Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi'nin olarak

Published: December 14, 2016 doi: 10.3791/54582
Automatic Translation
1
1Graduate Institute of Pharmacology, College of Medicine, National Taiwan University

Abstract

humoral bağışıklık damgasını sentez ve bir patojen olarak bir antijen (Ag), özel Abs salgılar ve ana savunma için kullanılan fonksiyonel TSK, üretmektir. Bir bireyin hümoral bağışıklık tepkisinin fonksiyonel kantitatif tayini, serum Abs ve dolaşan TSK hem yaygın fonksiyonel çıktılan olarak ölçülür. İnsanlarda, çevresel kan ana B hücreleri tarafından ortaya hümoral bağışıklık tepkisinin saptanması için kullanılabilecek en uygun ve kolayca erişilebilir bir örneğidir. TSK kapsamda, farklı B hücresi alt-gruplar, akış sitometrisi ile sıralama seri spesifik Ab-konjuge mikro-veya hücre aracılığıyla seçim yoluyla periferal kandan doğrudan izole edilebilir. Ayrıca, arıtılmış naif ve bellek B hücreleri, aktive edilmiş ve kültür TSK olarak ayırt edilebilir. Ab salgılama katkıda TSK fonksiyonel aktivitesi, Enzim yakınsar bir deney olan, elispot testi ile tayin edilebilirB-bağlı immunoabsorbance deneyi (ELISA) ve Western lekeleme teknolojileri tek hücre düzeyinde tek tek TSK numaralandırılmasına sağlamaktır. Uygulamada, ELISPOT testi artan için kan örnekleri, çok sayıda kullanım kolaylığı aşı etkinliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Periferik kandan insan B hücrelerini izole edilmesi yöntemleri, in vitro TSK olarak B hücrelerinin farklılaşmasını ve toplam IgM- IgG-TSK miktarının ELISPOT istihdam burada tarif edilecektir.

Introduction

B hücreleri, humoral bağışıklığın gelişiminde önemli bir rol oynar. Onlar başlangıçta kemik iliğinde gelişir ve daha da geliştirilmesi için naif gibi dalak gibi lenfoid dokularda geçebilecek B hücreleri, lenf düğümleri ve bademcikler, kan akışı girin. Ag karşılaşma üzerine, bazı naif B hücreleri germinal merkez B hücreleri bellek B hücreleri ve plazmablastlar (PB) / plazma hücrelerinin (PC) içine ayırt edebilirsiniz lenfoid follikül içine göç ederler. En PB / PC'ler kan akışına çıkış yaparken, birkaç sonunda uzun ömürlü PC'ler 1 içine terminal farklılaşma geçmesi kemik iliğinde bulunur. Dolaşımdaki B hücreleri heterojen ve kararlı durumda, PB / PC'ler, periferik kanda 2 nadirdir. seri spesifik yüzey markerlerinin durumunu bir sonucu olarak, akış sitometrisi periferik kanda B-hücresi alt kümelerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için uygun bir yöntem haline gelmiştir. Akış cytometr bir genişletilmiş uygulamaY, yüksek saflıkta ayrılmasını ve B hücrelerinin tek tek alt kümelerinin izole edilmesine izin veren, bir hücre sıralayıcı fonksiyonu eklenmesidir. İnsan dolaşımdaki B hücreleri, genel olarak üç temel alt popülasyonları sınıflandırılır farklı gelişim aşamalarında spesifik yüzey reseptörlerinin ekspresyonu göre: bellek B hücreleri (CD19 + CD27 + CD38 -) saf B hücreleri - (- CD38 CD19 + CD27) ve PB / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Şekil 1). doğası gereği Naif B hücreleri Ag'lerini karşılaşmadım. Bununla birlikte, IgM + CD27 + bellek B hücrelerine ayırt edilebilir. Naif B hücreleri B-hücresi antijen reseptörü (BCR) -associated molekülleri (örneğin, CD19, CD20 ve CD22) onların immünoglobulin repertuarı 5 heterojen ifade homojen olmasına rağmen. CD27 + bellek B hücrelerinin büyük bir çoğunluğu CD27 olarak ayırt edilebilir+ / hi CD38 + PB / PC'ler 6. Buna ek olarak, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC poliklonal ve gelişimsel ve fonksiyonel heterojenliği 4-7 sergiler. dolaşımda PB / PC'ler normalde kısa ömürlü ve CD138 ifade etmezler, ancak kemik iliğinde yerleşmek için yapılanlar ölümcül farklılaştırmak ve uzun ömürlü olacaktır. Terminal farklılaşmış PC'ler CD138 ifade ve yüzeyleri 8 CD27 molekülleri aşağı-düzenler. PB ve PC'ler hem Abs salgılayan yeteneğine sahip olduğundan, pek çok kez onlar topluca TSK olarak belirtilir. Buna mukabil, naif B hücreleri de bellek B hücreleri de Abs 9-10 kayda değer miktarda üretebilir. Uygun kültür koşulları 6, 11-15 yerleştirildiğinde 10 gün - izole Yine de, hem naif ve bellek B hücreleri 3 TSK içine ayırt edilebilir. Aslında, TSK bu doğrudan izole fr ile CD27 ve CD38 in vitro farklılaştırma payı benzer yüzey ifadeler türetilmişom periferik kan 6. Buna ek olarak, in vitro farklılaşan TSK bu PBS / PC 6 dolaşan benzer yüzey CD20 düşük seviyede eksprese eder. kültür kaynaklı TSK tüm kısa ömürlü olmasına rağmen, onlar işlevsel yetkin ve hümoral bağışıklık katkıda mümkün olduğunu belirten Abs salgılar olabilir.

kadar en sık uygulanan yöntemler hümoral immün yanıta fonksiyonel bilgi elde etmek için ELISA ve ELISpot hem de. ELISA 96 gözlü plaka bazlı deney, ve sık sık, serum Ag-spesifik Abs ve diğer analitler (örneğin, sitokinler) titreleri ölçmek için kullanılır. Bu uygun ve ölçeklenebilir. ELISA Sıvı bir numunede 16, ABS veya serum gibi diğer maddelerin varlığını tespit etmek için bir katı-faz enzim tahlili kullanmak üzere tasarlanmıştır. Serum ELISA ile ilgili okumalar yaygın vücudun bağışıklık tepkisini temsil etmek için kullanılmaktadır. yeniden kazanılması için gerekli bir araçELISA tahlilleri ile ilgili adouts bir spektrofotometrik mikroplaka okuyucu. Okuyucu, tipik olarak yaban turbu peroksidazı (HRP) ile birleştirilmiş bayır algılama Abs ve spesifik alt tabakalar 17 reaksiyonundan elde edilen son ürünlerin optik yoğunluk (OD) belirleyebilir. humoral immün tepkisi raporlama ile ilgili olarak, ELISA ile tespit serum antikor düzeyleri vücutta TSK toplu, ancak tek tek değil, performans belirtmektedir. Buna ek olarak, ELISA dikkate Abs salgılar yok bellek B hücreleri tarafından katılımını almak için başarısız olur.

ELISA gibi, ELISpot tespit ve periferik kan örnekleri 17-18 bağışıklık yanıtı izlemek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. ELISPOT bir sandviç ELISA ile ilgili bir tekniktir. İçinde hücre polivinilidin diflorin (PVDF) kısa süreli bir kültür 96 çukurlu mikrolevhaların membran destekli kuyu içine yerleştirilir. ELISpot tahlil bir mikroplaka ve developin batı blotting gerçekleştirmeden benzerdirg her kuyuda PVDF zarı üzerinde lekeler. Bir otomatik ELISpot okuyucu sistemi veya elle sayım için bir stereomikroskopta gereklidir. bir bağışıklık tepkisinin tespit bölgesindeki ELISPOT ana avantajı TSK ve sitokin salgılayan hücrelerin miktarının onun süper hassasiyettir. Sırasıyla, humoral ve hücresel bağışıklık işlevsel faaliyetlerini bildirir. Hümoral bağışıklık fonksiyonu ölçümünde, ELISA ve ELISPOT tarafından numaralandırılan TSK sayısına göre belirlenir serum Ab düzeyleri sıklıkla ilişkilidir, ancak bu iki deneyleri veri readouts fonksiyonel etkileri 19-20 bazı farklılıklar var. ELISPOT ana avantajı yönteminin onun hassasiyetidir. Abs uygun izotiplerinin bilinen bir miktarı, referans olarak dahil edildiğinde, ELISA ile belirlendiği şekilde, serum antikor titrelerinin seviyesi konsantrasyon çıktılan olarak, daha çok nicel göre antikor seviyesi gösteren OD çıktılan olarak da yarı-nicel olarak sunulmaktadır, ya da. Bunun aksine, ELISPOT sonuçları presente olanilgi konusu bir hücre havuzu TSK mutlak sayısı D (ör bölünmemiş periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC) ve PBMC'lerden Saflaştırılmış B hücreleri) içerir. ELISpot tek ASC algılayabilir, ancak ELISA ölçümden önce optimize tahlil bağımlı konsantrasyonları ulaşmak için TSK dan Ab miktarda gerektirir. Bu nedenle, ELISpot ölçümü duyarlılığı ELISA besbelli üstündür. Ayrıca, ELISPOT, aynı zamanda aktive edilmiş hafıza B hücreleri in vitro farklı TSK ölçülmesi için uygundur. Bellek B hücreleri Abs salgılar yok ama aktivasyon üzerine TSK içine ayırt edebilirsiniz; bu nedenle ELISA ile tespit edilen serum Abs hiçbir katkısı var. Bu nedenle, ELISPOT kültüründe aktif hale bellek B hücrelerinin, dolaşımdaki bağışıklık tepkisinin ölçümü tercih edilen bir yöntemdir. Uzun vadeli humoral bağışıklığın bakım izlenmesi için izin verir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

İnsan periferal kan aydınlatılmış onam altında sağlıklı donörlerden elde edilen edilmeli ve kan örneklerinin kullanılması bireysel kurumsal inceleme kurulları tarafından kurulan onaylanan yönergelere uyması gerekir. Bu çalışmada, protokol Ulusal Tayvan Üniversitesi Hastanesi İç İnceleme Kurulu (protokol numarası 201307019RINB) tarafından onaylandı akış sitometri (Şekil 1) ve ELISpot deneyleri (Şekil 3) sonuçlarının bir gösteriye insan kanı kullanmak için.

1. İzolasyon ve insan çevre kan B hücreleri ile saflaştırılması

  1. K 2 EDTA (1,5-2,0 mg / ml kan) içeren bir 15 ml tüp içine (dirsek kübital fossa anterior) medyan kübital damardan kan ~ 10 mL çizme ve Tüp hemen pıhtı önlemek için birkaç kez ters çevirin oluşumu.
  2. Kırmızı kan hücresi (RBC), tampon (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO 3 ve 1 mM EDTA lizis (121 ° C, 15 dakika) otoklava 35 mL ekleme sTaze kan örneği (≥ 3 içeren tüp H 7.4): 1 hacim / hacim) ve bundan sonra daha 5 dakika boyunca oda sıcaklığında (RT) enkübe edilir.
    NOT: tüp aracılığıyla ışık geçirgenliği görünümü RBC lizis tamamlandığını gösterir.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. pelet beyaz renklidir olduğundan emin olun.
  4. 10, otoklavdan geçirilmiş fosfat tamponlu tuz mL pelletini (PBS, 137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4 ve 1.47 mM KH 2 PO 4; pH 7.4) ve 1.3 adım olarak santrifüj.
  5. Süpernatantı atın ml RPMI 1640 ortamında (takviyeleri:% 10 fetal buzağı serumu, 100 U / ml penisilin / streptomisin, 0.25 ug / ml amfoterisin B ve 2 mM L-glutamin) 10 pelletini, ve sonra plaka 10 cm'lik bir kültür tabağı içine hücreleri (tabak başına 10 ml kan). 30 dakika boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör çanak yerleştirin.
  6. Yavaşça kültür çanak birkaç kez girdap ve koyun15 ml plastik konik tüpler içine kültür ortamı (süspansiyon hücreleri). kültür yemekleri yapışık hücrelere (çoğunlukla makrofajlar) atın.
  7. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
  8. RPMI 1640 ortamı içinde 1 mL pelletini. Bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını sayın.
    Not: İzole lökositlerin canlılığı normal tripan mavi dışlama% 90 daha büyüktür.
  9. Aşama 1.7 olarak santrifüj ve 5 konsantrasyonda soğuk PBS tampon (% 0.5 inek serumu albümini (BSA) ve 2 mM EDTA) içinde ~ 200 uL hücreler tekrar süspansiyon - 10 x 10 6 hücre / mL idi.
  10. 10 6 hücre başına (B hücrelerinin negatif seçim için) kan hücrelerine spesifik biyotinile edilmiş anti-insan antikor kokteyli 5 uL ilave edin ve 30 dakika 21 buz üzerinde inkübe edilir.
    Not: Anti-insan antikor kokteyli, en azından CD2 (ya da CD3), CD14, CD16 özgü Abs içermelidir.
  11. 10 kat fazla hacim eklemesteril PBS hücreleri, 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ve süpernatant atmak.
  12. Eşit streptavidin-konjuge mikroboncuk miktarda pelet (10 6 hücre başına 5 uL) ilave edin ve iyice karıştırın.
  13. 15 ml plastik konik bir tüp içinde, 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
  14. tüpe PBS tamponu 2 mL ekleyin.
  15. Manyetik bir stand içine tüp yerleştirilir ve 8 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir. Kahverengi mikroboncuklarının yavaş yavaş yanında mıknatıs 22 tüp duvar eklenecektir.
  16. Manyetik stand kalan tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril 15-ml tüp 22 içine süpernatant aktarın.
  17. Tekrarlayın 1.16 ile 1.14 arasındaki adımları ve el değmemiş B hücrelerini içeren iki süpernatantlar birleştirir. mikrobilyeleri atın.
  18. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. süpernatant atın.
  19. alt deneyler için RPMI 1640 ortamında pelletini.
    NOT: Genellikle, 1-5 x 10 5 B hücreleri zekâhektar periferik kan, 10 mL% 95 daha yüksek saflıkta 23 izole edilebilir.

İzole B Hücreleri 2. saflaştırılması ve Bellek Ayırma ve naif B Hücreleri

  1. Adım 1 saflaştırılmış hücreleri kullanın ve bir hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücre sayısını belirlemek.
  2. 5 dakika boyunca 600 x g'de santrifüj ve oda sonra soğuk PBS tampon 100 ul hücrelerin tekrar.
  3. Kapalı 1 - 10 6 hücre başına biyotinile CD27 mAb'nin 2 ug ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  4. 5 dakika boyunca 600 x g'de tüp ve santrifüj PBS tamponu 10 mL ekleyin.
  5. Süpernatantı atın ve PBS tampon 50 mcL hücreleri tekrar süspansiyon.
  6. 15 ml plastik konik tüp hücrelere - (2 ug / 10 6 hücre 1) streptavidin manyetik mikro boncuklar eşit miktarda ekleyin.
  7. Yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  8. tüpe PBS tamponu 3 mL - 2 ekleyin.
  9. YeriManyetik bir stand içine boru ve kahverengi bir mikro-mıknatıs en yakın tarafına takmak için izin 8 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  10. manyetik stand tüp ile, dikkatli bir şekilde yeni bir steril tüpe süpernatant fraksiyonu aktarın. Naif B hücreleri - Bu fraksiyon zenginleştirilmiş CD27 içerir.
  11. Mikroboncuklar içeren tüp 5 ml ilave edilir ve yavaşça, mikro-boncuklar tekrar süspansiyon (örneğin, CD27 + bellek B hücrelerinin zenginleştirilmiş fraksiyon) 24-25.
  12. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında 600 x g'de santrifüjleyin. alt deneyler için RPMI 1640 ortamı ile pelet yeniden süspanse edin.
    Not: Genellikle, ~ 30 - B hücreleri% 60 sağlıklı donörden 7, 25-26 PBMC'lerden CD27 + bellek hücresi saflaştırılabilir.

Naif B Hücreleri, Bellek B Hücreleri ve PB / PC'ler Tahsil sıralama 3. Hücre

  1. 1 aşamasından gelen arıtılmış, hücreleri kullanarak, bir hemocytome kullanılarak hücre sayısını belirlemekter ya da otomatik hücre sayacı.
  2. 5 ml polistiren tüp içinde 10 7'deki mL konsantrasyonda soğuk PBS tamponunda tekrar süspansiyon hücreleri.
  3. Kapalı 1 - 10 6 hücre başına, insan IgG 2 ug ve Fc blok için, 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir.
  4. 1 ug her bir ekleme, anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323) ve anti-CD38-PE (klon: HIT2), 10 6 hücre başına; karıştırın ve 30 dakika 4, 27 için buz üzerinde inkübe edilir.
  5. Adım 3.4 son 5 dakika içinde, ticari 7-aminoactinomycin D (7-AAD) 5 mcL ekleyin.
  6. 5 dakika boyunca 600 x g'de tüp, girdap ve santrifüj 2 mL PBS ekleyin.
  7. 15 ml bir tüp içinde mL başına 5 x 10 7 hücre - 1 bir konsantrasyonda (% 2 BSA ve 2 mM EDTA ile, steril PBS) tampon sıralama tekrar süspansiyon hücreleri.
  8. hücre kümeleri ortadan kaldırmak için bir naylon örgü hücre süzgecinden (40 mikron gözenek boyutu) aracılığıyla hücrelere Filtre.
  9. bir akış sitometri tür hücreleri ayırınmor (405 nm), mavi (488 nm) ve kırmızı (640 nm): er üç lazer ile donatılmış.
    NOT: 3 renkli sitometri 27-28 akış yalnız mavi lazer yeterlidir.
  10. Sıralama, üç saf B hücrelerinin aynı anda toplama (5 ml RPMI ortamı ihtiva eden) 15 ml tüpler (CD19 + CD27 -) içine hücreleri, hafıza B hücreleri (CD19 + CD27 +), ve PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28.
    Not: Aşama 4'te tarif edildiği gibi kriteri naif ve bellek B hücreleri, kültürlenebilir.

Naiv B hücreleri - izole edilmiş insan CD19 + B hücreleri, CD19 + CD27 + hafıza B hücreleri, ve CD19 + CD27 in vitro ayrımında 4.

  1. adımlarda 1.19, 2.10, 2.11 ve 3.10 olarak saflaştırılmış hücreleri kullanarak, bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacı ile hücre sayısını belirlemek.
  2. RPMI 1640 ortamı ile tekrar süspansiyon hücreleri1 bir konsantrasyonda - ve ml başına 10 X 10 5, 12 oyuklu plakanın kuyularına kısım.
  3. / Ml 18, 29 5 mg / 10 6 hücre CpG (ODN 2006) ekleyin.
  4. Kültür, 5 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C inkübatör hücreleri.
  5. Her bir oyuğa hücreleri hasat 15 ml tüpler içinde ayrı ayrı yer, her tüpe 5 ml PBS ekleyin ve 5 dakika boyunca 600 x g'de ve oda sıcaklığında santrifüj.
  6. Hemasitometre ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak hücreleri saymak. RPMI 1640 ortamı ile mL başına 10 X Ekim 5-1 arasında bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon hücreleri.

5. ELISPOT testi

  1. 30 s için ELISPOT levhaların her çukuruna damıtılmış su içinde% 35 etanol içinde 30 uL ekleyin.
    NOT: pipetlerken zaman her zaman kuyularda membran dokunmaktan kaçının.
  2. etanol kaldırmak için ELISpot plakları ters çevirin.
  3. Her kuyuya 150 ul otoklava GKD 2 O koyun ve inkübe5 dakika boyunca oda sıcaklığında bunları bakiye Etanol temizlemek için; 3 dakika boyunca oda sıcaklığında steril PBS yıkama ile takip edin.
    NOT: 5.3 5.1 plakaların imalatı bağlı isteğe bağlı olabilir adımlar.
  4. Adına 5 ug / ml poliklonal F (ab ') anti-insan Ig (IgG + IgM + IgA) 2 fragmanı, 50 uL bir gece boyunca 4 ° C'de inkübe (PBS içinde) ELISPOT plakaların her kuyuya ve (tercih edilir) ya da 2 saat 11 süreyle 37 ° C.
    NOT: kullanılıncaya kadar Parafilm ile plakaların kenarları mühür.
  5. 3 dakika her zaman için oda sıcaklığında iki bağlanmamış Abs kaldırmak her iyi PBS 200 mcL ekleyin ve bunları inkübe plakları ters çevirin.
  6. de bloke edilmesi için her bir% 5 BSA (ya da RPMI 1640 ortamı) 200 ul PBS ekleyin ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe.
  7. engelleme tampon kaldırmak için plakları ters çevirin. Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın.
  8. Her bir oyuğa RPMI 1640 ortamı, 100 uL ilave edin ve 37 ° C'de inkübe.
  9. hazır hücreleri tohum olduğunda, RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin.
  10. Tohum 100 uL (5 x 10 4), 50 uL (2.5 x 10 4) ve bir kuyu içine 25 uL hücre (1.25 x 10 4) (adımlar 1.19, 2.10, 2.11, 3.10 ile ilgili ve 4.6) ELISpot plaka. RPMI 1640 ortamı ile, / oyuk 150 uL hacim getir.
    Not: hücreleri kaplama için bir ya da iki 2-kat seri seyreltiler en az tavsiye edilir.
  11. 14 saat 18-8 için% 5 CO 2 ile 37 ° C inkübatör inkübe edin. inkübasyon sırasında plakalar hareket kaçının.
  12. hücreleri ve RPMI 1640 orta kaldırmak için plakları ters çevirin.
  13. 3 dakika boyunca, oda sıcaklığında, her zaman 5 kez (% 0.05 Tween 20 ile PBS) 200 uL / ​​göz PBS-T ilave edin ve inkübe. 5 yıkar her biri arasındaki yıkama tamponu çıkarmak için plakayı ters çevirin.
  14. Keçi anti-insan IgG-alkalin fosfataz (AP), Fcy özgü Abs ya ekleme (IgG tespiti, 1: 5000 PBS-T içinde) Ya da keçi anti-insan IgM-AP, Fcμ fragmanı spesifik Abs (IgM algılama, 1: PBS-T içinde 5,000) tahsis edilen gözleri içinde ve karanlıkta, 2 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
  15. Aşama 5.5 olarak PBS, 200 uL her bir iki kez yıkayın.
  16. 50 uL / ​​oyuk bromochloroindolyl fosfat nitro mavi tetrazolyum (BCIP / NBT) alt-tabaka çözeltisi ekleyin. 15 dakika - Mor renkli lekeler normalde 5 görünür.
  17. Noktalar aşırı gelişimini önlemek için 100 uL / oyuk GKD 2 O ekleyin.
  18. tüm noktalar tam gelişiminden sonra akan musluk suyu ile plakaları durulayın.
  19. Plakaların Alt drenaj çıkarın ve onları karanlıkta kuru hava için izin verir.
  20. Bir görüntü alıcı / analiz ünitesi (örneğin, otomatik bir tarayıcı veya manuel bir mikroskop ile) ile otomatik bir plaka okuyucusu kullanılarak noktalar sayın.
    NOT: plakalar, karanlıkta oda sıcaklığında saklanır ve daha sonra analiz edilebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PBMC'ler eritrosit ve yapışık hücrelere (1.7 1.2 adımlar) tükenmiş bulundu. Hücrelerin bir tümböleni (2 x 10 6) periferal kan (Şekil 1) saf B hücreleri, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC popülasyonunu gösteren bir akış sitometrik analizi yapıldı. Bu vericinin PBMC'ler olarak, lenfositler, yaklaşık% 10 CD19 + B hücreleri idi. B-hücresi bölümünde, CD19 + CD27 yüzdesi - naif B hücreleri% 50 civarında idi. Öte yandan, CD19 + B hücreleri, yaklaşık% 50, 25-26 CD27 + bellek B hücreleri 7 idi. Not, CD27 + bellek B hücreleri daha IgD 4 dahil ayrılabilir. 2, 30-31 - PBS dolaşımdaki fenotip daha düşük ya da hiç yüzey CD20 ifadesi (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo /) ile tanımlanabilir. , Ölü hücreler 7-AAD dışlamak içinhücre boyama (aşama 3.5) ve 7-AAD karşı FSC bir arsa dahil edilebilir canlı hücreler (7-AAD -) nüfusu yolluk sağlar.

ELISPOT testi temel adımları Şekil 2'de tasvir edilmiştir. Hem saflaştırılmış insan B hücreleri ve CD19 + CD27 + bellek B hücreleri, 5 gün boyunca RPMI 1640 ortamı ile CpG varlığında kültürlenmiştir. Hücreler, yeni ortaya çıkan TSK ölçülmesi için ELISPOT testi için toplandı. Eğer mevcut ise, daha önceden var olan PB 48 saat 11'de ölecek periferal kanından izole edilmiştir. ELISpot deneyi yapıldı ve bir otomatik plaka tarayıcı tarafından edinilen nokta görüntüleri Şekil 3'te gösterilmiştir. 10 4 hücrelerinde 11 50 - IgG TSK sayısı 10 iken, 5 gün süreyle CpG ile tedavi 10 4 B hücrelerinden 200 IgM-TSK - ELISPOT sonuçları tipik olarak 50 gösterecektir.


Yolluk Stratejisi Şekil 1. İllüstrasyon Naif B hücreleri, Bellek B hücreleri ayırın ve ölçülerek PB için. (A) Hücreler (2 x 10 6) CD19 APC, CD27-eFluor450 ve CD38-PE mAbs (aşama 3.4) 2 ug her biri ile boyandı. lenfosit bölmesi yan saçılma (SSC) karşı ileri saçılma (FSC) için nokta arsa üzerinde (G1) Geçitli. Birbirine yapışmış iki hücre oluşur (B) Hücre ikili, FSC-W (genişlik) FSC-H karşı (yükseklik) için arsa üzerinde (o dış G2) dışı bırakılmıştır. (C), CD19 + B hücreleri SSC-A (alan) ve CD19-APC arsa üzerinde G3 olarak çevrilmiştir. CD19 + hücrelerinin (D), CD27 ve CD38 parametrelerinin nokta arsa naif B hücreleri (CD19 + CD27 - Q1 ve S4) gösterdi, hafıza B hücreleri (CD19 + CD27 +;Q2 ve Q3) ve PB (CD19 + CD27 + / hi CD38 +; G4, Q2% 0,6). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
ELISpot Testi Temel Adımlar 2. Çizimleri Şekil. (A), koyun 50 uL / oyuk (5 ng / ml) 2 saat süre ile bir ELISPOT plaka F (ab ') anti-insan Ig (IgG + IgM + IgA) 2 fragmanının 37 ° C ya da gece boyunca 4 ° de C (tercih) (adım 5.4). ELISPOT plakasının oyuklarına hücreleri tohumu. 14 saat (aşama 5.11) - TSK PVDF membranına bağlanabilir ve 8 Abs salgılamasına olanak sağlamak. (B) (% 0.05 Tween 20) ile hücrelerin PBS ile yıkayın. (C) AP ya da HRP-geçidi eklemeugated algılama IgG veya IgM ya özgü Abs. (D) bağlanmamış olan algılama Abs yıkayın. (E) algılama Abs maç AP veya HRP bir substrat çözeltisi ile noktalar geliştirin. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Temsilci Plate 3. ELISpot Sonuçları Şekil. (A) Saflaştırılmış CD19 + B hücreleri, ELISPOT plaka, üç komşu kuyu (sırasıyla gözü # 1 'de 50,000 hücre, iyi 2. 25.000 hücreleri ve # 3 12,500 hücre) içine yerleştirildi. Hücreler, RPMI 1640 ortamında gece boyunca (~ 14 saat) 'de kültürlenmiştir. ELISPOT testi kültürü tamamlandıktan sonra yapıldı (5.18 5.12 adım). onu çözümlemee sonuçlarına ELISpot plaka tarayıcı ve yazılım ile donatılmış otomatik analizör aracılığıyla görüntüleri elde etmek için tarandı. (B) saflaştırılmış CD19 + CD27 + bellek hücreleri (10 6 / ml), 5 gün boyunca 5 ug CpG / ml varlığında kültürlenmiştir. Hücreleri, ELISPOT deneyi için, (A) 'deki gibi muamele edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İzolasyon ve İnsan periferal kan B hücrelerinin saflaştırılması

Normalde, RBCs verimli rüptüre ve lizis tamponu (adım 1.2) tarafından silinebilir. hücre canlılığı amonyum klorür ile etkilenebilir gibi, 5 dakika daha uzun RBC parçalama tamponu ile PBMC'ler inkübe önemlidir. Seçenek olarak ise, RBC ve trombositlerin aynı zamanda aşağıdaki protokol ile temizlenebilir.

asit dekstroz sitrat (ACD) tamponu taze tam kan karıştırın (39 mM sitrik asit, 75 mM sodyum sitrat ve 135 mM dekstroz, pH 7.4) 9 bir hacim oranında: 1, kan için tamponu. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 250 x g'de santrifüjleyin. ayrılık gösteren katmanları, oluşumuna dikkat edin. Aspire ve trombositleri ve trombositten zengin plazma (sarı renk) içeren üst katman atın. PBMC'ler içeren arayüzü, en ince orta katmanı kaldırın (mekanizması doğrultusuyla satmaya başladılar., Buffy coat). d (alt katmanda eritrosit kirlenmesini önlemek) Kırmızı renk Ark. artık eritrositlerde kaldırmak ve daha sonra 1.19 arası adımları 1.2 izleyin PBMC'ler için lizis tamponu ekleyin.

Pozitif ve negatif seçim 21: iki yaklaşım PBMC B hücreleri izole etmek için kullanılabilir. negatif seleksiyon yöntemi mansap deneyler için sınır Abs ya da mikro-ile, el değmemiş, fonksiyonel B hücreleri elde etmek için kullanılır (1.1 1.19 arasındaki adımları). Aktivasyonu ve / veya saflaştırılmış B hücrelerinin farklılaşma kültüründe oluştuğunda bu durum dikkate alınarak için çok önemlidir. endişe pozitif seleksiyon ile saflaştırılmış hücreler yanlışlıkla mAb-konjuge microbeads (çapı 0,2 ila 5 um) etkilenebilir olmasıdır. mAb'ler aktivasyonu için reseptörler çapraz olabilir, bu nedenle, B hücreleri üzerinde spesifik reseptörlere bağlanan ve edebilir. Ayrıca, mikro-bağlı reseptör aracılık B hücreler tarafından endositoze edilebilir. biyobozunur olsa da, microbeads bir haftadan daha uzun süre hücrelerin içinde kalabilirler. İster bu deneyimlerden etkileyecektir mikro-boncuk saklamave başarısı ampirik bir şekilde tespit edilmesi gerekir. Pozitif seçim, anti-CD 19 (klonlar: 4G7 ve HIB19) ile insan B hücrelerinin saflaştırılması CD19 yaygın B hücrelerinin gelişim aşamalarında eksprese olduğu için mikro-yaygın olarak kullanılmaktadır. Anti-CD 19 mikro-farklı epitopları tanıyan (SJ25C1 ya LT19 klonları), ayrıldıktan sonra B hücrelerinin saflığı, anti-CD 19 mAbs ile akış sitometrisi ile tespit edilebilir.

Arıtma ve İzole B Hücreleri Memory ve naif B Hücreleri Ayrılması

CD27, insan hafızası ve naif B hücre ayrımı 24 için yaygın olarak kabul yüzey belirtecidir. CD27 molekülü, tümör nekroz faktör reseptörü (TNFR) ailesine aittir. Saf B hücrelerinin - CD27 çok insan bellek B hücreleri üzerinde ifade edildiği için, genellikle CD27 bunları ayırmak için kullanılır. Bununla birlikte, CD27, aynı zamanda, T hücreleri ve NK hücreleri, anti-CD27 microbea kullanımı üzerinde ifade edilir, çünküDS (klon: O323) pozitif bellek B hücrelerinin seçiminde B hücrelerinin önceden saflaştırma (1.19 1.1 adım) gerektirir. ayrılmasından sonra saflık kontrolü için, insan CD27 için spesifik mAb'ler (klonlar: L128 ya LG.3A10) (adım 2.12) tavsiye edilir. CD27 + bellek B hücreleri, heterojen olduğundan, bu IgD ve FCRL4 gibi ek yüzey belirteçleri, hücre 4, 7 ayırma de ayrılması için kabul edilebilir.

Naiv B hücreleri, hafıza B hücreleri, ve PBS / PC elde hücre sıralama

B hücreleri FcyRIIB'ye ifade çünkü, bir Fc blok (adım 3.3) flow sitometri için mAbs ile hücrelerin boyanması öncesinde tavsiye edilir. Tek başına insan IgG Fc fragmanları, 1 ug / 10 6 hücre bütün insan IgG olarak eşit olarak iyi engelleyebilir. Anti-insan CD32 mAb (klon: 3D3 veya AT10) Fc blok için başka bir seçenektir. FcyRIIB bir yüzey işaretleyici ise Not, arıtılmış, B hücrelerinde lekelenmesine, florofor konjuge edilmiş anti-CD32 mAb SHPBS yıkama olmadan başka mAb'ler ile boyanarak, ardından Fc Block, feragat eklenebilir ould.

Üç renk için CD38-FITC (floresein), CD27-PE (Fikoeritrin) ve CD19-APC (alofikosiyanin) fluorophores tipik bir bileşimidir, akım sitometri. akım sitometri sıralayıcı gibi 405 nm, 488 nm ve 640 nm gibi üç lazerler ile donatılmıştır Yine de, eğer araştırmacılar daha sonra hücre sıralama için farklı lazerler tarafından heyecan fluorophores seçmek lüksüne sahip. , CD27-eFluor450 (Pasifik mavi klon eşdeğer: O323) ve CD38-PE (klon: HB7) naif B hücreleri ayırmak için, bellek: Şekil 1 'de gösterildiği gibi, hücreler, CD19 APC (HIB19 klon) ile boyanmıştır B hücreleri ve PBS ile yıkandı. Bir CD45 + CD19 + nüfusu bir lökosit soy işaretleyici ve kapı B hücreleri olarak: (HI30 klon) notu, bazı araştırmacılar CD45 dahil tercih ederim. kararlı durumda dolaşımdaki PBS tespiti nadir arife olduğundansubstantiates onların iyi niyetli varlığı 2, 30-31 - nt sağlıklı düşük bireyler veya PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo /) üzerinde CD20 hatta hiç yüzey ifadesinde. ELISpot deneyleri yüzey fenotipleri ve TSK tarafından PBS ölçümü sonuçları karşılaştırıldığında ediliyor kullanışlıdır. önceden hücre sıralamaya dönemde 7-AAD nedeniyle dar emisyon spektrumu ve akış sitometrisi çok renkli düşük yayılma için, ölü hücrelerin çıkarılması için, propidyum iyodür tercih edilir.

In vitro stimülasyon ve izole edilmiş insan B hücrelerinin farklılaşmasında

tip B CpG (ODN 2006), tek başına bellek B hücreleri IgM- IgG-TSK hem sınırlı farklılaşmasını teşvik edebilir. Ayrıca, saf B hücreleri, sadece CpG zayıf bir yanıt veren ve temel olarak IgM TSK 6, 11 neden olmaktadır. Kültür içinde CpG konsantrasyonu 2.5 aralığındadır - 5 ug / ml 10 6 B hücre başınaveya PBMC'ler 11, 18. CpG dışında, arıtılmış, B hücreleri ve PBMC (aşama 4.3), mitojenlere, sitokinlere ve BCR agonistleri ile CpG kombinasyonları varlığında kültürlenebilir kültür TSK, insan B hücreleri ayırt etmek. Örneğin, yaygın olarak mL başına 10 6 hücre tariflerini kullanılan, (a) CpG (5 ug / ml), rekombinant insan IL-2 (10 ng / ml) ve rekombinant insan IL-10 (10 ng / ml), 15 34; (b) CpG (5 ug / ml) ve F (ab ') anti-insan Ig (IgG + IgM + IgA) 2 fragmanları, (20 ug / ml) 11; (c) CpG (5 ug / mL), S. aureus Cowan (SAC) protein A (1: 10,000 seyreltme) ve pokeweed mitojen (PWM) (1: 100,000 seyreltme) 18; (d) rekombinant insan IL-21 (100 ng / ml) ve rekombinant sCD40L (1 ug / mL) 12, 15, 33; ve (e) yeniden birleştirici insan IL-2 (10 ng / ml) ve R848 (1 ug / mL), agonist, bir TLR7 33-34. B hücreleri üç gün 11 TSK olarak ayırt edilebilir, ancak, hücreler genellikle ön-S olanönceden TSK 11, 18 miktarının ELISPOT plakaya eklenmeden 5 ila 6 gün boyunca timulated. kültür döneminde, genellikle başlangıç ​​farklılaşma ajanlarının hiçbir ikmal yoktur.

CpG-içeren kültürlere IL-2 ve IL-10 eklenmesi önemli ölçüde farklılaşmış IgM- IgG-TSK 15, 35 sayısını artırabilir. kültür içinde IL-2 ile CpG ayırt B hücrelerinin genişleme kolaylaştırmak için mitojenik uyarımı sağlayabilir. IL-Ekim 10-25 ng aralığında / ml ölçüde CpG 35 mevcudiyetinde TSK üretimini (~ 3 ila 10 kat) artırabilir. Anti-BCR ve SAC ve PWM dahil BCR agonistleri, primer insan B hücreleri 18 proliferasyonunu uyarabilir. CpG ve poliklonal anti-BCR IgG TSK 28 esas olarak IgM TSK bir artışa yol açar fakat bellek B hücrelerinin inkübe edilmesi. FcyRIIB'ye bir F BCR yoluyla sinyal inhibisyonu önlenmesinde (ab# 39;), anti-Ig 2 fragmanı (10 - 20 ug BCR 11 çapraz bağlama sırasında önerilir) 10 6 hücre başına / ml. Bunun yerine, poliklonal bir anti-Ig ya IgM + veya IgG + B hücrelerine spesifik anti-BCR mAb'ler TSK halinde farklılaşması için izotip özgü B hücre alt grupları hedef göz önüne alınmalıdır. (: 10,000 sulandırma 1), ve PWM (1: 100,000 seyreltme) CpG, SAC bir kombinasyonu etkin IgM- IgG-TSK 18, 24 içine ayırt etmek için hafıza B hücrelerini aktive edebilir. Ayrıca, CpG orta vitro 28-29 yılında Ig sınıf anahtarlama neden olabilir. Buna, IL-21 (100 ng / ml) ve sCD40L 'deki (1 ug / mL) etkili bir şekilde açık IgG TSK 12, 30 özel bellek B hücresi farklılaşmasını indükler. SCD40L in vivo PC içine farklılaşmasını etkileyen, B hücreleri üstündeki CD40 ile T-hücresi yardımı taklit ederek B hücrelerini aktive edebilir. Notun, anti-CD40 (klon: 89 veya G28.5) kültürde 15 sCD40L yerini alabilir. ancak buradaner, tek başına sCD40L ya anti-CD40 de bellek B hücrelerinin farklılaşmasını teşvik edebilmektedir. Bu nedenle, kültürlenmiş B hücrelerinin CD40 aktivasyon genellikle Ig sınıf değişimi teşvik herhangi biri IL-4, CpG, R848, veya IL-21 gibi bir farklılaşma maddesi ile bir araya getirilmektedir. IL-4, kültür IgG1 + B hücreleri geçmek için çok lgM + B hücrelerinin uyarılmasını sağlayan Th2 CD4 hücreleri farklılaşmasında önemli bir rol oynar. Benzer şekilde, IL-21 varlığında, hafıza B hücreleri ve naif B hücreleri hem sınıf anahtarlamalı TSK 12, 32 içine özel olarak farklılık gösterir. CpG gibi, R848 B hücreleri 34 marjinal sınıf anahtarı neden olabilir. Son olarak, bu lipopolisakarit (LPS) etkili bir TSK Fare B hücrelerinin farklılaşmasını teşvik rağmen, insan B hücreleri TLR4 ve CD14 29 düşük seviyelerde eksprese olduğunu belirtmek gerekir. kültür bir farklılaşma maddenin eklenmesi açık B hücrelerinin üretimini teşvik için, bu ek kaçınılmalıdırönceden var olan PBS / PC veya anahtarsız bellek B hücreleri ne ölçülecek.

ELISPOT testi

ELISPOT testi tek bir B hücresi 18 tarafından salgılanan antikorların tespiti için izin membran bazlı Western blotting teknolojilerle plaka bazlı ELISA'lar birleştirir. ELISPOT da sitokinler 17, 36 salgılayan Ag-spesifik T hücresi sayısını bulmak için adapte edilmiştir. bir ELISPOT deneyi saflaştırılmış hücreler, ya da (eritrosit serbest) bölünmemiş PBMC halinde kullanılabilir. Bununla birlikte, ~ saflaştırılmış hücreler, ELISPOT deneyleri tutarlı sonuçlar elde etmek için daha fazla PBMC gerekmektedir 10 kat. PBMC'ler dolaşan TSK tespit etmek için kuyu başına 2 x 10 5 hücre - iyi bir başlangıç noktası 1'dir. Ag-spesifik TSK, tespiti, anti-lg, genellikle Ag ile ikame edilir (5-10 ug / ml PBS içinde) Ag-spesifik ACSS (aşama 5.4) yakalamak. izotip spesifik saptama Abs kullanımı Ag-spesifik IgM-TSK ve IgG izotop-TSK arasındaki farkı (5.1 adım izin4). Dikkat çekici bir şekilde, bağımsız olarak, anti-lg veya Ag TSK yakalamak için kullanılır bağımsız olarak, ELISA için kullanılan algılama Abs her ELISPOT için uygun olmayabilir. Benzer şekilde, değil ELISA için tüm renk yüzeyler ELISPOT düzgün çalışması. AP ve HRP konjuge Abs en yaygın ELISPOT spot tespiti için kullanılır. BCIP / NBT substrat çözeltisi 3,3 ', 5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) ve 3-amino-9-etilkarbazol ise (AEC) çözümleri HRP için ortak substratlardır, AP-tabanlı algılama için uygun bir seçimdir elisa testinde. AP ya da HRP ile doğrudan tespit Abs konjüge ise protokol (aşama 5.14) 'de tarif edildiği gibi, tek bir adım saptanması için ihtiyaç vardır. Bunun aksine, algılama Abs biyotinile edilmiş ve iki aşamalı bir yöntemde alt tabakalar ile reaksiyondan önce AP-ya da HRP-bağlı streptavidin ile bunu izleyen inkübasyon gerektirmektedir. Hem tek-aşamalı ve iki-aşamalı yöntemlerdir ve ELISPOT noktalar tespit etmek için etkili bir şekilde çalışır.

ELISPOT testi sadece dolaştırma sayısal olaraking ama aynı zamanda (4.6 karşı 1.19 adım) kültüründe TSK ayırt. Eğer mevcut ise, normal olarak, artık Kültür içinde iki günden fazla canlı TSK, dolaşımdaki veya PBMC'lerden 11 arıtılmadan ELISPOT plaka doğrudan kültürlenebilir. Bunun aksine, bellek B hücrelerinin farklılaşma 5 gün gerektirir. Bu nedenle, hücre izolasyonu (adım 1.19) sonra ELISpot plakaları doğrudan kültür tavsiye edilmez; uzun kültür dönemi kaynaklanan ölü hücre enkaz nokta tespiti arka plan artırabilir. Bunun yerine, saflaştırılmış B hücrelerinin ve tüm PBMC hem birinci mitojenler ve farklılaşma maddeler (aşama 4.3) mevcudiyetinde bir 6-yuvalı veya 12-çukurlu plaka içinde kültürlenebilir. Kültür işlemi sırasında stimulasyon maddelerin tekrar eklenmesi gereksiz (aşama 4.3) 'dir. plakalar enkübatör de olsa da, kuluçka kapak hafifçe bu hareket yolları boyunca salgılanmış Abs yayılabilir için noktalar üretilmesi, hareket tohumlanmış TSK önlemek için açılıp kapatılmalıdırkuyrukları (sözde "kuyruklu yıldız gibi" lekeler) (adım 5.11) ile. ELISPOT plakalarında Kuluçka süresi Noktası sayımı zorluk yaratacak hücreler bölünmeye izin vermeden antikorların tespit miktarda salgılayan hücreleri için gereken süre ile tespit edilir. Bu durumda, hücreler, 8 saat boyunca (aşama 5.11) aralığında, genellikle kültürlenir.

ELISpot tahlil bellek B hücre yanıtlarını ölçülmesi için en yaygın kullanılan yöntemdir. Bu hümoral immün yanıt ve immünolojik hafıza popüler, bağımsız okuma haline gelmiştir. Pratikte, önceki mitojenik kültür TSK (4.3 adım a) içinde farklılaşması için hafıza B hücrelerini aktive etmek için gereklidir. Yukarıda anlatıldığı gibi, hafıza B hücreleri, genişletme ve TSK farklılaşırlar frekanstır, farklı bir kültür ortamında değişir. uzlaşma olmadan rağmen, pek çok araştırmacı TSK üretimini maksimize indüksiyon durumunu benimsenmesi. ajan açısından nokta gözetleme için kullanılann, bir çözünür biyotinile Ag hassasiyeti 37 ödün vermeden yetersiz algılama Ab değiştirebilirsiniz. Ag çok daha düşük bir miktarda plakaları kaplamak için daha tespiti için gerekli olduğundan Ag durumu sınırlı olduğu durumlarda bu özellikle önemlidir. Son olarak, ELISpot hücresel heterojenite fenotipik analizini izin vermez, ve böylece hücre alt önceden fraksiyonasyon gerektirir. Son zamanlarda, algılama Abs farklı flüorofor ile etiketlenmiş olan bir çok renkli ELISPOT testi, tek bir oyuk 38-39 sitokin salgılayan hücrelerin çok tip tespit etmek için geliştirilmiştir. Bu yeni teknoloji, PBMC'ler düşük frekanslı hücrelerinin saptanması için ve aşı ile uyarılan B-hücresi tepkilerinin büyük ölçekli analizi için özellikle ilgi çekici olacaktır.

ELISPOT testi TSK ve sitokin salgılayan hücrelerin miktarının hızlı ve etkin olduğu için, sadece Circu işlevselliğini ölçmek için genişletilmiştirBöyle intrahepatik lökositler 40 olarak lenfositleri, aynı zamanda doku bağışıklık hücrelerini, izolasyon. Hatta tek bir ASC tespit seviyesine ulaşma duyarlılığı nedeniyle, ELISPOT testi artan mevcut ve ortaya çıkmakta olan patojenlere karşı aşı etkinliklerinin insan bağışıklık tepkilerini ölçmek için kullanılmıştır. ELISPOT testi yüksek verimlilik performansı ve dayanıklılık PBMC'ler kullanılarak bağışıklık tepkilerinin büyük çaplı değerlendirmeler için mükemmel olmakla birlikte, deneylerin sonuçları hücreler taze veya dondurulmuş olsun, bu örneklerin işlem gecikmesi gibi çeşitli faktörler tarafından etkilenebilir serum, kültür ortamı içinde bileşenler ve ELISPOT plaka 41 eklenen hücre sayısı. Böylece, normalizasyon prosedürleri büyük ölçekli ve boyuna takip çalışmaları (örneğin, aşı denemeleri) 'de içi ve inter-analiz varyasyonu en aza indirmek için ELISpot protokolüne dahil edilmelidir. Plaka okuma normalizasyon yöntemi de doğrusallık, doğruluk ve eksilerini için kritiktahlilinde istency 41-42 sonuçlanır. plaka okuma normalleştirme gerçekleştirmek için bir yolu ELISpot plakaları (adım 5.10) ile seribaşı hücrelerin seri seyreltme işlemi uzatmaktır. Bir referans plaka oluşturarak, daha seri seyreltme kuyu başına kaplama hücre sayıları ve oyuk başına nokta sayısı arasında doğrusal bir ilişki göstermelidir. ELISpot plaka tekrarlanan taramaları, hem otomatik ve manuel, spot sayımı şablonu doğrulamak için kullanılabilir. Spot sayısı minimal içi kuyu değişkenlik bu normalleşme prosedürleri 43 sonra öngörülmektedir. Son olarak, ELISPOT uygulaması gibi enfeksiyonlar ve alınması kanser immünoterapilerin hastaların tedavi yanıtlarının izlenmesi, yanı sıra immünotoksisite değerlendirilmesi (örneğin, immünsupresyon ve ilaca bağlı otoimmünite) gibi birçok şekillerde uzatılabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer K2E BD Biosciences 367525 10 mL tube
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-02 endotoxin-free
Trypan blue 0.5% solution Biological Industries 03-102-1B
IMag Human B lymphocyte enrichment set BD Biosciences 558007
Biotinylated CD27 mAb Biolegend 302804 clone O323
Streptavidin magnetic microbeads BD Biosciences 9000810
15 mL Falcon tubes BD Falcon 352196
Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm BD Falcon 352340
Anti-human CD19-APC Biolegend 302212 clone HIB19
Anti-human CD27-eFluor 450 eBioscience 48-0279-42 clone O323
Anti-human CD38-PE-Cy7 Biolegend 303516 clone HIT2 
Anti-human CD38-PE-Cy7 BD Biosciences 560677 clone HIT2 
Anti-human CD45-FITC Biolegend 304006 clone HI30
Anti-human CD45-FITC BD Biosciences 555482 clone HI30
Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 Biolegend 124213 clone LG.3A10
Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 BD Biosciences 65429 clone L128
Anti-human CD19-FITC Miltenyi Biotec 130-098-064 clone LT19
Anti-human CD19-FITC GeneTex GTX75599 clone LT19
Anti-human CD20-FITC BD Biosciences 555622 clone 2H7
biotinylated anti-human CD27 Biolegend 302804 clone O323
biotinylated anti-human CD27 eBioscience 13-0279-80 clone O323
7-aminoactinomycin D (7-AAD) BD Biosciences 559925
CpG (ODN 2006)  InvivoGen tlrl-2006 type B CpG
Recombinant human IL-2 PeproTech 200-02
Recombinant human IL-10 PeproTech 200-10
Recombinant human IL-21 PeproTech 200-21
Recombinant human sCD40L PeproTech 310-02
Protein A of S. aureus Cowan (SAC) Sigma-Aldrich 82526
Pokeweed mitogen (PWM) Sigma-Aldrich L9379
MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size Merck Millipore MSIPS4510 sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane
BCIP/NBT solution Sigma-Aldrich B6404
BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate Merck Millipore ES006
Human IgG Jackson ImmunoResearch 009-000-003
Human IgG, Fc fragment Jackson ImmunoResearch 009-000-008
F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) Jackson ImmunoResearch 109-006-127
Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-008
Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-055-043
Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-008
Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific Jackson ImmunoResearch 109-035-095
BD ELISPOT AEC substrate kit BD Biosciences 551951
C.T.L. ImmunoSpot analyzer C.T.L.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
  2. Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
  3. Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
  4. Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
  5. Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
  6. Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
  7. Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
  8. Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
  9. Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
  10. Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
  11. Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
  12. Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
  13. Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
  14. Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
  15. Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
  16. Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
  17. Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
  18. Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
  19. Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
  20. Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
  21. Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
  22. Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
  23. Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
  24. Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  25. Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
  26. Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
  27. Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
  28. Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
  29. Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
  30. Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
  31. Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
  32. Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
  33. Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
  34. Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
  35. Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
  36. Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
  37. Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
  38. Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
  39. Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
  40. Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
  41. Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
  42. Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
  43. Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).

Tags

Immunology Sayı 118 Tıp İnsan tedavisinde hümoral immünite periferal kan mononükleer hücreleri B hücre İzolasyon farklılaşma antikor salgılayan hücreler enzim-bağlı immünospot enzime bağlı Immunoabsorbance deneyi akım sitometrisi
İzolasyon, Farklılaşma ve Niceleme İnsan Kanı B Hücreleri Antikor salgılayan: ELISPOT Hümoral Bağışıklık bir Fonksiyonel Göstergesi'nin olarak
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Tzeng, S. J. The Isolation,… More

Tzeng, S. J. The Isolation, Differentiation, and Quantification of Human Antibody-secreting B Cells from Blood: ELISpot as a Functional Readout of Humoral Immunity. J. Vis. Exp. (118), e54582, doi:10.3791/54582 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter