Abstract
体液免疫的特点是，以产生功能性的ASC，其合成和分泌特异性抗原（银），ABS等的病原体，并用于宿主防御。用于定量测定的个体的体液免疫应答的功能状态，既血清ABS和循环的ASC通常为功能读数测定。在人类中，外周血是可用于由主机B细胞引起的体液免疫应答的确定最方便和最容易获得的样本。不同B细胞亚群，包括的ASC，可直接从外周血通过选择与谱系特异性抗体共轭微珠或通过细胞仪具有流量分选分离。此外，纯化的幼稚和记忆B细胞可被激活并分化成在培养的ASCs。的ASCs促进抗体分泌的功能活性可以通过ELISPOT进行量化，这是收敛酶的测定法- 连接immunoabsorbance吸附试验（ELISA）和Western印迹技术，使个人的ASC的枚举在单细胞水平。在实践中，ELISPOT测定已越来越多地用于评估，因为易于大量血液样品的处理的疫苗效力。从外周血中分离的人类B细胞的方法中，B细胞的分化为携带者，和酶联免疫斑点的就业总IgM-和IgG-的ASC的定量将在这里描述。
Introduction
B细胞发挥体液免疫的发展中发挥中心作用。他们最初开发在骨髓和进入血液流中作为幼稚B细胞，其可以迁移到淋巴组织，诸如脾，淋巴结，扁桃体，为进一步发展。在银相遇，一些幼稚B细胞迁移到淋巴滤泡，其中生发中心B细胞可以分化成记忆B细胞和plasmablasts（PBS）/浆细胞（PC）的。虽然大多数PBS / PC的出口进入血流，少数最终驻留在骨髓经受终端分化为长寿命的计算机1。 B细胞在循环是异构的，并且在稳定状态下，PBS / PC是外周血2罕见。作为谱系特异性表面标志物的可用性的结果，流式细胞术已经成为外周血B细胞亚群的鉴定和表征的常用方法。流动cytometr的扩展应用y是在加入细胞分选仪的功能，其允许分离与B细胞的个别亚群的分离具有高纯度的。基于人类循环B细胞一般分为三个主要亚群特异性表面受体在不同的发育阶段的表达：幼稚B细胞（CD19 + CD27 - CD38 - ），记忆B细胞（CD19 + CD27 + CD38 - ）和PBS /电脑（CD19 + CD27 + CD38 +）3-4（ 图1）。普通B细胞的性质还没有遇到过AGS。然而，它们可以分化成的IgM + CD27 +记忆B细胞。虽然幼稚B细胞在表达B细胞抗原受体（BCR）相关分子（ 例如，CD19，CD20和CD22），他们在他们的免疫球蛋白库5异构均匀。大多数CD27 +记忆B细胞可以分化成CD27+ / HI CD38 + PBS /电脑6。此外，记忆B细胞和PBS / PC是多克隆并表现出发育和功能的异质性4-7。流通中的PB / PC通常短暂的，不表达CD138，但那些由落户骨髓将最终分化，成为长寿。终末分化的PC表达CD138，下调其表面8 CD27分子。因为两者的PB和PC是能够分泌腹肌的，在许多情况下，他们被共同表示为携带者。相比之下，无论是普通B细胞，也没有记忆B细胞能产生相当数量的绝对9-10。放置在适当的培养条件下6，11-15时10日-然而，分离时，两者幼稚和记忆B细胞可以分化成的ASCs 3。事实上，从携带者和CD27 CD38 在体外分化有着相似的表面衍生的表达与那些直接分离FROM外周血6。此外， 在体外分化的携带者表达CD20表面的较低水平，这同样循环PBS /个人电脑6。虽然培养衍生的ASCs都是短暂的，它们能分泌腹肌，这表明它们在功能上是胜任和能够向体液免疫。
既ELISA和酶联免疫斑点是目前最常用的方法，用以获得关于体液免疫应答功能信息。 ELISA是一个96孔基于板的测定法，它经常用于测量血清抗原特异性ABS和其他分析物（ 例如，细胞因子）的效价。这是方便和可扩展性。 ELISA被设计为使用固相酶测定来检测ABS或其它物质，如血清存在下，液体样品16英寸从血清的ELISA所述读数已被广泛地用于表示身体的免疫反应。必要收购重的工具从ELISA检测adouts是酶标仪。读者可以决定最终产品通常由辣根过氧化物酶（HRP）缀合的检测ABS和其特定的底物17的反应所得的光密度（OD）。对于报告的体液免疫应答，通过ELISA测定血清抗体水平表示在身体的ASC的集体，但不是个别，性能。此外，酶联免疫吸附未能顾及由记忆B细胞，其不分泌腹肌的参与。
像酶联免疫吸附，酶联免疫斑点是用于检测和监测外周血样品17-18中免疫应答的广泛使用的方法。酶联免疫斑点是涉及夹心ELISA的技术。在它，将细胞放置到聚偏二氟乙烯（PVDF）的96孔膜支持孔微孔板用于短期培养。 ELISPOT试验类似于上微孔板和developin进行免疫印迹克，以每孔中的PVDF膜的斑点。一种自动化的ELISpot读取器系统或人工计数立体显微镜是必需的。酶联免疫斑点的检测的免疫应答的主要优点是在携带者和细胞因子分泌细胞的定量其极好的灵敏度。它分别报告它们的功能活动，体液免疫和细胞免疫。在体液免疫功能的测定中，通过ELISA和通过ELISPOT列举的ASC的数量来确定血清抗体水平通常相关，但来自这两个测定法中的数据读出有功能的影响19-20一些差异。酶联免疫斑点的主要优点是它的方法的灵敏度。血清抗体滴度通过ELISA报告的水平呈现半定量作为OD读数，表示相对抗体水平，或更定量地，作为集中读数当包括参考腹肌的适当的同种型的已知量。与此相反，酶联免疫斑点的结果是presente-d作为携带者的在感兴趣的细胞池的绝对数量（ 例如，未分级的外周血单核细胞（PBMC），并从PBMC中纯化的B细胞）。酶联免疫斑点法可以检测单个ASC，但ELISA需要来自的ASCs抗体达之前测量达到优化的测定依赖浓度。因此，酶联免疫斑点是定量的灵敏度明显优于ELISA。此外，酶联免疫斑点法也适用于量化从激活记忆B细胞的体外分化的携带者。记忆B细胞不分泌腹肌但能分化成在激活时的ASC;于是他们就用ELISA法检测血清中绝对没有任何贡献。因此，酶联免疫斑点是选择在培养活化后循环记忆B细胞的免疫应答的测定方法。它允许对维持长期体液免疫的监测。
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Protocol
人体外周血必须从知情同意下健康供者获得，利用血液样本必须符合个别机构审查委员会制定的指导方针批准。在这项研究中，要使用的协议人体血液流式细胞术（ 图1）和酶联免疫斑点试验（ 图3）的结果的示威是经台大医院的内部审查委员会（协议号201307019RINB）。
1.分离人外周血B细胞的分离纯化
- 绘制〜10毫升的血液从肘正中静脉（在肘窝前部到肘部）到含有K 2 EDTA（1.5至2.0毫克/毫升血）有15毫升管中并立即翻转试管几次，以防止凝块形成。
- 加的高压灭菌（121℃，15分钟）的红血细胞（RBC）裂解缓冲液（150mM的氯化铵 ，10毫KHCO 3，和1mM EDTA 35毫升，Pħ7.4）到含有新鲜血液样品（≥3的管：1体积/体积）并在室温（RT）下孵育不超过5分钟。
注：通过管透光的外观表示RBC裂解完成。 - 离心在在RT 600 xg离心5分钟。确保粒料的颜色为白色。
- 用10mL高压灭菌磷酸缓冲生理盐水的悬浮颗粒（PBS，137 mM氯化钠，2.7毫摩尔的KCl，4.3毫摩尔的 Na 2 HPO 4，和1.47毫摩尔KH 2 PO 4; pH7.4）和离心机如在步骤1.3。
- 弃去上清液，用10ml的RPMI 1640培养基（补充10％胎牛血清，100U / mL青霉素/链霉素，0.25微克/毫升两性霉素B，和2mM L-谷氨酰胺）重悬沉淀，然后镀细胞分化成一个10厘米的培养皿（10毫升每皿血）。放置在37℃培养箱，5％CO 2的30分钟的盘。
- 轻轻地摇晃培养皿几次，放置培养基（悬浮细胞）到15毫升的塑料锥形管。丢弃在培养皿中贴壁细胞（主要是巨噬细胞）。
- 离心在在RT 600 xg离心5分钟。弃去上清液。
- 悬浮用1mL的RPMI 1640培养基中的小球。计数与血球或自动细胞计数器的细胞数。
注：分离白细胞存活率通常是大于90％通过台盼蓝排除。 - 离心机如在步骤1.7和5的浓度重悬在冷的PBS缓冲液（0.5％牛血清白蛋白（BSA）和2mM EDTA）中的〜200μL的细胞- 10×10 6个细胞/ mL。
- 添加5μL的每10 6个细胞的特异性血细胞（B细胞的负选择）生物素化的抗-人抗体鸡尾酒的，并在冰上孵育30分钟21。
注：抗人抗体鸡尾酒至少应包括具体到CD2（或CD3），CD14，CD16和腹肌。 - 添加10倍过量体积无菌PBS的细胞，离心分离，在600×g离心5分钟，并弃去上清液。
- 添加链霉抗缀合的微珠等量（每10 6个细胞5微升）到颗粒并充分混合。
- 在一个15毫升的塑料锥形管在冰上孵育30分钟。
- 加入2毫升的PBS缓冲液到管。
- 放置管进入一个磁性底座，并在室温下孵育8分钟。棕色微珠将逐渐附着在管壁的磁铁22旁边。
- 与残留在磁性支架上的管中，小心地将上清液转移到一个新的无菌的15毫升管22。
- 重复步骤1.14至1.16，并结合包含不变的B细胞两个上清液。丢弃微珠。
- 离心在在RT 600 xg离心5分钟。弃去上清液。
- 重悬在RPMI 1640培养基中的小球用于下游实验。
注意：通常情况下，1 - 5×10 5个 B细胞机智公顷纯度大于95％，从10毫升外周血可以分离23。
2.分离的B细胞纯化和记忆的分离和普通B细胞
- 使用从步骤1纯化的细胞，并确定使用血细胞计数器或自动细胞计数器的细胞数。
- 重悬在100微升冷PBS缓冲液中的细胞在600 xg离心离心和RT 5分钟后。
- 添加1 - 2每10 6个细胞的生物素化的CD27单抗的微克，并在冰上孵育30分钟。
- 在600 XG添加10毫升的PBS缓冲液的管中，离心5分钟。
- 弃上清，重悬细胞在PBS缓冲液50微升。
- 添加链霉抗磁微珠的等量（1 - 2微克/ 10 6个细胞）的细胞在15毫升的塑料锥形管中。
- 轻轻拌匀，在冰上孵育30分钟。
- 添加2 - 3毫升PBS缓冲液到管。
- 放置围成一个磁性底座和孵化在室温进行8分钟，以允许棕色微珠附着到最靠近磁体的一侧。
- 与在磁性支架上的管中，小心地转移上清液部分到一个新的无菌试管中。该馏分包含富集CD27 -幼稚B细胞。
- 添加5毫升含有微珠的管，轻轻悬浮微珠（ 即，CD27 +记忆B细胞的富集级分）24-25。
- 离心在在RT 600 xg离心5分钟。重悬为下游实验的RPMI 1640介质中的颗粒。
注意：通常情况下，约30 - B细胞的60％，可以从健康供体7，25-26的PBMC中的CD27 +记忆细胞纯化。
3.细胞为普通B细胞，记忆B细胞和PBS / PC的收集整理
- 使用从步骤1纯化的细胞，确定使用hemocytome细胞数之三或自动细胞计数。
- 重悬在冷的PBS缓冲液将细胞以10 7每毫升的5毫升聚苯乙烯管的浓度。
- 添加1 - 2每10 6个细胞的人IgG微克，并在冰上孵育10分钟与Fc块。
- 添加1微克的每一个抗CD19-APC（克隆：HIB19），抗CD27-eFluor450（克隆：O323），和抗CD38-PE（克隆：HIT2）每10 6个细胞;拌匀，在冰上孵育30分钟4，27。
- 在步骤3.4的最后5分钟，加入商业7氨基放线菌素D（7-AAD）的5微升。
- 在600 XG添加2毫升的PBS于管，涡旋，离心5分钟。
- 悬浮细胞在1的浓度分拣缓冲液（无菌PBS用2％BSA和2mM EDTA） -在一个15毫升管每毫升5×10 7个细胞。
- 过滤细胞通过尼龙网细胞滤网（40微米孔径），以消除细胞团块。
- 分离细胞用流式细胞排序器配备了三个激光器：紫（405纳米），蓝色（488纳米），和红色（640纳米）。
注：单独的蓝色激光进行三色流式细胞27-28流量就足够了。 - 排序细胞成三个15-mL管（含有5 RPMI培养基中的溶液），用于幼稚B细胞的同时采集（CD19 + CD27 - ），记忆B细胞（CD19 + CD27 +），和PBS /个人电脑（CD19 + CD27 + / HI CD38 +）3-4，28。
注：在步骤4中所述排序天真和记忆B细胞可以培养。
4. 在离体人CD19 + B细胞，CD19 + CD27 +记忆B细胞和CD19 + CD27 体外分化-普通B细胞
- 利用在步骤1.19，2.10，2.11和3.10纯化的细胞，确定与血球或自动细胞计数器的细胞数。
- 悬浮用RPMI 1640培养基中的细胞以1:1的浓度- 10×10 5个每毫升和等分它们放入一个12孔板的孔中。
- 在5微克/ 10 6细胞添加CPG（2006年ODN）/毫升18，29。
- 培养的细胞在37℃培养箱，用5％ 的 CO 2 5天。
- 收获来自每个细胞孔，分别将它们放入15-mL管中，加入5毫升的PBS至每个管，并在600 xg离心和RT 5分钟离心它们。
- 算使用血球或自动细胞计数器细胞。悬浮细胞以1:1的浓度- 10×10 5个每毫升的RPMI 1640培养基。
5.酶联免疫斑点检测
- 在蒸馏水中添加35％乙醇的30微升到的ELISpot平板的每个孔中进行30秒。
注：吹打时，请避免在任何时候都接触在孔膜。 - 倒置的ELISpot板以除去乙醇。
- 把150蒸压DDH 2 O的的微升到每口井和孵化他们在RT 5分钟以冲洗掉残留的乙醇;按照与在RT无菌PBS洗涤3分钟。
注意：步骤5.1至5.3可以是可选的，这取决于板的制造中。 - 放5微克/毫升的多克隆的F（ab'）抗人Ig抗体（IgG + IgM阳性的IgA）2片段的50微升（在PBS中）插入的ELISpot平板的每个孔中，并在4℃下孵育他们过夜（优选的）或37℃2小时11。
注意：用Parafilm密封板的边缘，直到使用。 - 倒置平板在RT以除去未结合ABS，添加的PBS 200微升至每个孔，并孵育他们两次，每次3分钟。
- 添加的PBS200μL的含5％牛血清白蛋白（或RPMI1640培养基），以每孔用于阻挡，并在室温下孵育他们2小时。
- 倒置平板以除去封闭缓冲液。洗各孔用PBS，200μL的两倍，在步骤5.5。
- 加入100微升的RPMI 1640培养基中，以每个孔，并在37°C孵育它们。
- 当准备种子细胞，反转板卸下RPMI 1640培养基。
- 种子100微升（5×10 4），50微升（2.5×10 4），和25微升（1.25×10 4）的细胞（从步骤1.19，2.10，2.11，3.10，和4.6）转换成的一个孔中酶联免疫斑点板。用RPMI 1640培养基，使体积达到150微升/孔。
注：最小电镀细胞的一个或两个2倍连续稀释的建议。 - 孵育在37℃培养箱板用5％CO 2的10 - 14小时18。避免孵育期间移动所述板。
- 倒置平板以除去细胞和RPMI 1640培养基。
- 加入200微升/孔的PBS-T（PBS含0.05％吐温20），并培育它们的5倍于RT，每次3分钟。反转板，除去每个5洗涤的洗涤液。
- 添加任一的山羊抗人IgG-碱性磷酸酶（AP），与Fcγ特异性ABS（IgG的检测，1：5000于PBS-T的）或山羊抗人IgM-AP，Fcμ片段特异性ABS（对于IgM的检测，1：5000于PBS-T）到指定的孔，并在室温孵育在黑暗中2小时。
- 洗各孔用PBS，200μL的两倍，在步骤5.5。
- 添加50μL/孔的溴氯吲哚磷酸硝基蓝四唑（BCIP / NBT）底物溶液。紫色的斑点通常出现在5 - 15分钟。
- 加入100微升/孔的DDH 2 O操作防止斑点的过度发展。
- 与所有景点的全面发展后，自来水冲洗板。
- 取出板的暗渠，并允许他们在黑暗中空气干燥。
- 用自动板读数器与图像采集/分析单元（ 例如，一个自动扫描仪或通过在解剖显微镜手动）计数斑点。
注：该板可以存储在RT在黑暗中和后进行分析。
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Representative Results
外周血单个核细胞被耗尽的红细胞和贴壁细胞（步骤1.2到1.7）的。细胞的等分试样（2×10 6）进行流式细胞分析来说明幼稚B细胞，记忆B细胞和外周血（ 图1）PBS / PC的人口。在这个供体的外周血单个核细胞，淋巴细胞的约10％是CD19 + B细胞。在B细胞室，CD19 + CD27的百分比-幼稚B细胞是在50％左右。另一方面，所述CD19 + B细胞的约50％是CD27 +记忆B细胞7，25-26。值得注意的是，CD27 +记忆B细胞可进一步与列入IgD的4的分离。 2，30-31 -循环的PBS表型可与CD20的低或无表面表达（CD19 + CD27 + /高 CD38 + CD20 LO /）有更好的界定。以排除死细胞时，7-AAD可以包含在细胞染色（步骤3.5），以及对FSC 相对于 7-AAD的曲线允许门控活细胞（7-AAD - ）的人口。
ELISPOT试验的关键步骤在图2中描绘。两个纯化的人B细胞和CD19 + CD27 +记忆B细胞在的CpG的存在下用RPMI 1640培养基培养5天。收获细胞用于ELISPOT测定用于量化新出现的ASC。如果存在，预先存在的PB从外周血中分离将在48小时11消亡。进行的ELISPOT测定，并用自动板扫描器获取的光斑影像图3中证明。酶联免疫斑点的结果通常显示50 - 200从带的CpG处理5天10 4 B细胞的IgM-携带者，而IgG的携带者的数量是10 - 50 10 4个细胞11。
图 1. 门控战略的插图来分隔普通B细胞，记忆B细胞，和PBS的外周血单个核细胞。 （A）将细胞（2×10 6）与各2微克CD19-APC，CD27-eFluor450，和CD38-PE单抗（步骤3.4）的染色。淋巴细胞隔室门（G1）上的点积为前向散射（FSC）对侧散射（SSC）。 （B）的细胞双峰，由粘在一起的两个单元构成，被排除在外（那些以外G2）上的情节对FSC-W（宽度）与FSC-H（高度）。 （C），CD19 + B细胞被门控为对剧情的SSC-A（区）和CD19-APC G3。 （D）的CD19 +细胞，CD27的CD38和参数散点图显示幼稚B细胞（CD19 + CD27 - ; Q1和Q4），记忆B细胞（CD19 + CD27 +;Q2和Q3），和PBS（CD19 + CD27 + /高 CD38 +; G4，第二季度的0.6％）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. ELISPOT试验的关键步骤的插图。 （A）将50微升/孔（5微克/毫升）的F（ab'）抗人Ig抗体（IgG + IgM阳性的IgA）2片段成的ELISpot板2小时的在37℃或4℃过夜C（首选）（步骤5.4）。种子的细胞进入的ELISpot板的孔中。允许的ASC附加到PVDF膜和分泌腹肌8 - 14小时（步骤5.11）。 （B）中洗掉的细胞用PBS（含0.05％吐温20）。 （C）添加AP-或HRP-连词ugated检测ABS特定要么IgG或IgM。 （D）洗掉检测绝对是绑定。 （五）制定与AP或HRP的底物溶液，以匹配检测绝对的斑点。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. 从代表板块的ELISpot结果。 （A）纯化的CD19 + B细胞被放入的ELISpot板的三个相邻的孔（分别为50,000个细胞中公＃1，25,000个细胞在孔＃2中，12500细胞中公＃3，）。细胞然后培养在RPMI 1640培养基中过夜（〜14小时）。 （步骤5.12至5.18）培养完成后所执行的ELISPOT测定。要analyzE中的结果时，酶联免疫斑点平板扫描通过配备有扫描仪和软件的自动分析获取的图像。 （B）的纯化的CD19 + CD27 +记忆细胞（10 6 /毫升）是在5微克/毫升的CpG的存在下培养5天。将细胞视为（A）中的ELISPOT分析。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
分离和人外周血B细胞的分离纯化
通常情况下，红细胞可以有效地破裂并通过裂解缓冲液（步骤1.2）清零。它不孵育用RBC裂解缓冲超过5分钟长的PBMC是重要的，因为细胞生存力可能由氯化铵的影响。可替代地，RBC和血小板可以同时通过以下方案除去。
1，血液到缓冲液：在9:1的体积比;混合新鲜全血酸 - 柠檬酸盐 - 葡萄糖（ACD）缓冲液（pH 7.4 39 mM柠檬酸，75mM柠檬酸钠，和135毫右旋糖）。离心在250×g离心在RT 10分钟。注意图层，指示分离的形成。吸并丢弃上层，它包含血小板和富含血小板的血浆（黄色）。在接口，其中包含的PBMC除去薄中间层（i .E。，血沉棕黄层）。避免红细胞的污染在底层（四方舟红色）。添加裂解缓冲液到的PBMC以除去残余的红细胞，然后按照步骤1.2至1.19。
两种方法可用于B细胞从外周血分离：阳性和阴性选择21。用于获得不变，功能B细胞，没有结合的ABS或微珠，用于下游实验负选择方法（1.1至1.19的步骤）。它是当活化和/或纯化的B细胞分化的培养发生于考虑到这一点是至关重要的。值得关注的是，通过阳性选择纯化的细胞可能是由单克隆抗体缀合的微珠（0.2至5微米的直径）被无意中影响。单克隆抗体可结合B细胞上的特异性受体，因此可能交联的受体活化。此外，微珠可以通过B细胞通过结合受体胞吞。尽管生物降解，微珠可以呆在里面细胞超过一个星期。是否微珠将影响experi的保留精神的结果需要根据经验确定。在通过阳性选择，抗CD19（克隆：4G7或HIB19）人B细胞的纯化通常使用微珠因为CD19是广泛整个B细胞的发育阶段中表达。 （：SJ25C1或LT19克隆），其识别从抗CD19微珠不同的表位的分离后的B细胞的纯度通过流式细胞术用抗CD19单克隆抗体来确定。
纯化及分离的B细胞记忆和普通B细胞的分离
CD27是人类的记忆和普通B细胞的区别24被广泛接受的表面标志物。该CD27分子属于肿瘤坏死因子受体（TNFR）家族。因为CD27是在大多数人的记忆B细胞中表达，这是通常用于从CD27识别它们-幼稚B细胞。但是，由于CD27也表示对T细胞和NK细胞，采用抗CD27 microbea的DS（克隆：O323）在正选择记忆B细胞需要B细胞的前纯化（步骤1.1至1.19）。对于分离后的纯度检查，具体为人类单克隆抗体CD27（克隆：L128或LG.3A10）推荐（步骤2.12）。因为CD27 +记忆B细胞是异质的，额外的表面标志物，如IgD和FCRL4，可以在细胞分选4,7考虑用于进一步分离。
细胞分选获取普通B细胞，记忆B细胞和PBS /电脑
由于B细胞表达FcγRIIB中，Fc块（步骤3.3）就是染色细胞单克隆抗体流式细胞仪之前推荐的。单独的人IgG的Fc片段可以以1微克/ 10 6个细胞块同样以及整个人IgG。抗人CD32的单克隆抗体（克隆：3D3或AT10）可以与Fc块的另一种选择。值得注意的是，如果FcγRIIB是一个表面标记，以纯化的B细胞被染色，荧光团缀合的抗CD32单克隆抗体的sh乌尔德加到放弃与Fc块，随后用其它单抗染色未经PBS洗涤。
对于三色流式细胞术，CD38-FITC（荧光素），CD27-PE（藻红蛋白），和CD19-APC（别藻蓝蛋白）是荧光团的典型组合。然而，如果流式细胞分选仪配备有三个激光器，如那些的405纳米，488纳米和640纳米，研究者则具有豪华选择通过为细胞分选不同激光激发的荧光团。 ，CD27-eFluor450（相当于太平洋蓝，克隆：O323）和CD38-PE（克隆：HB7）以分离幼稚B细胞，记忆： 如图 1所示，将细胞用CD19-APC（HIB19克隆）染色B细胞和PBS中。值得注意的是，一些研究者倾向于CD45列入（克隆：HI30）作为白细胞谱系标记和门B细胞为CD45 + CD19 +的人口。由于PBS中流通的检测在稳定状态是一种罕见的前夜NT的健康人，低或PBS（CD19 + CD27 + /高 CD38 + CD20 LO / - ）CD20甚至没有表面表达证实其善意的存在2，30-31。的PB的定量结果通过表面表型和携带者通过ELISPOT测定法进行比较时，这是很有用的。期间之前的细胞分选期间，7-AAD优选碘化丙啶对死细胞的排斥，由于其窄的发射光谱和在多色流式细胞仪下溢出。
体外刺激和隔离人类B细胞分化
B型的CpG（ODN 2006）单独可诱导从记忆B细胞都IgM-和IgG-携带者有限的分化。此外，幼稚B细胞是只有弱响应的CpG和主要产生IgM抗体的ASCs 6,11。每10 6个 B细胞5微克/毫升-的CpG中培养的浓度在2.5的范围内或外周血单个核细胞11，18。以外的CpG，纯化的B细胞和PBMC中可与促细胞分裂剂，细胞因子，和BCR激动剂CpG基的组合的存在下培养时，对人体B细胞分化成的ASC中培养（步骤4.3）。例如，通常使用的配方为每毫升10 6个细胞包括（a）的CpG（5微克/毫升），重组人IL-2（10毫微克/毫升），和重组人IL-10（10毫微克/毫升）15， 34; （二）的CpG（5微克/毫升）和F（ab'）抗人Ig抗体（IgG + IgM阳性的IgA）2片段（20微克/毫升）11; （三）的CpG（5微克/毫升），来自金黄色葡萄球菌 Cowan的（SAC）蛋白A（1：10,000稀释），和美洲商陆有丝分裂原（PWM）（1：100稀释）18; （四）的重组人IL-21（100毫微克/毫升）和重组可溶性CD40L（1微克/毫升）12，15，33;和（e）的重组人IL-2（10毫微克/毫升）和R848（1微克/毫升），由TLR7激动剂33-34。虽然B细胞可以在三天11分化成的ASC，细胞通常是前S被添加到的ELISpot板的ASCs 11，18的量化之前timulated为5至6天。在培养期间，通常没有开始分化剂的补充。
含有CpG的培养物中加入IL-2和IL-10的可显著增加分化IgM-和IgG-携带者15,35的数目。的IL-2中培养的存在可以提供有丝分裂的刺激以促进分化的B细胞用CpG膨胀。 IL-10在10-25纳克/ mL范围内能大大增加生产的ASC的（〜3-至10倍）中的CpG 35的存在。 BCR激动剂，包括抗BCR和SAC和PWM也能刺激的原代人B细胞18的增殖。孵育记忆B细胞的CpG和多克隆抗BCR主要结果的增加的IgM-携带者，但不是在IgG的携带者28。用于预防通过BCR由FcγRIIB，一架F信令的抑制（AB＆＃39）抗Ig的2片段（10 - 20微克/毫升每10 6个细胞）的交联的BCR 11时，建议。代替多克隆抗Ig的，特定于任一的IgM +或IgG + B细胞的抗BCR单抗应考虑到分化同型特异性的B细胞亚群定位成携带者。 （1:10,000稀释1）和PWM（1：100稀释）的CpG，SAC的组合能有效地激活记忆B细胞分化成IgM-和IgG-携带者18,24。此外，可以CpG的适度诱导免疫球蛋白类开关在体外 28-29。相反，IL-21（100毫微克/毫升）和sCD40L的（1微克/毫升）有效地诱导记忆B细胞分化专门为切换IgG的携带者12,30。的可溶性CD40L可以通过CD40的B细胞上模拟T细胞的帮助，影响其分化成体内电脑激活B细胞。值得注意的是，抗CD40（克隆：89或G28.5）可以在培养15代替sCD40L的。 Howev呃既不sCD40L的也不抗CD40单独能够诱导记忆B细胞的分化。因此，培养的B细胞的CD40的活化通常与分化剂，如IL-4，CpG的，R848，或IL-21，其中任一种可以促进免疫球蛋白类别转换相结合。 IL-4起着Th2细胞CD4细胞的分化关键作用，使大多数的IgM + B细胞的诱导切换到的IgG1 + B细胞中培养。同样地，在IL-21的存在下，无论记忆B细胞和幼稚B细胞分化完全成类交换的ASC 12,32。 CpG的一样，R848可以诱导B细胞34的边缘类开关。最后，值得一提的是，虽然脂多糖（LPS）能够有效地诱导小鼠的B细胞分化成的ASC，人B细胞表达TLR4和CD14 29的低的水平。因为加培养中的分化剂的促进切换B细胞的产生，这除了应避免当预先存在的PBS / PC或无开关记忆B细胞进行测量。
酶联免疫斑点检测
ELISPOT试验结合板为主ELISA试剂盒与基于膜蛋白印迹技术，允许由单个B细胞分泌18检测绝对的。所述的ELISpot还适于量化分泌细胞因子17，36抗原特异性T细胞。在ELISPOT测定，可以使用纯化的细胞或普通的PBMC（游离的RBC）。然而，〜10倍以上的PBMC需要比纯化的细胞，以获得在ELISPOT分析一致的结果。一个好的起点是1 -每孔2×10 5个细胞在外周血单个核细胞检测循环携带者。在检测抗原特异性的ASC，的抗Ig通常被Ag取代（5 - 10微克/毫升在PBS中）来捕获抗原特异性ACSs中（步骤5.4）。使用同型特异性检测的ABS允许特定抗原特异性IgM的ASC和IgG同型携带者的区别（5.1步4）。值得注意的是，不管抗Ig或Ag是否用于捕捉的ASC，用于酶联免疫吸附检测绝对可能并不总是适合的ELISpot。同样，不是所有的ELISA底物的颜色在酶联免疫斑点正常工作。 AP-和HRP缀合的绝对最常用于酶联免疫斑点斑点检测。在BCIP / NBT底物溶液是基于AP的检测的普遍选择，而3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和3-氨基-9-乙基咔唑（AEC）解决方案是HRP共同基板在酶联免疫斑点。如果AP或HRP直接缀合到检测腹肌，需要一种用于检测仅一个步骤，如在协议（步骤5.14）中所描述。与此相反，在检测绝对被生物素化，并与在两步法在基板反应之前需要与AP-或HRP偶联的链霉随后孵化。既一步法和两步法有效地工作，以检测在酶联免疫斑点的斑点。
ELISPOT试验可以量化，不仅circulatING但是文化也是有区别的ASC（步骤1.19对4.6）。如果存在的话，循环的ASC，它通常比过去活文化中两种天无长，可以在的ELISpot板直接培养，有或没有从PBMC中11纯化。相反，记忆B细胞的分化，需要5天。因此，不建议在后细胞的分离（步骤1.19），酶联免疫斑点板直接培养;从延长培养期间产生的死细胞碎片能增加斑点检测的背景。相反，这两种纯化的B细胞和总的PBMC可首先在有丝分裂原和分化剂（步骤4.3）的存在下，6孔或12孔板培养。在培养过程中，刺激剂反复加法是不必要的（步骤4.3）。而板是在孵化器，培养箱的门应轻轻地打开和关闭，以防止种子的ASC从移动，因为它们能沿着移动轨道扩散分泌ABS，产生斑点尾巴（所谓的“彗星状”点）（步骤5.11）。在酶联免疫斑点板潜伏期是通过分泌腹肌的检测量而不使细胞分裂所需要的细胞的时间，这会造成在点数量的困难来确定。因此，细胞通常在8小时至过夜（步骤5.11）的范围内进行培养。
ELISPOT试验是用于量化记忆B细胞应答的最广泛使用的方法。它已成为体液免疫应答和免疫记忆的一种流行的，独立的读出。在实践中，如前述的有丝分裂培养是必需的，以激活分化记忆B细胞分化成的ASC（步骤4.3）。然而，在该记忆B细胞扩张和分化成携带者频率在不同的文化环境而变化，如上所述。虽然没有共识，大多数研究者采用诱导条件，可以最大限度地提高生产携带者的。在代理方面用于斑点detectioN，可溶性生物素化抗原可更换不满意的检测抗体而不会影响灵敏度37。这是特别重要的时，因为需要对检测比用于涂覆板的Ag的低得多的量的Ag的可用性是有限的。最后，酶联免疫斑点不允许细胞的异质性的表型分析，从而要求细胞亚群的前分馏。最近，多色的ELISpot测定法，其中检测绝对标有不同的荧光团，已经开发了用于检测多种类型的细胞因子分泌细胞的单井38-39。这种新技术将是在PBMC中检测低频细胞和疫苗诱导的B细胞应答的大规模分析特别感兴趣的。
因为ELISPOT试验是快速和有效的量化的ASC和细胞因子分泌细胞，它一直延伸到测量不仅断路器操作过电压的功能lating淋巴细胞，而且组织的免疫细胞如肝内白细胞40。因为它的灵敏度达到检测甚至单个的ASC水平，ELISPOT试验已被越来越多地用于测量针对现有的和新出现的病原体疫苗功效的人类免疫应答。虽然ELISPOT测定的高通量性能和鲁棒性是极好的供使用的PBMC的免疫应答大规模评估时，测定的结果可以通过各种因素，如样品的处理延迟的影响，细胞是否是新鲜或冷冻，在培养基中的血清成分，并加入到的ELISpot板41细胞的数目。因此，归一化程序应包括在酶联免疫斑点协议，以尽量减少在大规模和纵向随访研究（ 例如，疫苗试验）内和测定间变异。板读数的归一化方法也是线性，准确性及缺点临界istency在测定结果41-42。执行板读数归一化的一个方法是延长接种到的ELISpot板（步骤5.10）的细胞的系列稀释液的步骤。通过创建一个基准板，更连续稀释应表现出每孔铺板的细胞数和每孔斑点计数之间的线性关系。所述的ELISpot板的重复扫描可用于自动和手动验证点数量的模板。现货数量最少的内部以及变异性正常化这些程序后，43预期。最后，酶联免疫斑点的应用可以以多种方式，如到监测患者的感染和服用癌症免疫疗法的治疗反应的，以及免疫毒性的评价（ 例如，免疫抑制和药物诱导的自身免疫）进行扩展。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 mL tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 mL Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-043 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
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