Abstract
Отличительной чертой гуморального иммунитета является создание функциональных ИСС, которые синтезируют и секретируют Abs, специфичное к антигену (Ag), такие, как патогена, и используются для защиты хозяина. Для количественного определения функционального состояния гуморального иммунного ответа индивидуума, и сывороткой Абс и циркулирующие ИСС обычно измеряется в качестве функциональных считываниями. В организме человека в периферической крови является наиболее удобным и легко доступны образцы, которые могут быть использованы для определения гуморального иммунного ответа, вызываемого хозяином В-клеток. Четкие B-клеточные подмножества, в том числе ИСС, могут быть выделены непосредственно из периферической крови с помощью селекции с использованием линии дифференцировки специфических Ab-сопряженными микрошариков или через сортировки клеток с проточной цитометрии. Кроме того, очищенные наивные и В-клетки памяти могут быть активированы и дифференцированы в ИСС в культуре. Функциональной активности ИСС, чтобы способствовать секреции Ab может быть определена количественно с помощью ELISpot, который представляет собой анализ, который сходится фермент-связанной анализ immunoabsorbance (ИФА) и западные технологии блоттинга для того, чтобы перечисление отдельных ИСС на уровне одной клетки. На практике анализ ELISpot чаще используется для оценки эффективности вакцины из-за легкости в обращении большого количества образцов крови. Способы выделения клеток человека из периферической крови, дифференцировка В - клеток в ИСС в лабораторных условиях , а также применение ELISpot для количественного определения общего IgM- и IgG-ИСС будет описана здесь.
Introduction
В-клетки играют центральную роль в развитии гуморального иммунитета. Они изначально развиваются в костном мозге и попадает в кровь в виде наивных В-клеток, которые могут мигрировать в лимфоидные ткани, такие как селезенка, лимфатические узлы, а также миндалин, для дальнейшего развития. При столкновении Ag, некоторые наивные В-клетки мигрируют в лимфоидные фолликулы, где зародышевых центр В-клетки могут дифференцироваться в В-клетки памяти и plasmablasts (УБ) / плазмоцитов (ПК). В то время как большинство ФБФР / ПК EGRESS в поток крови, несколько в конечном счете находятся в костном мозге , чтобы пройти терминальной дифференцировки в долгоживущих ПК 1. В - клетки , находящиеся в обращении являются гетерогенными, и в стационарном состоянии, ФБФР / ПК редки в периферической крови 2. В результате наличия поверхностных маркеров линии дифференцировки специфических, проточной цитометрии стало популярным методом для идентификации и характеристики подмножеств В-клеток в периферической крови. Расширенное применение cytometr потокаY является добавление функции сортировки клеток, что позволяет разделение и выделение отдельных подмножеств В-клеток с высокой степенью чистоты. На основе экспрессии специфических рецепторов на поверхности на разных стадиях развития, человека , циркулирующие В - клетки , как правило , подразделяются на три основных субпопуляций: наивных В - клеток (CD19 + CD27 - CD38 -), В - клетки памяти (CD19 + CD27 + CD38 -), и ФБФР / ПК (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Рисунок 1). Наивные В-клетки по своей природе не сталкивались с АГС. Тем не менее, они могут быть дифференцированы в клетки IgM + CD27 + память B. Несмотря на то, наивные В - клетки являются однородными в выражении антиген В-клеточный рецептор (BCR) -associated молекулы (например, CD19, CD20 и CD22) , они неоднородны в своем репертуаре 5 иммуноглобулина. Большинство клеток CD27 + память B могут быть дифференцированы в CD27+ / CD38 + привет ФБФР / ПК 6. Кроме того, В - клетки памяти и ФБФР / ПК поликлональные и демонстрируют с развитием и функциональной гетерогенности 4-7. ФБФР / ПК в обращении, как правило, недолговечны и не выражают CD138, но сделанные осесть в костном мозге будет терминально дифференцируются и долговечны. Терминально дифференцированных ПК выражают CD138 и понижающей регуляции молекулы CD27 на их поверхности 8. Так как УБ и ПК способны секретировать Abs, во многих случаях они все вместе обозначаются как ИСС. В противоположность этому , ни наивным , В - клетки , ни В - клетки памяти может произвести значительные количества Abs 9-10. Тем не менее, при выделении, как наивные и В - клетки памяти могут быть дифференцированы в ИСС в течение 3 - 10 дней при помещении в соответствующих условиях культивирования 6, 11-15. На самом деле, ИСС происходит от в пробирке дифференциации доля подобных поверхностных проявлений CD27 и CD38 с теми , непосредственно выделенных фром периферической крови 6. Кроме того, ИСС дифференцировались в пробирке экспрессируют низкий уровень поверхности CD20, подобный что циркулирующих ФБФР / ПК 6. Хотя культура происхождения ИСС все недолговечны, они могут секретируют Abs, указывая, что они функционально компетентной и способной внести свой вклад в гуморального иммунитета.
Оба ELISA и ELISpot являются на сегодняшний день наиболее часто применяются методы, с помощью которых получить функциональную информацию о гуморального иммунного ответа. ИФА 96-луночный планшет на основе анализа а, и он часто используется для измерения титры сывороточного АГ-специфических антител и других аналитов (например, цитокины). Это удобно и масштабируемым. ИФА предназначен для использования анализа твердофазного фермента , чтобы обнаружить присутствие антител или других веществ, таких как сыворотка, в жидком образце 16. Показаниями из сыворотки ELISAs широко используется для представления иммунный ответ организма. Инструмент, необходимый для приобретения повторногоadouts из ИФА является спектрофотометрический микропланшет-ридера. Читателю может определить оптическую плотность (ОП) конечных продуктов , как правило , в результате реакции с пероксидазой хрена (HRP) Абс обнаружения и их специфических субстратов 17. Что касается отчетности гуморальный иммунный ответ, сывороточные уровни Ab, определенные методом ELISA обозначают коллективный, а не индивидуальный, производительность ИСС в организме. Кроме того, ИФА не принимает во внимание участие В-клетками памяти, которые не секретируют Abs.
Как ELISA, ELISpot является широко используемым методом для обнаружения и мониторинга иммунного ответа в образцах периферической крови 17-18. ELISpot представляет собой метод, связанные с бутербродом ELISA. В нем, клетки помещают в поливинилиденфторида (ПВДФ) Мембранный спинками лунки 96-луночных микропланшетов для кратковременной культуры. Анализ ELISpot аналогично выполнения вестерн-блоттинга на микропланшет и developinг пятна на PVDF мембрану в каждую лунку. Автоматизированная система для чтения ELISpot или стереомикроскоп для ручного подсчета требуется. Основное преимущество ELISpot в обнаружении иммунного ответа является его превосходная чувствительность в квантификации ИСС и цитокин-секретирующие клетки. Он сообщает их функциональную активность в гуморального и клеточного иммунитета, соответственно. При измерении гуморальной иммунной функции, уровни сывороточного Ab , определенные методом ELISA , и количество ИСС , перечисляемые ELISpot часто коррелируют, но показания данные из этих двух анализов имеют некоторые различия в функциональных последствий 19-20. Основным преимуществом ELISpot является его чувствительность метода. Уровень сывороточного титра Ab как сообщает ELISA представлены полуколичественно, как OD считываний, обозначающее относительный уровень Ab, или более количественно, так как концентрация считываний, когда известное количество правильных изотипов Abs включена для справки. В отличие от этого, результаты ELISpot являются Presented в качестве абсолютного числа ИСС в пуле клеток , представляющих интерес (например, нефракционированные одноядерные клетки периферической крови (РВМС) и очищенные В - клетки из МНПК). ELISpot может обнаружить одну ASC, но ELISA требует количества Ab от ИСС достичь оптимизированной опробования зависящих от концентрации перед измерением. Следовательно, ELISpot явно превосходит ELISA в чувствительности количественного определения. Кроме того, ELISpot также подходит для количественного определения in vitro на дифференцированные ИСС из активированных В - клеток памяти. Память В-клетки не секретируют Abs, но могут дифференцироваться в ИСС при активации; поэтому они не имеют никакого вклада в сыворотке крови антител, обнаруженных ELISA. Таким образом, ELISpot является методом выбора при измерении иммунного ответа циркулирующих В-клеток памяти после активации в культуре. Это позволяет осуществлять мониторинг содержания долгосрочного гуморального иммунитета.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Человеческой периферической крови должно быть получено от здоровых доноров в рамках информированного согласия, а также использование образцов крови должны соответствовать утвержденным руководящим принципам, установленным отдельными этическими комитетами. В этом исследовании, протокол использовать человеческую кровь в демонстрации результатов проточной цитометрии (рисунок 1) и анализов ELISpot (рисунок 3) был утвержден Советом внутреннего обзора Национального университета Тайваня больницы (номер протокола 201307019RINB).
1. Выделение и очистка периферической крови человека В-клеток
- Draw ~ 10 мл крови из срединной локтевой вены (в локтевой ямки кпереди от локтевого сустава) в пробирку объемом 15 мл , содержащей K 2 ЭДТА ( от 1,5 до 2,0 мг / мл крови) и немедленно Переверните пробирку несколько раз , чтобы предотвратить тромба образование.
- Добавить 35 мл автоклавного (121 ° С, 15 мин) красных кровяных клеток (эритроцитов) буфера для лизиса (150 мМ NH 4 Cl, 10 мМ КНСО 3, и 1 мМ ЭДТА; рН 7,4) в пробирку, содержащую свежий образец крови (≥ 3: 1 об / об) и инкубировали при комнатной температуре (RT) в течение не более 5 мин.
Примечание: Появление пропускания света через трубку указывает на завершение RBC лизиса. - Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Убедитесь, что гранулы белого цвета.
- Ресуспендируют осадок с 10 мл автоклавного фосфатно-солевом буфере (PBS, мМ NaCl 137, 2,7 мМ KCl, 4,3 мМ Na 2 HPO 4 и 1,47 мМ КН 2 РО 4, рН 7,4) и центрифугируют , как в пункте 1.3.
- Жидкость над осадком сливают, ресуспендируют осадок с 10 мл среды RPMI 1640 (добавки: 10% фетальной телячьей сыворотки, 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина В, и 2 мМ L-глутамина), а затем высевания клеток в культуральной чашке 10 см (10 мл крови на чашку). Поместите блюдо в 37 ° C инкубаторе с 5% СО 2 в течение 30 мин.
- Аккуратно водоворот культуры блюдо несколько раз и местокультуральной среды (суспензия клеток) в 15-мл пластиковых конических труб. Откажитесь прилипшие клетки (макрофаги), в основном на посуде культуры.
- Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют осадок в 1 мл RPMI 1640 среды. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика клеток.
Примечание: Жизнеспособность изолированных лейкоцитах, как правило, больше, чем 90% трипанового синего. - Центрифуга , как на стадии 1.7 , и клетки вновь суспендируют в ~ 200 мкл холодного буфера PBS (0,5% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 2 мМ ЭДТА) при концентрации 5 - 10 х 10 6 клеток / мл.
- Добавьте 5 мкл биотинилированного анти-АВ человека коктейлем , специфичные для клеток крови (для отрицательного отбора В - клеток) на 10 6 клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин 21.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ab коктейль против человека должен включать по крайней мере Abs, специфичные для CD2 (или CD3), CD14 и CD16. - Добавьте 10-кратный избыток объемастерильного PBS к клеткам, центрифуге при 600 мкг в течение 5 мин, и отбросить супернатант.
- Добавьте равное количество стрептавидин-конъюгированные микрогранул (5 мкл на 10 6 клеток) в гранулах и тщательно перемешать.
- Инкубируют на льду в течение 30 мин в 15-мл пластиковой конической трубки.
- Добавляют 2 мл буфера PBS в трубку.
- Поместите пробирку в магнитный штатив и инкубировать при комнатной температуре в течение 8 мин. Коричневые микрогранулы будут постепенно присоединять к стенке трубы рядом с магнитом 22.
- С помощью трубки , остающейся в магнитный штатив, тщательно передачи супернатант в новую стерильную 15-мл трубки 22.
- Повторите шаги 1.14 до 1.16, и объединить два супернатанта, которые содержат нетронутые В-клетки. Откажитесь от микрогранулы.
- Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Удалите супернатант.
- Ресуспендируют осадок в среде RPMI 1640 для последующих экспериментов.
Примечание: Как правило, 1 - 5 × 10 5 В - клетки остроумиега с чистотой выше 95% от 10 мл периферической крови может быть выделено 23.
2. Очистка и разделение памяти и наивные B Клетки из изолированных В-клеток
- Использование клеток, очищенные от стадии 1, и определяют количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика.
- Ресуспендируют клеток в 100 мкл холодного буфера PBS после центрифугирования при 600 мкг и комнатной температуре в течение 5 мин.
- Добавить 1 - 2 мкг биотинилированного CD27 мАт на 10 6 клеток и инкубируют на льду в течение 30 мин.
- Добавляют 10 мл буфера PBS в пробирку и центрифугируют при 600 х г в течение 5 мин.
- Жидкость над осадком сливают и клетки вновь суспендируют в 50 мкл буфера PBS.
- Добавьте равное количество стрептавидином магнитных микросфер (1 - 2 мкг / 10 6 клеток) к клеткам в пластиковую коническую пробирку 15 мл.
- Аккуратно хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 30 мин.
- Добавляют 2 - 3 мл буфера PBS к трубе.
- ПоместитеТрубка в магнитный штатив и инкубировать при комнатной температуре в течение 8 мин, чтобы позволить коричневый микрогранулы прикрепить к стороне, ближайшей к магниту.
- С помощью трубки в магнитный штатив, осторожно переносить фракцию супернатанта в новую стерильную пробирку. Эта фракция содержит обогащенную CD27 - наивных В - клеток.
- Добавьте 5 мл в пробирку , содержащую микрогранулы и осторожно ресуспендируют микрошарики (то есть, обогащенную фракцию клеток CD27 + память B) 24-25.
- Центрифуга при 600 х г при комнатной температуре в течение 5 мин. Ресуспендируют гранулы с RPMI 1640 средой для нисходящих экспериментов.
Примечание: Как правило, ~ 30 - 60% В - клеток , могут быть очищены в виде ячеек памяти CD27 + из МКПК здорового донора 7, 25-26.
3. сортировка клеток для коллекции наивных В-клеток, В-клеток памяти, и ФБФР / ПК
- Использование клеток, очищенные от шага 1, определяют количество клеток с помощью hemocytomeтер или автоматический счетчик клеток.
- Ресуспендируют клеток в холодном буфере PBS при концентрации 10 7 на мл в полистирольной трубки 5 мл.
- Добавить 1 - 2 мкг человеческого IgG на 10 6 клеток и инкубировать на льду в течение 10 мин для блока Fc.
- Добавьте 1 мкг каждого из анти-CD19-APC (клон: HIB19), анти-CD27-eFluor450 (клон: O323) и анти-CD38-PE (клон: HIT2) на 10 6 клеток; хорошо перемешать и инкубировать на льду в течение 30 мин 4, 27.
- В последние 5 мин на стадии 3.4, добавляют 5 мкл коммерческого 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Добавляют 2 мл PBS с трубкой, вихря и центрифуге при 600 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в буфер сортировки (стерильный PBS с 2% BSA и 2 мМ ЭДТА) при концентрации 1 - 5 × 10 7 клеток на мл в пробирку объемом 15 мл.
- Фильтр клеток через нейлоновое сито ячейки фильтра (размер пор 40 мкм), чтобы исключить скопления клеток.
- Отдельные клетки с цитометрии рода потокаэр оснащен тремя лазерами: фиолетовый (405 нм), синий (488 нм) и красный (640 нм).
Примечание: Голубой лазер одного достаточно для 3-цветной проточной цитометрии 27-28. - Сортировка клеток в три 15 мл пробирки (содержащие 5 мл RPMI среды) для одновременного сбора наивных В - клеток (CD19 + CD27 -), В - клетки памяти (CD19 + CD27 +), и ФБФР / ПК (CD19 + CD27 + / CD38 + привет) 3-4, 28.
Примечание: Сортировано наивные и В-клетки памяти могут культивироваться, как описано в шаге 4.
4. Экстракорпоральное Дифференциация изолированных человеческого CD19 + В - клеток, CD19 + CD27 + В - клетки памяти, и CD19 + CD27 - Наивные В - клетки
- Используя клетки, очищенные с шагом 1,19, 2,10, 2,11 и 3,10, определяют количество клеток с помощью гемоцитометра или автоматического счетчика.
- Ресуспендируют клетки с RPMI 1640,в концентрации 1 - 10 × 10 5 на мл и аликвоту их в лунки 12-луночного планшета.
- Добавить CpG (ODN 2006) на 5 мкг / 10 6 клеток / мл 18, 29.
- Культуры клеток в 37 ° C инкубаторе с 5% CO 2 в течение 5 дней.
- Сбора клеток из каждой лунки, размещают их по отдельности в 15 мл пробирки, добавляют 5 мл PBS в каждую пробирку, и отцентрифугированы при 600 мкг и комнатной температуре в течение 5 мин.
- Граф клеток с использованием гемоцитометра или автоматического счетчика. Ресуспендируют клеток в концентрации 1 - 10 × 10 5 на мл с RPMI 1640 среды.
5. Анализ ELISpot
- Добавить 30 мкл 35% этанола в дистиллированной воде, в каждую лунку планшетов ELISpot в течение 30 сек.
ПРИМЕЧАНИЕ: При пипеткой, не касаясь мембраны в лунки во все времена. - Инверсия пластины ELISPOT для удаления этанола.
- Поместите 150 мкл автоклавного DDH 2 O в каждую лунку и инкубироватьих при комнатной температуре в течение 5 минут, чтобы смыть от остаточного этанола; следовать с промывкой стерильной PBS при комнатной температуре в течение 3 мин.
Примечание: Шаги 5.1 до 5.3, могут быть по желанию, в зависимости от производства пластин. - Поместите 50 мкл 5 мкг / мл поликлональное F (аb ') 2 - фрагмента антитела против человеческого Ig (IgG + IgM + IgA) (в PBS) в каждую лунку планшетов ELISpot и инкубировать их при 4 ° С в течение ночи (предпочтительно) или 37 ° С в течение 2 ч 11.
Примечание: запечатать края пластин парафильмом до использования. - Инверсия пластины для удаления несвязанного Abs, добавьте 200 мкл PBS, в каждую лунку, и инкубировать их в два раза при комнатной температуре в течение 3 мин каждый раз.
- Добавить 200 мкл PBS с 5% БСА (или RPMI 1640), в каждую лунку для блокирования, и инкубировать их при комнатной температуре в течение 2 ч.
- Обратить пластины, чтобы удалить блокирующий буфер. Промыть каждую лунку два раза 200 мкл PBS, а на этапе 5.5.
- Добавить 100 мкл RPMI 1640, в каждую лунку и инкубировать их при 37 ° С.
- Когда все будет готово к семени клетки, инвертировать пластины, чтобы удалить RPMI 1640.
- Семенной 100 мкл (5 × 10 4), 50 мкл (2,5 × 10 4) и 25 мкл (1,25 × 10 4) клеток (от шагов , 1,19, 2,10, 2,11, 3,10 и 4,6) в ямах ELISpot пластины. С помощью RPMI 1640, довести объем до 150 мкл / лунку.
Примечание: Минимум одного или двух 2-кратных серийных разведений для посева клеток рекомендуется. - Инкубируйте пластин в инкубаторе C 37 ° с 5% CO 2 в течение 8 - 14 ч 18. Избегайте перемещения пластин во время инкубации.
- Инверсия пластины для удаления клеток и RPMI 1640.
- Добавить 200 мкл / лунку PBS-T (PBS с 0,05% Tween 20) и инкубируют их в 5 раз при комнатной температуре, каждый раз в течение 3 мин. Переверните планшет, чтобы удалить промывочный буфер между каждым из 5 промывок.
- Добавить либо козьего антитела против человеческого IgG, щелочной фосфатазы (AP), Fcγ специфические Абс (для обнаружения IgG, 1: 5000 в PBS-T) Или козьего антитела против человеческого IgМ-АР, Fcμ фрагмент конкретного Абс (для обнаружения IgM, 1: 5000 в PBS-T) в зону, лунки и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 ч в темноте.
- Промыть каждую лунку два раза 200 мкл PBS, а на этапе 5.5.
- Добавьте 50 bromochloroindolyl раствора мкл / лунку фосфатного-нитро тетразолия (BCIP / NBT) подложки. Фиолетовый-цветные пятна обычно появляются в 5 - 15 мин.
- Добавьте 100 мкл / лунку DDH 2 O , чтобы не допустить чрезмерного развития пятен.
- Промыть пластины с проточной водопроводной водой после полного развития всех пятен.
- Удалите underdrain пластин и дать им высохнуть на воздухе в темноте.
- Подсчитывают пятна с помощью автоматического планшет - ридера с блоком изображения сбора / анализа (например, автоматический сканер или вручную через рассекает микроскопом).
Примечание: Пластины можно хранить при комнатной температуре в темноте и проанализированы позже.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
РВМС обеднен эритроцитах и прилипшие клетки (шаги 1,2 до 1,7). Порцию (2 × 10 6) клеток подвергали анализу проточной цитометрии для иллюстрации популяции наивных В - клеток, В - клеток памяти, и ФБФР / ПК в периферической крови (рисунок 1). В МНПК этого донора, около 10% лимфоцитов были CD19 + В - клетки. В B-клеточного отсека, процент CD19 + CD27 - наивных В - клеток составляет около 50%. С другой стороны, около 50% клеток CD19 + В были CD27 + В - клетки памяти 7, 25-26. Следует отметить, что CD27 + клеток памяти B могут быть дополнительно разделены с включением IgD 4. Фенотип циркулирующих PbS можно лучше определить с низким или без выражения поверхности CD20 (CD19 + CD27 + / CD38 + привет CD20 Lo / -) 2, 30-31. Чтобы исключить мертвые клетки, 7-AADмогут быть включены в клетки окрашивания (этап 3.5), а также участок для FSC по сравнению с 7-AAD позволяет стробирования популяцию живых клеток (7-AAD -).
Основные этапы анализа ELISpot изображены на рисунке 2. Оба очищенные В - клетки человека и В - клетки памяти CD19 + CD27 + культивировали в присутствии CpG с RPMI 1640 , в течение 5 дней. Клетки собирали для анализа ELISpot для количественной оценки вновь возникшим ИСС. Если присутствует, то ранее существовавшие УБ выделены из периферической крови вымрут через 48 ч 11. Анализ ELISpot проводили, и пятно изображения , полученные с помощью автоматического сканера пластины, показаны на рисунке 3. Результаты ELISpot обычно будет показывать 50 - 200 IgM-ИСС из 10 4 B клеток , обработанных CpG в течение 5 дней, в то время как количество IgG-ИСС составляет 10 - 50 в 10 4 клеток 11.
Рисунок 1. Иллюстрация Стратегии для разделения Память клетки Наивные В, В - клетки памяти, и УБ в МНПК. (А) Клетки (2 х 10 6) окрашивали 2 мкг каждого из CD19-APC, CD27-eFluor450 и CD38-PE мАт (этап 3.4). Лимфоцит отсек закрытого типа (G1) на точечном участке для рассеяния вперед (FSC) по сравнению с боковым рассеиванием (SSC). (Б) Клеточные дублеты, которые образованы двумя клетками склеены, были исключены (те , за пределами G2) , на участке для FSC-W (ширина) по сравнению с FSC-H (высота). (С) CD19 + В - клетки закрытого типа , как G3 на участке для SSC-A (область) и CD19-APC. (D) Из CD19 + клеток, точка график параметров CD27 и CD38 показал наивных В - клеток (CD19 + CD27 -; Q1 и Q4), В - клетки памяти (CD19 + CD27 +;Q2 и Q3), и УБ (CD19 + CD27 + / CD38 + привет; G4, 0,6% от Q2). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Иллюстрации из ключевых шагов в ELISpot анализе. (А) Поместите 50 мкл / лунку (5 мкг / мл) F (аb ') 2 - фрагмента антитела против человеческого Ig (IgG + IgM + IgA) в пластине ELISpot в течение 2 ч при температуре 37 ° С или в течение ночи при 4 & deg ; C (предпочтительно) (шаг 5.4). Семенной клеток в лунки планшета ELISpot. Разрешить ИСС прикрепить к PVDF мембрану и секретируют Abs в течение 8 - 14 ч (шаг 5.11). (B) Смыть клеток с PBS (с 0,05% Tween 20). (C) Добавить ЩФ или HRP-CONJugated обнаружение Abs конкретных либо IgG или IgM. (D) Смыть Abs обнаружения, несвязанными. (Е) развивать пятна с раствором субстрата AP или HRP , чтобы соответствовать Abs обнаружения. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Результаты ELISPOT от представителя плиты. (A) Очищенная CD19 + В - клетки были помещены в трех соседних скважин (50000 клеток в лунку # 1, 25000 клеток в лунку # 2 и 12500 клеток в лунку # 3, соответственно) пластины ELISpot. Затем клетки культивировали в среде RPMI 1640, в течение ночи (~ 14 ч). Анализ ELISpot проводили после завершения культуры (шаги 5,12 до 5,18). Для Analyzе результаты, планшет ELISpot сканировали для получения изображений с помощью автоматического анализатора, оборудованного сканером и программным обеспечением. Ячейки памяти (B) Очищенная CD19 + CD27 + (10 6 / мл) культивировали в присутствии 5 мкг / мл CpG в течение 5 дней. Клетки обрабатывали , как и в (А) для анализа ELISpot. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Выделение и очистка периферической крови человека В-клеток
Обычно Эритроциты могут быть эффективно разорваны и очищается буфера для лизиса (шаг 1.2). Важно, чтобы не инкубировать МНПК с буфером для лизиса эритроцитов дольше, чем 5 мин, а жизнеспособность клеток может зависеть от хлорида аммония. В качестве альтернативы, Эритроциты и тромбоциты могут быть одновременно удалены следующим протоколом.
Смешайте свежую цельную кровь, с кислотно-цитрат-декстроза (ACD) буфера (39 мМ лимонной кислоты, 75 мМ цитрат натрия и 135 мМ декстроза, рН 7,4) в объемном соотношении 9: 1, кровь к буферу. Центрифуга при 250 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Обратите внимание на формирование слоев, что указывает на разделение. Отберите и выбросить верхний слой, который содержит тромбоциты и обогащенной тромбоцитами плазмы (желтый цвет). Удалите тонкий средний слой на границе раздела, который содержит МНПК (т .е., Слой светлого сгустка крови). Избегайте загрязнения эритроцитами в нижнем слое (dковчег красный цвет). Добавить буфер для лизиса в МНПК, чтобы удалить остаточные эритроциты, а затем выполните шаги с 1.2 до 1.19.
Два подхода могут быть использованы для выделения В - клетки из МКПК: положительного и отрицательного отбора 21. Метод негативного отбора (шаги 1,1 до 1,19) используется для получения нетронутым, функциональные В-клетки, не связанного Abs или микрогранул, для последующих экспериментов. Крайне важно учитывать это при активации и / или дифференцировки очищенных В-клеток происходит в культуре. Речь идет о том, что клетки, очищенные позитивной селекции могут быть неумышленно под влиянием МАВ-конъюгированных микрошариков (от 0,2 до 5 мкм в диаметре). моноклональные антитела могут связываться со специфическими рецепторами на В-клетках и, следовательно, могут сшивать рецепторы для активации. Кроме того, микросферы могут быть эндоцитированный В-клетками через связанных рецепторов. Хотя биологическому разложению, что микросферы могут оставаться внутри клетки дольше, чем на неделю. Является ли сохранение микрошариков будет влиять на Experiментальные результаты должны быть определены эмпирически. При очистке клеток человека с помощью положительной селекции, анти-CD19 (клоны: 4G7 или HIB19) микросферы обычно используются потому , что CD19 широко экспрессируется на протяжении стадии развития В - клеток. Чистота В-клеток после разделения может быть определено с помощью проточной цитометрии с анти-CD19 моноклональных антител (клоны: SJ25C1 или LT19), распознающие различные эпитопы из анти-CD19 микрогранул.
Очистка и разделение памяти и наивные В-клетки из выделенных В-клеток
CD27 является широко распространенным поверхностным маркером для человеческой памяти и наивным B различия 24 клеток. Молекула CD27 принадлежит к семейству фактора некроза опухолей-рецептор (ФНО). Поскольку CD27 экспрессируется на большинстве клеток памяти B человека, он обычно используется для различения их от CD27 - наивных В - клеток. Однако, поскольку CD27 также экспрессируется на Т-клеток и NK-клеток, использование анти-CD27 microbeaDS (клон: O323) в положительно выбора В-клетки памяти требует предварительной очистки В-клеток (шаги 1,1 до 1,19). Для проверки чистоты после разделения, моноклональные антитела, специфичные для человеческого CD27 (клоны: L128 или LG.3A10) рекомендуется (этап 2.12). Поскольку CD27 + В - клетки памяти являются гетерогенными, дополнительные поверхностные маркеры, такие как IgD и FCRL4, можно рассматривать для дальнейшего разделения в сортировке клеток 4, 7.
Сортировка клеток по получению Наивные В-клетки, В-клетки памяти и ФБФР / ПК
Так как B-клетки экспрессируют FcγRIIB,-блок Fc (этап 3.3) рекомендуется до окрашивания клеток с моноклональными для проточной цитометрии. Fc - фрагменты только человеческого IgG может блокировать одинаково хорошо , как и весь человеческий IgG на 1 мкг / 10 6 клеток. Античеловеческие CD32 моноклональными (клоны: 3D3 или AT10) является еще одним вариантом для блока Fc. Следует отметить, что если FcγRIIB является поверхностный маркер, чтобы быть окрашены в очищенных В-клетках, флуорофор-конъюгированные анти-CD32 мАт шульд быть добавлены отказаться от блока Fc, с последующим окрашиванием с другими моноклональными без промывки PBS.
Для трехцветной проточной цитометрии, CD38-FITC (Флюоресцеиновая), CD27-PE (Фикоэритрин) и CD19-APC (аллофикоцианин) являются типичным сочетание флуорофоров. Тем не менее, если проточной цитометрии сортировщик оснащен тремя лазерами, такими как 405 нм, 488 нм и 640 нм, исследователи затем могут позволить себе роскошь выбирать флуорофоров, возбуждаемых различными лазерами для сортировки клеток. Как показано на рисунке 1, клетки окрашивали CD19-APC (клон: HIB19), CD27-eFluor450 (эквивалент Pacific Blue, клон: O323) и CD38-PE (клон: HB7) , чтобы отделить наивных В - клеток, памяти В-клетки, и ФБС. Следует отметить, что некоторые исследователи предпочитают включение CD45 (клон: HI30) в качестве маркера лейкоцитарной клонального и ворота В - клеток как CD45 + CD19 + популяции. Поскольку обнаружение ФБФР в обращении в устойчивом состоянии является редким Eveнт у здоровых людей, низким или даже вообще без поверхностной экспрессии CD20 на ЧБ (CD19 + CD27 + / CD38 + привет CD20 Lo / -) обосновывает их добросовестным существование 2, 30-31. Это полезно, когда сравниваются результаты количественного определения ФБС по поверхности фенотипов и ИСС с помощью анализов ELISpot. В течение периода до клеточной сортировки, 7-ААР предпочтительно пропидийиодидом для исключения мертвых клеток, из-за ее более узкого спектра излучения и нижнего перелива в многоцветной проточной цитометрии.
In Vitro стимуляции и дифференцировки изолированных клеток человеческих В
Тип B CpG (ODN 2006) в одиночку может вызвать ограниченную дифференциацию как IgM- и IgG-ИСС из В-клеток памяти. Кроме того, наивные В - клетки слабо реагируют на CpG и в основном приводят к IgM-ИСС 6, 11. Концентрация CpG в культуре находится в диапазоне от 2,5 - 5 мкг / мл на 10 6 В - клетокили МНПК 11, 18. Кроме CpG, очищенные В-клетки и МНПК могут культивироваться в присутствии комбинаций CpG митогенами, цитокины и агонистов BCR, чтобы дифференцировать клеток человека в ИСС в культуре (шаг 4.3). Например, обычно используют рецепты 10 6 клеток на мл , включают (а) CpG (5 мкг / мл), рекомбинантный человеческий ИЛ-2 (10 нг / мл), и рекомбинантный человеческий IL-10 (10 нг / мл) 15, 34; (б) CpG (5 мкг / мл) и F (аb ') 2 - фрагментов против человеческого Ig (IgG + IgM + IgA) (20 мкг / мл) , 11; (с) CpG (5 мкг / мл), белок А из золотистого стафилококка Cowan (SAC) (1: 10000 разбавления), и Pokeweed митоген (ШИМ) (1: 100000 разведение) 18; (d) рекомбинантный человеческий IL-21 (100 нг / мл) и рекомбинантный sCD40L (1 мкг / мл) , 12, 15, 33; и (е) рекомбинантного человеческого IL-2 (10 нг / мл) и R848 (1 мкг / мл), добавляли TLR7 агонист 33-34. Несмотря на то, В - клетки могут быть дифференцированы в ИСС через три дня 11, клетки , как правило , предварительно stimulated в течение 5 до 6 дней перед добавлением к пластине ELISpot для квантификации ИСС 11, 18. В течение периода культивирования, не существует, как правило, не пополнение исходных дифференцировочных агентов.
Добавление IL-2 и IL-10 в CpG-содержащих культур может значительно увеличить количество дифференцированной IgM- и IgG-ИСС 15, 35. Присутствие IL-2 в культуре может обеспечить митогенетический стимуляцию содействовать расширению дифференцированных В-клеток CpG. ИЛ-10 в диапазоне 10-25 нг / мл может значительно увеличить производство ИСС (~ 3 до 10 раз) в присутствии CpG 35. Агонисты BCR, в том числе анти-BCR и ГАК, и PWM может также стимулировать пролиферацию В - клеток первичного человека 18. Инкубация клеток памяти с CpG и поликлональных анти-BCR в основном приводит к увеличению IgM-ИСС , но не в IgG-ИСС 28. Для профилактики ингибирования передачи сигналов через BCR по FcγRIIB, в F (аb &# 39;) 2 - фрагмент анти-Ig (10 - 20 мкг / мл на 10 6 клеток) рекомендуется при сшивающий BCR 11. Вместо того , чтобы поликлональной анти-Ig, анти-BCR моноклональные антитела , специфичные для либо IgM + или IgG + В - клеток следует рассматривать целевой изотипспецифичной специфических подклассов В-клеток для дифференцировки в ИСС. Сочетание CpG, SAC (1: 10000 разбавления) и PWM (1: 100000 разведение) может эффективно активировать В - клетки памяти дифференцироваться в IgM- и IgG-ИСС 18, 24. Кроме того, CpG может вызвать умеренно переключению класса иммуноглобулина в пробирке 28-29. В противоположность этому , IL-21 (100 нг / мл) и sCD40L (1 мкг / мл) эффективно индуцировать дифференцировку клеток памяти B исключительно к коммутируемой IgG-ИСС 12, 30. SCD40L может активировать В - клетки, имитируя Т-клеточной помощи через CD40 на В - клетках, влияющих на их дифференцировку в ПК в естественных условиях. Следует отметить, что анти-CD40 (клоны: 89 или G28.5) может заменить sCD40L в культуре 15. Howevэ-э, ни sCD40L, ни анти-CD40 в одиночку способен индуцировать дифференцировку В-клеток памяти. Таким образом, активация CD40, культивированных В-клеток, часто в сочетании с дифференцировочного агента, такого как IL-4, CpG, R848, или IL-21, любой из которых может способствовать переключение класс иммуноглобулинов. ИЛ-4 играет ключевую роль в дифференцировке клеток Th2 , CD4, что позволяет индукцию большинства клеток IgM + B , чтобы перейти к клеткам IgG1 + В в культуре. Аналогичным образом , в присутствии IL-21, как В - клетки памяти и наивные В - клетки дифференцироваться исключительно в класс коммутацией ИСС 12, 32. Как CpG, R848 может вызвать маргинальное класса выключателя В - клеток 34. И, наконец, следует отметить , что , хотя липополисахарида (LPS) может эффективно индуцировать дифференцировку мыши В - клеток в ИСС, В - клетки человека экспрессируют низкие уровни TLR4 и CD14 29. Поскольку добавление дифференциации агента в культуре способствует генерации коммутируемых В-клеток, это дополнение, следует избегатькогда существовавшие ранее ФБФР / ПК или Некоммутируемые В-клетки памяти должны быть измерены.
ELISpot Анализ
Анализ ELISpot сочетает в себе ELISAs пластинчатые основе с мембранами на основе вестерн - блоттинга технологий, что позволяет для обнаружения Abs , секретируемого одной ячейки B 18. ELISpot также была адаптирована для количественного определения антиген-специфические Т - клетки , которые секретируют цитокины 17, 36. В анализе ELISpot, могут быть использованы либо очищенные клетки или нефракционированные МНПК (свободные от эритроцитах). Тем не менее, ~ 10 раз больше МНПК требуются, чем очищенные клетки для получения стабильных результатов в анализах ELISpot. Хорошая отправная точка 1 - 2 × 10 5 клеток на лунку для обнаружения циркулирующих ИСС в МНПК. При детектировании Ag конкретных ИСС, анти-Ig-антитело, как правило, заменяется Ag (5 - 10 мкг / мл в PBS), чтобы захватить антиген-специфические ACSS (этап 5.4). Использование изотипным специфических антител обнаружения позволяет различать Ag-специфических IgM-ИСС и IgG изотипспецифичной ИСС (шаг 5.14). Следует отметить, что независимо от того, используются ли анти-Ig или Ag, чтобы захватить ИСС, абс, используемые для обнаружения ELISA может быть не всегда подходит для ELISpot. Кроме того, не все цветные подложки для ELISA функционировать должным образом в ELISpot. AP- и HRP-конъюгированные Абс наиболее часто используются для обнаружения пятен в ELISpot. Раствор субстрата BCIP / NBT является популярным выбором для обнаружения AP на основе, в то время как 3,3 ', 5,5'-тетраметил-бензидин (ТМБ) и 3-амино-9-ethylcarbazole растворы (AEC) являются общими субстраты для HRP в ELISpot. Если точка доступа или ПХ непосредственно конъюгированное с СБА обнаружения, только один шаг необходим для обнаружения, как описано в протоколе (этап 5.14). В противоположность этому, Абс обнаружения биотинилированное и требуют последующего инкубации с ЩФ или конъюгированным с пероксидазой хрена стрептавидином до реакции с субстратами в способе двухстадийной. Оба один шаг и двухступенчатые методы работают эффективно для обнаружения пятен в ELISpot.
Анализ ELISpot может количественно не только circulatING, но и дифференцированы ИСС в культуре (шаг 1,19 против 4,6). Если он присутствует, циркулирующих ИСС, которые обычно живут не более двух дней в культуре, могут быть непосредственно культивируют в пластине ELISpot, с или без очистки от МНПК 11. В противоположность этому, дифференцировку В-клеток памяти занимает 5 дней. Следовательно, прямое культивирование в ELISpot пластин после выделения клеток (этап 1.19) не рекомендуется; мертвых обломков клеток в результате длительного периода культивирования может увеличить опыт работы в области обнаружения пятна. Вместо того, чтобы, как очищенный В-клетки и общий МНПК можно сначала культивировали в 6-луночных или 12-луночный планшет в присутствии митогены и дифференцировки агентов (этап 4.3). В процессе культивирования, повторное добавление стимуляции агентов не является необходимым (шаг 4.3). В то время как плиты находятся в инкубаторе, дверь инкубатора следует аккуратно открывать и закрывать, чтобы предотвратить сеяных ИСС от перемещения, поскольку они могут диффундировать секретируемых Abs вдоль движущихся дорожек, создавая пятнас хвостами (так называемые "кометоподобное" пятна) (шаг 5.11). Инкубационный период в ELISpot пластин определяется временем, необходимым для клеток секретировать обнаруживаемые количества Abs, не позволяя клеткам делиться, что создаст трудности в месте подсчета. Таким образом, клетки, как правило, культивируют в диапазоне от 8 ч до в течение ночи (этап 5.11).
Анализ ELISpot является наиболее широко используемым методом для количественной оценки ответов памяти В-клеток. Она стала популярной, независимый отсчет гуморального иммунного ответа и иммунологической памяти. На практике, предшествующий митогенная культуре необходим для активации В-клеток памяти для дифференцировки в ИСС (шаг 4.3). Тем не менее, частота, при которой клетки памяти расширяются и дифференцируются в ИСС варьирует в различных культуральной среде, как описано выше. Несмотря на то, без консенсуса, большинство исследователей принять условие индукции, что может максимально увеличить производство ИСС. С точки зрения агента, используемого для точечного detectioп, растворимый биотинилированный Ag может заменить неудовлетворительную обнаружения Ab без ущерба для чувствительности 37. Это имеет особое значение, когда наличие Ag ограничено из-за гораздо меньшее количество Ag требуется для обнаружения, чем для покрытия пластин. И, наконец, ELISpot не позволяет фенотипический анализ клеточной неоднородности, и, таким образом, требует предварительного фракционирования клеточных субпопуляций. В последнее время многоцветной ELISpot анализ, в котором обнаружение Абс помечены различными флуорофоров, был разработан для обнаружения множества типов цитокин-секретирующие клетки в одной скважине 38-39. Эта новая технология будет представлять особый интерес для детектирования низкочастотных клеток в МНПК и для крупномасштабного анализа вакцин-индуцированных реакций B-клеток.
Поскольку анализ ELISpot быстр и эффективен при количественной оценке ИСС и цитокин-секретирующие клетки, она была расширена для измерения функциональных возможностей не только Circuствительный лимфоциты, но и иммунные клетки , ткани , такие как внутрипеченочных лейкоцитах 40. Из-за своей чувствительности, достигающей уровня обнаружения даже одного ASC, анализ ELISpot все чаще используется для измерения человеческих иммунных ответов на эффективностей вакцины против существующих и новых патогенных микроорганизмов. Хотя производительность с высокой пропускной способностью и надежность ELISpot анализа превосходны для крупномасштабных оценок иммунных реакций с использованием МНПК, результаты анализов могут влиять различные факторы, такие как задержка обработки образцов, могут ли клетки являются свежие или замороженные , сывороточные компоненты , в культуральной среде, и количество клеток , добавленных к ELISpot пластине 41. Таким образом, процедуры нормализации должны быть включены в протокол ELISpot свести к минимуму внутри- и между анализами изменения в крупномасштабных и продольных последующих исследований (например, вакцины испытания). Способ нормализации чтения пластины также имеет важное значение для линейности, точности и минусыistency в анализе результатов 41-42. Один из способов выполнить нормализацию пластины чтения является расширение процедуры последовательного разведения клеток, посеянных на ELISpot пластин (шаг 5.10). Создавая опорную плиту, больше серийных разведений должны демонстрировать линейную зависимость между числом клеток высевали на лунку и спотовых отсчетов на лунку. Повторные сканирование пластины ELISpot могут быть использованы для проверки шаблон точечного подсчета, и автоматически и вручную. Минимальная изменчивость внутри хорошо спот подсчетов ожидается после этих процедур нормализации 43. И, наконец, применение ELISpot может быть расширен разными способами, например, для мониторинга ответов лечения больных с инфекциями и принимающих иммунотерапии рака, а также к оценке иммунотоксичности (например, иммуносупрессии и аутоиммунные медикаментозный).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 mL tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 mL Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-043 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
