Abstract
Kendetegnet for humoral immunitet er at generere funktionelle ASC'er, der syntetiserer og secernerer Abs specifikke for et antigen (Ag), såsom en patogen, og som anvendes til værtsforsvar. Til kvantitativ bestemmelse af den funktionelle status af det humorale immunrespons af en individuel, både serum Ab'er og cirkulerende ASC'er almindeligvis måles som funktionelle udlæsninger. Hos mennesker, perifert blod er den mest bekvemme og let tilgængelig prøve, der kan anvendes til bestemmelse af den humorale immunrespons, som fremkaldes af vært B-celler. Distinct B-celle-delmængder, herunder ASC'er, kan isoleres direkte fra perifert blod via selektion med slægt-specifikke Ab-konjugerede mikroperler eller via cellesortering med flowcytometri. Desuden kan oprensede naive og memory-B-celler aktiveres og differentieret til ASC'er i kultur. De funktionelle aktiviteter af ASC at bidrage til Ab sekretion kan kvantificeres ved ELISpot, som er et forsøg, der konvergerer enzym-bundet immunoabsorbance assay (ELISA) og Western blotting teknologier til at muliggøre tælling af individuelle ASC'er på single-celle niveau. I praksis har ELISpot-assayet i stigende grad blevet anvendt til at evaluere vaccineeffektivitet på grund af den lette håndtering af et stort antal blodprøver. Fremgangsmåderne til isolering af humane B-celler fra perifert blod, vil differentieringen af B-celler i ASC'er in vitro, og anvendelse af ELISpot til kvantificering af totale IgM- og IgG-ASC'er blive beskrevet her.
Introduction
B-celler spiller en central rolle i udviklingen af humoral immunitet. De oprindeligt udvikle sig i knoglemarven og ind i blodet som naive B-celler, som kan migrere ind i lymfevæv, såsom milt, lymfeknuder og mandler, til videreudvikling. Upon Ag møde, nogle naive B-celler migrerer ind lymfoide follikler, hvor kimcenter B-celler kan differentiere til memory-B-celler og plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC'ere). Mens de fleste PBS / pc'er egress i blodstrømmen, et par vinder opholde sig i knoglemarven til at undergå terminal differentiering til langlivede pc'er 1. B-celler i omløb er heterogene, og ved steady state, PBS / pc'er er sjældne i perifert blod 2. Som følge af tilgængeligheden af slægt-specifikke overflademarkører, flowcytometri er blevet en populær metode til identificering og karakterisering af de B-celle-undergrupper i perifert blod. En udvidet anvendelse af flow cytometry er tilføjelsen af en cellesorteringsapparat funktion, der tillader separation og isolering af individuelle undergrupper af B-celler med høj renhed. Baseret på ekspressionen af specifikke overfladereceptorer på forskellige udviklingsstadier, humane cirkulerende B-celler er generelt inddeles i tre hovedkategorier subpopulationer: naive B-celler (CD19 + CD27 - CD38 -), memory-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -), og PBS / pc'er (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (figur 1). Naive B-celler af natur har ikke stødt Ags. De kan imidlertid opdeles i IgM + CD27 + B-hukommelsesceller. Selv naive B-celler er homogene i at udtrykke B-celle antigen receptor (BCR) associeret molekyler (f.eks CD19, CD20 og CD22) de er heterogene i deres immunglobulin repertoire 5. Størstedelen af CD27 + B-hukommelsesceller kan differentieres til CD27+ / hi CD38 + PBS / pc'er 6. Desuden memory-B-celler og PBS / pc'er er polyklonale og udviser udviklingsmæssig og funktionel heterogenitet 4-7. PBS / pc'er i omløb normalt kortvarig og ikke udtrykker CD138, men dem, der foretages for at slå sig ned i knoglemarven vil terminalt differentiere og blive langlivede. Terminalt differentierede pc'er udtrykker CD138 og nedregulere CD27-molekyler på deres overflader 8. Da både PBS og pc'er er i stand til at udskille Abs, i mange lejligheder de er kollektivt betegnet som ASC-kontrakter. I modsætning hertil kan hverken naive B-celler eller memory B celler producerer betydelige mængder af Abs 9-10. Men når isoleret, både naive og memory-B-celler kan differentieres til ASC'er i 3 - 10 dage, når de anbringes i de rette dyrkningsbetingelser 6, 11-15. Faktisk ASC'er stammer fra in vitro-differentiering deler lignende overflade udtryk for CD27 og CD38 med de direkte isoleret frabout perifert blod 6. Derudover ASC'er differentierede in vitro udtrykker et lavt niveau af overfladen CD20, ligner den for cirkulerende PBS / pc'er 6. Selvom kultur-afledte ASC'er er alle kortvarig, kan de udskiller Abs, hvilket indikerer, at de er funktionelt kompetente og i stand til at bidrage til den humorale immunitet.
Både ELISA og ELISpot er langt de mest almindeligt anvendte metoder med at opnå funktionel information om det humorale immunrespons. ELISA er en 96-brønds plade-baseret assay, og det er ofte anvendt til at måle titre af serum Ag-Ab'er og andre analytter (f.eks cytokiner). Det er praktisk og skalerbar. ELISA kan bruge en fastfase-enzymanalyse at detektere tilstedeværelsen af Abs eller andre stoffer, såsom serum, i en væskeprøve 16. De udlæsninger fra serum ELISA'er er ofte blevet brugt til at repræsentere immunresponset af kroppen. Et værktøj nødvendigt for erhvervelse af readouts fra ELISA-assays Spektrofotometrisk mikropladelæser. Læseren kan bestemme den optiske densitet (OD) af slutprodukterne typisk dannes ved reaktionen af peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret påvisning Abs og deres specifikke substrater 17. Med hensyn til at rapportere det humorale immunrespons, serum Ab-niveauer bestemt ved ELISA betegne den kollektive, men ikke individuelt, udførelse af ASC'er i kroppen. Desuden ELISA ikke tager hensyn til deltagelse memory-B-celler, som ikke udskiller Abs.
Ligesom ELISA, ELISpot er en meget anvendt metode til påvisning og overvågning af immunrespons i blodprøver perifere 17-18. ELISpot er en teknik relateret til en sandwich-ELISA. Heri anbringes celler i polyvinylidendifluorid (PVDF) membran-backed brønde af 96-brønds mikroplader for en kortsigtet kultur. ELISPOT-assayet er analog med udførelse western blotting på en mikroplade og developing pletter på PVDF-membran i hver brønd. Et automatiseret ELISpot reader system eller et stereomikroskop for manuel tælling er påkrævet. Den største fordel ved ELISpot i detektion af en immunreaktion er dens fremragende følsomhed i kvantificeringen af ASC'er og cytokin-secernerende celler. Det rapporterer deres funktionelle aktiviteter i humorale og cellulære immunitet, hhv. Ved målingen af humorale immunforsvar, er serum Ab-niveauer bestemt ved ELISA, og antallet af ASC'er opregner ELISpot ofte korreleret, men data udlæsninger fra disse to assays har nogle forskelle i funktionelle implikationer 19-20. Den største fordel ved ELISpot er dens følsomhed metode. Niveauet af serum Ab-titre som rapporteret af ELISA præsenteres semi-kvantitativt som OD udlæsninger, der angiver det relative Ab-niveau, eller mere kvantitativt, da koncentration aflæsning, når en kendt mængde af de rigtige isotyper af Abs er medtaget som reference. I modsætning hertil resultaterne af ELISpot er presented som den absolutte antal ASC'er i en celle pulje af interesse (f.eks ufraktionerede mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) og renset B-celler fra PBMC'er). ELISpot kan detektere en enkelt ASC, men ELISA kræver Ab mængder fra ASC'er at nå optimerede assay-afhængige koncentrationer før målingen. Derfor ELISpot er naturligvis bedre end ELISA i følsomhed kvantificering. Desuden ELISpot er også egnet til kvantificering af in vitro differentierede ASC'er fra aktiverede B-hukommelsesceller. B-hukommelsesceller udskiller ikke Abs men kan differentiere til ASC'er ved aktivering; de derfor ikke har bidraget til serum Abs detekteret ved ELISA. , ELISpot er således den foretrukne metode til måling af immunresponset af cirkulerende memory-B-celler efter aktivering i kultur. Det giver mulighed for overvågning af opretholdelsen af langsigtet humoral immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant perifert blod skal indhentes fra raske donorer under informeret samtykke, og brugen af blodprøver skal være i overensstemmelse med de godkendte retningslinjer fastlagt af de enkelte institutionelle anmeldelse bestyrelser. I denne undersøgelse, at protokollen bruge menneskeblod i en demonstration af resultaterne af flowcytometri (figur 1) og ELISPOT-analyser (figur 3) blev godkendt af den interne Review Board of National Taiwan University Hospital (protokol nummer 201307019RINB).
1. Isolering og oprensning af humane perifere blod B-celler
- Tegn ~ 10 ml blod fra medianen kubiske vene (i kubiske fossa anterior til albuen) i en 15-ml rør indeholdende K2EDTA (1,5 til 2,0 mg / ml blod) og straks Vend røret flere gange for at forhindre blodprop dannelse.
- Tilsættes 35 ml autoklaveret (121 ° C, 15 min) af røde blodlegemer (RBC) lyseringsbuffer (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3, og 1 mM EDTA; pH 7,4) til røret indeholdende det friske blodprøve (≥ 3: 1 volumen / volumen) og inkuberes ved stuetemperatur (RT) i et længere tidsrum end 5 min.
BEMÆRK: Udseendet af lystransmission gennem røret indikerer færdiggørelsen af RBC-lyse. - Centrifuger ved 600 xg ved stuetemperatur i 5 min. Sørg for, at pillen er hvid i farven.
- Pelleten resuspenderes med 10 ml autoklaveret phosphatbufret saltvand (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Na 2 HPO 4, og 1,47 mM KH 2 PO 4, pH 7,4) og centrifugeres som i trin 1.3.
- Supernatanten fjernes, resuspender pelleten med 10 ml RPMI 1640-medium (supplementer: 10% føtalt kalveserum, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 0,25 ug / ml amphotericin B og 2 mM L-glutamin) og derefter plettere celler i en 10 cm dyrkningsskål (10 ml blod pr skål). Skålen anbringes i et 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 30 min.
- Forsigtigt hvirvel dyrkningsskålen et par gange og placerdyrkningsmedium (suspension celler) i 15-ml plastik koniske rør. Kassér de klæbende celler (for det meste makrofager) på kultur retter.
- Centrifuger ved 600 xg ved stuetemperatur i 5 min. Supernatanten kasseres.
- Pelleten resuspenderes med 1 ml RPMI 1640-medium. Tæl celle nummer med et hæmocytometer eller en automatiseret celletæller.
BEMÆRK: levedygtighed isolerede leukocytter er normalt større end 90% ved trypan blå-udelukkelse. - Centrifuge som i trin 1.7 og resuspender cellerne i ~ 200 pi kold PBS-puffer (0,5% bovint serumalbumin (BSA) og 2 mM EDTA) ved en koncentration på 5 - 10 x 10 6 celler / ml.
- Tilsæt 5 pi af biotinyleret anti-humant Ab cocktail specifik blodceller (for negativ selektion af B-celler) pr 10 6 celler og inkuberes på is i 30 minutter 21.
BEMÆRK: anti-human Ab cocktail bør mindst omfatte Abs specifikke for CD2 (eller CD3), CD14, og CD16. - Tilføj et 10 gange overskud volumensterilt PBS til cellerne, centrifugeres ved 600 xg i 5 min, og kassér supernatanten.
- Tilføj lige store mængder af streptavidin-konjugeret mikrokugler (5 uL pr 10 6 celler) til pellet og bland grundigt.
- Der inkuberes på is i 30 minutter i en 15-mL plastic konisk rør.
- Der tilsættes 2 ml PBS-buffer ind i røret.
- Reagensglasset anbringes en magnetisk stativ og inkuberes ved stuetemperatur i 8 min. De brune mikroperler vil gradvist tillægger røret væggen ved siden af magneten 22.
- Med røret tilbage i den magnetiske stativ, omhyggeligt overføre supernatanten til et nyt sterilt 15 ml rør 22.
- Gentag trin 1,14-1,16, og kombinere de to supernatanter, der indeholder de uberørte B-celler. Kassér mikroperlerne.
- Centrifuger ved 600 xg ved stuetemperatur i 5 min. Supernatanten kasseres.
- Pellet resuspenderes i RPMI 1640 medium for downstream eksperimenter.
BEMÆRK: Typisk 1 - 5 x 10 5 B-celler witha renhed på over 95% fra 10 ml perifert blod kan isoleres 23.
2. Oprensning og adskillelse af hukommelse og naive B-celler fra isolerede B-celler
- Bruge celler oprenset fra trin 1 og bestemme celleantallet anvendelse af et hæmocytometer eller en automatisk celletæller.
- Resuspender cellerne i 100 pi kold PBS-buffer efter centrifugering ved 600 xg og stuetemperatur i 5 min.
- Tilføj 1 - 2 ud ug biotinyleret CD27 mAb pr 10 6 celler og inkuberes på is i 30 minutter.
- Der tilsættes 10 ml PBS-buffer til røret og der centrifugeres ved 600 xg i 5 min.
- Supernatanten fjernes, og cellerne resuspenderes i 50 pi PBS-buffer.
- Tilføj lige store mængder af streptavidin magnetiske mikroperler (1 - 2 ug / 10 6 celler) til celler i en 15-mL plastic konisk rør.
- bland forsigtigt brønd og inkuberes på is i 30 minutter.
- Tilsæt 2 - 3 ml PBS-buffer til røret.
- Placerrøret i en magnetisk stativ og inkuberes ved stuetemperatur i 8 minutter for at tillade den brune mikroperler at fastgøre til side tættest på magneten.
- Med røret i den magnetiske stativ, omhyggeligt overføre supernatantfraktionen til et nyt sterilt rør. Denne fraktion indeholder den berigede CD27 - naive B-celler.
- Tilsæt 5 ml til rør indeholdende mikroperlerne og forsigtigt resuspender mikroperlerne (dvs. den fraktion af CD27 + B-hukommelsesceller) 24-25.
- Centrifuger ved 600 xg ved stuetemperatur i 5 min. Resuspendere pellets med RPMI 1640 medium til de nedstrøms eksperimenter.
BEMÆRK: Typisk ~ 30 - 60% af B-celler kan oprenses som CD27 + hukommelsesceller fra PBMCer fra en rask donor 7, 25-26.
3. Celle Sortering for Indsamling af naive B-celler, Memory B-celler og PBS / pc'er
- Brug af celler oprenset fra trin 1, bestemme celleantallet ved anvendelse af en hemocytometer eller en automatisk celletæller.
- Resuspender cellerne i kold PBS-buffer i en koncentration på 10 7 per ml i en 5-ml polystyrenrør.
- Tilføj 1 - 2 ud ug humant IgG pr 10 6 celler og inkuberes på is i 10 minutter for Fc-blok.
- Tilsæt 1 ug hver af anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323), og anti-CD38-PE (klon: HIT2) pr 10 6 celler; bland godt og inkuber på is i 30 minutter 4, 27.
- I de sidste 5 min i trin 3.4, tilsættes 5 pi af kommercielle 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Tilsæt 2 ml PBS til røret, vortex, og der centrifugeres ved 600 xg i 5 min.
- Resuspender cellerne i sortering puffer (sterilt PBS med 2% BSA og 2 mM EDTA) ved en koncentration på 1 - 5 x 10 7 celler pr ml i en 15-ml rør.
- Filtrere celler gennem en nylon mesh cellesigte (40 um porestørrelse) for at udelukke celleklumper.
- Separere cellerne med en flowcytometrisk sorteringis udstyret med tre lasere: violet (405 nm), blå (488 nm) og rød (640 nm).
BEMÆRK: Den blå laser alene er tilstrækkeligt til 3-farve flowcytometri 27-28. - Sortere cellerne i tre 15-ml rør (indeholdende 5 ml RPMI-medium) til den samtidige indsamling af naive B-celler (CD19 + CD27 -), memory B-celler (CD19 + CD27 +), og PBS / pc'er (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28.
BEMÆRK: Sorter naive og memory-B-celler kan være dyrket som beskrevet i trin 4.
4. In vitro differentiering af isolerede humane CD19 + B-celler, CD19 + CD27 + B-hukommelsesceller, og CD19 + CD27 - naive B-celler
- Brug af cellerne renset i trin 1.19, 2.10, 2.11 og 3.10, fastlægge celletallet med et hæmocytometer eller en automatisk celletæller.
- Resuspender cellerne med RPMI 1640-mediumved en koncentration på 1 - 10 x 10 5 pr ml og udportionerer dem i brøndene på en 12-brønds plade.
- Tilføj CpG (ODN 2006) ved 5 pg / 10 6 celler / ml 18, 29.
- Dyrke cellerne i et 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 5 dage.
- Høst cellerne fra hver brønd, placere dem separat i 15-ml-rør, tilsættes 5 ml PBS i hvert rør, og centrifugeres dem ved 600 xg og RT i 5 min.
- Tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer eller en automatisk celletæller. Resuspender cellerne i en koncentration på 1 - 10 x 10 5 pr ml med RPMI 1640 medium.
5. ELISPOT-analyse
- Tilsæt 30 pi af 35% ethanol i destilleret vand til hver brønd af ELISPOT plader i 30 s.
BEMÆRK: Når pipettering, undgå at berøre membranen i brøndene på alle tidspunkter. - Invert ELISPOT plader for at fjerne ethanolen.
- Sætte 150 pi autoklaveret Hedeselskabet 2 O i hver brønd og inkuberdem ved stuetemperatur i 5 minutter for at skylle ud for den resterende ethanol; efter med vask sterilt PBS ved stuetemperatur i 3 minutter.
BEMÆRK: Trin 5,1-5,3 kan være valgfrit, afhængigt af fremstillingen af pladerne. - Sætte 50 pi af 5 pg / ml polyklonalt F (ab ') 2-fragment af anti-humant Ig (IgG + IgM + IgA) (i PBS) i hver brønd i ELISPOT plader og inkubere dem ved 4 ° C natten over (foretrukket) eller 37 ° C i 2 timer 11.
BEMÆRK: Seal kanterne af pladerne med Parafilm indtil anvendelse. - Vendes pladerne om at fjerne ubundet Abs, tilsættes 200 pi PBS til hver brønd, og inkuber dem to gange ved stuetemperatur i 3 min hver gang.
- Tilsæt 200 pi PBS med 5% BSA (eller RPMI 1640-medium) til hver brønd til blokering, og inkubere dem ved stuetemperatur i 2 timer.
- Vendes pladerne om at fjerne den blokerende buffer. Vask hver brønd to gange med 200 pi PBS, som i trin 5.5.
- Tilsæt 100 pi RPMI 1640-medium til hver brønd og inkubere dem ved 37 ° C.
- Når de er klar til at pode cellerne, vendes pladerne om at fjerne RPMI 1640 medium.
- Seed 100 pi (5 x 10 4), 50 pi (2,5 x 10 4), og 25 pi (1,25 x 10 4) af cellerne (blandt trin 1.19, 2,10, 2,11, 3,10, og 4.6) i brøndene i en ELISpot plade. Med RPMI 1640-medium, bringe volumenet til 150 pi / brønd.
BEMÆRK: Mindst en eller to 2-gange serielle fortyndinger for udpladning af cellerne anbefales. - Inkubér pladerne i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 i 8 - 14 timer 18. Undgå at flytte pladerne under inkubation.
- Vendes pladerne om at fjerne cellerne og RPMI 1640-medium.
- Tilsæt 200 pi / brønd af PBS-T (PBS med 0,05% Tween 20) og inkuberes dem 5 gange ved stuetemperatur, hver gang i 3 min. Vend pladen for at fjerne vaskepufferen mellem hver af de 5 vaske.
- Tilføj enten gede-anti-humant IgG-alkalisk phosphatase (AP), Fcy-Ab'er (for IgG detektion, 1: 5.000 i PBS-T) Eller gede-anti-humant IgM-AP, Fcμ fragment Ab'er (for IgM påvisning, 1: 5.000 i PBS-T) i de udpegede brønde og inkuberes ved stuetemperatur i 2 timer i mørke.
- Vask hver brønd to gange med 200 pi PBS, som i trin 5.5.
- Der tilsættes 50 uL / brønd af bromochloroindolyl phosphat-nitro blue tetrazolium (BCIP / NBT) substratopløsning. Purple-farvede pletter normalt i 5-15 min.
- Tilsæt 100 pi / brønd af Hedeselskabet 2 O for at forhindre over-udvikling af pletter.
- Skyl pladerne med rindende vand efter at hele udviklingen af alle pletter.
- Fjern underdrain af pladerne og lad dem lufttørre i mørke.
- Tæl pletter anvendelse af en automatiseret pladelæser med en billedopløsning optagelses- / analyseenhed (f.eks en automatisk scanner eller manuelt via et dissektionsmikroskop).
BEMÆRK: Pladerne kan opbevares ved stuetemperatur i mørke og analyseret senere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBMC'er blev depleteret for RBC'er og adhærente celler (trin 1.2 til 1.7). En portion (2 x 10 6) af celler blev underkastet en flowcytometrisk analyse til at illustrere de populationer af naive B-celler, memory-B-celler og PBS / pc'er i perifert blod (figur 1). I denne donors PBMC'er, omkring 10% af lymfocytterne var CD19 + B-celler. I B-celle-rum, procentdelen af CD19 + CD27 - naive B-celler var omkring 50%. På den anden side, omkring 50% af CD19 + B-celler var CD27 + B-hukommelsesceller 7, 25-26. Notatet kan CD27 + memory B-celler yderligere adskilles med inddragelse af IgD 4. Fænotypen af cirkulerende PBS kan defineres bedre med lav eller ingen overfladeekspression af CD20 (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo / -) 2, 30-31. For at udelukke de døde celler, 7-AADkan indgå i cellefarvning (trin 3.5), og et plot for FSC versus 7-AAD tillader slusning populationen af levende celler (7-AAD -).
De vigtigste trin i ELISpot-assayet er afbildet i figur 2. Begge oprensede humane B-celler og CD19 + CD27 + memory-B-celler blev dyrket i nærvær af CpG med RPMI 1640 medium i 5 dage. Celler blev høstet for ELISpot analyse til kvantificering af nyligt dukket ASC'er. Hvis stede, allerede eksisterende PBS isoleret fra det perifere blod vil dø ud i 48 h 11. ELISPOT-assayet blev udført, og pletten billeder optaget af et automatisk plade scanner er påvist i figur 3. Resultaterne af ELISpot vil typisk vise 50 - 200 IgM-ASC'er fra 10 4 B celler behandlet med CpG i 5 dage, mens antallet af IgG-ASC'er er på 10 - 50. I 10 4 celler 11.
Figur 1. Illustration af gating-strategien at adskille den naive B-celler, B-hukommelsesceller, og PBS i PBMC'er. (A) Celler (2 x 10 6) blev farvet med 2 ug hver af CD19-APC, CD27-eFluor450, og CD38-PE-mAb'er (trin 3.4). Den lymfocyt rum var gated (G1) på prikken plot for fremad spredning (FSC) versus side spredning (SSC). (B) Cell dubletter, som er dannet af to celler hænger sammen, blev udelukket (dem uden G2) på grunden for FSC-W (bredde) versus FSC-H (højde). (C) CD19 + B-celler blev gated som G3 på grunden for SSC-A (område) og CD19-APC. (D) Af de CD19 + celler, dot plot af CD27 og CD38 parametre viste naive B-celler (CD19 + CD27 -, Q1 og Q4), memory B-celler (CD19 + CD27 +;Q2 og Q3), og PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 +; G4, 0,6% af Q2). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Illustrationer af de vigtigste skridt i ELISpot-analysen. (A) Sæt 50 uL / brønd (5 ug / ml) af F (ab ') 2-fragment af anti-humant Ig (IgG + IgM + IgA) i en ELISPOT plade i 2 timer ved 37 ° C eller natten over ved 4 ° C (foretrukket) (trin 5.4). Frø cellerne i brøndene på ELISpot pladen. Lad ASC'er at fastgøre til PVDF membranen og til at udskille Abs i 8 - 14 timer (trin 5.11). (B) Vask cellerne med PBS (med 0,05% Tween 20). (C) Tilsæt AP eller HRP-conjugated påvisning Abs specifikke for enten IgG eller IgM. (D) Vask påvisning Abs der er ubundet. (E) Udvikle pletterne med en substratopløsning af AP eller HRP at matche afsløring Abs. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. ELISpot Resultater fra et repræsentativt Plate. (A) Oprenset CD19 + B-celler blev anbragt i tre tilstødende brønde (50.000 celler i brønd nr 1, 25.000 celler i brønd nr 2, og 12.500 celler i brønd nr 3, henholdsvis) af ELISpot pladen. Celler blev derefter dyrket i RPMI 1640 medium natten over (~ 14 timer). ELISPOT assay blev udført efter endt kultur (trin 5,12-5,18). at analyze resultaterne blev ELISpot pladen scannes for at erhverve billeder via et automatisk analyseapparat udstyret med scanneren og software. (B) Oprenset CD19 + CD27 + hukommelsesceller (10 6 / ml) blev dyrket i nærvær af 5 ug / ml CpG i 5 dage. Cellerne blev behandlet som i (A) for ELISpot analysen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering og oprensning af humane perifere blod B-celler
Normalt kan RBC'er effektivt brydes og væk for lysepuffer (trin 1.2). Det er vigtigt ikke at inkubere PBMC'er med RBC lysepuffer længere end 5 min, som cellelevedygtighed kan være påvirket af ammoniumchlorid. Alternativt kan RBC'er og blodplader samtidigt fjernes ved den følgende protokol.
Bland frisk fuldblod med syre-citrat-dextrose (ACD) puffer (39 mM citronsyre, 75 mM natriumcitrat og 135 mM dextrose, pH 7,4) i et volumenforhold på 9: 1, blod-til-puffer. Centrifuger ved 250 xg i 10 minutter ved stuetemperatur. Vær opmærksom på dannelsen af lag, indikerer adskillelse. Aspirer og kassér det øverste lag, som indeholder blodplader og blodpladerigt plasma (gul farve). Fjerne den tynde midterste lag ved grænsefladen, som indeholder PBMC'er (dvs., Buffy coat). Undgå forurening af RBC'er i bundlaget (darken rød farve). Tilføj lysis buffer til PBMC'er at fjerne de resterende røde blodlegemer, og derefter følge trin 1,2-1,19.
To metoder kan anvendes til at isolere B-celler fra PBMC'er: positiv og negativ selektion 21. Fremgangsmåden til negativ selektion (trin 1.1 til 1.19) anvendes til at opnå uberørte, funktionelle B-celler, uden bundne Ab'er eller mikroperler, for downstream eksperimenter. Det er afgørende at tage dette i betragtning, når aktivering og / eller differentiering af rensede B-celler forekommer i kultur. Den bekymring er, at celler oprenset ved positiv selektion kan utilsigtet påvirket af mAb-konjugerede mikroperler (0,2 til 5 um i diameter). mAb'er kan binde til specifikke receptorer på B-celler, og derfor kan tværbinde receptorerne for aktivering. Desuden kan mikroperler blive endocytoseres af B-celler gennem bundne receptorer. Skønt biologisk nedbrydelige, kan mikroperlerne bo inde celler i mere end en uge. Hvorvidt lagring af mikroperler vil påvirke experimentale resultater skal bestemmes empirisk. I oprensningen af humane B-celler via positiv selektion, anti-CD19 (klon: 4G7 eller HIB19) mikroperler er almindeligt anvendt, fordi CD19 udtrykkes bredt i hele de udviklingsmæssige stadier af B-celler. Renheden af B-celler efter separering kan bestemmes ved flowcytometri med anti-CD19 mAb'er (kloner: SJ25C1 eller LT19), som genkender distinkte epitoper fra anti-CD19 mikroperler.
Rensning og Adskillelse af Memory og naive B-celler fra isolerede B-celler
CD27 er et bredt accepteret overflade markør for menneskelige hukommelse og naiv B-celle skelnen 24. Den CD27-molekylet hører til tumornekrosefaktor-receptor (TNFR) -familien. Fordi CD27 udtrykkes på de fleste humane memory-B-celler, er det almindeligt anvendt til at skelne dem fra CD27 - naive B-celler. Men fordi CD27 udtrykkes også på T-celler og NK-celler, brug af anti-CD27 microbeads (klon: O323) i positiv udvælgelse memory-B-celler kræver forudgående oprensning af B-celler (trin 1.1 til 1.19). For en check renhed efter separation, mAbs specifikke for humant CD27: er (kloner L128 eller LG.3A10) anbefales (trin 2.12). Fordi CD27 + memory-B-celler er heterogene, yderligere overflademarkører, såsom IgD og FCRL4, kan komme i betragtning til yderligere separation i cellesortering 4, 7.
Celle Sortering fås Naïve B-celler, Memory B-celler og PBS / pc'er
Fordi B-celler udtrykker FcyRIIB, er en Fc-blok (trin 3.3) anbefales før farvning af cellerne med mAbs til flowcytometri. Fc-fragmenter af humant IgG alene kan blokere lige godt som hele humant IgG ved 1 ug / 10 6 celler. Anti-humane CD32 mAb (kloner: 3D3 eller AT10) er en anden mulighed for Fc blokken. Af note, hvis FcyRIIB er en overflademarkør, der skal farves i oprenset B-celler, fluoroforen-konjugeret anti-CD32 mAb shOuld tilføjes at give afkald Fc blokken, efterfulgt af farvning med andre mAbs uden en PBS vask.
For tre farver flowcytometri, CD38-FITC (fluorescein), CD27-PE (phycoerythrin), og CD19-APC (allophycocyanin) er en typisk kombination af fluoroforer. Stiller den flowcytometriske sorteringsanlæg er udstyret med tre lasere, såsom dem på 405 nm, 488 nm og 640 nm, forskerne så har den luksus at vælge fluoroforer ophidset af forskellige lasere til cellesortering. Som illustreret i figur 1 blev celler farvet med CD19-APC (klon: HIB19), CD27-eFluor450 (svarende til pacific blå, klon: O323), og CD38-PE (klon: HB7) for at adskille de naive B-celler, hukommelse B-celler og PBS. Notatet nogle forskere foretrækker at medtage CD45 (klon: HI30) som en leukocyt afstamning markør og gate B-celler som CD45 + CD19 + population. Fordi påvisning af PBS i omløb ved steady state er en sjælden Evant hos raske individer, lave eller slet ingen overfladeekspression af CD20 på PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo / -) underbygger deres bona fide eksistens 2, 30-31. Dette er nyttigt, når kvantificering resultaterne af PBS ved overfladen fænotyper og ASC'er ved ELISPOT-analyser er der sammenlignes. I perioden forud for celle-sortering, er 7-AAD foretrak at propidiumjodid for udelukkelse af døde celler, på grund af sin smallere emission spektrum og lavere afsmitning i flerfarvet flowcytometri.
In vitro-stimulering og differentiering af isolerede humane B-celler
Type B CpG (ODN 2006) alene kan inducere begrænset differentiering af både IgM- og IgG-ASC'er fra B-hukommelsesceller. Desuden naive B-celler er kun svagt reagerer på CpG og hovedsagelig giver anledning til IgM-ASC'er 6, 11. Koncentrationen af CpG i kultur er i området på 2,5 - 5 ug / ml pr 10 6 B-cellereller PBMC'er 11, 18. Andre end CpG, kan oprensede B-celler og PBMC'er dyrkes i nærværelse af kombinationer af CpG med mitogener, cytokiner og BCR-agonister, for at differentiere humane B-celler i ASC'er i kultur (trin 4.3). For eksempel almindeligt anvendte opskrifter til 10 6 celler pr ml indbefatter (a) CpG (5 ug / ml), rekombinant human IL-2 (10 ng / ml) og rekombinant humant IL-10 (10 ng / ml) 15, 34; (b) CpG (5 ug / ml) og F (ab ') 2-fragmenter af anti-humant Ig (IgG + IgM + IgA) (20 ug / ml) 11; (c) CpG (5 ug / ml), protein A fra S. aureus Cowan (SAC) (1: 10.000 fortynding), og kermesbær mitogen (PWM) (1: 100.000 fortynding) 18; (d) rekombinant humant IL-21 (100 ng / ml) og rekombinant sCD40L (1 ug / ml) 12, 15, 33; og (e) rekombinant humant IL-2 (10 ng / ml) og R848 (1 ug / ml), en TLR7 agonist 33-34. Selvom B-celler kan differentieres til ASC'er i tre dage 11, celler er generelt præ-stimulated for 5 til 6 dage før tilsætning til ELISpot plade til kvantificering af ASC'er 11, 18. Under dyrkningsperioden, er der normalt ingen genopfyldning af udgangsmaterialerne differentierings- midler.
Tilsætningen af IL-2 og IL-10 til CpG-holdige kulturer kan øge antallet af differentierede IgM- og IgG-ASC'er 15, 35. Tilstedeværelsen af IL-2 i kultur kan tilvejebringe mitogen stimulation at lette udbygningen af differentierede B celler ved CpG. IL-10 i området fra 10-25 ng / mL i høj grad kan øge produktionen af ASC'er (~ 3- til 10-fold) i nærvær af CpG 35. BCR-agonister, herunder anti-BCR og SAC, og PWM kan også stimulere proliferation af primær humane B-celler 18. Inkubering hukommelse B-celler med CpG og polyklonale anti-BCR primært resulterer i en stigning i IgM-ASC'er men ikke i IgG-ASC'er 28. Til forebyggelse af inhibering af signalering gennem BCR af FcyRIIB, et F (ab &# 39;) 2 fragment af anti-Ig (10 - 20 mg / ml pr 10 6 celler) anbefales, når tværbinding BCR 11. I stedet for polyklonalt anti-Ig, bør anti-BCR mAb'er specifikke for enten IgM + eller IgG + B celler anses for at målrette isotypespecifikke B-celle-undergrupper for differentiering til ASC'er. En kombination af CpG, SAC (1: 10.000 fortynding), og PWM (1: 100.000 fortynding) effektivt kan aktivere memory-B-celler til at differentiere til IgM- og IgG-ASC'er 18, 24. Endvidere kan CpG moderat inducere klasseskift af Ig in vitro 28-29. I modsætning hertil IL-21 (100 ng / ml) og sCD40L (1 ug / ml) effektivt inducere hukommelse B celledifferentiering udelukkende til koblet IgG-ASC'er 12, 30. Den sCD40L kan aktivere B-celler ved at efterligne T-celle hjælp gennem CD40 på B-celler, påvirke deres differentiering i pc'er i vivo. Af note, anti-CD40 (kloner: 89 eller G28.5) kan erstatte sCD40L i kultur 15. HowevEr, hverken sCD40L eller anti-CD40 alene er i stand til at inducere differentieringen af B-hukommelsesceller. Således er CD40 aktivering af dyrkede B-celler ofte kombineret med en differentiering middel, såsom IL-4, CpG, R848, eller IL-21, der hver kan fremme Ig klasseskift. IL-4 spiller en central rolle i differentieringen af Th2 CD4-celler, hvilket tillader induktionen af de fleste IgM + B-celler til at skifte til IgG1 + B celler i kultur. Ligeledes i nærværelse af IL-21, begge memory-B-celler og naive B-celler differentierer udelukkende i klasse-switched ASC'er 12, 32. Ligesom CpG, kan R848 fremkalde en marginal klasse switch af B-celler 34. Endelig er det værd at nævne, at selv om lipopolysaccharid (LPS) effektivt kan inducere differentiering af muse-B-celler til ASC'er, humane B-celler udtrykker lave niveauer af TLR4 og CD14 29. Fordi tilsætningen af en differentiering middel i kulturen fremmer dannelsen af switched B-celler, bør denne tilsætning undgåsnår allerede eksisterende PBS / pc'er eller uden afbryder hukommelse B-celler skal måles.
ELISPOT-analyse
ELISPOT assay kombinerer plade-baserede ELISA'er med membranbaserede western blotting teknologier, der giver mulighed for påvisning af Abs udskilles af en enkelt B-celle 18. ELISPOT er også blevet tilpasset til at kvantificere Ag-specifikke T-celler, som secernerer cytokiner 17, 36. I en ELISPOT-analyse, kan anvendes enten oprensede celler eller ufraktionerede PBMC'er (gratis RBC'er). Imidlertid ~ 10 gange, mere PBMC'er kræves end rensede celler for at opnå ensartede resultater i ELISPOT-analyser. Et godt udgangspunkt er 1 - 2 x 10 5 celler per brønd til påvisning af cirkulerende ASC'er i PBMC'er. Ved påvisning af Ag-specifikke ASC'er, anti-Ig sædvanligvis erstattet af Ag (5 - 10 ug / ml i PBS) at fange Ag-specifik ACSS (trin 5.4). Anvendelsen af isotype-specifik påvisning Abs tillader skelnen mellem Ag-specifikke IgM-ASC'er og IgG isotype-ASC'er (trin 5.14). Af note, uanset om anti-Ig eller Ag anvendes til at indfange ASC'er, detektions- Ab'er anvendes til ELISA måske ikke altid være egnet til ELISpot. Ligeledes ikke alle farver substrater for ELISA fungere ordentligt i ELISpot. AP og HRP-konjugerede Abs er mest brugt til spot detektion i ELISpot. BCIP / NBT-substrat-opløsning er et populært valg for AP-baseret detektion, hvorimod 3,3 ', 5,5'-tetramethyl-benzidin (TMB) og 3-amino-9-ethylcarbazol (AEC) løsninger er almindelige substrater for HRP i ELISpot. Hvis AP eller HRP er direkte konjugeret til påvisning Abs, er der kun behov et trin til påvisning, som beskrevet i protokollen (trin 5.14). I modsætning hertil er påvisning Abs biotinyleret og kræver efterfølgende inkubation med AP eller HRP-konjugeret streptavidin før omsætning med substraterne i en totrins-metode. Både et-trins og to-trins metoder virker effektivt til at opdage pletter i ELISpot.
ELISPOT-assayet kan kvantificere ikke kun Cirkulationing men også differentieret ASC'er i kultur (trin 1,19 versus 4.6). Hvis tilstede, cirkulerende ASC'er, som normalt lever ikke længere end to dage i kultur, kan være direkte dyrket i ELISpot plade, med eller uden oprensning fra PBMC'er 11. I modsætning hertil differentieringen af B-hukommelsesceller kræver 5 dage. Derfor er direkte dyrkning i ELISpot plader efter celle isolation (trin 1.19) ikke anbefales; de døde cellerester følge af den forlængede dyrkningsperiode kan øge baggrunden i stedet detektering. I stedet kan både oprensede B-celler og samlede PBMC'er først dyrkes i en 6-brønds eller 12-brønds plade i nærværelse af mitogener og differentiering agenter (trin 4.3). Under dyrkningsprocessen, den gentagne tilsætning af stimulation midler er unødvendig (trin 4.3). Mens pladerne er i inkubatoren, bør døren til inkubatoren forsigtigt åbnet og lukket for at forhindre podede ASC'er i at bevæge sig, for de kan diffundere udskilte Abs langs de bevægelige spor, frembringelse plettermed haler (de såkaldte "komet-lignende" pletter) (trin 5.11). Inkubationstiden i ELISpot-plader er bestemt af den tid, det tager for cellerne at secernere påviselige mængder Abs uden at tillade cellerne at dele sig, hvilket ville skabe vanskeligheder i stedet tælling. Således celler er sædvanligvis dyrkes i området fra 8 timer til natten over (trin 5.11).
ELISPOT-assayet er den mest udbredte metode til kvantificering memory-B-celle-responser. Det er blevet en populær, uafhængig udlæsning af humorale immunrespons og immunologisk hukommelse. I praksis er det foregående mitogene kultur kræves for at aktivere B-hukommelsesceller for differentiering til ASC'er (trin 4.3). Men den frekvens, hvor B-hukommelsesceller udvide og differentiere til ASC'er varierer i forskellige miljø kultur, som beskrevet ovenfor. Selv uden konsensus, de fleste forskere vedtage induktion tilstand, som kan maksimere produktionen af ASC'er. Med hensyn til midlet bruges til spot detection, kan en opløselig biotinyleret Ag erstatte den utilfredsstillende påvisning Ab uden at kompromittere følsomhed 37. Dette er af særlig betydning, når tilgængeligheden af Ag er begrænset, fordi en meget lavere mængde Ag kræves til påvisning end til coating af pladerne. Endelig er ELISpot ikke tillader fænotypisk analyse af cellulær heterogenitet, og kræver derved forudgående fraktionering af celle subpopulationer. For nylig, en flerfarvet ELISpot-assay, ved hvilken påvisning Abs er mærket med forskellige fluoroforer, er blevet udviklet til at detektere flere typer af cytokin-secernerende celler i en enkelt brønd 38-39. Denne nye teknologi vil være af særlig interesse til påvisning af lavfrekvente celler i PBMC'er og for en storstilet analyse af vaccine-inducerede B-celle-responser.
Fordi ELISpot-assayet er hurtig og effektiv i kvantificere ASC'er og cytokin-secernerende celler, er det blevet udvidet til at måle funktionaliteten af ikke blot kredsløb;lating lymfocytter, men også væv immunceller såsom intrahepatiske leukocytter 40. På grund af dens følsomhed nå niveauet detektere selv en enkelt ASC har ELISpot-assayet i stigende grad blevet anvendt til at måle humane immunresponser på vaccine effektiviteter mod nuværende og nye patogener. Selv om high-throughput ydeevne og robusthed ELISpot-assay er fremragende til vurdering af immunreaktioner ved anvendelse af PBMC'er store, kan resultaterne af assayene være påvirket af forskellige faktorer, såsom behandlingsforsinkelsen af prøver, om celler er friske eller frosne , serum komponenter i dyrkningsmediet, og antallet af celler føjes til ELISpot pladen 41. Derfor bør normalisering procedurer medtages i ELISpot-protokollen til at minimere intra- og inter-assay variationer i stor skala og langsgående opfølgende undersøgelser (f.eks vaccine forsøg). Normaliseringen metode plade læsning er også kritisk for linearitet, nøjagtighed og ulemperistency i analyseresultaterne 41-42. En måde at udføre pladeaflæsningsspektrofotometer normalisering er at udvide proceduren på den serielle fortynding af celler podet til ELISpot plader (trin 5.10). Ved at skabe en reference plade, bør flere seriefortyndinger påvise et lineært forhold mellem celleantal udpladet per brønd og pletten tællinger pr brønd. Gentagne scanninger af ELISpot plade kan anvendes til at validere skabelonen af spot optælling, både automatisk og manuelt. Minimal intra-brønd variabiliteten i stedet tællinger forventes efter disse normaliserings- procedurer 43. Endelig kan anvendelsen af ELISpot udvides på mange måder, såsom til overvågning af behandlingen svarene fra patienter med infektioner og tager kræft immunterapier, samt til evaluering af immunotoksicitet (fx immunsuppression og narkotika-induceret autoimmunitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 mL tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 mL Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-043 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
