Abstract
Det kännetecknande för humoral immunitet är att generera funktionella DSKer som syntetiserar och utsöndrar Abs specifik för ett antigen (Ag), såsom en patogen, och som används för värdförsvar. För kvantitativ bestämning av den funktionella statusen av det humorala immunsvaret hos en individ, både serum Abs och cirkulerande DSKer vanligen mätt som funktionella avläsningar. Hos människa är perifert blod den mest praktiska och lättillgänglig prov som kan användas för bestämning av det humorala immunsvaret som framkallas av värd B-celler. Distinkta B-cellundergrupper, inklusive DSKer, kan isoleras direkt från perifert blod via selektion med härstamningsspecifika Ab-konjugerade mikropärlor eller via cellsortering med flödescytometri. Dessutom kan renade naiva och minnes-B-celler aktiveras och differentieras till DSK: er i odling. De funktionella aktiviteter DSK att bidra till Ab sekre kan kvantifieras genom ELISpot, vilket är en analys som konvergerar enzym-kopplad immunoabsorbance analys (ELISA) och Western blotting-teknik för att möjliggöra räkning av enskilda ASC: er vid enkelcellnivån. I praktiken har det ELISpot-analysen blivit allt vanligare att utvärdera vaccinets effektivitet på grund av den lätthet vid hantering av ett stort antal blodprov. Metoderna för att isolera humana B-celler från perifert blod, kommer differentieringen av B-celler i DSK: er in vitro och anställning av ELISpot för kvantifiering av totala IgM- och IgG-DSKer beskrivas här.
Introduction
B-celler spelar en central roll i utvecklingen av humoral immunitet. De initialt utvecklas i benmärgen och in i blodomloppet som naiva B-celler, som kan vandra in i lymfvävnader såsom mjälte, lymfkörtlar och tonsiller, för vidareutveckling. Vid Ag möter några naiva B-celler migrerar till lymfoida folliklar, där germinal center B-celler kan differentiera till minnes-B-celler och plasmablasts (PBS) / plasmaceller (PC). Medan de flesta PBS / PC utträde in i blodomloppet, några så småningom uppehålla sig i benmärgen att genomgå terminal differentiering till långlivade datorer 1. B-celler i omlopp är heterogena, och vid steady state, PBS / datorer är sällsynta i perifert blod 2. Som ett resultat av tillgängligheten av härstamningsspecifika ytmarkörer, har flödescytometri blivit en populär metod för identifiering och karakterisering av de B-cellundergrupper i perifert blod. En utvidgad tillämpning av flödes cytometry är tillägget av en cellsorterare funktion, som medger separation och isolering av enskilda delmängder av B-celler med hög renhet. Baserat på expressionen av specifika ytreceptorer i olika utvecklingsstadier, mänskliga cirkulerande B-celler är i allmänhet klassificeras i tre huvudunderpopulationer: naiva B-celler (CD19 + CD27 - CD38 -), minnes-B-celler (CD19 + CD27 + CD38 -), och PBS / PC (CD19 + CD27 + CD38 +) 3-4 (Figur 1). Naiva B-celler av naturen har inte stött på AGS. De kan emellertid differentieras till IgM + CD27 + minnes-B-celler. Även naiva B-celler är homogena uttrycka B-cellsantigenreceptor (BCR) -associated molekyler (t.ex. CD19, CD20 och CD22) de är heterogena i deras immunoglobulin repertoar 5. Majoriteten av CD27 + minnes-B-celler kan differentieras till CD27+ / hi CD38 + PBS / PC 6. Dessutom minnes-B-celler och PBS / PC är polyklonala och uppvisar utvecklande och funktionell heterogenitet 4-7. PBS / datorer i omlopp är normalt kortlivade och inte uttrycka CD138, men de gjorde att slå sig ner i benmärgen kommer terminalt differentiera och bli långlivade. Terminalt differentierade datorer uttrycker CD138 och nedreglera CD27-molekyler på sina ytor 8. Eftersom både PBS och datorer är kapabla att utsöndra Abs, i många tillfällen de kollektivt betecknas som DSK. I motsats härtill kan varken naiva B-celler eller minnes-B-celler producerar avsevärda mängder Abs 9-10. Icke desto mindre, när den isoleras, både naiva och minnes-B-celler kan differentieras till ASCs i 3 - 10 dagar när de placeras i de riktiga odlingsbetingelser 6, 11-15. I själva verket, DSK: er som härrör från in vitro differentiering dela liknande yta uttryck för CD27 och CD38 med de direkt isolerade frOm perifert blod sex. Dessutom DSK: er differentierade in vitro uttrycker en låg nivå av ytan CD20, liknande den i cirkulerande PBS / PC 6. Även om odlingshärledda DSKer är alla kortlivade, kan de utsöndra Abs, vilket indikerar att de är funktionellt behörigt och kan bidra till den humorala immuniteten.
Både ELISA och ELISpot är överlägset de mest tillämpade metoder som man kan få funktionell information om det humorala immunsvaret. ELISA är en 96-brunnars platta-baserad analys, och det används ofta för att mäta de titrar av serum-Ag-specifik Abs och andra analyter (t.ex. cytokiner). Det är bekvämt och skalbar. ELISA används för att använda en fast fas enzymanalys för att detektera närvaron av Abs eller andra ämnen, såsom serum, i ett vätskeprov 16. De avläsning från serum ELISA har använts i stor utsträckning för att representera immunsvaret i kroppen. Ett verktyg som krävs för förvärv av readouts från ELISA-analyser är en spektrofotometrisk mikroplattläsare. Läsaren kan bestämma den optiska densiteten (OD) av slutprodukterna typiskt resulterar från reaktionen av pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad detekterings Abs och deras specifika substrat 17. När det gäller att rapportera det humorala immunsvaret, serum Ab nivåer bestäms av ELISA beteckna det kollektiva, men inte individuella, prestanda DSK: er i kroppen. Dessutom ELISA låter att ta hänsyn till den deltagande av minnes-B-celler, vilka inte utsöndrar Abs.
Liksom ELISA, är ELISpot en allmänt använd metod för att detektera och övervaka immunsvar i perifera blodprov 17-18. ELISpot är en teknik relaterad till en sandwich-ELISA. I den, är celler placeras i polyvinylidendifluorid (PVDF) membranstödda brunnar av 96-brunnars mikroplattor för en kortsiktig odling. ELISPOT-analysen är analogt med att utföra western blotting på en mikro och developing fläckarna på PVDF-membranet i varje brunn. krävs ett automatiserat ELISpot läsarsystem eller en stereo för manuell räkning. Den största fördelen med ELISpot vid detektering av ett immunsvar är dess utmärkt känslighet vid kvantifieringen av ASC: er och cytokin-utsöndrande celler. Det rapporterar deras funktionella aktiviteter i humoral och cellulär immunitet, respektive. Vid mätningen av humorala immunförsvar, är serum Ab halter som uppmätts med ELISA och antalet ASC: er räknas upp ELISpot ofta korrelerade, men data avläsning från dessa två analyser har vissa skillnader i funktionella konsekvenser 19-20. Den största fördelen med ELISpot är dess känslighet metod. Nivån av serum Ab-titrar som rapporterats av ELISA presenteras halv kvantitativt som OD avläsningar, som betecknar den relativa Ab nivå, eller mer kvantitativt, eftersom koncentrations avläsning när en känd mängd av rätt isotyperna av Abs ingår som referens. I kontrast, resultaten av ELISpot är presented som det absoluta antalet ASC: er i en cell pool av intresse (t.ex., ofraktionerade perifera mononukleära blodceller (PBMC) och renade B-celler från PBMC). ELISpot kan upptäcka en enda ASC, men ELISA kräver AB uppgår från DSK att nå optimerade analysberoende koncentrationer före mätningen. Därför är ELISpot naturligtvis överlägsen ELISA i känslighet för kvantifiering. Dessutom är ELISpot också lämplig för att kvantifiera de differentierade DSK in vitro från aktiverade minnes-B-celler. Minnes-B-celler inte utsöndrar Abs men kan differentiera till DSKer vid aktivering; De har därför inget bidrag till serum Abs detekteras med ELISA. Således är ELISpot den metod som i mätningen av immunsvaret av cirkulerande minnes B-celler efter aktivering i odling. Det möjliggör övervakning av underhåll på lång sikt humoral immunitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Humant perifert blod måste erhållas från friska donatorer enligt informerat samtycke, och användningen av blodprov måste överensstämma med de godkända riktlinjer som fastställts av enskilda institutionella prövningsnämnder. I denna studie, att protokollet använder människoblod i en demonstration av resultaten av flödescytometri (figur 1) och ELISPOT-analyser (Figur 3) godkändes av den inre Review Board of National Taiwan University Hospital (protokollnummer 201307019RINB).
1. Isolering och rening av humant perifert blod-B-celler
- Dra ~ 10 ml blod från symmetri kubiska ven (i kubiska fossa anterior till armbågen) in i en 15-ml rör innehållande K 2 EDTA (1,5 till 2,0 mg / ml blod) och omedelbart invertera röret flera gånger för att förhindra koagel bildning.
- Tillsätt 35 ml autoklaverat (121 ° C, 15 min) av röda blodkroppar (RBC) lysbuffert (150 mM NH4CI, 10 mM KHCO3 och 1 mM EDTA; pH 7,4) till röret med den friska blodprovet (≥ 3: 1 vol / vol) och inkubera vid rumstemperatur (RT) under en längre tid än fem minuter.
OBSERVERA: Utseendet på ljustransmission genom röret indikerar slutförandet av RBC-lys. - Centrifugera vid 600 xg vid RT i 5 min. Se till att pelleten är vit till färgen.
- Resuspendera pelleten med 10 ml autoklaverat fosfatbuffrad saltlösning (PBS, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na 2 HPO 4, och 1,47 mM KH 2 PO 4; pH 7,4) och centrifugera som i steg 1,3.
- Kassera supernatanten, suspendera pelleten med 10 ml RPMI 1640-medium (tillägg: 10% fetalt kalvserum, 100 U / ml penicillin / streptomycin, 0,25 ^ g / ml amfotericin B, och 2 mM L-glutamin), och sedan platta den celler till en 10-cm odlingsskål (10 ml blod per skål). Placera skålen i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 30 min.
- Snurra försiktigt kulturen skålen några gånger och placeraodlingsmedium (suspensionsceller) in i 15-ml plast koniska rör. Kasta de vidhäftande cellerna (mestadels makrofager) på odlingsskålarna.
- Centrifugera vid 600 xg vid RT i 5 min. Kassera supernatanten.
- Suspendera pelleten med 1 ml RPMI 1640-medium. Räkna antalet celler med en hemocytometer eller en automatiserad cellräknare.
OBS: Viabiliteten hos isolerade leukocyter normalt är större än 90% genom trypan blå exklusion. - Centrifug såsom i steg 1,7 och återsuspendera cellerna i ~ 200 | il kall PBS-buffert (0,5% bovint serumalbumin (BSA) och 2 mM EDTA) i en koncentration av 5 - 10 x 10 6 celler / ml.
- Tillsätt 5 | il av biotinylerat anti-humant Ab cocktail specifik för blodceller (för negativ selektion av B-celler) per 10 6 celler och inkubera på is under 30 min 21.
OBS: anti-human Ab cocktail bör åtminstone omfatta Abs specifika för CD2 (eller CD3), CD14 och CD16. - Lägga till en 10-faldig överskottsvolymsteril PBS till cellerna, centrifugera vid 600 xg under 5 min, och kassera supernatanten.
- Lägg lika mycket streptavidin-konjugerade mikropärlor (5 mikroliter per 10 6 celler) till pelleten och blanda väl.
- Inkubera på is under 30 minuter i en 15-ml plast koniska rör.
- Tillsätt 2 ml av PBS-buffert i röret.
- Placera röret i en magnetisk monter och inkubera vid RT under 8 min. De bruna mikropärlorna kommer successivt fästa på rörväggen intill magneten 22.
- Med röret finns kvar i den magnetiska monter, noggrant överföra supernatanten till en ny steril 15-ml rör 22.
- Upprepa steg från 1,14 till 1,16, och kombinera de två supernatanterna som innehåller orörda B-celler. Kasta mikropärlorna.
- Centrifugera vid 600 xg vid RT i 5 min. Kassera supernatanten.
- Suspendera pelleten i RPMI 1640-medium för experiment nedströms.
OBS: Normalt 1 - 5 x 10 5 B-celler witha renhet större än 95% från 10 ml av perifert blod kan isoleras 23.
2. Rening och separation av minne och naiva B-celler från isolerade B-celler
- Använd celler renade från steg 1 och bestämma antalet celler med hjälp av en hemocytometer eller en automatisk cellräknare.
- Resuspendera cellerna i 100 pl kall PBS-buffert efter centrifugering vid 600 x g och rumstemperatur under 5 min.
- Lägg 1 - 2 | ig av biotinylerat CD27 mAb per 10 6 celler och inkubera på is under 30 min.
- Tillsätt 10 ml PBS-buffert till röret och centrifugera vid 600 xg under 5 min.
- Kassera supernatanten och återsuspendera cellerna i 50 | il PBS-buffert.
- Lägg lika mycket streptavidin magnetiska mikropärlor (1 - 2 pg / 10 6 celler) och celler i en 15-ml plast koniska rör.
- Försiktigt blanda väl och inkubera på is under 30 min.
- Tillsätt 2 - 3 ml av PBS-buffert till röret.
- Placeraröret i en magnetisk stå och inkubera vid RT under 8 min för att tillåta de bruna mikropärlorna att fästa vid sidan närmast magneten.
- Med röret i den magnetiska stativ, noggrant överföra supernatantfraktionen i ett nytt sterilt rör. Denna fraktion innehåller den anrikade CD27 - naiva B-celler.
- Tillsätt 5 ml till röret med mikropärlorna och försiktigt suspendera mikropärlor (dvs. den anrikade fraktionen av CD27 + minnes-B-celler) 24-25.
- Centrifugera vid 600 xg vid RT i 5 min. Resuspendera pellets med RPMI 1640 medium för de nedströms belägna experiment.
OBS: Typiskt ~ 30-60% av B-celler kan renas såsom CD27 + minnesceller från PBMC hos en frisk givare 7, 25-26.
3. cellsortering för indrivning av naiv B-celler, minnes B-celler och PBS / PC
- Använda celler renade från steg 1, bestämma antalet celler med hjälp av en hemocytometer eller en automatisk cellräknare.
- Resuspendera cellerna i kall PBS-buffert vid en koncentration av 10 7 per ml i en 5-ml polystyrenrör.
- Lägg 1 - 2 | ig av humant IgG per 10 6 celler och inkubera på is under 10 min för Fc-block.
- Lägg ett ig vardera av anti-CD19-APC (klon: HIB19), anti-CD27-eFluor450 (klon: O323), och anti-CD38-PE (klon: HIT2) per 10 6-celler; blanda väl och inkubera på is under 30 min 4, 27.
- Under de senaste fem minuter i steg 3,4, tillsätt 5 mikroliter av den kommersiella 7-aminoactinomycin D (7-AAD).
- Tillsätt 2 ml PBS till röret, virvel, och centrifugera vid 600 xg under 5 min.
- Resuspendera cellerna i sorteringsbuffert (steril PBS med 2% BSA och 2 mM EDTA) vid en koncentration av 1 - 5 x 10 7 celler per ml i ett 15-ml rör.
- Filtrera cellerna genom ett nylonmaskcellfilter (40 | j, m porstorlek) för att eliminera cellklumpar.
- Separera cellerna med en flödescytometrisk sortser utrustad med tre lasrar: violett (405 nm), blå (488 nm) och röd (640 nm).
OBS: Den blå laser i sig är tillräcklig för 3-färg flödescytometri 27-28. - Sortera cellerna i tre 15-ml rör (innehållande 5 ml RPMI-medium) för samtidig insamling av naiva B-celler (CD19 + CD27 -), minnes-B-celler (CD19 + CD27 +) och PBS / PC (CD19 + CD27 + / hi CD38 +) 3-4, 28.
NOT: sorterade naiva och minnes-B-celler kan odlas såsom beskrivs i steg 4.
4. In vitro-differentiering av isolerade humana CD19 + B-celler, CD19 + CD27 + Minne B-celler, och CD19 + CD27 - Naiv B-celler
- Använda celler renade i steg 1,19, 2,10, 2,11 och 3,10, bestämma antalet celler med en hemocytometer eller en automatisk cellräknare.
- Återsuspendera cellerna med RPMI 1640-mediumvid en koncentration av 1 - 10 x 10 5 per ml och delprov dem i brunnarna på en 12-brunnars platta.
- Lägg till CpG (ODN 2006) vid 5 mikrogram / 10 6 celler / ml 18, 29.
- Odla cellerna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 5 dagar.
- Skörda cellerna från varje brunn, placera dem separat i 15-ml rör, tillsätt 5 ml PBS till varje rör, och centrifugera dem vid 600 xg och RT under 5 min.
- Räkna cellerna med användning av en hemocytometer eller en automatisk cellräknare. Resuspendera cellerna i en koncentration av 1 - 10 x 10 5 per ml med RPMI 1640-medium.
5. ELISPOT-analys
- Tillsätt 30 mikroliter av 35% etanol i destillerat vatten till varje brunn i ELISPOT-plattor i 30 s.
OBS: När pipettering, undvik att röra membranet i brunnarna vid alla tidpunkter. - Invertera ELISPOT-plattor för att avlägsna etanolen.
- Sätta 150 mikroliter av autoklaveras DDH 2 O i varje brunn och inkuberadem vid RT i 5 min för att spola bort kvarvarande etanol; följa med en tvätt av steril PBS vid RT i 3 min.
OBS: Steg 5,1-5,3 kan vara valfria, beroende på tillverkningen av plattorna. - Sätta 50 mikroliter av 5 mikrogram / ml polyklonal F (ab ') 2-fragment av anti-human-Ig (IgG + IgM + IgA) (i PBS) i varje brunn i ELISPOT-plattorna och inkubera dem vid 4 ° C över natten (föredraget) eller 37 ° C under 2 h 11.
OBS: Täta kanterna på plattorna med Parafilm fram till användning. - Vänds plattorna för att avlägsna obundet Abs, tillsätt 200 | il av PBS till varje brunn och inkubera dem två gånger vid RT i 3 minuter varje gång.
- Tillsätt 200 | il av PBS med 5% BSA (eller RPMI 1640 medium) till varje brunn för att blockera, och inkubera dem vid RT under 2 h.
- Vänds plattorna för att ta bort den blockerande buffert. Tvätta varje brunn två gånger med 200 | il av PBS, såsom i steg 5,5.
- Tillsätt 100 | il RPMI 1640-medium till varje brunn och inkubera dem vid 37 ° C.
- När du är redo att ympa cellerna vänds plattorna för att avlägsna RPMI 1640-medium.
- Seed 100 mikroliter (5 x 10 4), 50 | il (2,5 x 10 4), och 25 mikroliter (1,25 x 10 4) av cellerna (från steg 1.19, 2.10, 2.11, 3.10, och 4.6) i brunnarna i en ELISpot plattan. Med RPMI 1640-medium, bringa volymen till 150 | il / brunn.
OBS: Ett minimum av en eller två 2-faldiga seriespädningar för utstrykning av cellerna rekommenderas. - Inkubera plattorna i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 under 8-14 h 18. Undvik att flytta plattorna under inkubation.
- Vänds plattorna för att avlägsna cellerna och RPMI 1640-medium.
- Tillsätt 200 | il / brunn av PBS-T (PBS med 0,05% Tween 20) och inkubera dem 5 gånger vid RT, varje gång under tre min. Vänd på plattan för att avlägsna tvättbufferten mellan var och en av 5 tvättar.
- Lägg antingen get-anti-humant IgG-alkaliskt fosfatas (AP), Fcy-specifik Abs (för IgG detektion, 1: 5000 i PBS-T) Eller get-anti-human-IgM-AP, Fcμ fragment-specifik Abs (för IgM-detektering, en: 5000 i PBS-T) i de utsedda brunnarna och inkubera vid RT under 2 h i mörker.
- Tvätta varje brunn två gånger med 200 | il av PBS, såsom i steg 5,5.
- Tillsätt 50 | il / brunn av bromochloroindolyl fosfat-nitroblå tetrazolium (BCIP / NBT) substratlösning. Lila-färgade fläckar normalt 5-15 min.
- Tillsätt 100 mikroliter / brunn av DDH 2 O för att förhindra överexploatering av fläckar.
- Skölj plattorna med rinnande vatten efter den fullständiga utvecklingen av alla ställen.
- Ta bort dränerings av plattorna och låta dem lufttorka i mörker.
- Räkna fläckarna med användning av en automatiserad plattläsare med ett bildmottagande / analysenheten (t.ex. en automatisk scanner eller manuellt via ett dissektionsmikroskop).
OBS: Plattorna kan förvaras vid rumstemperatur i mörker och analyseras senare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
PBMC tömdes av RBC och vidhäftande celler (steg från 1,2 till 1,7). En alikvot (2 x 10 6) av cellerna utsattes för en flödescytometrisk analys för att illustrera de populationer av naiva B-celler, minnes-B-celler och PBS / datorer i perifert blod (figur 1). I detta givarens PBMC, var cirka 10% av lymfocyterna CD19 + B-celler. I B-cellavdelningen, den procentuella andelen CD19 + CD27 - naiva B-celler var cirka 50%. Å andra sidan, var ungefär 50% av CD19 + B-celler CD27 + minnes-B-celler 7, 25-26. Notera, kan CD27 + minnes-B-celler att separeras ytterligare med införandet av IgD 4. Fenotypen av cirkulerande PBs kan definieras bättre med låg eller ingen yta uttryck av CD20 (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo / -) 2, 30-31. För att utesluta döda celler, 7-AADkan ingå i cellfärgning (steg 3,5), och en tomt för FSC kontra 7-AAD möjliggör grind populationen av levande celler (7-AAD -).
De viktigaste stegen i ELISpot-analysen visas i Figur 2. Både renade humana B-celler och CD19 + CD27 + minnes-B-celler odlades i närvaro av CpG med RPMI 1640-medium under 5 dagar. Celler skördades för ELISPOT-analys för att kvantifiera de nyligen framkommit DSK. Om de är närvarande, den redan existerande PBs isolerats från det perifera blodet kommer att dö ut i 48 h 11. ELISPOT-analysen genomfördes, och spot bilder som förvärvats av en automatisk plattskanner demonstreras i figur 3. Resultaten av ELISpot typiskt kommer att visa 50 - 200 IgM-ASC: er från 10 4 B-celler behandlade med CpG i 5 dagar, medan antalet IgG-ASC: er är 10-50 i 10 fyra celler 11.
Figur 1. Illustration av Gating strategi för att separera den naiva B-celler, minnes-B-celler, och PBS i PBMC. (A) Celler (2 x 10 6) färgades med 2 ug vardera av CD19-APC, CD27-eFluor450, och CD38-PE mAbs (steg 3,4). Den lymfocyter facket var gated (G1) på pricken tomt för framåtspridning (FSC) mot sidospridning (SSC). (B) Cell dubletter, som bildas av två celler sitter ihop, uteslöts (de utanför G2) på tomten för FSC-W (bredd) mot FSC-H (höjd). (C) CD19 + B-celler gated som G3 på tomten för SSC-A (område) och CD19-APC. (D) Av de CD19 + celler, dot plot av CD27 och CD38 parametrar uppvisade naiva B-celler (CD19 + CD27 -; Q1 och Q4), minnes-B-celler (CD19 + CD27 +;Q2 och Q3), och PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 +, G4, 0,6% av Q2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Illustrationer av de viktigaste stegen i ELISPOT-analys. (A) Sätt 50 | il / brunn (5 ^ g / ml) av F (ab ') 2-fragment av anti-human-Ig (IgG + IgM + IgA) i en ELISpot plattan under 2 h vid 37 ° C eller över natt vid 4 ° C (föredraget) (steg 5,4). Ympa cellerna i brunnarna hos ELISpot plattan. Låt DSK att fästa till PVDF-membranet och att utsöndra Abs för 8 - 14 h (steg 5,11). (B) Tvätta cellerna med PBS (med 0,05% Tween 20). (C) Tillsätt AP eller HRP-conjugated upptäckt Abs specifika för antingen IgG eller IgM. (D) Tvätta detekterings Abs som är obunden. (E) Utveckla fläckar med en substratlösning av AP eller HRP för att matcha detekterings Abs. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. ELISPOT Resultat från en representant Plate. (A) Renat CD19 + B-celler placerades i tre intilliggande brunnar (50.000 celler i brunn nr 1, 25.000 celler i brunn nr 2, och 12.500 celler i brunn nr 3, respektive) i ELISpot plattan. Cellerna odlades sedan i RPMI 1640-medium över natten (~ 14 h). ELISPOT-analysen genomfördes efter avslutad kulturen (steg från 5,12 till 5,18). att analyze resultaten var ELISpot plattan skannas för att få bilder via en automatisk analysator utrustad med skannern och programvaran. (B) Renat CD19 + CD27 + minnesceller (10 6 / ml) odlades i närvaro av 5 pg / ml CpG i 5 dagar. Cellerna behandlades såsom i (A) för ELISpot-analysen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Isolering och rening av humant perifert blod-B-celler
Normalt kan RBC effektivt brista och godkänts av lysbuffert (steg 1,2). Det är viktigt att inte inkubera PBMC med RBC lysisbuffert längre än fem minuter, som cellviabilitet kan påverkas av ammoniumklorid. Alternativt kan RBC och trombocyter samtidigt avlägsnas genom följande protokoll.
Blanda färskt helblod med syra-citrat-dextros (ACD) buffert (39 mM citronsyra, 75 mM natriumcitrat och 135 mM dextros; pH 7,4) i ett volymförhållande av 9: 1, blod-till-buffert. Centrifugera vid 250 xg under 10 min vid RT. Var uppmärksam på bildandet av skikt, som indikerar separation. Aspirera och kasta det övre skiktet, som innehåller blodplättar och trombocytrik plasma (gul färg). Ta bort det tunna mellanskiktet vid gränsytan, som innehåller PBMC (d .v .s., Buffy coat). Undvika kontaminering av de röda blodkropparna i det nedre skiktet (dark röd färg). Lägg lysbuffert till PBMC för att ta bort kvarvarande röda blodkropparna, och följ sedan steg 1,2-1,19.
Två tillvägagångssätt kan användas för att isolera B-celler från PBMC: positiv och negativ selektering 21. Metoden för negativ selektion (stegen 1,1-1,19) används för att erhålla orörda, funktionella B-celler, utan någon bunden Abs eller mikropärlor, för experiment nedströms. Det är viktigt att ta hänsyn till detta när aktivering och / eller differentieringen av renade B-celler förekommer i kultur. Oron är att celler renats genom positiv selektion kan oavsiktligt påverkas av mAb-konjugerade mikropärlor (0,2 till 5 mikrometer i diameter). mAbs kan binda till specifika receptorer på B-celler och därför kan tvärbinda receptorer för aktivering. Dessutom kan mikropärlor kan endocytoseras av B-celler genom bundna receptorer. Även biologiskt nedbrytbara, kan mikropärlorna stanna inne celler längre än en vecka. Om lagring av mikropärlor kommer att påverka erfamentala resultat måste bestämmas empiriskt. Vid rening av humana B-celler via positiv selektion, anti-CD19 (kloner: 4G7 eller HIB19) mikropärlor används vanligen eftersom CD19 är allmänt uttryckt i hela utvecklingsstadier av B-celler. Renheten hos B-celler efter separation kan bestämmas genom flödescytometri med anti-CD19 mAbs (kloner: SJ25C1 eller LT19), som känner igen distinkta epitoper från anti CD19 mikropärlor.
Rening och separation av minne och naiva B-celler från isolerade B-celler
CD27 är en allmänt accepterad yta markör för människans minne och naiva B-cells åtskillnad 24. Den CD27-molekylen tillhör tumor necrosis factor receptor (TNFR) -familjen. Eftersom CD27 uttrycks på de flesta humana minnes-B-celler, är det vanligt förekommande att skilja dem från CD27 - naiva B-celler. Emellertid, därför att CD27 uttrycks också på T-celler och NK-celler, användning av anti-CD27 microbeads (klon: O323) i positivt välja minnes-B-celler kräver förhands rening av B-celler (steg från 1,1 till 1,19). För en renhetskontroll efter separation, mAbs specifika för human CD27: är (kloner L128 eller LG.3A10) rekommenderas (steg 2,12). Eftersom CD27 + minnes-B-celler är heterogena, ytterligare ytmarkörer, såsom IgD och FCRL4 kan övervägas för ytterligare separation i cellsortering 4, 7.
Cellsortering Skaffa Naiv B-celler, minnes B-celler och PBS / PC
Eftersom B-celler uttrycker FcyRIIB är en Fc-block (steg 3,3) rekommenderas före färgning av cellerna med mAbs för flödescytometri. Fc-fragment av humant IgG ensam kan blockera lika väl som hela humant IgG vid 1 pg / 10 6 celler. Anti-humana CD32 mAb (kloner: 3D3 eller AT10) är ett annat alternativ för Fc blocket. Notera om FcyRIIB är en yta markör som ska färgas i renade B-celler, fluoroforen-konjugerade anti-CD32 mAb should tillsättas för att avstå från Fc blocket, följt av färgning med andra mAbs utan PBS tvätt.
För tre färger flödescytometri, CD38-FITC (fluorescein), CD27-PE (fykoerytrin), och CD19-APC (allofykocyanin) är en typisk kombination av fluoroforer. Icke desto mindre, om den flödescytometriska sorterare är utrustad med tre lasrar, såsom de med 405 nm, 488 nm och 640 nm, forskarna har då lyx att välja fluoroforer exciterade av olika lasrar för cellsortering. Såsom visas i fig 1 färgades cellerna med CD19-APC (klon: HIB19), CD27-eFluor450 (ekvivalent med Pacific Blue, klon: O323) och CD38-PE (klon: HB7) att separera de naiva B-celler, minnes B-celler och PBS. Notera vissa forskare föredrar införandet av CD45 (klon: HI30) som en leukocyt härstamning markör och grind B-celler som en CD45 + CD19 + befolkning. Eftersom upptäckten PBS i omlopp vid steady state är en sällsynt event hos friska individer, låg eller till och med ingen yta uttryck av CD20 på PBS (CD19 + CD27 + / hi CD38 + CD20 lo / -) styrker sin bona fide existens 2, 30-31. Detta är användbart när kvantifieringen resultaten av PBS genom fenotyper och DSKer ytan av ELISPOT-analyser jämförs. Under perioden före cellsortering, är 7-AAD föredrog att propidiumjodid för att utesluta döda celler, på grund av sin smalare emissionsspektrum och lägre spillover i multi flödescytometri.
Stimulering in vitro och differentiering av isolerade humana B-celler
Typ B CpG (ODN 2006) ensam kan inducera en begränsad differentiering av både IgM- och IgG-DSKer från minnes-B-celler. Dessutom naiva B-celler är endast svagt svarar på CpG och främst ger upphov till IgM-DSK: er 6, 11. Koncentrationen av CpG i kultur är i intervallet av 2,5-5 | ig / ml per 10 6 B-cellereller PBMC 11, 18. Andra än CpG, kan renade B-celler och PBMCs odlas i närvaro av kombinationer av CpG med mitogener, cytokiner och BCR-agonister, för att differentiera humana B-celler in i ASC: er i odling (steg 4,3). Till exempel, som vanligen används recept för 10 6 celler per ml innefattar (a) CpG (5 | j, g / ml), rekombinant humant IL-2 (10 ng / ml) och rekombinant humant IL-10 (10 ng / ml) 15, 34; (b) CpG (5 | j, g / ml) och F (ab ') 2-fragment av anti-human-Ig (IgG + IgM + IgA) (20 | ig / ml) 11; (c) CpG (5 | j, g / ml), protein A från S. aureus Cowan (SAC) (1: 10000 utspädning), och Pokeweed mitogen (PWM) (1: 100.000 utspädning) 18; (d) rekombinant humant IL-21 (100 ng / ml) och rekombinant sCD40L (1 | ig / ml) 12, 15, 33; och (e) rekombinant human IL-2 (10 ng / ml) och R848 (1 mikrogram / ml), en TLR7 agonist 33-34. Även om B-celler kan differentieras till DSKer på tre dagar 11, celler är i allmänhet för-stimulated under 5 till 6 dagar innan den tillsätts till ELISpot plattan för kvantifiering av ASC: er 11, 18. Under odlingsperioden, finns det oftast ingen påfyllning av utgångsdifferentieringsmedel.
Tillsatsen av IL-2 och IL-10 till CpG-innehållande kulturer kan avsevärt öka antalet differentierade IgM- och IgG-ASC: er 15, 35. Närvaron av IL-2 i kultur kan ge mitogen stimulering för att underlätta utbyggnaden av differentierade B-celler genom CpG. IL-10 inom området från 10 till 25 ng / ml kan kraftigt öka produktionen av ASC: er (~ 3- till 10-faldig) i närvaro av CpG 35. BCR-agonister, inklusive anti-BCR och SAC, och PWM kan också stimulera spridningen av primär humana B-celler 18. Inkubering av minnes-B-celler med CpG och polyklonal anti-BCR huvudsakligen resulterar i en ökning av IgM-ASC: er men inte i IgG-ASC: er 28. För att förebygga hämning av signalering genom BCR av FcyRIIB, en F (ab# 39;) 2-fragment av anti-Ig (10-20 mikrogram / ml per 10 6 celler) rekommenderas när tvärbindning BCR 11. I stället för polyklonala anti-Ig, bör anti-BCR mAbs specifika för antingen IgM + eller IgG + B-celler anses rikta isotyp-specifik B-cellundergrupper för differentiering till DSK. En kombination av CpG, SAC (1: 10000 utspädning) och PWM (1: 100.000 utspädning) kan effektivt aktivera minnes B-celler att differentiera till IgM- och IgG-DSK: er 18, 24. Dessutom CpG kan måttligt inducera klass-switchning av Ig in vitro 28-29. I kontrast, IL-21 (100 ng / ml) och sCD40L (1 | ig / ml) på ett effektivt sätt inducera minne B-cellsdifferentiering uteslutande till kopplad IgG-ASC: er 12, 30. Den sCD40L kan aktivera B-celler genom att härma T-cellhjälp genom CD40 på B-celler, som påverkar deras differentiering till persondatorer in vivo. Notera anti-CD40 (kloner: 89 eller G28.5) kan ersätta sCD40L i kultur 15. however, är varken sCD40L eller anti-CD40 ensam kan inducera differentieringen av minnes-B-celler. Således är CD40-aktivering av odlade B-celler ofta i kombination med en differentieringsmedel, såsom IL-4, CpG, R848, eller IL-21, av vilka någon kan främja Ig klass-switchning. IL-4 spelar en nyckelroll i differentieringen av Th2 CD4-celler, vilket gör att induktion av de flesta IgM + B-celler för att byta till IgG1 + B-celler i odling. På liknande sätt, i närvaro av IL-21, båda minnes B-celler och naiva B-celler differentierar uteslutande in i klasskopplade ASC: er 12, 32. Liksom CpG kan R848 framkalla en marginell klass byte av B-celler 34. Slutligen är det värt att nämna att även om lipopolysackarid (LPS) effektivt kan inducera differentiering av mus B-celler i DSKer, humana B-celler uttrycker låga nivåer av TLR4 och CD14 29. Eftersom tillsatsen av ett differentieringsmedel i kultur befrämjar alstringen av omkopplade B-celler, bör denna tillsats undvikasnär redan existerande PBS / datorer eller icke omkopplad minnes-B-celler är som skall mätas.
ELISPOT-analys
ELISPOT-analysen kombinerar plattbaserade ELISA med membranbaserade Western blotting-teknik, vilket möjliggör detektion av Abs som utsöndras av en enda B-cell 18. ELISpot har också anpassats för att kvantifiera Ag-specifika T-celler som utsöndrar cytokiner 17, 36. I en ELISPOT-analys, kan antingen renade celler eller ofraktionerade PBMC (utan RBC) användas. Men ~ 10 gånger fler PBMC krävs än renade celler för att erhålla konsekventa resultat i ELISPOT-analyser. En bra utgångspunkt är 1 - 2 x 10 5 celler per brunn för att detektera de cirkulerande ASC: er i PBMC. Vid detektion av Ag-specifik ASC: er, anti-Ig vanligen ersättas med Ag (5-10 | ig / ml i PBS) för att fånga Ag-specifik ACS (steg 5,4). Användningen av isotyp-specifik detektion Abs kan man skilja mellan Ag-specifika IgM-DSK och IgG isotyp-DSKer (steg 5,14). Notera oavsett om anti-Ig eller Ag används för att fånga DSKer, detekterings Abs används för ELISA kanske inte alltid vara lämplig för ELISpot. På samma sätt, inte alla färg substrat för ELISA fungera korrekt i ELISpot. AP och HRP-konjugerade Abs används oftast för punktdetektering i ELISpot. Den BCIP / NBT-substratlösning är ett populärt val för AP-baserad detektering, medan 3,3 ', 5,5'-tetrametyl-bensidin (TMB) och 3-amino-9-etylkarbazol (AEC) lösningar är vanliga substrat för HRP i ELISpot. Om AP eller HRP direkt konjugerad till detekterings Abs, behövs bara ett steg för detektering, som beskrivs i protokollet (steg 5,14). Däremot är detekterings Abs biotinyleras och kräver efterföljande inkubering med AP eller HRP-konjugerad streptavidin innan reagera med substraten i en två-stegsmetoden. Både en-stegs och två-stegs metoderna fungerar effektivt för att upptäcka platser i ELISpot.
ELISPOT-analysen kan kvantifiera inte bara circulatning men även differentierade DSKer i odling (steg 1,19 jämfört med 4,6). Om det finns cirkulerande DSKer, som normalt lever längre än två dagar i kultur, kan vara direkt odlas i ELISpot plattan, med eller utan rening från PBMC 11. I motsats härtill kräver differentiering av minnes-B-celler 5 dagar. Därför är direkt odling i ELISPOT-plattor efter cell isolering (steg 1,19) rekommenderas inte; de döda cellrester till följd av den förlängda odlingsperioden kan öka bakgrunden i spot upptäckt. I stället kan både renade B-celler och totala PBMC först odlas i en 6-brunnars eller 12-brunnar i närvaro av mitogener och differentieringsmedel (steg 4,3). Under odlingsprocessen, är den upprepad tillsats av stimuleringsmedel onödiga (steg 4,3). Medan plattorna är i inkubatorn, bör dörren till inkubatorn försiktigt öppnas och stängas för att förhindra seedade DSK: er från att röra sig, för de kan diffundera utsöndrade Abs längs de rörliga spår, generera fläckarmed svansar (de så kallade "kometliknande" fläckar) (steg 5,11). Inkubationstiden i ELISPOT-plattor bestäms av den tid som krävs för cellerna att utsöndra detekterbara mängder av Abs utan att cellerna att dela, vilket skulle skapa svårigheter i spoträkning. Således celler är vanligtvis odlas i intervallet 8 h till över natten (steg 5,11).
ELISPOT-analysen är den mest använda metoden för att kvantifiera minnes-B-cellsvar. Det har blivit en populär, oberoende avläsning av humoralt immunsvar och immunologiskt minne. I praktiken är det föregående mitogen kulturen krävs för att aktivera minnes-B-celler för differentiering till DSKer (steg 4,3). Emellertid den frekvens vid vilken minnes-B-celler expandera och differentiera till DSKer varierar i olika odlingsmiljö, såsom beskrivits ovan. Även utan konsensus, de flesta forskare antar induktion tillstånd som kan maximera produktionen av ASC: er. I termer av medel som används för punkt detection, kan en löslig biotinylerad Ag ersätta otillfredsställande upptäckt Ab utan att kompromissa med känslighet 37. Detta är av särskild betydelse när tillgången på Ag är begränsad eftersom en mycket lägre kvantitet av Ag krävs för detektion än för beläggning av plattorna. Slutligen gör ELISpot inte tillåta fenotypisk analys av cell heterogenitet, och därmed kräver förhandsfraktionering av cellpopulationer. Nyligen har en flerfärgad ELISpot-analys i vilket detekterings Abs är märkta med olika fluoroforer, utvecklats för att detektera multipla typer av cytokin-utsöndrande celler i en enda brunn 38-39. Denna nya teknik kommer att vara av särskilt intresse för detektion av lågfrekventa celler i PBMC och för en storskalig analys av vaccininducerade B-cellsvar.
Eftersom ELISpot-analysen är snabb och effektiv i att kvantifiera ASCs och cytokin-utsöndrande celler, har det utökats till att mäta funktionalitet inte bara circulating lymfocyter, men också vävnadsimmunceller såsom intrahepatiska leukocyter 40. På grund av dess känslighet når nivån för att upptäcka en enda ASC har ELISPOT-analys blivit allt vanligare att mäta mänskliga immunsvar mot vaccinutbyte mot befintliga och nya patogener. Även om hög genomströmning prestanda och robusthet ELISpot-analysen är utmärkt för storskaliga bedömningar av immunsvar med användning av PBMC, kan resultaten av analyserna att påverkas av olika faktorer, såsom bearbetningsfördröjningen av prover, oavsett om cellerna är färskt eller fryst , serumkomponenter i odlingsmediet, och antalet celler tillsatta till ELISpot plattan 41. Därför bör normaliseringsförfaranden ingå i ELISpot protokollet för att minimera intra- och inter-analysvariationer i stor skala och longitudinella uppföljningsstudier (t.ex. vaccin prövningar). Normaliseringen metoden plattläsande är också avgörande för linearitet, noggrannhet och nackdelaristency i analysresultaten 41-42. Ett sätt att utföra plattläsande normalisering är att utvidga förfarandet av serieutspädning av celler sådda till ELISPOT-plattor (steg 5,10). Genom att skapa en referensplatta, bör flera serieutspädningar visar ett linjärt förhållande mellan cellantal pläterade per brunn och spot impulser per brunn. Upprepade skanningar av ELISpot plattan kan användas för att validera mall plats räkning, både automatiskt och manuellt. Minimal inom väl variabilitet spot räknas förväntas efter dessa normaliseringsförfaranden 43. Slutligen kan tillämpningen av ELISpot utökas på många sätt, till exempel övervakningen av behandlingssvar hos patienter med infektioner och tar cancerimmunterapier, samt utvärdering av immun (t.ex. immunosuppression och läkemedelsinducerad autoimmunitet).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer K2E | BD Biosciences | 367525 | 10 mL tube |
| Ficoll-Paque Plus | GE Healthcare | 17-1440-02 | endotoxin-free |
| Trypan blue 0.5% solution | Biological Industries | 03-102-1B | |
| IMag Human B lymphocyte enrichment set | BD Biosciences | 558007 | |
| Biotinylated CD27 mAb | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| Streptavidin magnetic microbeads | BD Biosciences | 9000810 | |
| 15 mL Falcon tubes | BD Falcon | 352196 | |
| Blue nylon mesh cell strainer, 40 μm | BD Falcon | 352340 | |
| Anti-human CD19-APC | Biolegend | 302212 | clone HIB19 |
| Anti-human CD27-eFluor 450 | eBioscience | 48-0279-42 | clone O323 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | Biolegend | 303516 | clone HIT2 |
| Anti-human CD38-PE-Cy7 | BD Biosciences | 560677 | clone HIT2 |
| Anti-human CD45-FITC | Biolegend | 304006 | clone HI30 |
| Anti-human CD45-FITC | BD Biosciences | 555482 | clone HI30 |
| Anti-mouse/rat/human CD27-PerCP Cy5.5 | Biolegend | 124213 | clone LG.3A10 |
| Anti-human CD27-PerCP Cy5.5 | BD Biosciences | 65429 | clone L128 |
| Anti-human CD19-FITC | Miltenyi Biotec | 130-098-064 | clone LT19 |
| Anti-human CD19-FITC | GeneTex | GTX75599 | clone LT19 |
| Anti-human CD20-FITC | BD Biosciences | 555622 | clone 2H7 |
| biotinylated anti-human CD27 | Biolegend | 302804 | clone O323 |
| biotinylated anti-human CD27 | eBioscience | 13-0279-80 | clone O323 |
| 7-aminoactinomycin D (7-AAD) | BD Biosciences | 559925 | |
| CpG (ODN 2006) | InvivoGen | tlrl-2006 | type B CpG |
| Recombinant human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant human IL-10 | PeproTech | 200-10 | |
| Recombinant human IL-21 | PeproTech | 200-21 | |
| Recombinant human sCD40L | PeproTech | 310-02 | |
| Protein A of S. aureus Cowan (SAC) | Sigma-Aldrich | 82526 | |
| Pokeweed mitogen (PWM) | Sigma-Aldrich | L9379 | |
| MultiScreen filter plates, 0.45 µm pore size | Merck Millipore | MSIPS4510 | sterile, clear 96-well filter plate with hydrophobic PVDF membrane |
| BCIP/NBT solution | Sigma-Aldrich | B6404 | |
| BCIP/NBT single reagent, alkaline phosphatase substrate | Merck Millipore | ES006 | |
| Human IgG | Jackson ImmunoResearch | 009-000-003 | |
| Human IgG, Fc fragment | Jackson ImmunoResearch | 009-000-008 | |
| F(ab')2 fragment of goat anti-human Ig (IgG + IgM + IgA) | Jackson ImmunoResearch | 109-006-127 | |
| Goat anti-human IgG-alkaline phosphatase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-008 | |
| Goat anti-human IgM-alkaline phosphatase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-055-043 | |
| Goat anti-human IgG-peroxidase, Fcγ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-008 | |
| Goat anti-human IgM-peroxidase, Fcµ fragment specific | Jackson ImmunoResearch | 109-035-095 | |
| BD ELISPOT AEC substrate kit | BD Biosciences | 551951 | |
| C.T.L. ImmunoSpot analyzer | C.T.L. |
References
- Bemark, M. Translating transitions - how to decipher peripheral human B cell development. J. Biomed. Res. 29 (4), 264-284 (2015).
- Odendahl, M., et al. Generation of migratory antigen-specific plasmablasts and mobilization of resident plasma cells in a secondary immune response. Blood. 105 (4), 1614-1621 (2005).
- Jackson, S. M., Wilson, P. C., James, J. A., Capra, J. D. Human B cell subsets. Adv. Immunol. 98, 151-224 (2008).
- Sanz, I., Wei, C., Lee, F. E., Anolik, J. Phenotypic and functional heterogeneity of human memory B cells. Semin. Immunol. 20 (1), 67-82 (2008).
- Perez-Andres, M., et al. Human peripheral blood B-cell compartments: A crossroad in B-cell traffic. Cytometry B Clin. Cytom. 78 (Suppl 1), S47-S60 (2010).
- Huggins, J., et al. CpG DNA activation and plasma-cell differentiation of CD27- naïve human B cells. Blood. 109 (4), 1611-1619 (2007).
- Wu, Y. C., Kipling, D., Dunn-Walters, D. K. The relationship between CD27 negative and positive B cell populations in human peripheral blood. Front. Immunol. 2, 81 (2011).
- Maïga, R. I., Bonnaure, G., Rochette, J. T., Néron, S. Human CD38hiCD138⁺ plasma cells can be generated in vitro from CD40-activated switched-memory B lymphocytes. J. Immunol. Res. 2014, 635108 (2014).
- Wienands, J., Engels, N. The memory function of the B cell antigen receptor. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 393, 107-121 (2016).
- Kurosaki, T., Kometani, K., Ise, W. Memory B cells. Nat. Rev. Immunol. 15 (3), 149-159 (2015).
- Tzeng, S. J., Li, W. Y., Wang, H. Y. FcγRIIB mediates antigen-independent inhibition on human B lymphocytes through Btk and p38 MAPK . J. Biomed. Sci. 22, 87-98 (2015).
- Ettinger, R., et al. IL-21 induces differentiation of human naïve and memory B cells into antibody-secreting plasma cells. J. Immunol. 175 (12), 7867-7879 (2005).
- Bekeredjian-Ding, I., Foermer, S., Kirschning, C. J., Parcina, M., Heeg, K. Poke weed mitogen requires Toll-like receptor ligands for proliferative activity in human and murine B lymphocytes. PLoS One. 7 (1), e29806 (2012).
- Bernasconi, N. L., Traggiai, E., Lanzavecchia, A. Maintenance of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells. Science. 298 (5601), 2199-2202 (2002).
- Defrance, T., Vanbervliet, B., Brière, F., Durand, I., Rousset, F., Banchereau, J. Interleukin 10 and transforming growth factor beta cooperate to induce anti-CD40-activated naive human B cells to secrete immunoglobulin A. J. Exp. Med. 175 (3), 671-682 (1992).
- Hornbeck, P., Fleisher, T. A., Papadopoulos, N. M., et al. Chapter 2, Unit 2.2, Isotype determination of antibodies. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2001).
- Tanguay, S., Killion, J. J. Direct comparison of ELISPOT and ELISA-based assays for detection of individual cytokine-secreting cells. Lymphokine Cytokine Res. 13 (4), 259-263 (1994).
- Crotty, S., Aubert, R. D., Glidewell, J., Ahmed, R. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J. Immunol. Methods. 286 (1-2), 111-122 (2004).
- Zhang, Y., Wang, Y., Zhang, M., Liu, L., Mbawuike, I. N. Restoration of retarded influenza virus-specific immunoglobulin class switch in aged mice. J. Clin. Cell. Immunol. 7 (2), 403 (2016).
- Doedée, A. M., Kannegieter, N., Öztürk, K., van Loveren, H., Janssen, R., Buisman, A. M. Higher numbers of memory B-cells and Th2-cytokine skewing in high responders to hepatitis B vaccination. Vaccine. 34 (19), 2281-2289 (2016).
- Coligan, J. E., et al. Chapter 7, Unit 7.5, Isolation of human B cell populations. Current Protocols in Immunology. , (2011).
- Safarík, I., Safaríková, M. Use of magnetic techniques for the isolation of cells. J. Chromatogr. B Biomed. Sci. Appl. 722 (1-2), 33-53 (1999).
- Morbach, H., Eichhorn, E. M., Liesem, J. G., Girschickm, H. J. Reference values for B cell subpopulations from infancy to adulthood. Clin. Exp. Immunol. 162 (2), 271-279 (2010).
- Thornton, A. M., et al. Chapter 3, Unit 3.5A, Fractionation of T and B cells using magnetic beads. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Klein, U., Rajewsky, K., Küppers, R. Human immunoglobulin (Ig)M+IgD+ peripheral blood B cells expressing the CD27 cell surface antigen carry somatically mutated variable region genes: CD27 as a general marker for somatically mutated memory)Bcells. J.Exp. Med. 188 (9), 1679-1689 (1998).
- Bohnhorst, J. Ø, Bjørgan, M. B., Thoen, J. E., Natvig, J. B., Thompson, K. M. Bm1-Bm5 classification of peripheral blood B cells reveals circulating germinal center founder cells in healthy individuals and disturbance in the B cell subpopulations in patients with primary Sjögren's syndrome. J. Immunol. 167 (7), 3610-3618 (2001).
- Bleesing, J. J., et al. Chapter 7, Unit 7.35, Assays for B cell and germinal center development. Current Protocols in Immunology. Coligan, J. E., et al. , (2003).
- Horvatinovich, J. M., Sparks, S. D., Mann, K. P. Establishing a pure lymphocyte gate for subset analysis by flow cytometry. Cytometry. 26 (2), 172-177 (1996).
- Ruprecht, C. R., Lanzavecchia, A. Toll-like receptor stimulation as a third signal required for activation of human naive B cells. Eur. J. Immunol. 36 (4), 810-816 (2006).
- Smith, K., et al. Rapid generation of fully human monoclonal antibodies specific to a vaccinating antigen. Nat. Protoc. 4 (3), 372-384 (2009).
- Caraux, A., et al. Circulating human B and plasma cells. Age-associated changes in counts and detailed characterization of circulating normal CD138- and CD138+ plasma cells. Haematologica. 95 (6), 1016-1020 (2010).
- Kuchen, S., Robbins, R., Sims, G. P., Sheng, C., Phillips, T. M., Lipsky, P. E., Ettinger, R. Essential role of IL-21 in B cell activation, expansion, and plasma cell generation during CD4+ T cell-B cell collaboration. J. Immunol. 179 (9), 5886-5896 (2007).
- Pinna, D., Corti, D., Jarrossay, D., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Clonal dissection of the human memory B-cell repertoire following infection and vaccination. Eur. J. Immunol. 39 (5), 1260-1270 (2009).
- Jahnmatz, M., et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J. Immunol. Methods. 391 (1-2), 50-59 (2013).
- Weiss, G. E., et al. High efficiency human memory B cell assay and its application to studying Plasmodium falciparum-specific memory B cells in natural infections. J. Immunol. Methods. 375 (1-2), 68-74 (2012).
- Leehan, K. M., Koelsch, K. A. T Cell ELISPOT: For the identification of specific cytokine-secreting T cells. Methods. Mol. Biol. 1312, 427-434 (2015).
- Karahan, G. E., et al. Quantification of HLA class II-specific memory B cells in HLA-sensitized individuals. Hum. Immunol. 76 (2-3), 129-136 (2015).
- Hadjilaou, A., Green, A. M., Coloma, J., Harris, E. Single-cell analysis of B cell/antibody cross-reactivity using a novel multicolor FluoroSpot assay. J. Immunol. 195 (7), 3490-3496 (2015).
- Janetzki, S., Rueger, M., Dillenbeck, T. Stepping up ELISpot: multi-level analysis in FluoroSpot assays. Cells. 3 (4), 1102-1115 (2014).
- Alatrakchi, N., Graham, C. S., He, Q., Sherman, K. E., Koziel, M. J. CD8+ cell responses to hepatitis C virus (HCV) in the liver of persons with HCV-HIV coinfection versus HCV monoinfection. J. Infect. Dis. 191 (5), 702-709 (2005).
- Smith, S. G., et al. Identification of major factors influencing ELISpot-based monitoring of cellular responses to antigens from Mycobacterium tuberculosis. PLoS. One. 4 (11), e7972 (2009).
- Sundararaman, S., et al. High reproducibility of ELISPOT counts from nine different laboratories. Cells. 4 (1), 21-39 (2015).
- Janetzki, S., et al. Guidelines for the automated evaluation of Elispot assays. Nat. Protoc. 10 (7), 1098-1115 (2015).
