet nodig om deze stappen in een steriele omgeving.
- Voeg 75 ul van NaCl / CaCl2 aanpassing oplossing (Tabel 2). Roer voorzichtig te mengen en incubeer gedurende 5 min.
- Voeg 160 ul NaCl / CaCl2 aanpassing oplossing. Roer voorzichtig te mengen en incubeer gedurende 5 min.
- Voeg 390 gl BSA solution (Tabel 2). Roer voorzichtig te mengen en incubeer gedurende 4 min.
- Voeg 1,25 ml BSA oplossing. Roer voorzichtig te mengen en incubeer gedurende 4 min.
- Voeg 4,37 ml BSA oplossing. Roer voorzichtig te mengen en incubeer gedurende 4 min.
Opmerking: De uiteindelijke concentratie van calcium wordt 1,8 mM. - Naar aanleiding van calcium re-aanpassing, het verzamelen van SAM door toe te staan om zich te vestigen door de zwaartekracht voor ~ 10 min of door centrifugeren bij ~ 2000 xg gedurende 3 min.
- Voor acuut geïsoleerde cellen voorzichtig verwijdert en weggooit ongeveer 5 ml van de supernatant met een glazen Pasteur pipet, waardoor cellen in een volume van ~ 2 ml. Bewaar de cellen bij kamertemperatuur gedurende maximaal 8 uur ~ patch clamp.
- Voor gekweekte cellen, verwijder zoveel van de supernatant mogelijk met een steriele glazen Pasteur pipet. Hersuspenderen celpellet in 1 ml voorverwarmde (37 ° C) Plating Medium (tabel 2).
8. Plating en Cultuur van sinuatriale Myocyten (Sla voor acuut geïsoleerde cellen)
- Verwijderen laminine oplossing uit stap dekglaasjes van 3,3 met een Pasteur pipet. Onmiddellijk zaad 500 ui (50-100 cellen) op beide laminine beklede dekglaasje (van stap 3).
OPMERKING: De contractiele remmer 2,3- butaandion monoxime (BDM) is opgenomen in de platen en kweekmedia contractie, die attritie cellen 9 veroorzaakt voorkomen. - Zet de 24-well plaat met nieuw geplaatste SAMs naar de incubator en handhaven op 37 ° C in een atmosfeer van 95% lucht / 5% CO2. Een cel in staat zich te houden aan dekglaasjes voor 4-6 uur in plating media (tabel 2).
- Verwijder voorzichtig Plating Medium met een steriele Pasteur pipet. Vervangen door 500 gl per putje van voorverwarmde (37 ° C) kweekmedium (tabel 2).
9. Adenovirale Transductie van Adult sinoatriale Myocyte Cultures (Sla voor acuut geïsoleerde cellen)
- Schatting aantal cells per dekglaasje onmiddellijk voordat adenovirus door het tellen van de cellen in een gezichtsveld onder een microscoop, correctie voor vergroting. Tel alle cellen, niet alleen SAM.
- Verdun adenovirus in Medium 199 en stel de verdunning van het virale titer zodat toepassing van 1-10 gl is vereist om een uiteindelijke multipliciteit van infectie (MOI) van 100 virale eenheden per cel bereikt. Voeg adenovirale oplossing in een druppelsgewijze direct op vergulde SAM.
- Incubeer cellen met het virus bevattende medium 's nachts (~ 12-14 uur). wisselen daarna met vers kweekmedium. Handhaaf cellen in incubator, veranderende cultuur medium elke 48 uur, tot de gewenste eiwit expressie wordt verkregen.
10. Functionele Evaluatie van acuut geïsoleerde of gekweekte SAM
Opmerking: Het volgende protocol is een voorbeeld van functionele beoordeling van geïsoleerde SAMs met het amfotericine geperforeerde-patch techniek om zowel spontaan AP en I opnemen
- Bereid opname bereid zoals vermeld in Tabel 3.
- Bereid een voorraadoplossing van 20 mg / ml amfotericine-B in DMSO vers op de dag van opname. Houd voorraad bij kamertemperatuur en bescherming tegen licht. Verdun amfotericine-B aandelen in intracellulaire oplossing tot een eindconcentratie van 200 ug / ml juist voor gebruik. Handhaving van de laatste pipet oplossing op ijs en bescherming tegen licht.
OPMERKING: De amfotericine bevattende pipet oplossing experimenten moet vers uur door het verdunnen van een monster van de voorraadoplossing in de intracellulaire oplossing en vortexen gedurende ten minste 1 min worden bereid. - Breng een hoeveelheid van acuut gedissocieerde celsuspensie SAM of een fragment van glazen dekglaasje voorzien gekweekt SAMs een opname kamer bevattende oplossing Tyrode bij 35 ± 1 ° C. Perfuseren cellen met Tyrodes oplossing gedurende ten minste 2 minuten voor elektrofysiologische recordings om eventuele resten BDM overgebleven uit kweekmedium te verwijderen.
OPMERKING: Spontane contracties moet duidelijk zijn onmiddellijk na overdracht aan de oplossing van de Tyrode. SAM voor opnames, kan worden geïdentificeerd door een combinatie van eigenschappen waaronder spontane contractiele activiteit kenmerkende morfologie (bijv. Figuur 2), gebrek aan strepen, expressie van HCN4 eiwit, aanwezig If stroom, membraancapaciteit <50 pF en spontane AP met golfvormen dat een diastolische depolarisatie fase en een langzame opgaande slag bevatten. - Met behulp van borosilicaatglas pipetten met weerstanden van 1,5-3,0 MQ, vul de tip met intracellulaire oplossing ontbrak amfotericine door dompelen gedurende 10-30 sec. Dan back-vul de pipet met de amfotericine bevattende oplossing. Een GQ-cel bevestigd afdichting moet zo snel worden verkregen mogelijk. Als afdichting formatie moeilijk is, verhoogt u de tip-fill tijd.
NB: De toegang weerstand moet continu wordenbewaakt na de vorming van de cel bevestigd seal, en opnames mogen alleen worden begonnen na het behalen van een stabiele toegang weerstand van <10 MQ. - Om spontane AP's op te nemen, schakelt de versterker snel stroom-clamp mode met geen stroom injectie.
Opmerking: 1 nM isoproterenol is opgenomen in de extracellulaire oplossing Tyrode bij het opnemen AP de vuursnelheid te stabiliseren, zoals eerder vermeld 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven protocollen zijn eerder gebruikt voor het isoleren zichzelf actief SAMs van volwassen muizen die geschikt zijn voor een grote verscheidenheid patch clamp studies 5-8. Bovendien, de protocollen zorgen voor geïsoleerde SAMs die in kweek gedurende maximaal een week kan worden gehandhaafd. Genoverdracht in de gekweekte cellen kan worden bewerkstelligd via adenovirale infectie 9. De in dit deel de resultaten voort uit onze eerdere werk en worden hier getoond als voorbeelden van de kenmerken van acuut geïsoleerd en gekweekt SAM.
Zoals getoond in figuur 2, kan zichzelf actief SAMs in kweek worden gehandhaafd tot 6 dagen. De gekweekte cellen behouden een algehele morfologie die sterk lijkt op die van acuut geïsoleerde SAMs, zonder significante veranderingen in de gemiddelde lengte, breedte doorsnedeoppervlak of membraancapaciteit gekweektecellen in vergelijking met acuut geïsoleerde cellen (Figuur 2B - E). Er was echter slijtage van het aantal levensvatbare SAMs tijd in kweek. Daarom wordt aanbevolen culturen worden bereid uit samengevoegde cellen van verschillende dieren als proefopzet grote datasets vereist.
Een belangrijk doel bij de ontwikkeling van het protocol voor cultuur van sino-atriale myocyten van volwassen muizen werd een systeem dat de expressie van exogene eiwitten in de natieve cellulaire context volwassen SAMs zou mogelijk maken. Een voorbeeld van een dergelijke eiwitexpressie wordt getoond in Figuur 3 in het geval van cellen die geïnfecteerd zijn met virussen die de fluorescente merker eiwit GFP en mCherry. We vonden dat eiwitexpressie bleek duidelijk binnen 24 uur van adenovirale infectie en was maximaal voor de test eiwitten binnen 48 uur (figuur 3). Virale MOI van 100 resulteerde in bijna 100% infeel efficiency met geen bewijs van cellulaire toxiciteit. Daarentegen transfectie middels lipide-gebaseerde reagentia niet produceren detecteerbare genoverdracht in volwassen SAMs, zelfs na 72 uur 9.
Functionele karakterisatie via patch-clamp elektrofysiologie is van cruciaal belang voor de evaluatie van zowel acuut geïsoleerd en gekweekt SAM. Figuur 4A toont typische stroom-clamp opnames van spontane actiepotentialen opgenomen van acuut geïsoleerde of gekweekte SAM met behulp van de amfotericine geperforeerde-patch opname configuratie. Actiepotentiaal golfvormen waren vergelijkbaar in acuut geïsoleerde en gekweekte monolagen en er was geen verschil in de gemiddelde AP aanslagsnelheid (figuur 4B).
If is een kenmerk van SAM en de kanalen die HCN4 If produceren worden gebruikt immunocytochemische merkers van de sinusknoop. Vandaar de presence van If patch clamp kan worden gebruikt om het idee dat de cellen in feite SAMs ondersteunen. Alle spontaan actieve acute en gekweekt SAMs hierin beschreven vertoonden ook If> 100 pA in reactie op een 1 seconde spanning stap -120 mV. Voor de hier getoonde representatieve resultaten werden cellen geperfuseerd met Tyrodes oplossing die 1 mM BaCl2 K + -stromen (tabel 3) en de spanningsafhankelijkheid van activering van If blokkeren werd bepaald door 3 sec hyperpolariserende voltage stappen van -60 tot -160 mV van een bedrijf potentieel van -50 mV, zoals we al eerder beschreven 5-8. De huidige dichtheid werd geëvalueerd in reactie op 3 sec hyperpolarizing testpulsen aan -150 mV van een bedrijf potentieel van -50 mV. Er waren geen significante verschillen in zowel de voltage-afhankelijkheid van de activering van If of de If stroomdichtheid tussen acuut geïsoleerd en gekweekt monolagen (Figuur 4C - D). Deze co-opnames van spontane AP's en ik f van individuele SAM's vereisen ongeveer 9 minuten in totaal (met inbegrip van een 2 min initiële wassen, 30-60 sec spontane AP's in de huidige klem mode, een 2 min oplossing verandering, en ongeveer 5 min naar verzamelen voldoende spanning klem gegevens naar het voltage-afhankelijkheid van de activering van I f) te beschrijven. Vandaar de in figuur 4C gegevens illustreren ook de robuustheid van het celpreparaat.
Figuur 1: Dissection instrumenten voor de isolatie en scheiding van SAMs muis (A) i Twee 10 cm platen met ~ 25 ml siliconen elastomeer... Elk gerecht is voorgeladen met 6-10 kleine dissectie pinnen voor het immobiliseren van weefsel. Ii. Bekerglas van 100 ml voor het houden Compleet Tyrode in de 35 &# 176;... C waterbad iii Wide (~ 2 mm diameter), brand-gepolijst dissociatie pipet iv Narrow (~ 1,5 mm diameter) brand-gepolijst pipet overdracht v Plastic overdracht pipet om te zwemmen voorbereiding met Compleet Tyrode met... heparine. vi. Zelfopenende micro schaar voor interne snijden procedures. vii. Fijn pincet (formaat tip 0,06 x 0,02 mm) voor de interne weefsel manipulatie. viii. tissue tang, 5,5, 1 x 2 tanden voor externe weefsel manipulatie. ix. gebogen iris schaar 4.3 voor externe snijden procedures. (B) Close-up foto markeren kleine dissectie pinnen geplaatst in dissectie schotel. (C) Close-up foto markeren brand gepolijst smalle overdracht pipet (links) en vuur-gepolijst pipet met brede opening voor de mechanische trituratie (rechts). Klik hier om een grotere versio bekijkenn van deze figuur.
. Figuur 2: Acuut geïsoleerd en gekweekt SAMs morfologisch onderscheiden A:. Helderveld beelden van representatieve monolagen hetzij onmiddellijk na isolatie (acuut) of na 24 uur, 48 uur, 72 uur, 96 uur of 6 dagen in vitro B - D : gemiddelde (± SEM) maximale lengte, breedte en doorsnede gebied voor acuut geïsoleerd versus 48 uur gekweekt SAM E:. average (± SEM) membraan capaciteit van voltage-clamp opnamen van acuut geïsoleerde of gekweekte SAM. Alle vergelijkingen zijn niet significant: p> 0,05 versus acute. Aangepast van referentie-9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Adenovirale expressie van exogene eiwitten in gekweekte monolagen helderveld en epifluorescerende beelden van representatieve gekweekte monolagen die werden geïnfecteerd bij een MOI van 100 adenovirussen expressie eGFP (groen) en mCherry (rood), hetzij op 24 of 48 uur na. dubbele infectie. Schaal bar = 20 micrometer. Overgenomen uit referentie 9.
Figuur 4: Elektrofysiologische karakterisatie van gekweekte SAM A:. Vertegenwoordiger huidige clamp opnames van acuut geïsoleerd (zwart) of gekweekte (grijs) SAMs in oplossing Tyrode met 1 nM isoproterenol. Schaal bars: 40 mV, 100 msec B:. Average (± SEM) ogenblikkelijkeafvuren frequentie in acuut geïsoleerde (zwart; n = 6) of 48 uur gekweekt (grijs; n = 14) SAMs C. De genormaliseerde gemiddelde (± SEM) conductantie-voltage relaties voor If in acuut geïsoleerde (zwart; n = 8) of gekweekte (grijs; n = 14) SAMs Insets:.. vertegenwoordiger huidige families van acute (zwart) of gekweekte (grijs) SAMs uitgelokt door 3 sec hyperpolarizing testpulsen van -60 tot -160 mV in stappen van 10 mV D: Average ( ± SEM) If stroom dichtheid bij -150 mV in acuut geïsoleerde (zwart; n = 7) en gekweekt (grijs; n = 8) SAMs. Aangepast van referentie-9. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| compleet Tyrode's | lage Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode | KB Medium | BSA Solution | NaCl / CaCl2 aanpassing Solution | |
| NaCl | 140 | 140 | 140 | 10 | |
| KCl | 5.4 | 5.4 | 25 | 5.4 | |
| KH 2 PO 4 | 1.2 | 1.2 | 10 | 1.2 | |
| HEPES | 5 | 5 | 5 | 5 | |
| glucose | 5.55 | 18.5 | 20 | 5.55 | |
| MgCl2 | 1 | 1 | |||
| CaCl2 | 1.8 0,066 | 1.8 | 1.8 | ||
| taurine | 50 | 20 | |||
| BSA | 1 mg / ml | 1 mg / ml | 1 mg / ml | ||
| K-glutamaat | 100 | ||||
| K-aspartaat | 10 | ||||
| MgSO4 | 2 | ||||
| creatine | 5 | ||||
| EGTA | 0.5 | ||||
| pH bijgesteld tot | 7,4 met NaOH | 6.9 met NaOH | 7,2 met KOH | 7,4 met NaOH |
Tabel 1:. Dissociatie oplossingen Samenstellingen oplossingen gebruikt bij de dissociatie van sinusknoop myocyten. De concentraties zijn aangegeven in mm tenzij anders aangegeven.
| plating Medium | Culture Medium | |
| Media199 | baseren | baseren |
| 2,3-butaandion monoxime (BDM) | 10 mM | 10 mM |
| Foetaal runderserum (FBS) | 5% | - |
| Bovine Serum Albumine (BSA) | 0,1 mg / ml | |
| Insuline | 10 ug / ml | |
| transferrine | 5,5 ug / ml | |
| Selenium | 5 ng / ml | |
| Penicilline | 100 U / ml | 100 U / ml |
| streptomycine | 100 mg / ml | 100 mg / ml |
Tabel 2: Plating en cultuur oplossingen Composities van oplossingen gebruikt voor plating en de cultuur van de sinusknoop myocyten..
| Tyrode | PP Intracellulaire | |
| NaCl | 140 | 5 |
| KCl | 5.4 | 135 |
| Kh 2 PO 4 | 1.2 | |
| HEPES | 5 | 10 |
| glucose | 5.55 | |
| MgCl2 1 | 1 | |
| CaCl2 | 1.8 | 0.1 |
| EGTA | 10 | |
| Mg-ATP | 4 | |
| Amfotericine-B | 200 ug / ml behoefte | |
| isoproterenol | 1 nM behoefte | |
| pH bijgesteld tot | 7,4 met NaOH | 7,2 met KOH |
Tabel 3: Elektrofysiologie recording oplossingen Composities van extracellulair (Tyrode) en intracellulaire (PP) oplossingen gebruikt voor amfotericine geperforeerde-patch opnamen van sinusknoop myocyten..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit document presenteert gedetailleerde protocollen voor de isolatie en de cultuur van volledig gedifferentieerde sinusknoop myocyten van volwassen muizen. De isolatie protocol produceert betrouwbaar spontaan actieve muis SAM geschikt voor zowel directe elektrofysiologische analyse of daaropvolgende cultuur. Soortgelijke protocollen zijn beschreven door vele andere groepen (zie bijvoorbeeld referenties 11,12,10,13-17). Echter, ons protocol voor het handhaven van volwassen muizen SAMs in vitro behoudt de karakteristieke morfologie, spontane activiteit en elektrofysiologische eigenschappen van de cellen en maakt adenovirale afgifte van eiwitten 9.
Voor de wijziging en het oplossen van problemen van de protocollen, moet een paar kritische stappen worden opgemerkt. De eerste kritische factor is een belangrijk stuk tot batch variabiliteit in de activiteit van de enzymen (stap 1,4), die dramatisch het aantal en de kwaliteit van SAMs kunnen veranderen die in een bepaalde preparatie. Deze variabiliteit is bijzonder voor de elastase, die typisch vereist lotspecifieke optimalisatie, waarin de concentratie en blootstellingstijden worden bracketing de loop van verscheidene preparaten (vaak in parallel) het aantal cellen en de gezondheid te maximaliseren. Sommige protocollen voor het isoleren van monolagen van verschillende soorten gebruiken individuele collagénase en protease-enzymen in plaats van de collagenase-protease-enzym mengsel in het onderhavige protocol. De partij tot batch variabiliteit voor elk van deze enzymen vrij hoog (vergelijkbaar met die van elastase), noodzakelijk herhaalde ronden van co-optimalisatie. Het enzym mix zorgt voor meer samenhang tussen veel en vereist minder optimalisatie stappen.
Een tweede kritische en unobvious factor voor het oplossen van de SAM isolatie is de integriteit van het vuur gepolijste glazen pipet dissociatie (figuur 1C). Als de rand van de pipet bevat scherpe randen, scheuren of geaccumuleerd cellular vuil, kan de mechanische trituratie stap de cellen beschadigen, hetgeen calcium toxiciteit. Het vuur-gepolijste dissociatie pipet moet worden vervangen minstens elke 2 maanden van regelmatig gebruik, of op elk moment dat de cel opbrengst of kwaliteit daalt aanzienlijk in de loop van een aantal preparaten.
De timing en de kracht van de mechanische dissociatie is een derde cruciale stap voor het oplossen van de isolatie-protocol. De trituratie vereist langzame (ongeveer 0,5-1 Hz), maar krachtige turbulentie voor 5-10 min. Hogere snelheden en lagere tijden kunnen ook worden gebruikt, maar het is belangrijk om te voorkomen dat er luchtbellen of genereren van schuim in de oplossing. Wanneer de sinusknoop monsters volledig zijn gescheiden, moet het resterende weefsel strips piekerig en wit van kleur worden weergegeven; subtiele roze-achtige kleuring geeft incomplete aanwrijven. Wanneer onderzocht op 200-400X vergroting, cellen van optimaal voorbereid monsters gladde celmembranen, terwijl cel membranes van over-verteerd of over-gewreven monsters hebben een kraters en gestreepte uiterlijk. In gezonde cellen, worden samentrekkingen waargenomen hoofdzakelijk als subtiele trillen van de uiteinden van de cellen. Golven van contractie zijn een teken van beschadigde cellen, die kunnen worden waargenomen krachtig samen voor een korte tijd, voordat balling-up. Een gebarsten dissociatie pipet is de meest voorkomende oorzaak van een dergelijke celbeschadiging. In monsters die onder gedigereerd of onder-getritureerd zijn cellen aanwezig als aggregaten of klonten in plaats van afzonderlijke cellen en grote aantallen verdragsluitende SAMs kunnen in het resterende weefsel stukjes worden waargenomen.
Elke gebruiker moet de dissociatie individueel te optimaliseren. Hoewel de enzymatische digestie en mechanische dissociatie tijden moeten beide worden aangepast, wordt aanbevolen begin beperken de enzymatische digestie tijdconstante bij het aanpassen van de dissociatie tijd. Overige opties berust vooral op het vermogen van de gebruiker om de een te herkennenVoorkom en van het weefsel delen die bij voltooiing van trituratie - wanneer de stukken zijn en onregelmatige witachtige kleur, dan het tritureren moet worden gestopt. Optimalisering is nodig om variaties in de sinusknoop dat verschillen in leeftijd, geslacht of stam van muizen gepaard tegemoet. Bijvoorbeeld, dissociatie van cellen van oudere dieren 7 vereist dat zowel enzymatische digestie en mechanische dissociatie tijden. Als algemene richtlijn, een typische bereiding van een 2-3 maanden oude mannelijke C57BL / 6 muizen levert ongeveer 50-200 levensvatbare SAMs, die misschien 5-10 succes-patch geklemd in een goede dag zitting, afhankelijk van de experimenten kan worden . De opbrengst is aanzienlijk (~ 30%) lager als de oudere muizen worden gebruikt 7.
Het succes van de cultuur protocol beroept zich ook op een paar belangrijke stappen. Vooral het succes van een primaire celkweek vereist een hoge kwaliteit dissociatie, zoals hierboven besproken. Het wordt aanbevolen thbij het acuut geïsoleerde cel voorbereiding geoptimaliseerd worden voordat u de cellen in de cultuur te behouden. Een tweede kritische factor voor gekweekte cellen ligt bij de selectie van cellen voor elektrofysiologische opnames. Voor het beste resultaat moet gekweekt SAM's geselecteerd voor opnamen spontane contracties vertonen onmiddellijk na uitwassen van de BDM-bevattend kweekmedium. Een trage begin van spontane contracties bij wash-out van de BDM is een teken van ongezonde cellen.
De SAM kweeksysteem heeft enkele beperkingen, vooral de zeer kleine grootte van de muis SAN. Terwijl het hier gedemonstreerd werkwijzen maken voldoende aantal cellen voor elektrofysiologische en imaging studies, de beperkte hoeveelheid weefsel uitsluit biochemische analyses van gekweekte monolagen. Een andere beperking van de techniek is dat SAMs gekweekt in aanwezigheid van de reversibele myosine ATPase remmer, BDM moet zijn. Dit is een potentieel zorg omdat BDM heeft andere cellulaire effecten, met inbegrip vanniet-specifieke fosfataseactiviteit, remming van cardiale transcriptiefactoren 19, en remming van natriumkanalen, calciumkanalen en ryanodinereceptor 20. Echter, de gegevens blijkt dat de BDM heeft minimale effecten op de morfologische en elektrofysiologische eigenschappen van SAM hier getest.
In toekomstige toepassingen, lijkt het waarschijnlijk dat de hier beschreven methoden kunnen worden aangepast aan SAM kweken bereiden van grotere zoogdieren. In combinatie met adenovirale genoverdracht, kan dergelijke culturen genetische manipulaties van pacemaking in grote diermodellen mogelijk te maken. Het vermogen om eiwitten van belang te introduceren ook voor toekomstige toepassingen waarbij genetisch gecodeerde reporter moleculen kunnen worden gebruikt om de intracellulaire signaleringsroutes sonde in de SAM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sylgruard/Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| Borosilicate 9" pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20C | |
| Small, round bottomed culture tubes | Fisher Scientific | 352059 | |
| Large, round bottomed culture tubes | Corning | 14-959-11B | |
| Elastase | Worthington Biochemical | LS002279 | |
| Liberase TM | Roche | 5401119001 | Tissue dissociation solution |
| Heparin | SAGENT Pharmaceuticals | NDC 25021-400-10 | |
| Mouse Laminin | Corning | CB-354232 | |
| 12 mm round glass coverslips | Fisher | 12-545-80 | |
| 24-well culture plate | Fisher | 08-772-1 | |
| Ad-mCherry | Vector Biolabs | 1767 | |
| Ad-eGFP | Vector Biolabs | 1060 | |
| Plastic, disposable transfer pipette | Fisher Scientific | ||
| Micro scissors | Fisher Scientific | 17-467-496 | |
| Dumont #4 Forceps | Roboz Instruments | RS-4904 | |
| Tissue Forceps | Roboz Instruments | RS-8164 | |
| Dissecting Iris Scissors | WPI, Inc. | 501264 | |
| Dissecting Pins | Fine Science Tools | 26002-20 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | |
| KCl | Sigma | 60128 | |
| KH2PO4 | Sigma | 60353 | |
| HEPES | Sigma | 54457 | |
| glucose | Sigma | G0350500 | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | |
| taurine | Sigma | T0625 | |
| BSA | Sigma | A2153 | |
| K-glutamate | Sigma | G1501 | |
| K-aspartate | Sigma | A6558 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| creatine | Sigma | C0780 | |
| EGTA | Sigma | E3889 | |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | |
| Amphotericin-B | Fisher Scientific | 1397-89-3 | |
| Isoproterenol | Calbiochem | 420355 | |
| Media199 | Sigma | M4530 | |
| 2,3-butanedione monoxime (BDM) | Sigma | B0753 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | SH30071 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A5611 | |
| Insulin | Sigma | I3146 | |
| Transferrin | Sigma | I3146 | |
| Selenium | Sigma | I3146 | |
| Penicillin | GE Healthcare | SV30010 | |
| Streptomycin | Hyclone | SV30010 |
References
- Irisawa, H., Noma, A. Pacemaker currents in mammalian nodal cells. J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).
- DiFrancesco, D.
- Mangoni, M., Nargeot, J. Genesis and regulation of the heart automaticity. Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).
- Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both. J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).
- Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node. J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).
- Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes. Channels. 5 (2), 115-119 (2011).
- Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate. Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).
- St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes. Channels. 7 (4), 318-321 (2013).
- St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice. Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).
- Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).
- Mangoni, M., Nargeot, J. Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells. Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).
- Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node. J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).
- Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).
- Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\. Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).
- Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium. PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).
- Groenke, S., Larson, E. D., et al. Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity. PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).
- Torrente, A. G., Zhang, R., et al. Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice. Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).
- Denyer, J. C., Brown, H. F. Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties. J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).
- Thum, T., Borlak, J. Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures. Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).
- Borlak, J., Zwadlo, C. The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins. Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).
